Krooninen sairaus

tiivistelmä

Gemsitabiini (Gem) on kliinistä hyötyä haiman adenokarsinooma (PDAC). Tässä tutkimuksessa tutkittiin yhdistelmiä gemsitabiinin antiangiogeenisesti eri tekijöistä mekanismeja PDAC, kuten bevasitsumabi (Bev), sunitinibia (Su) ja EMAP II. Solujen lisääntyminen ja proteiinin ilmentyminen analysoitiin WST-1 määritys ja Western blotting. In vivo kokeet tehtiin kautta hiiren ksenograftit. Inhibitio in vitro leviämisen AsPC-1 PDAC soluissa gemsitabiini (10 uM), bevasitsumabi (1 mg /ml), sunitinibia (10 uM) ja EMAP (10 uM) oli 35, 22, 81 ja 6 prosenttia; Gemsitabiinin bevasitsumabia, sunitinibille tai EMAP ollut vahvistava vaikutus. Endoteelin HUVEC, gemsitabiini, bevasitsumabi, sunitinibin ja EMAP aiheutti 70, 41, 86 ja 67 prosenttia esto, kun taas yhdistelmä gemsitabiinin bevasitsumabia, sunitinibille tai EMAP oli vahvistava vaikutus. WI-38 fibroblastit, gemsitabiini, bevasitsumabi, sunitinibin ja EMAP aiheutti 79, 58, 80 ja 29 prosenttia esto, jossa lisäaine vaikutuksia yhdistelmänä samoin. Net in vivo kasvaimen kasvun estäminen in gemsitabiinin, bevasitsumabi, sunitinibin ja EMAP monoterapia oli 43, 38, 94 ja 46 prosenttia; dual yhdistelmiä Gem + Bev, Gem + Su ja Gem + EMAP johti 69, 99 ja 64 prosenttia eston. Yhdistelmät useampia antiangiogeeninen aine gemsitabiinihoito olivat yleisesti tehokkaampia, mutta ei ylivoimainen Gem + Su. Kasvaimensisäistä leviämisen, apoptoosin ja mikroverisuonitiheys havainnot korreloivat kasvaimen kasvun estäminen tiedot. Mediaani eläin eloonjääminen lisääntyi gemsitabiini (26 päivää), mutta ei bevasitsumabi, sunitinibille tai EMAP monoterapiana kontrolleihin verrattuna (19 päivää). Gemsitabiini yhdistelmät bevasitsumabiin, sunitinibille tai EMAP parantunut säilyminen samassa laajuudessa (36 tai 37 päivää). Yhdistelmät gemsitabiinin kanssa Bev + EMAP (43 päivää) tai Bev + Su + EMAP (46 päivää) johti suurimman eloonjäämishyötyä havaittu. Yhdistelmä antiangiogeeniset aineet parantaa gemsitabiinin Vastauksena sunitinibilla asiakkuutta vahvin vaikutus. Nämä havainnot osoittavat edut yhdistämällä usean kohdentamisaineita standardin Gemsitabiinihoidon varten PDAC.

Citation: Awasthi N, Zhang C, Ruan W, Schwarz MA, Schwarz RE (2012) Evaluation of Poly-Mekanistiset antiangiogeeninen yhdistelmät Paranna sytostaattihoidossa Response in Haimasyöpä. PLoS ONE 7 (6): e38477. doi: 10,1371 /journal.pone.0038477

Editor: Chryso Kanthou, Sheffieldin yliopisto, Iso-Britannia

vastaanotettu: 28 marraskuu 2011; Hyväksytty: 09 toukokuu 2012; Julkaistu: 18 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Awasthi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDAC) on yksi aggressiivisin ihmisen syöpien ja jää neljänneksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien Yhdysvalloissa. Rapid syövän etenemiseen, myöhäinen diagnosointi, varhainen ja aggressiivinen etäpesäke ja kestää hyvin tavanomainen kemoterapia johtaa poikkeuksellisen huonon ennusteen kanssa 5 vuoden pysyvyys on alle 5% [1]. Hoito PDAC riippuu vaiheessa syöpä; yleinen resectability korko on vain 10-15%, ja postoperatiivinen toistuminen on yhteinen [2], [3], [4]. Paljon huomiota on kohdistettava systeemistä hoitovaihtoehtoja PDAC mahdollisia lopullisia tai perioperatiivisen hoidon hyöty. Gemsitabiini (Gem), joka on deoksisytidiinin nukleosidianalogi, on sytotoksinen aine, joka aiheuttaa DNA-synteesin inhibitio ja solukuolemaan. Food and Drug Administration (FDA) hyväksyi gemsitabiinin edenneen PDAC vuonna 1997. Kuitenkin gemsitabiinin kliinisesti tehokas vain 20-30% PDAC potilaista, mikä mediaani ilman taudin etenemistä 5,7 kuukauden aikana verrattuna 4,4 kuukautta 5-fluorourasiilin käsitelty ryhmä [5]. Gemsitabiinin-pohjainen yhdistelmä kemoterapiahoitojen eivät ole osoittaneet mitään merkittävää mahdollisuudet säilyä monoterapiana gemsitabiini [6], [7]. Nämä seikat osoittavat selvästi kiireesti uusia ja tehokkaampia terapeuttisia strategioita PDAC.

Angiogeneesi, prosessi, jossa kasvaimet hankkia verenkierto niiden kasvun jatkuminen, on välttämätöntä etenemistä ensisijaisen ja metastaattisen kiinteiden kasvainten kuten PDAC. Angiogeneesi on aloittanut hypoksia, kasvutekijät, sytokiinit, ja aktivointi proto-onkogeenin ja de-aktivointi tuumorisuppressorigeenin mekanismien [8]. Kohdistaminen angiogeneesin vähentämiseksi kasvainprogression ja etäpesäkkeiden voi tuottaa uusi lähestymistapa yhdistelmähoitoa. Antiangiogeeniset aineet kuten anti-endoteelikasvutekijä (VEGF) agentti bevasitsumabi (Bev), matriksimetalloproteiiniaasiestäjät (marimastaatti) ja inhibiittoreiden (Selekoksibi) on tutkittu yhdistelmähoitoa PDAC malleissa on rajoitettu eloonjäämishyötyä [9], [10 ], [11]. Erlotinibi, epidermaalisen kasvutekijän reseptorin estäjä, on tähän mennessä ollut ainoa aine välittävä vaatimaton eloonjäämiseen hyötyä yhdessä gemsitabiinin [12].

Monet Kirjallisuuden mukaan VEGF signalointi näyttelee tärkeä rooli PDAC etenemisessä [13], [14], [15], [16]. Siksi bevasitsumabi, rekombinantti humanisoitu monoklonaalinen vasta-aine VEGF, tutkittiin faasin II ja faasin III kliinisissä tutkimuksissa. Vaikka bevasitsumabin ja gemsitabiinin yhdistelmää esiintyi jonkin verran lupauksen faasin II tutkimus, mitään merkittävää parannusta havaittiin faasin III jatkotutkimuksiin [17]. Sunitinibi (Su) on monen reseptoria (RTK) estäjä antiangiogeenisesti ja antituumoriaktiivisuuksia [18], [19], [20]. Sunitinibi estää RTK: t ilmaistaan ​​kasvaimen solut, jotka osallistuvat kasvaimen solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen mukaan lukien kantasolujen kasvutekijän reseptoria (c-KIT), Fms liittyvät tyrosiinikinaasi 3 (FLT3), glial cell line hermokasvutekijä reseptorin (RET) ja pesäkkeitä stimuloiva tekijä tyypin 1 reseptorin (CSF-1 R) [18], [19]. Sunitinibi estää myös RTK: t ilmennetään endoteelin ja kiinnitti soluja, kuten VEGF-reseptoreja (tyyppi 1 ja 2) ja verihiutaleista johdettu kasvutekijä (PDGF) reseptorit α ja β [20], [21]. Ihmisen PDAC, VEGF-reseptorit ja PDGF-reseptorien yli-ilmentää ja ovat korreloineet huonoon ennusteeseen [22], [23], [24]. Sunitinibin on osoitettu olevan tuumorin vastaista tehokkuutta kokeellisen PDAC [25], [26], [27]. Endoteelin monosyytti aktivoiva polypeptidi II (EMAP) on tulehdusta edistävä sytokiini antiangiogeenisesti ja endoteeliä toimintaa. EMAP on voimakas vaikutus endoteelisolujen (EC), kuten lisäkasvun estäminen, siirtolaisuuden ja verisuonten muodostumista sekä apoptoosin induktion [28], [29]. EMAP estää primaarinen ja metastaattinen kasvaimen kasvu [28], [30], [31], jotka voivat liittyä sen kyky sitoa VEGF-reseptoreihin ja α5β1 integriinin, mikä puuttumista fibronectin- ja VEGF merkinanto [32], [33] . EMAP on äskettäin osoitettu parantavan gemsitabiinin ja doketakselin vasteen kokeellisissa PDAC [34], [35], [36]. Tässä tutkimuksessa arvioitiin ja verrattiin yhdistelmä hoito edut gemsitabiinin kolmen antiangiogeeniset aineet bevasitsumabille sunitinibi ja EMAP varten mahdollisesti parantaa PDAC kliinisiä sovelluksia.

AsPC-1, HUVEC ja Wi-38 soluviljelmiä käsiteltiin Gem (10 uM), Bev (1 mg /ml), Su (10 uM) ja EMAP (10 uM), joko yksinään tai yhdessä 16 tuntia. Kokosolulysaattia päässä ryhmissä tehtiin SDS-PAGE ja immunoblottaus. Expression of α-tubuliinin analysoitiin sisäisen kuormituksen valvonta. Tiedot edustavat kaksi erillistä koetta samoin tuloksin.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Gemsitabiini hankittiin Eli Lilly (Indianapolis, IN). Bevasitsumabi ostettiin Genentech (South San Francisco, CA). Sunitinibille hankittiin LC Laboratories, Inc. (Woburn, MA). Rekombinantti ihmisen EMAP valmistettiin, kuten on aiemmin kuvattu [37], kun taas solujen lisääntymistä reagenssin WST-1 hankittiin Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, IN).

Cell Culture

Ihmisen haimasyövän solulinja AsPC-1, ihmisen fibroblastisolulinjan WI-38 ja ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC: t) olivat kaikki hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). AsPC-1 ja WI-38-soluja kasvatettiin RPMI 1640 väliaineessa ja DMEM, vastaavasti (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS). HUVEC kasvatettiin EndoGRO-LS väliaineessa, joka sisältää endoteelisolujen kasvun täydentää (Millipore Corp., Billerica, MA).

solunelinkykyisyysmääritys

In vitro Solujen elinkelpoisuus arvioitiin WST-1-määritys . Neljä tuhatta solua maljattiin 96-kuoppaiselle levylle ja 16 tunnin kuluttua elatusaine korvattiin alhaisen seerumia sisältävässä väliaineessa. Soluja käsiteltyä gemsitabiiniryhmässä, bevasitsumabi, sunitinibin ja EMAP. Pitoisuusalueen käytetään gemsitabiini, sunitinibia ja EMAP (10 nM 10 uM); ja bevasitsumabi (1 ug /ml 1 mg /ml) oli verrattavissa kliinisesti saavutettavissa pitoisuuksia. Sen jälkeen, kun 72-tunnin inkuboinnin 10 ui WST-1-reagenssia lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja absorbanssi 450 nm: ssä mitattiin 2 tunnin kuluttua mikrolevynlukijaa käyttäen.

Nude-hiiret injektoitiin subkutaanisti AsPC-1 solun (0,75 x 10

6) ja käsiteltiin Gem, Bev, Su ja EMAP, joko yksinään tai yhdistelmänä, ja 2 viikkoa. Kasvaimen kasvu mitattiin 2 kertaa viikossa käyttäen jarrusatulat, ja netto kasvaimen kasvua laskettiin vähentämällä kasvaimen tilavuus ensimmäisenä hoitopäivänä kyseisestä viimeisenä päivänä. Tiedot edustavat keskiarvoja 6-8 hiirtä per ryhmä.

Nude-hiiret injektoitiin subkutaanisti AsPC-1-soluja (0,75 x 10

6) ja käsiteltiin Gem, Bev, Su ja EMAP, joko yksin tai yhdessä, 2 viikkoa. (A) Kasvaimen kudosleikkeiden immunovärjättiin Ki67 tuma-antigeenin ja valokuvattiin fluoresenssimikroskoopilla. (B) Ki67-positiivisten solujen lukumäärä laskettiin viidestä eri HPF. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta. Symbolit • ja * edustaa merkittäviä eroja (P 0,05) verrattuna kontrolleihin ja Gem ryhmä, vastaavasti.

Nude hiiriin injektoidaan subku- AsPC-1-soluissa (0,75 x 10

6) ja käsiteltiin Gem, Bev, Su ja EMAP, joko yksinään tai yhdistelmänä, ja 2 viikkoa. (A) Kasvaimen kudosleikkeet värjättiin TUNEL menettelyä ja valokuvattiin fluoresenssimikroskoopilla. (B) TUNEL-positiivisia apoptoottisia soluja laskettiin viidestä eri HPF. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta. Symbolit • ja * edustaa merkittäviä eroja (P 0,05) verrattuna kontrolleihin ja Gem ryhmä, vastaavasti.

Nude hiiriin injektoidaan subku- AsPC-1-soluissa (0,75 x 10

6) ja käsiteltiin Gem, Bev, Su ja EMAP, joko yksinään tai yhdistelmänä, ja 2 viikkoa. (A) Tuumorikudos leikkeet värjättiin PECAM-1-vasta-aineen ja valokuvattiin fluoresenssimikroskoopilla. (B) PECAM-1 positiivisia pienten suonten laskettiin viidessä eri HPF. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta. Symbolit • ja * edustaa merkittäviä eroja (P 0,05) verrattuna kontrolleihin ja Gem ryhmä, vastaavasti.

AsPC-1-soluissa (0,75 x 10

6) injektoitiin intraperitoneaalisesti SCID-hiirissä, ja sen jälkeen 2 viikkoa sen jälkeen käsittelemällä Gem, Bev, Su ja EMAP, joko yksinään tai yhdistelmänä, ja 2 viikon ajan. Käyrä edustaa eläimen elinaika alusta hoidon.

Western Blot analyysi

subkonfluenteista yksisolukerros käsiteltiin gemsitabiinin (10 uM), bevasitsumabi (1 mg /ml), sunitinibia (10 uM) tai EMAP (10 uM) ja inkuboitiin 12 tuntia HUVEC ja 24 tuntia AsPC-1 ja Wi-38 soluihin. Kokosolulysaattia valmistettiin, proteiinipitoisuus mitataan ja yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-kalvoille (Bio-Rad, Hercules, CA). Membraanit blokattiin 1 tunnin estoliuoksessa (5% maitoa TBS-T [Tris-puskuroitu suolaliuos, joka sisälsi Tween-20]) ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa seuraavilla vasta-aineilla: lohkaista poly (ADP-riboosi) polymerase- 1 (PARP-1), pilkottiin kaspaasi-3 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), tai α-tubuliinin (Sigma). Membraanit inkuboitiin sitten vastaavan HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineilla (Pierce Biotechnologies, Santa Cruz, CA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Erityisiä vyöhykkeet havaittiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssin reagenssilla (ECL, Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA) on autoradiografisten elokuva ja kvantitoitiin densitometrisesti.

kasvaimen istutuksen ja in vivo tuumorikasvun Experiment

Kaikki eläinkokeiden ja hoito suoritettiin ohjeiden mukaisesti ja hyväksyttyjen käytäntöjen yliopiston Texas Southwestern Medical Center (Dallas, TX) Institutional animal Care ja Käytä komitean (eläinten Protocol Number 2008-0348). Kateenkorvattomiin naispuolinen nude-hiirten (iältään 4-8 viikkoa) käytettiin ihonalaisen ksenograftimallissa. Ihmisen haimasyövän AsPC-1-soluissa (0,75 x 10

6) injektoidaan subkutaani- kussakin hiiri. 14 päivän jälkeen, kun kaikki hiiret olivat mitattavissa kasvain, hiiret jaettiin satunnaisesti ryhmitelty (n = 6-8 ryhmää kohti) ja käsiteltiin vatsaontelonsisäisesti PBS: llä (kontrolli), gemsitabiini (100 mg /kg, kahdesti viikossa), bevasitsumabi (10 ug hiirtä kohti, kahdesti viikossa), sunitinibia (40 mg /kg 1

st viikko, 20 mg /kg 2

nd viikko, 5 x viikossa) ja EMAP (80 ug /kg, 5 x viikossa) 2 viikon ajan. Kasvain koko kaikkien hiirten mitattiin kahdesti viikossa paksuus. Kasvaimen tilavuus (V) laskettiin kaavalla [V = ½ (L x (W)

2], jossa L = pituus ja W = leveys. Nettokasvu kasvaimen koon laskettiin jokaiselle eläimelle vähentämällä kasvaimen ensimmäisenä hoitopäivänä kyseisestä viimeisenä päivänä. hoidon päätyttyä kaikki eläimet tapettiin, kasvaimet poistettiin, punnittiin leikeltiin ja käsitellään histologista tai immunohistokemiallista analyysiä.

Histologia ja immunohistokemiallinen analyysi

Kasvain kudosnäytteet kiinnitettiin 4% paraformaldehydi ja upotettiin parafiiniin käytettiin histologista ja immunohistologista analyysia. kasvaimensisäisenä proliferatiivinen aktiivisuus mitattiin käyttämällä Ki67 tuma-antigeeni värjäystä kohti valmistajan protokollaa (Abcam, Cambridge, MA). Lyhyesti, parafiini -Embedded tuumorikudoksen leikattiin, parafiini, vedettömät ja antigeenin haetaan. kudosleikkeitä inkuboitiin CAS estopuskurilla seurasi 1 tunnin inkubointi Ki67-vasta-aineen (1:200 laimennus). kudosleikkeitä inkuboitiin sitten Cy3 (1 :200 laimennos) sekundaarisella vasta-aineella (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) 40 minuutin ajan. Objektilasit kiinnitettiin käyttäen kiinnitys, joka sisälsi 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Proliferatiivinen aktiivisuus arvioitiin laskemalla Ki67-positiivisten solujen viidestä eri suuritehoisia kentät (HPF) pidennetyn tavalla. Havaitsemiseksi mikroverisuonitiheys (MVD), kudoksen leikkeitä inkuboitiin 1:100 laimennus PECAM-1 (CD-31) vasta-aineella (BD Pharmingen, Bedford, MA) yön yli 4 ° C: ssa. Kudosleikkeissä inkuboitiin sitten 1:200 laimentamalla Cy3 sekundääristä vasta-ainetta 40 minuutin ajan. Objektilasit kiinnitettiin käyttämällä asennusratkaisu sisältäviä DAPI, ja MVD arvioitiin laskemalla PECAM-1 positiivisia suonia sisällä mikroskooppisen HPF pidennetyn tavalla. Kasvaimensisäistä apoptoosin analysoitiin värjäämällä kudosleikkeiden kanssa ”Apoptag Apoptosis Detection Kit” mukaan valmistajan (Millipore) ohjeet. Fluoresenssimikroskopia käytettiin havaitsemaan fluoresoivat signaalit käyttämällä IX81 Olympus mikroskoopilla ja kuvat otettiin kiinni kanssa Hamamatsu Orca digitaalikamera (Hamamatsu Corporation, Bridgewater, NJ), jossa on DSU spinning konfokaali kö Slidebook ohjelmistoa (Intelligent Imaging Innovations, Philadelphia, PA).

eläinten Survival Analysis

eläinten eloonjääminen suoritettiin käyttäen 6- 8-viikkoisen naaras-SCID [38]. AsPC-1 (0,75 x 10

6) solua injektoitiin intraperitoneaalisesti kullekin hiirelle ja kahden viikon jälkeen hiiret jaettiin satunnaisesti ryhmitelty (n = 6-8 ryhmää kohti) ja käsiteltiin vatsaontelonsisäisesti PBS: llä (kontrolli), gemsitabiini (100 mg /kg, kahdesti viikossa), bevasitsumabi (10 ug hiirtä kohti, kaksi kertaa viikossa), sunitinibia (40 mg /kg 1

st viikko, 20 mg /kg 2

nd viikko, 5 x viikossa) tai EMAP ( 80 ug /kg, 5 kertaa viikossa) ja 2 viikkoa. Eläimet lopetettiin käännyttäessä kuolemaisillaan ennalta määrättyjen kriteerien mukaan lukien nopea painon lasku tai nousu ( 15%), tuumorin koon, uupumus, kyvyttömyys pysyä pystyssä ja voiman puute. Survival arvioitiin ensimmäisestä päivästä hoidon kuolemaan asti.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen merkittävyys analysoitiin kaksisuuntaisella Studentin t-testiä käyttäen GraphPad Prism 4 Software (GraphPad Software, San Diego , CA). In vitro solujen lisääntymisen tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta. Additiivisuuden lääkeyhdisteistä määritettiin laskemalla ”vuorovaikutus indeksi” käyttäen Chou TC, Talalay P [39] ja Lee JJ [40] menetelmiä. Tilastollinen analyysi in vivo tutkimuksissa tehtiin ANOVA useita vertailuihin ja Studentin t-testiä varten yksittäisten vertailuihin. Survival tutkimus tilastot arvioitiin StatView Macintosh (SAS, Carey, NC) nonparametrisellä selviytymisen tilastot ja logrank testaus. Arvot p 0,05 katsottiin edustavan tilastollisesti merkitsevä ryhmäeroja.

Tulokset

Effect of Gemsitabiini Bevasitsumabilla, Sunitinibi ja EMAP soluproliferaatioon

In vitro solujen lisääntymistä analyysi in AsPC-1-soluissa gemsitabiini (10 uM), bevasitsumabi (1 mg /ml), sunitinibipitoisuutta (10 uM) ja EMAP (10 uM) oli 35, 22, 81 ja 6 inhibitioprosentti soluproliferaatioon, vastaavasti. Yhdistelmät gemsitabiinin yhden antiangiogeeniset aineet bevasitsumabille tai EMAP ollut additiivisia vaikutuksia, kun taas yhdistelmä gemsitabiinin sunitinibilla voinut ylittää vaikutuksia monoterapiana sunitinibin. Yhdistelmiä useamman kuin yhden antiangiogeeninen aine gemsitabiinin kanssa ei ollut lisäainetta in vitro vaikutuksia (taulukko 1). Vaikka gemsitabiinin oli eri vaikutuksia muihin PDAC solulinjat BxPC-3, MIA PaCa-2 ja Panc-1, vaikutukset yhdistelmien antiangiogeeniset aineet olivat samanlaiset tulokset kuin ne, jotka havaittiin AsPC-1 (tuloksia ei ole esitetty).

HUVEC-soluja, gemsitabiini (10 uM), bevasitsumabi (1 mg /ml), sunitinibipitoisuutta (10 uM) ja EMAP (10 uM) käsittely aiheutti 70, 41, 86 ja 67 prosenttia inhibitio soluproliferaatiota, vastaavasti. Yhdistelmät gemsitabiinin kanssa ainoana lääkkeenä bevasitsumabia, sunitinibille tai EMAP aiheutti merkittäviä additiivisten leviämisen estäminen. Kuitenkin yhdistelmä useammasta kuin yhdestä antiangiogeeninen aine ei ole additiivinen vaikutus. WI-38-soluja, gemsitabiini (10 uM), bevasitsumabi (1 mg /ml), sunitinibipitoisuutta (10 uM) ja EMAP (10 uM) aiheutti 79, 58, 80 ja 29 prosenttia inhibitio soluproliferaatiota, vastaavasti. Gemsitabiinin bevasitsumabiin, sunitinibille tai EMAP ollut merkittävä lisävaikutus ja yhdistelmän useampia antiangiogeenisten agenttien gemsitabiinin ollut enää lisäainetta vaikutuksia (taulukko 1). Gemsitabiinia yhdistelmä, jossa eri antiangiogeeniset aineet, mediaani vuorovaikutus-indeksi oli 1,03 (vaihteluväli 0,9-1,34) ja AsPC-1-solut, 1,3 (vaihteluväli 1,06-2,59) ja HUVEC-soluja ja 1,35 (vaihteluväli 1,06-2,47) ja Wi-38 soluihin. Vuorovaikutus indeksit saatiin IC

25, IC

50, IC

75 ja IC

90 tasoa ja eivät merkittävästi poikkea 1 osoittaa, että kaikissa lääkeyhdistelmät yhdistetyt vaikutukset olivat additiivisia.

Effects of gemsitabiini bevasitsumabilla, Sunitinibi ja EMAP apoptoosiin liittyvät proteiinit

tutkia, mikäli esto solujen elinkelpoisuuden gemsitabiini, bevasitsumabi, sunitinibin ja EMAP voitaisiin osittain korreloi apoptoosin induktion. Arviointi PARP-1 pilkkominen ja kaspaasi-3 pilkkominen merkkiaineina induktion apoptoosin paljasti, että AsPC-1-soluissa gemsitabiinihoidon aiheutti pientä lisäystä, bevasitsumabi ja EMAP ei aiheuttanut lisäystä, mutta sunitinibihoito johti merkittävään kasvuun. Gemsitabiinin sunitinibilla oli lisäaineen vaikutukset (kuva 1). Vuonna HUVEC, gemsitabiini, bevasitsumabi ja EMAP aiheutti pientä kasvua ja sunitinibille aiheutti voimakasta kasvua PARP-1 ja kaspaasi-3 pilkkominen. Yhdistelmät gemsitabiinin antiangiogeenisesti aineilla oli vahvistava vaikutus. WI-38-soluissa, gemsitabiini ja sunitinibin molemmat aiheutti selvää kasvua; kun bevasitsumabin ja EMAP osoittivat ole merkittävää vaikutusta PARP-1 ja kaspaasi-3 pilkkominen. Yhdistelmät gemsitabiinin bevasitsumabin sunitinibi ja EMAP oli kaikilla additiivisten lohkaista PARP-1 ja kaspaasi-3-proteiinin ilmentyminen (kuvio 1).

Effects of Gemsitabiini Bevasitsumabilla, Sunitinibi ja EMAP Local Tumor Growth

ihonalainen hiiren PDAC ksenografteissa tutkimukset osoittivat, että gemsitabiini, bevasitsumabi, sunitinibin ja EMAP hoito esti paikallinen kasvaimen kasvua, sunitinibilla monoterapiana, jolla on voimakkain vaikutus. Netto kasvaimen kasvun estäminen jälkeen 2 viikon gemsitabiinihoidon, bevasitsumabi ja sunitinibin ja EMAP oli 43, 38, 94 ja 46 prosenttia, vastaavasti (kuva 2). Lisääminen ainoana lääkkeenä bevasitsumabi, sunitinibin ja EMAP gemsitabiiniannokseen oli additiivisten kasvaimen kasvun estäminen, kuten Gem + Bev, Gem + Su ja Gem + EMAP johti 69, 99 ja 64 prosenttia kasvaimen kasvun estäminen. Yhdistelmät useampia antiangiogeeninen aine gemsitabiinihoito olivat myös tehokkaita, mutta ei merkitsevästi paremmin tässä kokeessa kuin sunitinibipitoisuutta yksinään (kuvio 2, Kuva S1). Mitään ilmeistä merkkejä lääkkeeseen liittyvän myrkyllisyyden havaittiin kaikissa hoitoryhmissä suhteessa eläimen habitus, toiminnan taso ja paino (kuva S2).

Effects of Gemsitabiini Bevasitsumabilla, Sunitinibi ja EMAP päälle kasvaimensisäisenä Proliferative ja apoptoottinen aktiivisuus

analyysi Ki67-positiivisten solujen markkeri kasvaimensisäisenä lisääntymisaktiivisuus paljasti, että gemsitabiini, bevasitsumabi, sunitinibin ja EMAP monoterapia aiheutti 34, 28, 82 ja 22 prosenttia eston proliferatiivinen indeksi. Yhdistelmät gemsitabiinin yhden tai useamman antiangiogeeniset aineet olivat tehokkaita, mutta ei lisännyt esto kasvaimensisäisenä proliferatiivinen indeksi pidemmälle tasot saavutetaan sunitinibipitoisuutta yksin (kuva 3).

Evaluation of kasvaimensisäisenä apoptoosin TUNEL-värjäys osoitti pieniä korotuksia apoptoosin gemsitabiini, bevasitsumabi ja EMAP, ja merkittävä kasvaa sunitinibin yksin. Yhdistelmät bevasitsumabi ja sunitinibin tai EMAP gemsitabiinin kanssa johti kohonneeseen apoptoosin verrattuna yksittäisinä aineina. Apoptotic indeksit (TUNEL-positiivisia soluja /yhteensä solu per HPF) kontrolleissa ja Gem, Bev, Su, EMAP, Gem + Bev, Gem + Su, Gem + EMAP ryhmät olivat 0,13 ± 0,03, 0,21 ± 0,06, 0,19 ± 0,03 , 0,47 ± 0,05, 0,18 ± 0,01, 0,26 ± 0,03, 0,53 ± 0,01 ja 0,25 ± 0,02, tässä järjestyksessä. Yhdistelmät useampia antiangiogeeninen aine gemsitabiinihoito kasvoi myös apoptoosia, mutta eivät olleet merkitsevästi tehokkaampi kuin sunitinibipitoisuutta yksinään (kuva 4).

Effects of Gemsitabiini Bevasitsumabilla, Sunitinibi ja EMAP päälle kasvaimensisäisenä mikroverisuonitiheys

PECAM-1 värjäys kasvainkudossektioista tutkia kasvaimen verisuoniston paljasti, että gemsitabiini, bevasitsumabi, sunitinibin ja EMAP aiheuttivat kaikki merkittävä väheneminen mikroverisuonitiheys verrattuna ohjaus (kuva 5). Sunitinibi yksin aiheuttama suurin vaikutus vähenee MVD kaikkien aineiden testattu. Yhdistelmät gemsitabiinin bevasitsumabin ja EMAP osoittivat lisäaineen vaikutuksia vähentämällä pienten suonten laskee verrattuna yksittäisinä aineina. Kaikki yhdistelmät sunitinibilla olivat erittäin tehokkaita, mutta ei ylittämään sunitinibille yksin vaikutuksia. Kaikki ryhmät arvioitiin keskimääräinen pienten suonten laskee lukien, valvonta (25,5 ± 3,5), gemsitabiini (14,2 ± 2,1), bevasitsumabi (11,8 ± 2,6), sunitinibia (5,0 ± 2,3), EMAP (11,1 ± 2,5), Gem + Bev (7,8 ± 2), Gem + Su (5,6 ± 1,1), Gem + EMAP (7,9 ± 1,7), Bev + Su (2,9 ± 1), Bev + EMAP (8,2 ± 1,5), Su + EMAP (5,2 ± 1,5), Gem + Bev + Su (3,9 ± 1), Gem + Bev + EMAP (5,5 ± 1,5), Gem + Su + EMAP (3,3 ± 0,6), ja Gem + Bev + Su + EMAP (2,9 ± 1), tässä järjestyksessä (kuva 5 ).

Effects of Gemsitabiini Bevasitsumabilla, Sunitinibi ja EMAP eläinten Survival

PDAC hiiren ksenograftin tutkimukset SCID-NOD-hiirillä johti eloonjäämismediaani 19 päivää kontrolliryhmässä. Eloonjäämismediaani (MS) lisääntyi hieman jälkeen gemsitabiini (26 päivää, p = 0,02), mutta ei ollut merkittävää vaikutusta kuolleisuuteen yhden aineen bevasitsumabia, sunitinibille tai EMAP verrattuna kontrolli. Yhdistelmähoito gemsitabiinin kanssa ainoana lääkkeenä bevasitsumabi, sunitinibin ja EMAP kaikki merkittävästi parantanut eläinten eloonjäämisen samassa laajuudessa, jossa mediaani eloon jäämisestä vuonna Gem + Bev ryhmä 36 päivää (p = 0,003 vs. kontrolli, 0,006 vs. Gem), kun Gem + Su 37 päivää (p = 0,003 vs. kontrolli, 0,01 vs. Gem) ja sen jälkeen Gem + EMAP 36 päivää (p = 0,002 vs. kontrolli, 0,001 vs. Gem). Yhdistelmä gemsitabiinin kanssa Su + EMAP (M.S. = 36 päivää) ei ollut parempi kuin yhdistelmä gemsitabiinin kanssa monoterapiana sunitinibille tai EMAP. Gemsitabiinin kanssa Bev + EMAP (ms = 43 päivää, p = 0,001 vs. kontrolli, 0,005 vs. Gem) tai Bev + Su + EMAP (46 päivää, p = 0,001 vs. kontrolli, 0,003 vs. Gem) osoitti maksimi eloonjäämishyötyä (kuva 6).

keskustelu

Haimasyöpä on erittäin huono ennuste johtuu myöhäisvaiheen diagnoosin varhainen metastaaseja ja korkea Säteilynsietotestin ja kemoterapiaa. Vaikka yksittäinen aine Gemsitabiinihoidon on tuottanut jonkin verran kliinistä hyötyä metastaattinen PDAC, yleinen eloonjäämishyötyä edelleen vähäistä [1]. Koska angiogeneesi on kriittinen primaarinen ja metastaattinen PDAC etenemisen, antiangiogeeninen hoito on järkevä ja silti lupaava terapeuttinen avenue koska sen mahdollisuudet synergistinen vuorovaikutus muiden antituumoriaineista, alhainen myrkyllisyys ja parannettu antituumorivaikutus [41], [42]. Useat kasvutekijät, kuten VEGF, fibroblastikasvutekijä (FGF), PDGF tai insuliinin kaltainen kasvutekijä (IGF) ovat tärkeimpiä angiogeenisten aktivaattorit on PDAC etenemistä. Bevasitsumabi, ensimmäinen FDA-hyväksytty angiogeneesinestäjän osoitti jonkin lupaaviksi aluksi PDAC tutkimuksissa yhdessä gemsitabiinin mutta ei vahvista mitään merkittävää eloonjäämishyötyä myöhemmissä tutkimuksissa [17]. Sunitinibin monikohteisen estäjä angiogeenisten RTK VEGFR, PDGFR, c-KIT, FLT-3 ja RET, on mielenkiintoinen aine koskevat sen yhdistelmähoidon potentiaali verrattuna kapea-taajuuksien estäjiä, jotka ovat tähän mennessä osoittaneet melko rajallisesti kliinistä aktiivisuutta. Tuloksemme osoittavat, että 1 .: yhdistelmä antiangiogeeniset aineet gemsitabiinihoito yleensä tuottaa parempia tuloksia kuin monoterapia; 2 .: vaikutuksia sunitinibi yksin voidaan varsin lausutaan ainakin kokeiltu malli; 3 .: useita yhdistelmiä antiangiogeeniset aineet lisäksi gemsitabiinin yleensä saadaan parhaat tulokset; ja 4 .: sunitinibin ja bevasitsumabin näytä olevan mitään selvää yhdistelmä hyötyä.

Kasvaimen eteneminen riippuu ratkaisevasti monimutkaisesta vuorovaikutuksesta useita komponentteja kuten kasvainsolujen, immuunisolujen, EC, soluväliaineen (ECM) ja tukikudosten fibroblasteissa. Solid kasvain hoito kohdistamalla n ja fibroblastien osastojen sisällä kasvain microenvironment on osoittanut joitakin merkittäviä etuja [43], [44]. EMAP, kasvaimeen johdettu antiangiogeenistä ja endoteeliä sytokiini, kokemuksemme kasvaintenvastaisia ​​vaikutuksia useissa kasvaintyypeissä, kuten PDAC [28], [30], [31], [34], [35], [45], [46] . Laajuus Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida parantaminen gemsitabiinin vasteen yhdistelmällä useampia antiangiogeeniset aineet, joiden koko kirjon erilaisia ​​mekanismeja PDAC. Esimerkiksi äskettäin osoittaneet, että EMAP parantaa gemsitabiini bevasitsumabin yhdistelmän vaikutuksia vastaan ​​PDAC [34]. Lisääminen multi-TKR kohdistaminen aine kuten sunitinibille ilmestyi siis järkevää. Gemsitabiini oli ero kasvua estävän vasteen PDAC soluissa in vitro. Gemsitabiini herkkyys nähtiin järjestyksessä BxPC-3 MIA PaCa-2 Pancin-1 AsPC-1, mikä osoittaa BxPC-3 herkin ja AsPC-1 vähiten herkät solut (kuvio S3). Ehkä tämä on melko hyödyllinen lähestymistapa, joka mahdollistaa testaus ylimääräisiä mekanismeja in vivo yhdistelmä hyötyä toisin PDAC linjat, jotka ovat gemsitabiini-herkkiä. Joukossa antiangiogeeniset aineet, bevasitsumabi ja EMAP yksinään ei ollut merkittävää vaikutusta AsPC-1 leviämisen, kun sunitinibi oli erittäin tehokas. Sunitinibille vaikutus oli voimakkaampi kuin ekvimolaarinen gemsitabiini, kun taas lisäksi kaksi tai useampia antiangiogeeniset aineet, ei ollut enemmän inhiboiva kuin sunitinibin yksin. Kuten odotettua, kaikki kolme antiangiogeeniset aineet estivät merkittävästi EY ja fibroblastien proliferaatiota in vitro, sunitinibilla jälleen yksin on tehokkain. Meidän tutkimuksissa, koska sunitinibia oli maksimi in vitro aktiivisuus kasvainsoluihin, EC ja fibroblastit, se tukee oletusta, että in vivo antituumoriaktiivisuuksia Sunitinibin voi osittain riippua sen vaikutusta tuumorisoluihin sekä kasvaimen verisuoniston ja peruskudoskomponentit, kuten aiemmin raportoitu [20],. Mendel et al. [20] osoittivat, että sunitinibi IC

50 VEGF- ja PGDF aiheuttaman HUVEC oli joka nanomoolialueella. Suhteellisen heikko aktiivisuus Sunitinibin havaittiin esillä olevassa tutkimuksessa; oletamme, että tämä johtuu siitä, että käytön koko kasvualustan HUVEC, joka voi saattaa solut vastustuskykyisiä tyrosiinikinaasia estäviä vaikutuksia. Nämä tulokset tukevat käsitystä, että etuja voidaan saada yhdistelmä usean kohdentamisaineita yli aineita, joilla on rajallinen tavoitteita yksinään tai niiden lisäksi. Gemsitabiini ja Sunitinibin on osoitettu aiheuttavan apoptoosia kasvainsoluissa sekä endoteelisolujen [49], [50], [51], [52], kun taas bevasitsumabi ja EMAP pääasiassa on proapoptoottiset aktiivisuutta endoteelisolujen [28], [53 ]. Esillä olevassa tutkimuksessa, arviointi induktion apoptoosin gemsitabiini ja antiangiogeeniset aineet, joko yksin tai yhdistelmänä, oli korreloi solujen proliferaation tulokset osoittavat, että menetys solujen elinkelpoisuuden nämä aineet voivat osittain johtua induktion apoptoosin.

In vivo hiiren ksenografti tutkimukset osoittivat, että gemsitabiini, bevasitsumabi, sunitinibin ja EMAP esti paikallisen kasvaimen kasvua yksittäisenä aineena. Antituumorivaikutukset bevasitsumabi ja EMAP todennäköisemmin johtuen niiden vaikutusta hankittua ja fibroblasteissa sijaan kasvaimen soluihin, ja sen mukaisesti, vaikutus näiden aineiden monoterapiana oli rajallinen.