Krooninen sairaus

tiivistelmä

syövän etenemiseen varmaa muutoksia ydin- matriisin (NM) proteiini koostumus sekä kromatiinirakenteeseen esiintyä. NM vuorovaikutuksessa kromatiinin kautta erikoistuneiden DNA-sekvenssit kutsutaan matriisikiinnitysalueet alueet (mars). Esillä olevassa tutkimuksessa käyttämällä proteomic lähestymistapaa yhdessä kaksiulotteinen Lounais määritys ja konfokaali laser mikroskopian, osoitamme, että erilaistumista vakiintunut ihmisen eturauhasen syöpä solujen viitoittamaa muutoksilla sekä NM proteiinikoostumus ja sidos NM proteiinien ja mars. Hyvin erilaistunut androgen-reagoiva ja hitaasti kasvava LNCaP-soluja on tunnusomaista vähemmän monimutkaisia ​​kuvioita ja suuri määrä proteiineja sitovien MAR sekvenssit verrattuna 22Rv1 solut, jotka ilmentävät androgeenireseptorin mutta androgeenin riippumaton. Lopuksi huonosti eriytetty ja voimakkaasti aggressiivinen androgeenista riippumaton PC3-solujen monimutkaisuudesta NM kuvio lisäkorotukset ja vähäisen määrän proteiineja sitovat mars. Lisäksi tässä solulinjassa suhteen LNCaP, nämä muutokset ovat synkronissa muutoksia sekä ydin- jakautuminen MAR sekvenssit ja keskimääräisessä silmukka ulottuvuuksia merkittävästi. Vaikka ilmaus monista NM proteiinien muutoksia dedifferentiaation aikana, vain hyvin rajallinen joukko MAR sitovien proteiinien näyttävät avainasemassa tässä prosessissa. Vaihtelut ilmentymisen poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) ja erityinen AT-rikas sekvenssi-sitova proteiini-1 (SATB1) yhdessä kasvua fosforylaation lamiini B edustavat muutoksia, jotka voivat laukaista kulkua kohti aggressiivinen fenotyyppi . Nämä tulokset viittaavat siihen, että valaisemaan MAR-sitovia proteiineja, jotka osallistuvat erilaistumista eturauhassyöpäsolujen voisi olla tärkeä väline parantaa ymmärtää tämän syövän synnyn prosessia, ja ne voivat myös olla uusia kohteita eturauhassyövän hoidossa.

Citation: Barboro P, Repaci E, D’Arrigo C, Balbi C (2012) The Role of Nuclear matriisiproteiineista Sitoutuminen Matrix Attachment alueiden (mars) in Eturauhassyöpä Cell Differentiation. PLoS ONE 7 (7): e40617. doi: 10,1371 /journal.pone.0040617

Editor: Kaustubh Datta, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 joulukuu 2011; Hyväksytty: 11 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 11 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Barboro et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Ligurian alue (www.regione.liguria.it), apurahan numero 563/2009; Compagnia San Paolo (www.fondazioneintesasanpaoloonlus.org), avustuksen määrä 2009,127; Ministero dell’Universita ”e Ricerca SCIENTIFICA – MIUR (www.prin.miur.it) hanke PRIN myöntää numero 2005065404-003. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Epänormaali ydin- organisaatio ja muutoksia määrää ja jakautumista heterochromatin on pitkään tunnustettu tunnusmerkkejä ihmisen syövän [1]; kuitenkin tällä hetkellä emme tiedä tarkat syyt näiden muutosten emmekä tiedä miten toiminta /hiljentäminen tuhansien geenien on järjestettyjä. Eukaryooteissa, genomi on lokeroitu osaksi kromatiinin domeenien kiinnitys kromatiinin tukirakenteeseen: ydin- matriisin (NM). Välinen vuorovaikutus chromatin ja NM tapahtua AT-rikas DNA-sekvenssit kutsutaan matriisikiinnitysalueet alueet (mars). Mars toiminto useissa prosesseissa myös järjestämällä kromatiinin silmukoita, augmenting geenien ilmentymistä ja helpottamaan replikointi [2]. Kaikkia mahdollisia Mars sidotaan NM tai osallistua järjestämiseen silmukka kiinnitys alueilla. MAR sitoutuminen on dynaaminen tapahtuma, joka on solutyyppi ja /tai solusyklin riippuvaisia ​​ja voivat sallia asetuksen kaukaisten geenien koordinoidusti [3]. Useat MAR-sitovia proteiineja on tunnistettu, joista jotkin ovat dramaattisesti purettu kasvainsoluissa. Usein niiden ilmentyminen myös korreloi merkitsevästi aggressiivinen kasvain fenotyyppejä. Samoin muutoksia väliseen vuorovaikutukseen NM proteiinien ja Mars saattavat liittyä laajamittaiseen chromatin uudelleenjärjestelyä havaittu syövän synnyn. Tämä on saanut yhä kiinnostuneempia Mars ja MAR sitovien proteiinien mahdollisina kohteina antineoplastiset lääkkeet [2].

Viime aikoina olemme osoittaneet, että alkuvaiheessa rotan maksan Karsinogeneesin laajamittainen chromatin uudelleenjärjestely on liittyvät morfologiset ja proteiinikoostumus korjauksilla NM. Nämä muutokset muuttavat kykyä NM proteiinien sitoutua RNA: ta ja DNA: ta sisältävässä MAR-sekvenssit [4]. Lisäksi nämä muutokset ovat synkroninen muutoksiin järjestämiseen lamins että nucleoplasm. Normaalissa maksasoluissa, lamins kootaan säikeet, jotka muodostavat ortogonaalisen ristikko, kun taas muuttaneet hepatosyyteissä kaksiulotteisessa paikallista tilaus katoaa [5].

Eturauhasen karsinooma (PCA) on suuri terveysongelma, koska sen esiintyvyys kasvaa edelleen, ja ei ole biomarkkerit tällä hetkellä pysty erottamaan veltto kasvaimia aggressiivisia niistä. Androgeeniablaatio on yleisin terapeuttinen lähestymistapa PCa. Valitettavasti muutaman vuoden hoidon tauti etenee useimmilla potilailla, jotka sitten saavat androgeenista riippumaton fenotyyppi, jolle ei ole olemassa hoitoja saatavilla [6]. Ymmärrystä polkuja, jotka johtavat androgeeniriippumattomuuteen on siksi ratkaisevan tärkeää kehittää uusia hoitoja. Työ suoritetaan laboratoriossamme ym etsiä PCa markkereita on parannettu ja ennustavia ominaisuudet havaittiin useita NM proteiineja, joita ekspressoituu differentiaalisesti PCa suhteessa kuin kasvainkudoksen; Lisäksi muutama proteiinit korreloi merkitsevästi kasvaimen aggressiivisuus ja /tai riskin biokemiallisten etenemisen [7], [8].

Tässä tutkimuksessa käytimme proteomic lähestymistapa yhdessä kaksiulotteinen Southwestern blotting (SWB ) ja konfokaali analysoi luonnehtia sidos NM proteiinien ja mars kolmessa ihmisen PCa solulinjoissa, jotka edustavat malleja eri vaiheissa PCa etenemistä: hyvin eriytetty androgen reagoiva LNCaP-solulinjasta, väli-erilaistua 22Rv1 solut, jotka ilmentävät androgeenireseptorin (AR ) mutta androgen riippumaton ja lopuksi huonosti eriytetty ja voimakkaasti aggressiivinen PC3, joka ei ilmennä AR. Nämä solulinjat ovat hyvä malli järjestelmä tutkia PCa etenemistä, koska yli 70%: n NM proteiinien ilmaistuna täsmää eristetty PCa kudoksista [9]. Täällä voimme tarjota todisteita siitä, että on olemassa käänteinen suhde monimutkaisuus NM proteiinikoostumus ja luokka erilaistumisen solulinjan ja että NM vuorovaikutus MAR sekvenssit muutu erilaistumisen, joka muuttaa chromatin loop mitat ja siten geenin ilmentymistä.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

LNCaP, 22Rv1 ja PC3 eturauhaskarsinooman solulinjat saatiin ATCC: ltä (CRL-1740, CRL-2505 ja CRL-1435, vastaavasti; Rockville, MD, USA) ja pidettiin RPMI-1640 ilman fenolipunaista (Celbio, Milano, Italia), joka sisältää lämmöllä inaktivoitua 10% naudan sikiön seerumia (puuhiilellä puhdistettua), 1% penisilliini, 1% streptomysiiniä ja 1% glutamiinia. LNCaP ja 22Rv1 väliaine lisättiin myös 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvaattia ja 4,5 mg /ml glukoosia. Kanavan numerot, jotka LNCaP-solut lisätty elatusaineeseen vaihteli välillä 24 ja 34. Soluja viljeltiin yksikerroksisen läsnä ollessa 0,1 nM 5-α-dihydrotestosteronin (SIGMA, St. Louis, MO, USA) 37 ° C: ssa 5% CO

2. Kaikki kokeet suoritettiin käyttäen soluja eksponentiaalista kasvuvaiheessa.

eristäminen NM

yksi- tai kaksiulotteinen polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (1D tai 2D-PAGE), NM oli eristettiin Barboro

et ai

. [10]. Proteiinikonsentraatiot määritettiin käyttäen Bio-Rad (München, Saksa) proteiini mikrokoetta naudan seerumin albumiinia standardina. Sillä konfokaalimikroskopia, NM uutettiin

in situ

kuten on kuvannut Zeng

et al

. [11].

(A) edustaja Deep Purple-värjätty 1D geeli ja vastaavan SWB. Nuolet oikealla osoittavat kolme pääasiallista bändejä kertyy 1D SWB, joista kukin vastaa useita paikkoja 2D kuin ilmeistä (D), (F) ja (H). (B) Vertailu välinen suhteellinen määrä Xmnl sitoutumisen NM proteiinien eri solulinjoissa. Ordinaatta edustaa keskiarvoa ± SE: n suhteelliset määrät Xmnl määritettynä kvantitatiivinen analyysi kolmen eri valmisteissa. Väheneminen 22Rv1 ja PC3 suhteen LNCaP oli merkitsevä (* P = 0,004, ** P 10

-5). (C, E ja G) edustaja 2D hopealla värjätyn geelin karttoja ja (D, F ja H) SWB NM proteiinien uutettu LNCaP (C, D), 22Rv1 (E, F) ja PC3 (G, H) soluja. Proteiinit tunnistettiin on korostettu punaisella laatikoihin. Kolme nuolet osoittavat kolmeen ryhmään proteiinien korostanut (A). L, lamiinivektori; h, hnRNP, fr, fragmentteja.

valmistaminen DNA Probe

erittäin toistuva DNA-sekvenssi 370 bp (Xmnl) saatu S /MAR tapahtuma tietokanta [http: //smartdb.bioinf.med.uni-goettingen.de] release 2.3 (hakunumero SM0000134) käytettiin koettimena DNA: ta sitovan kokeissa. Xmnl on AT-rikas DNA-sekvenssin sisällä pohja-Parin alue (BUR) ja pystyy sitoutumaan samaan proteiineja, jotka sitovat MAR-sisältävä DNA yhteistyössä eristettiin NM, kuten olemme aiemmin osoittaneet, [4]. Plasmidi pUC57 kanssa Xmnl sekvenssi muodostettiin GenScript Corporation (Piscataway, NJ, USA).

Escherichia coli

TOP F10 ”transformoitiin pUC57, ja transformoidut solut valittiin agarmaljoilla täydennetty ampisilliinia. Plasmidit eristettiin käyttäen Qiagen Plasmid Maxi kit, rajoitus-pilkottiin

Xmnl

I ja sen jälkeen geeli-puhdistettiin agaroosigeelistä käyttämällä High Pure PCR-tuotteen puhdistuskittiä (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa).

DNA-näytteet biotinoitiin nick translation menettely (BioNick DNA Labeling System, Invitrogen /Life Technologies, San Diego, CA). Yhtiöimätön nukleotidit poistettiin näytteestä käyttäen Sephadex G-25 -fuugipylväässä (Roche Diagnostics).

Nuclear Halo valmistelu ja Halo-fluoresenssi in situ hybridisaatio (FISH) Technique

Nuclear halos valmistettiin menetelmän mukaisesti de Belle

et ai

. [12] pienin muutoksin. Lyhyesti, LNCaP ja PC3-solut pestiin kaksi kertaa fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja tumat uutettiin inkuboimalla soluja 100 mM KCI, 300 mM sakkaroosi, 10 mM PIPES, pH 6,8, 3 mM MgCI

2, 0,5% Triton X-100: 4

°

C: ssa 20 min. Sitten 3 x 10

5 tumat Cytospin dioja 10 minuutin ajan 100 x

g.

Objektilasit upotettiin 4 min liuoksessa, joka sisälsi 2 M NaCl, 10 mM PIPES, pH 6,8 ja 10 mM EDTA: a ja huuhdeltiin sitten 2 min sarja 10X, 5X, 2X ja 1 x PBS, pH 7,4. Kiinnityksen jälkeen 3,7% formaldehydiä PBS: ssä, DNA värjättiin DAPI ja suhteellinen halo koko kunkin ytimen määritettiin raportoitu Guillou

et ai

. [13].

(A) Venn-kaavio, joka esittää useita proteiinin paikkoja visualisoida kustakin solulinjasta. Numerot päällekkäiset alueet edustavat yhteisiä paikkoja. (B-D) Piirakkakuviot kertoo prosentuaalisen paikkoja, jotka sitovat Xmnl järjestyksessä kolmessa solulinjoissa. Värit syaani ja keltainen, merkitsevät paikkoja, jotka olivat, suhteen LNCaP, toisin ilmaistu tai ilman eroa, vuonna 22Rv1 (C) tai PC3 (D), tässä järjestyksessä.

Tutkia jakelu n Xmnl sekvenssit nukleoidien, halo-FISH tekniikkaa on sovellettu. Sen jälkeen, kun halogeeni kopiointi ja kiinnityksen jälkeen levyt inkuboitiin 70% formamidia, 2 x suolaliuos-natriumsitraatti (SSC) ja 50 mM natriumfosfaattia, pH 7,0 73 ° C: ssa 3 min, jota seurasi 50% formamidia, 2 x SSC: ssä ja 50 mM natrium- fosfaatti, pH 7,0, 73 ° C 1 min. Hybridisaatioseos (4 ng /ul biotinyloitua Xmnl koetin, 2x SSC, 1 mg /ml kilpailija-DNA, 10% dekstraanisulfaattia ja 25% formamidia), sen Lämpödenaturoitu erikseen 5 minuutin ajan 73 ° C: ssa, jäähdytettiin nopeasti jäällä ja sovellettu näyte. Sen jälkeen kun oli inkuboitu yön yli 37 ° C: ssa, levyt pestiin kolme kertaa 50% formamidia ja 2 x SSC, pH 7,0, 42 ° C: ssa 5 min, jota seurasi vielä kolme pesua 0,1 x SSC 60 ° C: ssa 5 min. FISH havaitseminen suoritettiin streptavidiinilla konjugoitu CF

TM555 (1:100 laimennus, Biotium, Hayward, CA), kun koko DNA vastavärjättiin DAPI. Näytteet analysoitiin valomikroskoopilla käyttämällä Leica DM LB2 epifluoresenssimikroskooppia (Wetzlar, Saksa) varustettu 40x tavoite. Kuvat otettiin Olympus DP70 kamera ja käsitelty WCIF ImageJ v1.43 ohjelmisto (https://www.uhnresearch.ca/facilities/wcif/imagej/).

geelielektroforeesi

1D ja 2D-PAGE: n NM-proteiinien suoritettiin, kuten on aiemmin kuvattu [14]. Geelit joko värjättiin proteiinimalli analyysiä tai tuotettu Western blot (WB) tai SWB. Lamiinivektori B fosforyloitumismallia suoritettiin multipleksoidun proteomiikka-analyysi. Geelit aluksi inkuboitiin Pro-Q Diamond (Molecular Probe Inc., Eugene, OR, USA), fosfoproteiinia väriaineella, jonka jälkeen inkuboitiin SYPRO Ruby värillä (Molecular Probe Inc.) kokonaisproteiinista visualisointi, suosittelema valmistaja.

SWB ja WB menettelyt

SWB suoritettiin, kuten aiemmin on raportoitu [4]. Lyhyesti, 1D tai 2D-PAGE-geeli on sähkön avulla Hybond-P-membraanille (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Kaivoa inkuboitiin puskurissa A (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl

2 ja 0,5% Tween-20) 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ja sitten niitä inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa samaa puskuria, joka sisälsi 50 ng /ml DNA-koetin ja 500-kertainen ylimäärä ei-spesifistä kilpailija (sonikoitua sillin sperman DNA: ta). Membraani pestiin sitten kolmeen kertaan puskurilla A aikana 60 min. Ennen ilmaisua, membraanit tutkittiin biotinyloitua DNA: ta inkuboitiin 30 minuuttia piparjuuriperoksidaasi-entsyymiin liitetyn streptavidiinin kanssa (Invitrogen, Carlsbad, CA) laimennettuna 1:1200 puskuriin A ja pestiin sitten neljä kertaa samalla puskurilla 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa . Ei-radioaktiivinen havaitseminen DNA sitoutuneen NM toteutettiin parannetun ECL Plus Western-blottaus Reagenssit ja paljastettiin käyttäen Hyperfilm ECL (GE Healthcare) kanssa samoissa altistusolosuhteissa.

noi edustavat keskiarvoa ± SE suhteellisia määriä näiden proteiinien määritettynä kvantitatiivinen analyysi kolmesta kuuteen Wbs suorittaa käyttäen vähintään kolmea eri valmistamiseksi NM (* P≤0.05; ** P 0,0005). Edustavia WBS näkyvät oikealla; suuret proteolyyttisiä fragmentteja PARP1 ja SATB1 on merkitty koko pisteillä. Suhteellinen molekyylipainot standardin proteiinien kDa raportoidaan.

WB, proteiinit erotetaan 1D tai 2D-PAGE siirrettiin Hybond-P-membraanille (GE Healthcare), ja immunologinen suoritettiin käyttämällä vasta-aineita, on esitetty taulukossa 1. Immunoreaktiiviset pilkkuja tai vyöhykkeet havaittiin käyttäen ECL. Jälkeen 1D WB-analyysi, suhteellinen määrä kunkin tutkittavan proteiinin saatiin normalisoimalla integroitu optinen tiheys ECL integroitu optinen tiheys kokonaismäärästä NM proteiinien määritetään Deep Purple värjäytyminen geeli kuten aikaisemmin on kuvattu [4]. Lyhyesti, yhtä suurina määrinä (8 ug) saman valmisteen lastattiin kahteen 1D-PAGE-geeleissä ja elektroforeesi. Yksi Geeli värjättiin Deep Purple ja densitometristen skannaa tehtiin Molecular Imager FX skanneri (Bio-Rad) ja kokonaismäärät proteiinia (

) arvioitiin integroimalla optisen tiheyden käyrä. Toinen geelistä ja immunoreaktiivisia vyöhykkeet havaittiin käyttäen Hyperfilm ECL kalvoja (GE Healthcare), joilla on lineaarinen vaste valoa tuotetaan parannettu kemiluminesenssin. Suhteelliset määrät proteiineja varamies saatiin normalisoimalla integroitu optinen tiheys ECL (

B

) integroituun optinen tiheys (

) vastaavasta Deep Purple-värjätyn geelin. Tämä menetelmä antoi meille mahdollisuuden saada kvantitatiivisia tuloksia. Vertailu suhteelliset määrät proteiinien suoritettiin viemällä yksittäinen arvoja kunkin elokuvan ja analysoimalla niitä käyttämällä Studentin t-testiä sisällä OriginPro 7.5 ohjelmiston.

Kuva-analyysi 2D geeli Spot Patterns

Kaikki hopeavärjätyn 2D geelit digitoitiin, joissa on GS-800 densitometrillä (Bio-Rad) käyttäen samaa skannaus olosuhteissa. Spot havaitseminen, geeli yhdenmukaistaminen ja normalisointi suoritettiin käyttäen ohjelmistopakettia PDQuest (Ver. 7.3.0, BioRad). Ero analyysi suoritettiin ryhmittelemällä 2D geelit kolmeen luokkaan, joista kukin sisältää viisikymmentäkuusi yli viisi geeleillä neljästä viiteen eri NM valmisteet eristettiin LNCaP tai 22Rv1 tai PC3-soluja. Toistettavuus geelien ilmaistuna keskimääräisinä prosenttiosuuksina sovitetun paikkoja kussakin luokassa ± SD, oli 87 ± 5% LNCaP, 83 ± 3% 22Rv1 ja 83 ± 1% PC3. Mann-Whitneyn testiä käytettiin havaitsemaan ali- tai ilmaistuna paikkoja; P 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä ja vain proteiinitäplien jonka ilmentyminen oli 2-kertainen tai enemmän vapautettu analysoitiin. Kompensoimiseksi hienoisia eroja näyte lastaus ja geelivärjäys volyymi kunkin täplän normalisoitiin mukaan kokonaismäärä, voimassa paikkoja jokaisessa geeli.

PDQuest analyysin ohjelmisto käytettiin myös havaitsemaan proteiineja, jotka sitovat vasta-aineiden 2D WB sovittamalla antigeeni paikkoja autoradiografit proteiinin paikkoja replica 2D SWB.

(A, D) Koko solut värjätään kaksivärinen immunofluoresenssimenetelmällä. (B, E) NM valmistettu

in situ

ja värjätään immuno-FISH. (A, B) -konfokaalimikroskoopilla analyysi lokalisoinnin PARP (vihreä) ja DNA: n tai Xmnl sekvenssi (sininen). (D, E) lokalisaatio SATB1 (vihreä) ja DNA: n tai Xmnl sekvenssi (sininen). Pohjaan paneelien B ja E intensiteetti profiilin viivapyyhkäisyt, suoritetaan välillä valkoisen ristit NM osoittamiin konfokaali Yhdistämisen kuvien B ja E, on esitetty. Ordinaatta edustaa fluoresenssin voimakkuutta mielivaltaisina yksikköinä, abskissa edustaa etäisyys pikseleinä. Palkit vastaavat 5 pm. (C, F) sirontakaavioissa osoittaa määrällisesti analyysit rinnakkaispaikantumisen PARP /DNA: ta (a), PARP /Xmnl (b), SATB1 /DNA: ta (a), tai SATB1 /Xmnl (b), vastaavasti. R vastaa Pearsonin korrelaatiokerrointa; M1 osa proteiinin tutkitaan päällekkäin DNA tai Xmnl ja M2 ovat osa DNA: n tai Xmnl päällekkäin proteiinia. Vaakaviivat esittävät keskiarvoja ± SE 20 kenttien (122-226 yhteensä NMS) kopioidaan kahdessa eri kokeessa (* P≤0.03, ** P 0,001).

CLSM ja Image Analysis

koko LNCaP ja PC3-solujen, analyysi spatiaalinen suhde proteiinien tutkittavana ja kokonais-DNA suoritettiin kaksivärinen immunofluoresenssivärjäyksen kuten aiemmin raportoitu [15]. Proteiinit leimattiin käyttäen primaarista vasta-ainetta vastaan ​​joko erityisiä AT-rikas sekvenssi-sitova proteiini-1 (SATB1) (1:20 laimennus, Santa Cruz) tai poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) (01:50, Santa Cruz) CF

TM555 vuohen anti-kani-IgG: tä (1:200 laimennus, Biotium) toissijaisena vasta-ainetta, kun taas DNA leimattiin 5 uM SYTOX Orange (Molecular Probes). Jotta tutkia vuorovaikutukset NM proteiinien ja MAR sekvenssit, suoritimme immunologiseen kala NM uuttaa suoraan liukuu noudattamalla edellä kuvattua menettelyä. Tämä immuno-FISH tekniikalla mukana samanaikaisesti värjäys NM proteiinien ja DNA-sekvenssit ja koostuu kahdesta osasta. Ensimmäisessä osassa (FISH), MAR sekvenssit visualisoitiin käyttäen Xmnl biotinyloitu koetin yllä kuvatut (katso kohta halo-FISH). Toisessa osassa, NM proteiinit havaittiin immunofluoresenssilla käyttäen kaniinin anti-SATB1 (1:15 laimennus, Santa Cruz), kanin anti-PARP (01:40, Santa Cruz) tai vuohen anti-Lamin B (1:20 laimennus , Santa Cruz). Immunolokalisoinnissa proteiini-MAR-kompleksit tehtiin käyttäen cocktail leimatut sekundääriset vasta-aineet (CF

TM633 anti-kani-Ig, 1:100 laimentaminen ja Alexa 488 anti-vuohi-Ig, 1:100 laimennos) ja konjugoidun streptavidiinin kanssa CF

TM555 (1:100 laimennus). Kaikki confocal kuvat kerättiin mukainen Nyquistin kriteerin 3D-aineistoja (z-pinot), jossa vaiheen koko on 250 nm käyttäen Olympus FV-500 laser skannaus -konfokaalimikroskoopilla varustettu 60 x /1,4 NA öljy-immersio-objektiivi. Kuvankäsittely ja kolokalisaation analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [15] käyttämällä WCIF ImageJ v1.43 ohjelmisto, joka tarjoaa sekä Pearsonin korrelaatiokerroin (R) ja toinen esiintyminen Mandersin kertoimet (M1 ja M2).

(A) edustaja -konfokaalimikroskoopilla kuvia Lamin B (punainen) ja Xmnl järjestyksessä (sininen) on NM uutettu

in situ

ja värjätään immuno-FISH. Palkit vastaavat 5 pm. (B) Suurennettu osa 2D-PAGE värjätty SYPRO Ruby (a, c) tai Pro-Q Diamond joka selektiivisesti värjää vain fosfopro- (b, d). Nuolenpäät osoittavat eri isoformien lamiinivektori B. sama väri vastaa samaa isoformi kahdessa solulinjassa. PC3-soluissa, ei-fosforyloitu peptidi läsnä LNCaP katosi (punainen arrowheads).

Tulokset

Expression of NM Proteiinit Binding Mars Riippuu Differentiated State Eturauhassyövän Cell Line

NM uutetut proteiinit LNCaP, 22Rv1 ja PC3-solut erotettiin 1D-PAGE ja näytön sitoutumaan Xmnl-sekvenssi suoritettiin. Kaikissa solulinjoissa tutkittiin kolme eri proteiineja (keskitetty noin 107, 71 ja 55 kDa, vastaavasti), joka sitoutuu voimakkaasti DNA havaittiin (Fig. 1A, nuolet). Ei laadulliset muutokset olivat tuntuvia joukossa kolme solulinjojen; kuitenkin, määrä DNA: ta sitovan NM proteiinit oli huomattavasti korkeampi vähiten aggressiivinen solut (Fig. 1 B).

(A) edustaja nukleoidien värjättiin joko DAPI (sininen) visualisoimiseksi vain kokonais-DNA (vasemmanpuoleiset paneelit ) tai halo-FISH Korosta Xmnl sekvenssi (punainen) ja vasta- värjättiin DAPI havaita kokonais-DNA (sininen) kantavassa palkki vastaa 10 um. (B) Scatter graafinen esitys, jakelu DNA halo koon. Vaakasuorat viivat osoittavat saatuina keskiarvoina mitataan kullekin solulinjan vähintään 100 nukleoidien. Keskimääräinen DNA halo koko ± SE oli 6,8 ± 0,2 LNCaP ja 7,5 ± 0,2 PC3-soluissa, vastaavasti (p = 0,009). Pohja paneeli esittää frekvenssijakautuman halo säteiden ryhmitelty välein 2 um. (C) Kaavamainen malli keskinäisistä suhteista silmukat ja NM että erilaistamattomuuden Eturauhassyövän soluja. Useammassa-erilaistuneita soluja (LNCaP) NM on hyvin järjestetty useita sitoutuneet proteiinit MAR sekvenssit. PC3, jossa joitakin rakenteellisia säännönmukaisuuksia ja NM katoavat, pienempi määrä proteiinia, jotka ovat sitoutuneet Mars ja niin suuremman DNA-silmukka on ankkuroitu NM.

polypeptidejä, olemme edelleen tunnettu ilmaus NM proteiinien 2D-PAGE ja sen jälkeen 2D SWB analyysi. Yleinen ekspressioprofiileja saatu 2D geelit olivat melko samanlaiset; kuitenkin, analyysi perusteellisesti osoitti, että monimutkaisuus proteiinimalli oli käänteinen palkkaluokkaan solujen erilaistumisen. PC3-solut osoittivat monimutkaisempi NM-proteiinin rakenteessa ja 22Rv1 näytetään väli- kuvio välillä LNCaP ja PC3-solut (Fig. 1 C, E ja G). Keskimäärin 725 proteiinitäplien havaittiin NM eristetty LNCaP (vaihteluväli 598-781), 847 (vaihteluväli 808-909) välillä 22Rv1 soluista ja 918 (vaihteluväli 727-1142) alkaen PC3 soluista. Venn kaavio kerrotaan kuviossa. 2A osoittaa, että suurin osa paikoista visualisoida 2D-PAGE ottelun kolmella solulinjoissa, yhteisymmärryksessä seurauksena jo raportoitu, että yli 70% NM proteiinit ovat yhteisiä välillä solulinjoja ja PCa kudoksia; nämä proteiinit ovat osa NM solutyyppispesifisten [9], [16]. Pilkut toisin ilmaistu 22Rv1 ja PC3, suhteessa LNCaP olivat 98 ja 155, tässä järjestyksessä. Erityisesti 22 paikkoja oli yli-ilmentynyt ja 76 oli alle ilmaistu 22Rv1 soluissa ja 98 yli-ilmentynyt ja 57 oli alle ilmaistaan ​​PC3. Tämä havainto vahvistaa aiemmat tulokset osoittavat, että NM proteiinimalli tapahtuu muutoksia solujen erilaistumista [16] ja kasvaa monimutkaisuutta siirtyminen enemmän-vähemmän erilaistunut kasvaimia [7], [8], [17].

Kun 2D geelit analysoitiin SWB, useat NM proteiineja vahvasti sidottu Xmnl sekvenssi (Fig. 1D, F ja H). Sidos oli sekvenssi-spesifinen sijasta spesifinen (sähköstaattinen) vuorovaikutus, koska inkuboinnin jälkeen kalvot yön yli 2 M NaCl sitoutuminen oli vielä havaittavissa (tuloksia ei ole esitetty). Mukaisesti 1D-analyysi, maailmanlaajuinen väheneminen DNA-sitoutumista todettiin funktiona solujen erilaistumisen: noin 136 MAR-sitova täplät visualisoitiin LNCaP, 79 22Rv1 ja 63 PC3-soluissa. Kokonaisuutena tämä analyysi osoittaa, että kasvu monimutkaisuus NM proteiinimalli tapahtuu samanaikaisesti laskua määrästä proteiinien sitovan Xmnl järjestyksessä. Todellakin, nämä jälkimmäiset olivat 19, 9 ja 7% koko NM proteiinin ilmaistu LNCaP, 22Rv1 ja PC3-soluissa, vastaavasti (kuvio. 2 B-D).

Pääasiallinen Xmnl sitova täplät tunnistettiin WB ja niin se oli mahdollista antaa identiteetin proteiinit havaitaan 1D SWB. Ensimmäinen ryhmä, suuremmilla molekyylipainon, vastaa yhteistyössä kulkeutumista PARP1, heterogeeninen ydin- ribonukleoproteiini- (hnRNP) U, Marpa ja Matrin3; toinen ryhmä vastaa MARPb, Lamin A, lamiinivektori B ja hnRNP M; ja kolmas ryhmä vastaa PARP2, hnRNP I hnRNP K ja fragmentit PARP1 ja SATB1.

Vertailu joukossa 2D SWBs eri solulinjojen varamies osoittavat, että sen lisäksi muuttamista määrä proteiineja ilmaisi myös signaalin voimakkuuden DNA: ta sitovaa joidenkin niiden muutoksia. Mitä enemmän ilmeinen muutokset olivat välillä LNCaP ja PC3-solut taas, myös tässä tapauksessa, käyttäytyminen 22Rv1 soluissa oli väli. Siksi seuraavat analyysit tehtiin vertaamalla kahden solun useamman erilaisen eli LNCaP vs. PC3.

Expression ja lokalisaatio PARP ja SATB1 Riippuu viety erilaistuminen Eturauhassyövän Cells

PC3-solujen suhteen LNCaP, signaalin voimakkuus DNA sitoutumisen Matrin3, SATB1 fragmentti, hnRNP U ja kaikki perus hnRNPs vähentynyt. Tämä lasku voi johtua alas-ilmentymisen perus hnRNPs (jotka olivat 57 paikkoja havaittiin olevan alle ilmaistuna PC3-solut), muutos suhde ilmentymisen eri isoformien (esimerkiksi hnRNP U ja Matrin3) tai eri mallia pirstoutuminen (varten SATB1). Päinvastoin, ilmaus PARP2, Marpa ja MARPb lisääntynyt. Vaikka nämä kaksi jälkimmäistä proteiinit olivat läsnä niin pieni määrä, että ne usein ei havaittu hopeavärjäyksellä (kuvio. 1C ja G), ne sitovat erittäin voimakkaasti mars. Valitettavasti, kuten on jo raportoitu [4], Marpa ja MARPb ole tunnistettavissa vielä ja ne ovat erittäin todennäköisesti uusia tuntemattomia proteiineja. Olemme kuitenkin määrällisesti proteiinien ekspression, että differentiaalisesti sidottu Xmnl sekvenssin 1D WB-analyysillä käyttäen kaupallisesti saatavilla olevia vasta-aineita.

kaavioita esittäen suhteellisia määriä proteiineja ja edustavia WB kokeissa on esitetty kuvassa. 3. hnRNP U ja Matrin3 vain suuntauksena laskua voidaan havaita PC3 suhteessa LNCaP; päinvastoin, sekä PARP ja SATB1 tehdään merkittäviä muutoksia niiden ilmaisua. Korkeampi PARP ekspressiota havaittiin PC3-soluissa, ja proteiini oli sen alkuperäisessä tilassaan, ja vain pieni määrä (noin 19%) on ominaista jakautuminen 89 kDa [18] havaittu. Korkeampi tämän proteiinin ilmentymisen PC3-soluissa (joka edustaa aiempaa erilaistumaton ilmiasuun nähden LNCaP) on yhtä mieltä käänteinen korrelaatio solujen erilaistumisen ja PARP-aktiivisuutta [18].

Suhteen SATB1, kaksi johtavaa bändejä lähes yhtä intensiteetti 89 (natiivi SATB1) ja 54 kDa ovat havaittavissa LNCaP. PC3-soluja, ilmentyminen täyspitkän proteiinin vähenee ja kolme fragmenttia 62, 54 ja 43 kDa: n läsnä. Lisäksi intensiteetti nämä kolme juovaa pienenee 60% suhteessa ehjä SATB1, mikä osoittaa, että ei ollut ainoastaan ​​proteiinin eri ilmaistaan ​​kahden solulinjoja, mutta että sekä intensiteetti ja kuvio pirstoutuminen olivat erilaiset ja (Fig. 3). Yleisin SATB1 hajoamistuotteet ovat kaksi fragmenttia noin 70 ja 30 kDa [19], vaikka muita fragmentteja, joiden molekyylipaino hyvin lähellä havaittu kokeissa, on myös esitetty [20], [21]. Polyklonaalinen vuohen vasta-ainetta käytettiin tässä tutkimuksessa tunnistaa SATB1 N-päähän; Näin ollen, odotimme havaita vastaavat vyöhykkeet täyspitkän SATB1 ja lyhyempi peptidejä. Sen sijaan, LNCaP-solujen pääasiallinen hajoamistuote oli 54 kDa fragmentti, joka voisi vastata C-terminaalinen deleetio aminohapon 494 (Mr laskettu 54915), joka sisältää domeenit tarvitaan lokalisointi on NM ja sitoutumisesta mars [22 ]. Koska vahvistuksen mitä edellä mainitun, 2D SWB (Fig. 1 D), huomasimme SATB1 fragmentti sitoo Xmnl sekvenssin noin 54 kDa. Lisäksi on olemassa eri proteiinin fragmentaatiomalli PC3 suhteen LNCaP ei johdu läsnäolo apoptoottisten populaatioiden koska meillä ei ole havainnut mitään DNA: n fragmentoituminen tai apoptoottisten kappaleiden soluvalmisteissa (tietoja ei esitetty). Näin ollen on mahdollista, että lohkaisu kuviot ovat erittäin riippuvaisia ​​erityisesti erilaistumiseen ja proliferatiivisen tilan solun [21], [23]. Syy siihen, että koko SATB1 ei siirry 2D huolimatta vaeltavat 1D WB kokeissa on tällä hetkellä tuntematon. Se voisi riippua alhainen pitoisuus proteiinin liuoksessa käytetään lataamaan näytteet geeli nauhat fokusoinnin, vaikka liukoisuus ongelmia ei voida sulkea pois.

Voit selvittää jakeluun ja vuorovaikutusta PARP ja SATB1 DNA: n kanssa ja /tai MAR sekvenssit muuttaa funktiona aste solujen erilaistumisen, suoritimme konfokaalimikroskopialla analyysi.

koko LNCaP ja PC3-solut, PARP (visualisoitu vihreällä kuvassa. 4A) oli läsnä siinä nucleoplasm jossa se näkyy homogeeninen rakeinen värjäys suostumuksella aiemmissa tutkimuksissa [24]. [25].