Krooninen sairaus

tiivistelmä

Huomattavan vähän tietoa siitä, biologiset mekanismit, jotka määräävät tauti kokonaisuus metastasoitunut kolorektaalisyöpä maksassa (CRCLM) ilman hyvää kliinisten parametrien arvioida ennustetta. Muutaman viime vuoden aikana, suhteen ymmärtämiseksi kasvainten ominaisuuksiin ja paikallisen immuunivasteen on saanut kasvavaa huomiota. Koska monipuolinen roolit B-solujen perustuvia vastauksia, pyrimme selvittämään immunologista jälki B-lymfosyyttien on metastaattinen sivustolla, liittyivät toisiinsa makrofagien, ja niiden ennustetekijöitä merkitystä. Tässä esittelemme uusia algoritmi, jonka avulla voidaan arvioida linkkinä paikallisten potilaskohtaista immunologisia kapasiteettia ja kliiniseen tulokseen. Mikroskopian kuvantaminen alusta käytettiin automatisoitua skannausta laajamittaisen kudosleikkeiden myöhemmin laadullisia ja määrällisiä analyysejä immuunijärjestelmän solualatyyppien käyttäen linjaa markkereita ja yksisoluiset tunnustamista strategiaa. Tulokset osoittavat massiivinen infiltraatio CD45-positiivisten leukosyyttien rajoittuu metastaattisen rajaa. Me raportoimme ensimmäistä kertaa kertymistä CD20-positiivisten B-lymfosyytit kasvaimen – maksa rajapinta käsittää suurten asutuskeskusten sisällä suuri CD45-positiivisia aggregaatteja. Silmiinpistävän, toiminnallisesti aktiivisia, aktivaation aiheuttama sytidiinideaminaasin (AID) -positiivinen ektooppinen imukudoksen rakenteet todettiin koota sisällä metastaattinen marginaalin. Lisäksi CD20-pohjainen datajoukon paljasti vahvan ennustetekijöiden teho: potilailla, joilla on korkea CD20 sisältöä ja /tai kohdunulkoinen munarakkuloita oli huomattavasti alhaisempi riski taudin uusiutumisen joka ilmenee yhden muuttujan analyysin (p 0,001 molemmille) ja malleissa oikaistu kliinis muuttujien (p 0,001 ja p = 0,01, vastaavasti), ja osoitti pitkittyneen kokonaiselossaolo. Sitä vastoin CD68 värjäys johdettu data set eivät osoittaneet yhteyksiä kliinisiin tuloksiin. Yhdessä me nimetä suuruus B-lymfosyyttien, myös järjestetty kohdunulkoinen munarakkuloita, uusina ennustetekijöitä merkki, joka on ylivoimainen kliinis parametreja. Havainnot korostavat kasvaimia torjuvaa roolia B-solujen perustuvan mekanismin (t) ja siten osoituksena uuden tavan ajatella mahdollisia hoitostrategioiden CRCLM potilaille.

Citation: Meshcheryakova A, Tamandl D, Bajna E, Stift J , Mittlboeck M, Svoboda M, et al. (2014) B Cells and Ectopic Follikulaarinen Structures: Novel Pelaajat Anti-Kasvain Ohjelmointi Prognostiset Virta metastasoituneen peräsuolen syövän. PLoS ONE 9 (6): e99008. doi: 10,1371 /journal.pone.0099008

Editor: Jean-Pierre Vartanian, Institut Pasteur, Ranska

vastaanotettu: 29 tammikuu 2014; Hyväksytty: 09 toukokuu 2014; Julkaistu: 06 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Meshcheryakova et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Itävallan Science Fund (FWF; https://www.fwf.ac.at/) työntyy P22441-B13 ja P23228-B19 DEM. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Metastasoitunut peräsuolen syöpä on edelleen terapeuttinen haaste viimeaikaisista parannuksista huolimatta systeemisen hoidon kehitys mukaan lukien sytotoksiset ja kohdennettuja tekijöille [1], [2] ja monitieteinen hallinta. Huomattavan vähän tietoa koskien biologisten mekanismien, jotka määräävät ennusteen tämän taudin ja voidaan pitää lähtökohtien uusia terapeuttisia interventioita. Lisäksi ei ole kliinisiä parametreja arvioida eloonjäämisen ennustetta potilaiden jälkeen maksaresektio. Kuitenkin, on olemassa todisteita harkita paksusuolen syövän metastaaseja (CRCLM), kuten immunogeeninen syövän tyyppiä, sillä lisääntynyt tiheys T-lymfosyyttien on metastaattinen marginaali kasvaimia torjuvaa T-solujen efektoreita ajettu mekanismeja osoitettiin olevan ennusteen tärkeää [3].

on yleisesti hyväksyttyä, että kiinteiden kasvainten edustavat esimerkkiä kudos, jossa immuunisolujen, joko asuin- tai soluttautuminen, saattaa saada poikkeavasti aktivoida mikä vaikuttaa taudin kliinistä etenemistä [4], [5]. Kuitenkin kiinteät kasvaimet eri alkuperää voi vaihdella huomattavasti leukosyyttien koostumus. Koska osuus kumpaa immuunisolujen – sytotoksiset T-lymfosyytit (CTL), T auttaja (Th-solut), säätelijä-T (Treg) soluja, NK-soluja, DC, monosyytti /makrofagilinjan soluja, ja B-solujen alaryhmiä – TissueFlex erityisiä mekanismeja määrään kunkin kasvaimen tyyppi yhdistää potilaskohtaista immunologinen kapasiteetin ja kliininen tulos voidaan harkita. Kuvata paras syövän tyypin johtuvan ja potilassuuntautuneita heterogeenisuus määrää ja /tai tyypit soluttautua immuunisolujen ja niiden leviäminen alueella kasvain sekä sen myötä vaiheittain tapahtumista tuottaa kasvaimeen liittyvän immuunivasteen, uusi terminologia oli integroitu kuten

immuunijärjestelmän maisema

,

immuunijärjestelmän contexture The Immunoscore, The immunome

, ja

syöpää immuniteetti sykli

[4], [6] – [8 ]. Toisaalta kiinteät kasvaimet ovat yleensä luonnehtia immunosuppressiivisten perustuu useisiin verkottuminen mukaan luettuina aktivointi immunosuppressiivisten polkuja ja signaaleja, toleranssin tuumoriantigeeneille ja rekrytointi immunosuppressiivisten soluja kuten Treg soluja, myeloidinen johdettuja suppressorisolut, ja kasvain- siihen liittyvät makrofagit (TAM) [9] – [11]. Toisaalta, joissa keskitytään T-solujen ehdottanut voimakas anti-kasvaimen mahdollisuuksia CD8-positiivisten CTL-soluja potilailla, joilla on eri syöpätyyppien [12]. Huomionarvoista on vahva positiivinen yhteys välillä tiheyden infiltraattien sytotoksista ja muisti-T-solujen fenotyyppiä ja pitkittynyt potilaan selviytymisen primaarinen ja metastaattinen kolorektaalisyöpä [3], [13] – [16].

vähemmän tiedetään noin toiminnallista roolia kasvainten /strooman infiltroivia B-solut, jotka koskevat mekanismeista pro- stä anti-kasvain ohjelmointi neoplastisten kudosten. Erilaisia ​​B-soluvälitteisen toimia käsittää antigeenin riippuvaista T-solun esikäsittely, koneen synnyttämiseen immunoglobuliinien, sytokiinien ja kemokiinien välittävät (edistävät tai estävät) solujen erilaistumista ja tulehduksen [17] siten edistää taudin synnyssä kautta vasta-aineista riippuvainen riippumattomien mekanismien kautta [18] – [22].

Muita suhteellisen uusi näkökohta yhdistää B solubiologian ja tulehduksen perustuu löytö itukeskuksen (GC) kaltaisia ​​rakenteita ulkopuolella johdetun imukudoselimissä. Todellakin, useat tutkimukset ovat osoittaneet, että on olemassa kohdunulkoisen follikulaarinen rakenteiden (kutsutaan myös kolmannen asteen lymfaattisessa rakenteet) paikoissa kroonisen tulehduksen sisällä eri kudoksissa, mikä viittaa luokkavaihdoksen immunoglobuliinien ja somaattisen hypermutaatiolle suorittamisen tapahtumista paikallisesti valvonnassa aktivaation aiheuttaman sytidiinideaminaasin (AID) ([23] – [26], tarkistetaan [13], [27], [28]). Tärkeää on, lukuun ottamatta hyvänlaatuinen kudoksista, joilla on krooninen tulehduksellinen prosesseja, kohdunulkoisen follikulaarinen rakenteita on raportoitu joidenkin kiinteiden kasvainten. Tertiaaristen imukudoksen rakenteet tutkittiin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä potilaita ja todettu liittyvän suotuisa kliininen tulos; joko tiheys kypsillä DC [29], tai lisäksi, tiheys follikulaarinen B-solujen [30] käytettiin arvioimaan ennustetekijöiden vaikutus kolmannen asteen imukudoksen rakenteet. Kohdunulkoinen follikulaarinen rakenteet havaittiin myös potilailla, joilla on soluttautua ductal rintasyövän, mikä viittaa

in situ

antigeenipohjaista B-soluvasteen erilaisia ​​kasvain- ja rintojen liittyviä antigeenejä [31]. Osalta ensisijainen peräsuolen syöpä (CRC), joka pilottitutkimuksessa, kohdunulkoinen follikulaarinen rakenteet ennustettiin immuuni geenijärjestelyillä profilointia ja vahvistanut immunovärjäyksellä [32].

Koska todisteita mahdollinen panos kasvaimen infiltroivien B solujen taudin synnyssä, etenemistä ja /tai sairauden resoluutio, pyrimme tutkimaan B-solu-ajettu immuuni ohjaus potilaan kohortin kolorektaalisyöpään maksametastaaseihin (CRCLM). Silti yleinen heikko kohta arviointia läsnäolo sekä varoituksia vaikutus kotimaisten ja /tai infiltroituvien immuunisolujen poikki laajamittainen potilaan näytteestä CRCLM (tai muun tyyppinen monimutkaisten pahanlaatuinen kudos) on vaatimus kvantifiointiin algoritmeja. Itse asiassa tarvitaan automatisoitu, toistettavan määrällisesti immuunijärjestelmän solupopulaatioiden ollut histologinen arviointeihin on korostanut tiedeyhteisö kuluessa Translaatiotutkimuksen alue ja tietyt algoritmit on kuvattu [33] – [35]. Menestynein esimerkki immuunijärjestelmän pisteytys arviointi perustuu suhde T-solujen alaryhmiä (CD3

+, CD8

+, CD45RO

+, ja grantsyymi B

+) primaarista peräsuolen syöpä. Immunoscore ehdotettiin prognostinen markkeri, jota käytetään rutiininomaisesti testaus [36], [37]; edistämään maailmanlaajuista käyttöä Immunoscore työryhmän aloitettiin joukossa 22 kansainvälistä asiantuntija-keskuksia [38].

Nykyisessä tutkimuksessa käytimme automatisoituja TissueFAXS perustuva mikroskopia järjestelmä ja vastikään perustettu algoritmi havaitsemiseen ja kvantifiointiin immuunisolujen solupopulaatioiden poikki laajamittainen näyte CRCLM. Koska monipuolinen roolit B-solujen perustuva vasteet erityisesti paikoissa, joissa on krooninen tulehdus, pyrimme valaista potilaskohtaista jälki B-lymfosyyttien on metastaattinen rajalla keskittyen erityisesti johtuvan ilmiö kohdunulkoisen follikkelia muodostumisen, yhteenliittämisen B-solut ja soluttautuminen /asukas makrofageja, ja arvio niiden ennustetekijöiden vaikutuksen.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

tutkimus hyväksynyt eettinen komitea Medical University of Vienna (EK-nro. 1277/2012). Tietoon perustuva suostumus oli luopunut sen Institutional Review Board johtuen taannehtivuus tutkimuksen.

profiili tutkimuspotilaiden

Paneeli parafinoidut näytteitä potilaista, joilla CRCLM noudettiin takautuvasti 65 potilasta, jotka leikattiin laitoksella kirurgian, Medical University of Vienna. Ensimmäinen ryhmä koostuu 14 potilaalla, joilla oli maksaresektio vuosien 2001 ja 2007, oli metachronous esittäminen etäpesäkkeitä (ei etäpesäkkeitä, kun ensisijainen kasvain oli diagnosoitu) ja jalostustoiminto resektio ilman leikkausta edeltävän kemoterapiaa (paneeli I). Mediaani seuranta aikaa tässä ryhmässä oli 50,2 kuukautta (95% CI: +33,6-+66,8kuukautta). Tämä Potilaskohortti pystyimme arvioimaan immunologista jälki aiemmin hoitamattomilla yksilöitä. Toinen ryhmä (paneeli II, n = 51) sisältyy satunnaisesti valittua potilasta, jotka saivat kemoterapiaa ennen maksaresektio; sisällyttäminen päivämäärä oli vuodesta 2006 vuoteen 2009; mediaani seuranta aika oli 32,2 kuukautta (95% CI: +24,4-+40,0kuukautta). Seurauksena satunnaisvalinnan, paneeli II mukana ne potilaat, joilla oli fluoropyrimidiinipohjaisen sytostaattihoitoa ja oksaliplatiinin (46 potilasta) tai irinotekaanin (5 potilasta). Lisäksi kaikki potilaat saivat Bevasitsumabin ensisijaisena hoito meidän laitoksen tämän jakson aikana. Potilaat saivat viime solunsalpaajahoitoa 21 päivää ennen leikkausta; viimeinen bevasitsumabin hoito annettiin jopa 5 viikkoa ennen leikkausta. Within paneeli II, 19 ulos 51 yksilöitä tutkittiin CD45 taas kaikki 51 näytteet arvioitiin B-solujen ja makrofagien suvusta. Potilaille, joilla on useampi kuin yksi etäpesäke, valinta sopivin etäpesäke värjäyksessä oli paljastaminen patologi; tyypillisesti sama kudosnäyte, jota käytettiin diagnostisten menettelyä ja hoito-valvonta sisällytettiin tutkimukseen. Kliinis ominaisuudet potilaista on koottu taulukkoon 1: demografiset tiedot, patologista lavastus mukaan TNM luokittelujärjestelmän, määrä ja koko maksametastaaseista, elinvoimaa maksametastaaseista (paneelin II), taudista vapaa aikaväli, ja tietoja leikkauksen jälkeisiä kemoterapiaa tarjotaan. Molemmat päivämäärä uusiutumisen ja joko kuolin- tai päivämäärän nähty viimeksi tallennettiin. Kokonaiselinaika (OS) määriteltiin välistä aikaa diagnoosin ja syöpään liittyviä kuolemantapauksia (22 dokumentoitu syöpätapausta liittyvä kuolema); uusiutumiseen elinaika (RFS) välinen aika diagnoosin etäpesäkkeiden ja sairauden etenemisen arvion mukaan toistumisen etäpesäke tai minkä tahansa kasvain (46 dokumentoituja tapauksia taudin uusiutumisen). Taudista vapaa väli (DFI) määriteltiin välinen aika diagnoosi ensisijaisen peräsuolen syövän ja maksametastaaseista potilailla, joilla metachronous kehittämiseen etäpesäkkeitä. Elinvoimaa maksametastaaseista arvioitiin kuvatulla [39].

immuunivärjäytyminen on parafinoidut kudosleikkeiden värjäyksellä arviointi

parafinoidut 4 pm paksu osissa tehtiin rutiini värjäystä hematoksyliinillä ja eosiinilla. Jaksot CRCLM yksilöt otettiin CD45, CD20, AID, IgM, CD138, ja CD68. Havaitsemiseksi CD45, yhteinen leukosyyttiantigeenin, kani klonaalinen vasta-aine, klooni E19-G (DB Biotech, Kosice, SR) käytettiin. CD20 (hiiren monoklonaalinen vasta-aine, klooni L26, Thermo Scientific, Cheshire WA7 1PR, UK tai kanin klonaalisen vasta-klooni E17-P, DB Biotech, Kosice, SR) käytettiin yleisesti B-solujen markkeri. Havaita AID, kloonata ZA001 hiiren IgG1-kappa (Invitrogen, Paisley, UK) käytettiin. Anti-AID vasta aiemmin osoitettu olevan toiminnallista immuunivärjäykseen Raji, lymfoblastoidisoluilla peräisin Burkittin lymfooma, ja AID-positiivisten solujen parafinoidut kudosleikkeiden kuten nielurisat ja nenän polyypit 24,40,41. Havaitsemiseksi IgM, kaniinin polyklonaalista vasta-ainetta käytettiin (acris, Herford, Saksa). Havaitsemiseksi CD68, monosyytit /makrofagit linjaa merkki, hiiren monoklonaalinen vasta-aine, klooni KP1 (Thermo Scientific, Cheshire WA7 1PR, UK) käytettiin. Immunohistokemiaa menetelmä, DAKO EnVision +, peroksidaasisysteemi (DAKO, Glostrup, Tanska) levitettiin jälkeen ensimmäinen vasta-aine. Osiot vastavärjättiin hematoksyliinillä ydinvoiman visualisointiin. Fluoresoiva värjäys anti-hiiri ja anti-kaniini-Ig-vasta-aineita konjugoituna Alexa väriaineet 488 ja 568 (Invitrogen, Paisley, UK) käytettiin CD45 värjäystä sekä kaksinkertainen värjäystä (CD20 ja CD68). Nuclear counterstaining tässä tapauksessa suoritettiin DAPI (Roche, Mannheim, Saksa). TissueFAXS (TissueGnostics, Wien, Itävalta), täysin automatisoitu mikroskopia-pohjainen kudosta analyysijärjestelmä käytettiin hankintaan sairaiden näytteen kudosten ja kvantitatiivisen analyysin. TissueFAXS tekniikka saa automaattisesti skannata laajamittainen kudosleikkeiden fluoresenssissa tai Kirkas tilat, mahdollisuus visualisoida kudosrakenteille seuraa tunnistetiedot kaikista solujen monimutkainen natiivi kudosympäristön ja määrällisen analyysin positiivisesti värjäytyneiden solujen [24], [42], [43]. Näin ollen tämä lähestymistapa edellyttäen mikroskooppinen kuvat koko metastaattisen kudosleikkeiden. Kukin näyte koostui 100 tai useamman yksilön näkökenttää. Kuten edustava esimerkki, sillä ala on 400 mm

2 kudosnäyte oli tyypillisesti hankittu seurata analyysejä. Hankintaan 20x /0.5 tavoite käytettiin (EY Plan_NeoFluar, Zeiss). Suodinsarjat olivat Chroma TechnologyCorp (DAPI 350/460 nm; FITC /Cy 2 470/525 nm; TxRed /Cy5 620/700 nm). Kvantitatiivinen analyysi infiltroivien immuunisolujen suoritettiin käyttäen TissueQuest tai HistoQuest ohjelmisto (TissueGnostics, Wien, Itävalta) immunofluoresenssivärjäyksessä ja immunohistokemiallista värjäystä, vastaavasti. Arviointi värjättiin immuunisolujen suoritettiin ilman tietoa kliiniset parametrit kullekin potilaalle. Voit selvittää ennustetekijöiden merkitystä, kohdunulkoinen munarakkuloita määritelmänä (i) ominaisuus kompakti, pyöreä lymfaattisen yhteenlaskettu morfologia kanssa (ii) minimi läpimitta on 20 solua, ja (iii) läsnäolo CD20-positiivisten B-solujen. Näin ollen kaikki lymfaattisen aggregaatit täyttävät nämä kriteerit riippumatta niiden aktivoinnin tilan sisällytettiin ennustetekijöiden merkki. Kohdunulkoinen follikulaarinen rakenteet laskettiin perustuvat vertailevaan analyysiin CD45 ja CD20 värjäyskuviot kunkin näytteen kolmen riippumattoman tarkkailijan vahvojen expertize mikroskopian. Kaikki yksittäiset värjäys johdettu muuttujien poikki määrätyillä alueilla käytettiin korrelaatiota clinicophathological parametreja. Joidenkin värjäys-pohjainen muuttujat muutamia näytteitä jätettiin kvantifiointi analyysin perusteella kudoksen laadusta ja /tai taustan värjäytymistä; Näitä tapauksia tarkka määrä näytteitä on merkitty kuvioon legendoja.

Tilastollinen

osalta tehon laskennan, jos oletetaan, että kaksipuolinen merkitsevyystasolla riskisuhde 3,0 voidaan havaita, jonka teho on 90%, jos 35 tapahtumaa havaitaan näytteessä. Kategorinen data kuvattiin absoluuttinen ja suhteellinen taajuuksia. Ryhmä erot testattiin khiin neliö testi tai chi-squared suuntaus testi järjestysluku muuttujia. Mikäli harva tietojen tarkka testejä käytettiin. Jatkuvat kuvattiin kanssa mediaani, minimi ja maksimi. Ryhmä erot arvioitiin Wilcoxonin rank sum test tai t-testi tapauksessa normaalijakaumaa (normaalijakaumaa saavutettiin jälkeen logaritminen muunnos). Varianssin analyysiä käytettiin vertaamaan kolmen alueen (rajalla, portaali kenttä, kaukainen maksa) sisällä potilaille. Tukey oikaisu tehtiin useita pareittain vertailuissa. Korrelaatiot laskettiin Spearmanin korrelaatiota järjestys- muuttujien ja Pearsonin korrelaatiota log2 muuttaneet jatkuvia muuttujia. OS ja RFS osoitettiin Kaplan-Meier kaavioita ja ryhmäeroja testattiin käyttämällä log-rank-testi. Saat järjestysluku muuttujien log-rank testi suuntaus vaikutus oli käytetty. Lisäksi riskisuhteita ja vastaavat 95%: n luottamusväli arvioitiin Coxin regressiomalleja. Värjäys johdetut arvot log2 transformoitiin Cox regressiomalleja saavuttaa likimääräisen normaalijakaumaa. Vuorovaikutukset kahden paneelien ja värjäys-pohjainen muuttujat laskettiin. Mikäli ei-merkitsevä vuorovaikutus tai jos molemmat vaikutuksia kaksi paneelia suoraan samaan suuntaan, on kerrostettu Cox regressiomallin käytettiin, kun paneeli I ja II tiedot analysoidaan yhdessä. Coxin monimuuttuja regressiomalleja käytetään säätämään ennustetekijöiden vaikutuksia värjäys-pohjainen muuttujista kliinisen parametrin (t) havaittiin olevan merkittäviä Yksiulotteisissa Coxin regressio. Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen SPSS-ohjelmiston version 20 (IBM Corporation, Armonk, New York, USA); kaikki p-arvot annetaan kaksipuolinen ja p≤0.05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

algoritmi kuvaamista ja kvantitatiivisen analyysin kotimaisten ja soluttautua immuunisolujen populaatiot CRCLM kudosnäytteiden

analysoida ja mitata läsnäolo kotimaisten ja soluttautua immuunisolujen sisällä CRCLM kudoksen perustimme algoritmin avulla TissueFAXS järjestelmää. Näytteen vertailussa haimme yhtenäinen strategia tekemällä osa-alueille kasvain – maksan rajan (noin 0,5 x 0,5 mm kummallakin puolella, joiden keskikoko on noin 30 mm

2) ja niiden sisällä maksakudosta ympärillä porttilaskimon alueilla (viisi edustavalla mitoitettu 0,25 mm

2) ja alueita maksakudoksissa kaukainen portaaliin suonet nimetty kaukainen maksan vuonna jatkotoimia kuvaukset (kolme edustavalla mitoitettu 0,25 mm

2) ( edustava kuva on esitetty kuviossa 1, A). Tutkimuksen suunnittelu on tiivistää vuokaavio kuviossa 1, B. parafinoidut leikkeitä värjätään ensin anti-CD45-vasta-aineiden havaitsemiseksi kaikkien luokkien asuvat ja /tai infiltroituvien immuunisolujen poikki potilaan näytteestä. Seuraavaksi määrittää immuunijärjestelmän solupopulaatioiden me erotellut B solulinjaan ja monosyytti /makrofagilinjan (kuvio 1, B). Kvantitatiivinen analyysi käyttäen TissueQuest /HistoQuest ohjelmisto on sovellettu määrän määrittämiseksi CD45-positiivisia, CD20-positiivisia, ja CD68-positiivisten solujen tavataan edellä määritellyt sijainnit kohteisiin. Laskenta-algoritmi on kuvattu kuviossa S1. Sen määrittämiseksi kliinistä merkitystä potilaan immuunivasteen työmaalla metastaasin, värjäys johdettuja aineistoja käytettiin linjassa kliinis parametreja.

(A) määritelmä alueiden etua CRCLM kudosnäytteitä yhtenäistää kvantifiointia strategia väliin yksilöitä. Kun hankinta laajamittaisen näytteen avulla mikroskopian-pohjainen TissueFAXS järjestelmä, kiinnostavilla alueilla määriteltiin kasvaimen – maksa rajan (merkitty

punainen

viiva), sisällä maksakudosta ympärillä porttilaskimoa alueet (merkitty katkoviivalla neliöillä

vihreä

) ja alueita maksakudoksissa kaukainen portaaliin suonet (merkitty katkoviivalla neliöillä

sininen

). On huomioitava, että tässä määritelty strategia käyttäen 0,5 x 0,5 mm: n alueen analyysi kasvaimen – maksa rajalla määritettiin empiirisesti perustuen mikroskooppisen arviointiin CD45 leikkeitä osoittavat lymfosyyttien kertymistä tällä alueella; tämä oli määritelty riippumaton mutta vastaavia määrällistä rajaaman alueen Halama ym [3]. Mitta-asteikko: 1 mm. (B) Tutkimuksen suunnittelu. Tutkimuksen suunnittelu on tiivistää vuokaaviossa lukien värjäys vakiintuneiden markkereita, immuunisolujen järjestö kuvio, kvantifiointiin, ja arviointi kliinistä merkitystä rinnastamalla kanssa kliinis parametreja.

Potilaan erityinen laajuus ja jakaantumiskuvio CD45 positiivisia soluja paikalla CRCLM

Gross tutkimus paljasti massiivista infiltraatiota CD45-positiivisten solujen rajoitu kasvaimeen – maksa rajalla etäpesäkkeitä. Kuvat ovat esitetään kuvassa 2, A. Eri malleja immuunisolujen kerääntymistä havaittu hoidettavien joukossa ja saattaa rinnakkain saman näytteen kasvaimen – maksa border: yksittäisiä soluja, leviää solujen aggregaatteja, ja kohdunulkoinen munarakkuloita rakenteet (kuvio 2 B ). Määrä CD45-positve solujen kolmen alueen kohteisiin näytteillä suuria potilaiden välinen vaihtelu määritettynä kvantitatiivisen analyysin: rajalla vaihtelee 8%: sta 46% (mediaani 19%), sisällä maksakudosta työmaalla portaalin laskimoiden vaihdellen 9%: sta 56% (mediaani 29%) ja sisällä kaukainen maksakudosta vaihtelevat 4%: sta 16% (mediaani 9%); analyysi suoritettiin paneeli I ja paneeli II yhdessä. Tärkeää on, CD45-johdettuja aineistoja ei todettu merkittäviä eroja paneeli I ja paneeli II (kuva S2).

(A) Massiivinen soluttautuminen CD45-positiivisten solujen rajoitu kasvaimeen – maksa rajalla etäpesäkkeitä. Edustavia osat metastaattisen alueita kaksi CRCLM potilasta näkyvät (punainen kanava CD45 sininen kanava ytimet /DAPI). T: kasvain; L: maksa. Mitta-asteikko: 200 um. (B) eri malleja CD45-positiivinen solu keskittymistä on metastaattinen rajalla. Edustavat kuvat eri immuunijärjestelmän solujen infiltraatteja on esitetty: (

) yksittäisiä soluja; (

b

) suuri immuunisolujen aggregaattien; (

c

) näkyvä kohdunulkoisen follikkelia. Sen lisäksi, että sulautuneen kuvien (

a-c

, punainen kanava CD45 ja sininen kanava DAPI), kuvia yksittäisten kanavien sisältyvät (

d-f

varten DAPI;

g-i

CD45); yksittäiset kanavat näkyvät musta /valkoinen, kun taas sulautunut kuvat näkyvät värillisinä. T: kasvain; L: maksa. Mitta-asteikko: 50 um. (C) (

–

c

) Kaplan-Meier-estimaatteja potilaille kerrostuminen perustuu CD45-johdettujen arvojen rajalla. Kaplan-Meier -käyrät RFS perustuu CD45 arvot paneeli I, paneeli II, ja niiden yhdistelmä esitetään antavat potilaiden kerrostuminen matalan ja korkean riskin ryhmiin (korkeampi kuin mediaani osoittaa alhainen riski); p-arvo log-rank-testi on tarpeen. Paneeli I: mediaani on yhtä kuin 20,95, alle mediaani n = 6, edellä mediaani n = 7; paneeli II: mediaani on yhtä 17.66, alle mediaani n = 10, edellä mediaani n = 9; paneeli I + II: mediaani on yhtä kuin 19,13, alle mediaani n = 16, edellä mediaani n = 16. (

d

) Boxplots CD45 aineistoja potilaille uusiutumatta (Ei) vs. potilaalla on toistumisen (Yes ) ajanhetkellä 17 kuukautta. Leikattu pois asetettiin Uusimpien tapahtuman esiintyminen (16,3 kuukautta), jossa ei sensurointi on tapahtunut, mikä tarjoaa selkeitä erottaminen sensuroitu aiheista (≥32.2 kk) visualisoidaan (

b

). Mediaani CD45-arvo, jota käytettiin potilaan kerrostuminen matalan ja korkean riskin ryhmiin Kaplan-Meierin kuvaaja (

b

) on merkitty katkoviivalla; p-arvo on esitetty (t-testi).

CD45-positiivisia asukas ja /tai tunkeutuvia lymfosyyttejä sisällä CRCLM kudoksissa: ennustetekijöiden vaikutus

määrittämiseksi kliinistä merkitystä potilaskohtaista immunologinen jälki, CD45-johdettuja aineistoja korreloivat toistumisen elinaika (RFS) ja kokonaiseloonjääminen (OS). Arvioimana Coxin regressioanalyysiä (taulukko S1), läsnäolo CD45-positiivisten solujen kasvain – maksan raja lla havaittiin olevan vahva positiivinen ennustetekijöiden vaikutus RFS sekä potilaiden paneelien (paneeli I: HR = 0,004, 95% CI : 0,001-0,627, p = 0,033; paneeli II: HR = 0,156, 95% CI: ,045-0,546, p = 0,004) sekä paneelin I ja paneeli II yhdessä (HR = 0,093, 95% CI: 0,028-0,305 , p 0,001); yhdistelmä tietokokonaisuuksien oli mahdollista perustuen lisätestejä varten vuorovaikutusta kahden paneelien ja värjäys-pohjainen muuttujat (taulukko S2). Lisäksi korkeampi CD45 sisältöä Metastasoituneessa rajalla havaittiin korreloivan paremmin OS, vaikkakin heikompi ennustetekijöiden vaikutus (taulukko S1). Suhteen RFS, potilasta oli jaettu ryhmiin, joilla on suurempi prosenttiosuus CD45-positiivisten solujen (yli mediaanin) ja alempi osuus CD45-positve soluja (alle tai yhtä suuri kuin mediaani). Kuviossa 2 C on esitetty vastaava Kaplan-Meier kuvaajia. Erilliset analyysit paneelin I ja paneeli II sekä niiden yhdistelmänä osoitti tilastollisesti merkitseviä eroja korkean ja matalan riskin ryhmissä (log-rank-testi: p 0,001, p = 0,009, ja p 0,001, tässä järjestyksessä). Koska ei ole tapahtumia läsnä pienen riskin ryhmään paneelin I (n = 7), vastaava HR Cox regressioanalyysi taipumus äärettömään. Lisäksi paneelin II tietojen jakaminen CD45-pohjainen arvot voidaan näyttää potilaille ja ilman taudin uusiutumista 17 kuukautta, kun mitään sensurointi ole tapahtunut vielä (kuvio 2, C,

d

). Potilaat, joilla ei taudin uusiutumisen osoittivat merkittävästi korkeampia CD45 pitoisuus verrattuna niihin, joilla toistumisen (p = 0,019). Toisin rajalle, yhdenmukaistaminen maksasta johdettujen aineistoja (porttilaskimon alueet ja kaukana maksa) ei paljastanut tilastollisesti ennustetekijöiden vaikutusta RFS tai OS (taulukko S1).

Yhteenvetona havaintomme korostavat vahvan vaikutus potilaskohtaista paikallisen immuunivasteen meneillään sivusto etäpesäke kliinisestä tuloksesta CRCLM potilaista. Se antaa meille motivaatiota rajata vaikutus yksittäisten immuunisolujen osajoukot, joka käsittää CD45-positiivisen solupopulaation käyttämällä suurempaa kohortin potilaista. Niinpä vuonna jatkotoimia kokeet määritellään B-solu- ja makrofagi suvusta suurennettu kohortin potilaista kuluessa paneelin II tutkittiin (n = 51).

Potilaan erityinen laajuus ja organisointi kuvio CD20-positiivisten B-lymfosyyttejä paikalla CRCLM

Seuraavaksi luonnehtia B-solulinjaa on CRCLM päällä, kudosnäytteet analysoitiin CD20-positiivisia soluja. Huomiota herättävää on, suuri osa solujen suuri CD45-positiivisten solujen aggregaatit ja etenkin sisällä ectopic munarakkuloiden havaittiin olevan CD20-positiivisten B-solujen; mielenkiintoisesti, vain pieniä määriä CD20-positiiviset B-solut havaitaan ei-järjestäytyneen CD45-positiivisia lymfosyyttipopulaatioita (kuvio 3, A). Eri järjestäminen malleja CD20-positiivisia soluja havaittiin kolmen kiinnostavilla alueilla. Edustavat kuvat on esitetty kuviossa 3, B. Rajalla yksittäisiä soluja (kuvio 3, B,

) ja /tai solun aggregaattien (kuvio 3, B,

b

), ja /tai kohdunulkoinen munarakkuloita (kuva 3, B,

c

) havaittiin. Huomattavaa on, että CD20-positiiviset B-solujen havaittiin kerääntyä ympärille kasvain saaret (kuva 3, B,

b

, insertti). Suuri B-solujen aggregaatit samoin havaittu ympäri portaalin suonet lähelle raja-alueella, kun taas kauempana portaalin laskimoiden single CD20-positiivisia soluja havaittiin (kuva 3, B,

d

,

e

, vastaavasti). Erityisesti sisällä kaukainen maksakudosta, koko näyte vain harvakseltaan, yksittäisiä tapahtumia havaittiin (kuva 3, B,

f

). Linjassa, määrällisiä arviointeja kolmen alueen paljasti B-solujen kasvaimen – maksan raja vaihtelee 0,3%: sta 13% ja mediaani 2% ja tapahtuu maksassa ympäröivästä kudoksesta portaalin suonet vaihtelee 0,1%: sta 36% mediaani arvo on 4%; single CD20-positiivisia soluja havaittiin sisällä kaukainen maksakudosta (mediaani 0,1%); analyysi tehtiin paneelikäsittelyyn I ja II yhdistettynä. Lisäksi vertailevissa kemoterapiaa ryhmiä paneeli II havaitsimme mitään suurta eroa jakauman värjäys johdettujen arvojen ja joilla ei ole viitteitä ryhmässä erot kemoterapian (taulukko S3). Tärkeää on, vertailu CD20 muuttujat paneeli I ja paneeli II paljastanut mitään merkittäviä eroja kolmen alueen kohteisiin (kuva S3).

(A) alaryhmästä CD20-positiivisten B-solujen metastaattista rajalla. Tyypillisiä esimerkkejä CD45-positiivinen (

) kohdunulkoinen follikkelia, (

c

) suuri solu yhteenlaskettu ja (

e

) järjestäytymätön solupopulaation ja vastaavat pinta-alat värjätä CD20 näkyvät (

b

,

d

,

f

, vastaavasti). Määrällinen analyysi tehtiin käyttämällä TissueQuest ja HistoQuest ohjelmistot; positiivisten solujen prosenttiosuuden on ilmoitettu. Mitta-asteikko: 100 um. (B) eri organisaatio malleja CD20-positiivisten solujen kolmen kiinnostavilla alueilla. Kuvat ovat (i) rajalla: (

) yksittäiset solut, (

b

) soluaggregaatteja; aseta: korkeampi voima näkymä CD20-positiivisten solujen kanssa kosketuksiin paksusuolen kasvain epiteelisolujen (

c

) kohdunulkoisen follikulaarinen rakenteet; (Ii) noin portaalin suonet (

d

) lähelle rajaa ja (

e

) kaukainen rajalle sekä (iii) sisällä maksakudosta (

f

) on esitetty. T: kasvain; L: maksa. Mitta-asteikko: 50 um. Mitta-asteikko: 50 um.