Krooninen sairaus

tiivistelmä

MUC4 mukiinia on suurimolekyylipainoinen, kalvoon sitoutuneita, ja erittäin glykosyloitunut proteiini. Se on monen domeenin proteiini, joka on oletettavasti pilkotaan suuri limaa, kuten alayksikkö (MUC4α) ja C-terminaalinen kasvutekijän kaltaiset alayksikön (MUC4β). MUC4 pelaa kriittinen rooli fysiologisia ja patologisia tiloja vastaan ​​ja on poikkeuksellisesti yli-ilmentynyt useissa syövissä, mukaan lukien haiman, kohdunkaulan, rinta- ja keuhkosyövän. Se on myös mahdollinen biomarkkeri diagnoosi, ennuste ja eteneminen useiden syöpäsairauksia. Edelleen MUC4 soittaa monipuolista toiminnallisten roolien syövän taudin alkamisen ja etenemisen kuten käy ilmi sen osallistumisesta syövän syntyyn, leviämisen, apoptoosin, liikkuvuuteen ja invaasio, ja kestävyys kemoterapian ihmisen syöpäsoluja. Olemme aiemmin tuotettu monoklonaalinen vasta-aine 8G7, joka on suunnattu vastaan ​​TR alueen MUC4, ja on laajasti käytetty ekspression tutkimiseksi MUC4 useiden maligniteettien. Tässä me kuvaamme sukupolven anti-MUC4 vastaisia ​​vasta-aineita ei-TR alueilla MUC4. Rekombinantti glutationi-S-transferaasi (GST) -fuusioitunut MUC4α fragmentit, sekä ylävirtaan (MUC4α-N-Ter) ja loppupään (MUC4α-C-Ter) TR verkkotunnuksen, käytettiin immunogeeneinä immunisoimaan BALB /c-hiirissä. Sen jälkeen Solufuusiossa hybridoomia seulottiin käyttämällä edellä mainittua rekombinanttiproteiineja ilmoitus lysaatit ihmisen haiman solulinjoista. Kolme anti MUC4α-N-Ter ja yksi anti-MUC4α-C-Ter-vasta-aineita karakterisoitiin useita inmmunoassays, kuten entsyymi-immunologinen määritys (ELISA), immunoblotting, immunofluorescene, virtaussytometrialla ja immunosaostuksella käyttäen MUC4 ilmentävät ihmisen haimasyövän solulinjoissa. Vasta-aineet reagoivat myös kanssa MUC4 ihmisen haimakasvaimesta osiot immunohistokemiallinen analyysi. Uuden domain-specific anti-MUC4 vasta-aineet toimivat tärkeänä reagenssit tutkia rakenteen ja toiminnan suhteen MUC4 aloilla ja kehittämistä varten MUC4 diagnostiikan ja terapeuttisten.

Citation: Jain M, Venkatraman G, Moniaux N, Kaur S, Kumar S, Chakraborty S, et ai. (2011) Monoclonal Antibodies tunnustavat Non-Tandem Toista alueet Ihmisen Mucin MUC4 in Haimasyöpä. PLoS ONE 6 (8): e23344. doi: 10,1371 /journal.pone.0023344

Editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: Kesäkuu 27, 2011; Hyväksytty: 12 heinäkuu 2011; Julkaistu: 23 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Jain et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat tämän työn tuetaan, osittain avustusta Yhdysvaltain puolustusministeriö (BC074639, BC083295, BC09742, ja PC074289) ja National Institutes of Health (R21 CA156037, RO1 CA78590, UO1 CA111294, RO1 CA131944, RO1 CA133774, RO1 CA138791, RO3 CA 139285 ja P50 CA127297). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ihmisen MUC4 on erittäin glykosyloitu kalvoon liittyvä musiini, joka koostuu suuresta 850-kD limaa, kuten alayksikkö MUC4α, ja kalvoon sitoutunut 80 kD: n kasvutekijän kaltaiset alayksikön MUC4β [1], [2] . MUC4α sisältää keskeisen tandem-toisto (TR) domeenin, joka sisältää vaihtelevan määrän 16 aminohappotähteen motiiveja, jotka voidaan toistaa jopa 400 kertaa per molekyyli. TR-domeenin vieressä, jonka C-terminaalinen kysteiini rikas domeeni ja N-terminaalinen domeeni, joka sisältää kolme toistoa 123 aminohappotähdettä [1]. MUC4β sisältää kysteiinirikkaan domeenin, domeenin runsaasti N-glykosylaatiokohdan ja kolme EGF: n kaltaiset domeenit [1]. MUC4 pidetään ihmisen homologi rotan sialo-musiini-kompleksia (SMC, rotta Muc4) samankaltaisuuksien vuoksi rakenteellinen organisaatio [1], [3], [4]. SMC on heterodimeerinen glykoproteiini, joka koostuu O-glykosyloitunut musiini-alayksikön, askites sialoglykoproteiinilla (ASGP-1), tiukasti sitoutuneena N-glykosyloitu transmembraaninen alayksikön, ASGP-2, joka sisältää kaksi epidermaalisen kasvutekijän kaltaisia ​​domeeneja sen solunulkoisen osan [ ,,,0],3], [4].

MUC4 on ilmaistu useissa epiteeli- kudoksissa, mukaan lukien epiteeli sikiön keuhkojen ja aikuisten hengitysteiden henkitorven ja kokoojaputkissa keuhkojen henkitorven [5], paksusuolen [6], endocervix [7], sidekalvon [8], sarveiskalvo [9], sylkirauhasten [10], välikorvan ja Korvatorvi [11]. Viimeaikaisissa tutkimuksissa asteittain lisänneet MUC4 ilmentyminen on havaittu haiman intraepiteliaalisten uudisvaurioiden, mikä osoittaa sen rooli taudin kehitys [12]. Aiemmat tutkimukset laboratoriossamme ovat osoittaneet, että esto MUC4 ilmentymisen käyttäen anti-sense tai lyhyt-häiritsevä RNA (siRNA) oligonukleotidit ominaisia ​​MUC4 johtaa vähentynyt tuumorigeenisyyteen ja levittäminen syöpäsolujen [13]. Edelleen, viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että MUC4 johtaa onkogeenisen transformaation hiiren fibroblasteissa [14], myötävaikuttaa lääkeresistenssideterminantit haimasyövän soluja aktivoimalla anti-apoptoottisten reittien [15], ja se on mukana epiteelin-to-mesenkymaaliset siirtyminen munasarjasyöpäsoluja [16]. Nämä tutkimukset laboratoriossamme ja muut ryhmät osoittavat mahdollista merkitystä tämän musiinia eri osa tuumoribiologiassa.

Olemme aiemmin luotu paneelia monoklonaalisia vasta-aineita vastaan ​​suunnattuja TR alueen MUC4 [17]. Yksi anti-MUC4 TR-vasta-aineita, 8G7, on toiminut arvokas reagenssi tutkia ilmentymisen MUC4 musiinia eri kudoksissa ja purkaa sen osallistuminen oli erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia, mukaan lukien, haiman [12], [18], mahan [19] , kohdunkaulan [20], munasarja- syöpiä [21], extra maksan sappitiehyen syöpä [22], kolangiokarsinooma [23], ja ihon okasolusyöpä. Kuitenkin MUC4 sisältää monia rakenteellisia ja toimintakykyyn sekä ylävirtaan ja alavirtaan TR alueen [1], [2], ja monet saumattu muotoja MUC4 ovat täysin vailla TR alueella [24], [25]. Lisäksi TR alue on voimakkaasti O-glykosyloitu. Kun otetaan huomioon muutos glykosylaation asema kiinteiden kasvainten, on mahdollista, että reaktiivisuus vasta-aine voidaan peittää tiettyjen pahanlaatuisten kasvainten. Täten rakenteellinen monimutkaisuus MUC4, oli lukuisia silmukointivariantit ja glykomuodoiksi, ja raskas O-glykosylaatio TR toimialueen perusteltua sukupolven ylimääräinen vasta ymmärtää täysin rakenne-toiminta suhdetta eri MUC4 verkkotunnuksia fysiologisissa ja patologisissa tiloissa.

Täällä raportoimme sukupolvi ja luonnehdinta uusi anti-MUC4 MAb: jotka tunnistavat alueet MUC4α sekä ylävirtaan ja alavirtaan TR verkkotunnuksen. Puhdistettu rekombinantti MUC4 fragmentteja, fuusioidaan lukukehyksessä GST: n kanssa, käytettiin immunogeeneinä ja positiiviset kloonit valittiin perustuen niiden reaktiivisuutta ELISA: ssa. Valitut kloonit tunnusomaista niiden reaktiivisuus kohti MUC4 immuunitäpläkokeilla immunosaostus, immunofluoresenssilla ja virtaussytometria käyttäen haiman syöpäsoluja. Ei-TR anti-MUC4 MAb: t kehitettiin tässä tutkimuksessa voi olla lupaavia reagensseja määritysten kehittämisen kvantifiointi MUC4 kudoksissa ja biologisissa nesteissä, tutkia toiminnallista roolia MUC4 eri sairauksien ja mahdollisesti immunoterapiassa.

tulokset

kaavamainen rakenne MUC4 ja rekombinantti verkkotunnukset ovat osoitettu kuviossa 1a. Sen jälkeen Solufuusiossa viljelmäsupematanteista stabiileja hybridoomia seulotaan ja positiivisen hybridoomat näytteille korkea reaktiivisuus rekombinanttiproteiinia ja negatiivinen reaktiivisuus GST kloonattiin kolme kierrosta rajoittavan laimennuksen. Seitsemän stabiilien kloonien reaktiivinen MUC4α-N-Ter ja kolme kloonia, jotka reagoivat MUC4α-C-Ter saatiin (taulukko 1 ja kuvio 1 b). MAb: 2172, 2173, 2175, 2212, 2213, 2214 ja 2382 esiintyi spesifinen reaktiivisuus kohti MUC4α-N-Ter, kun taas MAb: 2103, 2106 ja 2107 olivat ominaisia ​​MUC4α-C-Ter. Edelleen, yksikään valittujen vasta-aineiden ei esiintynyt reaktiivisuutta kohti puhdistettiin MUC4 TR peptidi, BSA tai GST (tuloksia ei ole esitetty). Samoin aikaisemmin tuotettu anti-MUC4 TR-vasta-aine 8G7 tai anti-KLH-vasta-aine K2G6 ei osoittanut mitään reaktiivisuutta yhdistelmä-MUC4 verkkotunnuksia.

a) Kaavamainen rakenne MUC4 ja rekombinanttiproteiinien käytetään tutkimuksessa. MUC4 on oletettavasti pilkkoutuu GDPH päällä tuottaa N-terminaalisen musiini-tyyppinen alayksikkö MUC4-α ja C-terminaalisen kasvutekijä-tyypin alayksikön MUC4-β. Tärkeää domeenit MUC4 on merkitty. Rekombinantti domeenit MUC4- α vastaavat fragmentteja ylävirtaan ja alavirtaan tandem-toisto (TR) domain kloonattiin ja ilmaistiin kuvattu Materiaalit ja menetelmät sekä kutsutaan MUC4-α-N-ter ja MUC4-α-C-Ter, vastaavasti. Nukleotidinumerot vastaavat rajat rekombinantti domeenien on merkitty, ja niitä kuvataan Moniaux et ai. ja Choudhury et al (viite 1 ja 24, vastaavasti) mukaan alkuperäinen numerointi. Cys-kysteiini-rikas domain EGF-kasvutekijän kaltaisen domeenin; TM-transmembraanidomeeni; CT-sytoplasmahännän. b) ELISA osoittaa reaktiivisuutta anti-MUC4 MAb: t ja rekombinantti-immunogeenejä. Ilmoitettu MAb: t inkuboitiin 2,5 ug /ml GST-merkityn N-terminaalin ja tandem-toisto rekombinantti domeenit MUC4. Erityispiirteet testattiin myös vastaan ​​MUC4 TR peptidi, GST ja epäspesifinen kontrolli-proteiinin naudan seerumin albumiinia ja vasta-aineet osoittivat negatiivista reaktiivisuutta näitä antigeenejä vastaan. Määritys myös epäspesifinen isotyyppiä ohjaus K2G6.

Vasta-aineita testattiin edelleen niiden kyky spesifisesti tunnistavat MUC4 proteiinin solulysaateista MUC4 ilmentävien haimasyövän solulinjoissa immunoblottauksella. Seitsemän MUC4α-N-Ter-spesifisten vasta-aineiden vain MAb: t 2214, 2175 ja 2382 tunnustettu MUC4 proteiinin solulysaateista (kuvio 2). MAb: t 2215 ja 2382 kirjattu suuren molekyylipainon proteiinin bändejä lysaateista MUC4 positiivisten solujen (HPAF /CD18, Colo357, QGP1 ja T3M4) (Fig. 2a ja 2c), ja reaktiivisuus kuvio oli samanlainen kuin anti-TR-MAb 8G7 (Fig. 2d). Kukin MUC4 positiivisissa solulinjoissa näytteillä tyypillisesti erillinen vyöhyke koko, joka on yhdenmukainen aiempien raporttien VNTR polymorfismien MUC4 kanssa HPAF /CD18, Colo357 ja QGP1 osoittaa yhden kaistan ja T3M4 ilmaistaan ​​kaksi bändejä (alleelinen VNTR polymorfismi). Toisin kuin MAb: 2175, 2382 ja 8G7, MAb 2214 reagoivat pääasiassa kanssa pienimolekyylipainoisen muodossa MUC4 mutta juovakuvio vastaava VNTR polymorfismi (kuva 2b). Mab 2214 osoitti myös erittäin heikkoa reaktiivisuutta suurimolekyylipainoinen bändi, jotka vastaavat tunnustettuja muiden vasta vuonna QGP1 ja T3M4 lysaatit. Immunoblottianalyysi β-aktiini on SDS-PAGE ratkaistu lysaatit osoitti yhtä suuri Proteiinilisäyksen (kuvio 2, upotus). Reaktiivisuutta ei havaittu mitään vasta-aineen lysaatin MUC4 negatiivinen solulinja MiaPaca. Mikään anti-MUC4α-C-Ter vasta-aineet reagoivat MUC4 solulysaateissa immunoblottauksessa (tuloksia ei ole esitetty).

yhteensä 20 ug proteiinia solu-uutteista erotettiin elektroforeesilla 2% SDS-agaroosigeelillä, siirrettiin PVDF-membraanille, ja inkuboitiin 2 ug /ml MAb: 2175 (a), 2214 (b), 2382 (c) tai 1 ug /ml anti-MUC4 TR Mab 8G7 (d). Sitten membraania koetettiin piparjuuriperoksidaasi-leimattua vuohen anti-hiiri-immunoglobuliini. Signaali havaittiin käyttämällä ECL reagenssikittiä. Asentoa havaittua juovaa on osoitettu nuolilla. Lastaus ohjaus, immunoblot havaitsemista varten β-aktiini (upotettu a) tehtiin lysaatit vastaavien solujen päätti 10% SDS-PAGE.

Vasta-aineiden kykyä tunnistaa MUC4 ehjässä solut tutkittiin immunofluoresenssilla ja virtaussytometria. Vuonna metanoli kiinteän ja läpäiseviksi määritys HPAF /CD18-solujen kaikki valitut MAbien näytteillä erityisiä värjäyksen MUC4; ei värjäytymistä ei havaittu kontrolli anti-KLH-vasta-ainetta K2G6 (kuvio 3). MAb 2214 osoitti sekä kalvo ja perinuclear värjäys, kun taas MAb: 2175, 2382 ja 2106 osoitti sytoplasman ja solukalvojen värjäytymistä. Anti-TR MAb 8G7 osoitti vahvinta reaktiivisuus johtuen toistuvan luonteen epitooppeja. Edelleen, yksikään vasta-aineita ei esiintynyt reaktiivisuutta MUC4 negatiivinen haimasyöpä solulinjoja MiaPaca tai Panc1 (tuloksia ei ole esitetty). Solun pinnalla värjäys, parformaldehyde-kiinteä (unpermmeabilized) soluja käytettiin ja sitovat vasta-aineiden analysoitiin virtaussytometrialla. MAb 2214 esillä vahvin reaktiivisuus solun pinnalla paraformaldehydillä kiinnitettyjen solujen, kun taas pinnan reaktiivisuus MAb: 2175 ja 2382 oli heikko ja keskimääräinen fluoresenssin intensiteetti (MFI) arvot olivat verrattavissa arvoihin, jotka saatiin MAb 8G7 (kuvio 4).

Soluja kasvatettiin alhaisen tiheyden on steriloitu kansi-dioja, kiinteä jääkylmässä metanoli -20 ° C: ssa ja inkuboitiin 10 ug /ml ei-TR monoklonaalisia vasta 2214, 2175, 2382 ja 2106, tai 2 ug /ml anti-MUC4 TR MAb 8G7 (Control) ja havaittiin käyttäen FITC konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta. Anti-KLH-vasta-aine K2G6 käytettiin isotyyppikontrolli. Solut asetettiin lasilevyille käyttäen anti-fade Vectashield kiinnitysväliaine ja tarkkailtiin Zeiss konfokaali laserskannaus mikroskoopilla (suurennos, x 630).

Solut kerättiin ei-entsymaattisesti, kiinnitettiin paraformaldehydillä ja inkuboitiin jossa mainituilla vasta-aineilla. Kanssa inkuboinnin jälkeen sekundaarinen vasta-solut analysoitiin käyttämällä BD FACSCalibur. Keskimääräinen fluoresenssin intensiteettiä (MFI) arvot, jotka saatiin kunkin vasta-aineen on osoitettu parantheses.

domain-specific anti-MUC4 vasta-aineita testattiin myös niiden kyky immunosaostaa MUC4 käyttäen HPAF /CD18 lysaattia. MAb: 2382 2175, ja 2214 immunosaostettiin täyspitkä MUC4 päässä kokosoluliuotteissa joka visualisoitiin kun käsitellyt näytteet erotettiin SAS-agaroosigeelillä ja immunoblotattu anti-MUC4-TR MAb 8G7 (kuvio 5). Immunosaostetut näytteitä eri vasta-aineet myös immunoblotattiin MAb 2214, koska se on hallitseva reaktiivisuus on pienempi molekyylipaino muodossa MUC4. Kun koetettiin MAb 8G7, korkein määrä MUC4 immunosaostettiin 8G7, kun taas MAb 2382 johti myös huomattava rikastuminen 8G7 reaktiivisen proteiinin bändejä. MAbit 2175 ja 2214 myös immunosaostettiin täyspitkän 8G7 reaktiivinen bändi mutta rikastumista ei ollut niin vahva kuin havaittiin MAb: 8G7 ja 2382. Anti-C-terminaali MAb 2106 ja negatiivinen kontrolli anti-KLH-vasta K2G6 ei vedä alas mitään 8G7 reaktiivista proteiini bändi. Kuitenkaan yksikään testatuista vasta-aineita lukuun ottamatta 2214, immunopecipitated MAb 2214-reaktiivisen pienimolekyylipainoisen muodossa MUC4.

Protein lysaatit päässä MUC4-ilmentävät CD18 /HPAF solut immunosaostettiin käyttäen 5 ug /ml 8G7 ( Tandem toista MAb), 2382, 2214 ja 2175 (Non-tandem repeat MAb: t) ja K2G6 (isotyyppiä kontrolli MAb) ja immunoblotattiin käyttämällä MAb: 8G7 ja 2214 kuvatulla Materiaalit ja menetelmät.

vasta-aineiden kykyä tunnistaa MUC4 kasvainkudoksissa testattiin immunohistokemiallisella analyysit, jotka suoritettiin haimasyöpä kudoksiin. MAb: t 2214, 2175 ja 2382 osoitti positiivista värjäytymistä kasvaimessa kudos, joka määritettiin olevan MUC4 positiivinen perustuen sen reaktiivisuus anti-TR MAb 8G7 (kuvio 6). Kuvio värjäytymisen uuden vasta-aineilla oli samanlainen kuin havaittiin 8G7 osoittaa diffuusia värjäytymistä sekä kalvon ja sytoplasmaan syöpäsoluja. Värjäytymistä ei havaittu Mab 2106 tai epäspesifinen isotyyppiä kontrolli-MAb K2G6.

Parafiinisektioista inkuboitiin osoitetun testi- ja kontrollivasta-aineita, ja sitoutuminen havaittiin käyttämällä VECTOR Universal värjäystä Kit. MAb 8G7 käytettiin pitoisuutena 2 ug /ml, kun taas kaikki muut vasta-aineita käytettiin pitoisuutena 10 ug /ml.

Keskustelu

MUC4 on suuri glykoproteiini mukana fysiologian ja sekaantunut eri sairaustiloissa. Erityisen tärkeä on sen rooli haimasyövän kehitykseen ja etenemiseen [2], [26], [27]. Useat viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet roolin transmembraanisen musiinituoton MUC4 patogeneesissä useiden syöpäsairauksia. MUC4 koostuu kahdesta domeenista, nimittäin MUC4α joka on tandem-toistoalueen ja MUC4β, joka on trans-kalvon alue, ja lisäksi sillä kasvutekijän kaltaisia ​​domeeneja [1], [2]. Johtuen polymorfismi tandem-toistojen lukumäärä [28] ja että on olemassa eri jatkos muotoja täysin vailla TR verkkotunnuksen [25], vasta-aineet tunnustaa ei-tandem-toisto alueilla proteiini, joka voisi antaa hyödyllistä tietoa sen toiminta mahdolliset vuorovaikutuksessa kumppanit ja ennen kaikkea voidaan käyttää kvantitatiivisissa määrityksissä.

Kolme vasta-aineiden vastaan ​​alueen ylävirtaan Keski TR domain 2214, 2175 ja 2382, ja yksi muodostettuja vasta-aineita vastaan ​​alavirtaan TR verkkotunnuksen, 2106 osoitti vahvaa reaktiivisuus vastaan ​​kunkin yhdistelmä-verkkotunnuksia ELISA. Mikään vasta-aineet tunnistavat ei-spesifisiä rekombinantti-domeeneja, GST tai synteettisiä TR peptidejä. Nämä vasta-aineet voivat mahdollisesti olla hyödyllisiä reagensseina kehittämiseen MUC4 biologisissa määrityksissä ja voi täydentää olemassa olevia anti-MUC4 TR-vasta-aineen tai muiden reaktiivisia vasta-aineita vastaan, hiilihydraatin läsnä olevien epitooppien musiinit (DUPAN2, CA 19,9, TAG 72). Kasvava todistusaineisto viittaa siihen, että MUC4 musiinin, koska sen yli-ilmentymisen useissa pahanlaatuinen kasvain on potentiaalinen markkeri diagnoosia [27], etenkin tappava haimasyövän jossa sen yhdessä varhaisen uudisvaurioiden on todettu [29]. Toinen tuore tutkimus on osoittanut MUC4 olevan uusi ennustetekijä of maksanulkoisen sappitiehyen syöpä [22]. MUC4 ilmentyminen korreloi huonoon ennusteeseen pienikokoisissa keuhkoadenokarsinooma [30]. Kaikki nämä tutkimukset ovat osoittaneet, että MUC4 voisi olla avainasemassa kasvainten synnyssä; kuitenkin, kaikki näissä tutkimuksissa on analysoitu MUC4 kudosnäytteistä, jotka voivat rajoittaa otantavirheiden, johtuen heterogeeninen ilmentyminen kasvaimen antigeenejä. Siksi olisi loogista kehittää kvantitatiivisia määrityksiä MUC4 biologisissa nesteissä, mikä on ei-invasiivisia, kustannustehokas ja helposti automatisoida. Johtuen muuttujan koko peräkkäisten toistumien alueella, tunnistavaa vasta-ainetta peräkkäisten toistumien alueella ei voitu käyttää kvantitatiiviseen tarkoituksiin. Verkkotunnuksen spesifisiä vasta-aineita voidaan mahdollisesti tukea kehittämisessä

in vitro

diagnostisissa määrityksissä kvantitoimiseksi MUC4 seerumissa ja muissa biologisissa nesteissä.

Kaikki vasta-aineet, jotka reagoivat alueen ylävirtaan MUC4 TR verkkotunnuksen pystyivät tunnistaa MUC4 solun lysaatit MUC4 ilmentäviä haima- syöpäsoluja. MAbit 2175 ja 2382 kirjattu täyspitkä MUC4, joilla on korkea molekyylipaino, jossa bändi kooltaan samanlainen kuin tunnustettu anti-TR MAb 8G7. Ero signaalin voimakkuuden ei-TR ja TR-vasta-aineita voitaisiin katsoa johtuvan saatavilla olevien epitooppien lukumäärä, että MAb sitoa, koska 8G7 tunnistaa peräkkäisten toistumien alue, joka on esitetty useita kertoja jokaisessa molekyylissä, kun taas epitoopit tunnustettu 2175 ja 2382 ovat edustettuina vain kerran molekyyliä kohti. Sitä vastoin Mab 2214 osoitti vahvaa tunnustamista proteiinin kaistan pienempiä kuin tunnustettu MAb: t 8G7, 2175 ja 2382. Vaikka niiden alemman molekyylikoon taajuusalueita kuvasti alleelivariaatiota näytteille täyspitkän MUC4 vastaaville solulinjoja , mikä viittaa siihen, että Mab 2214 mahdollisesti reagoi epäkypsä tai underglycosylated muodossa MUC4. Hyvin heikkoa vyöhykettä, jotka vastaavat suuren molekyylipainon kypsä proteiini oli havaittu edelleen QGP1 ja T3M4. Vahvempi signaalin voimakkuus Mab 2214 alemman bändit voisi johtua runsaasti kehittymätön MUC4 proteiinin syöpäsoluja. Syöpäsoluissa se on vakiintunut, että koska poikkeava ja tehoton glykosylaation, musiinien ovat hypoglycosylated ja nämä epäkypsä muotojen jatkuvasti issa toistuvien sisäistämisen, tuloksena on enemmän kehittymätön muodossa kuin kypsä muoto. Kuitenkin kalvolla deglykosylaatio (entsymaattisella tai kemiallisella) on ratkaistu proteiinijuovia ei reaktiivisuuden parantamiseksi Mab 2214 kypsän MUC4 nauhojen (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin paraformadehyde kiinnitettyjä soluja, MAb 2214, osoitti suurinta reaktiivisuus solun pinnalla. Kehittymätön proteiini tuskin on läsnä solun pinnalla, ja mahdollisesti tallennuksesta solujen paraformaldehydin altistuvat MAb 2214 reaktiivisen epitoopin. Lisäksi luonnehdinta alhaisen molekyylipainon muodossa MUC4 reaktiivinen MAb 2214 on käynnissä.

Immunofluoresenssianalyysi osoitti spesifistä värjäytymistä varten MUC4 kalvoissa sekä sytoplasman osastoissa HPAF /CD18-soluihin. Värjäyssarjaan oli verrattavissa anti TR MAb 8G7 ja niiden erityismerkitys MUC4 päätelmää tukevat puute signaalin MUC4 negatiivisissa soluissa. Perinuclear värjäytyminen Mab 2214 edelleen tukee sen reaktiivisuus epäkypsä proteiini.

Koska sen suuren koon ja multi-domain organisaatio, MUC4 voi mahdollisesti vuorovaikutuksessa monien proteiinien ja näistä yhteisvaikutuksia voi olla avain eri toimintojen johtuvan että MUC4. Sen vuorovaikutusta HER2 ja toiminnallinen merkitys tämä vuorovaikutus on hyvin tutkittu [31], [32]. On kuitenkin olemassa monia muita mahdollisia vuorovaikutuksessa olevaa kumppaneiden MUC4, että voisi olla tärkeä rooli moduloimaan tai välittämään MUC4 toiminto. MAbit 2175 ja 2382 pystyivät immunosaostamaan MUC4 proteiinin solulysaateista on HPAF /CD18 soluja ja voivat siten auttaa eristämistä ja tunnistamista ylimääräisten MUC4 vuorovaikutuksessa kumppaneita. Edelleen, hallitseva reaktiivisuus MAb 2214 alentaa molekyylipainon MUC4 on viittaavia erimuotoista MUC4 jonka kanssa rinnakkaista kypsää proteiinia. Jos, itse asiassa se on epäkypsä muoto proteiinin, niin MAb 2214 saattavat auttaa eristämistä erilaisia ​​uusia vuorovaikutuksessa kumppaneita, jotka voivat olla vuorovaikutuksessa tämänkaltaisen MUC4 ja purkaa sen toiminnallinen merkitys.

MAbs 2214, 2175 ja 2382 myös tunnustettu MUC4 ilmaistu syövän kudoksissa immunohistokemiallisella analyysillä reaktiivisuusprofiilin samanlaisia ​​kuin anti-TR Mab 8G7. Mikään tavanomaisen haiman kanavat värjättiin, mikä on sopusoinnussa meidän aiempia tutkimuksia, jotka ovat osoittaneet puuttuminen MUC4 ekspression ei-neoplastisten kanavat. Uusi vasta-aineet voivat olla käyttökelpoisia työkaluja vahvistaa saatujen tulosten 8G7, mikä viittaa siihen, yliekspressio MUC4 eri syöpäsairauksia. Edelleen, koska ei-toistuvat luonteen reaktiivisen epitoopin, äskettäin kehitetty vasta saadaan entistä kohtuullinen mitta laajuuden yli-ilmentymisen hylkäävät vaikutukset VNTR polymorfismin. Anti-TR-vasta 8G7, voisivat kuitenkin suurempi herkkyys havaitsemisen takia moninaisuus epitooppeja. Siten yhdistelmä anti-TR ja anti-non TR MUC4 vasta-aineet voivat tarjota parempaa tietoa laajuudesta MUC4 yli-ilmentymisen kasvainkudoksessa.

toimilla halutaan tutkia suoraan estävät vaikutukset vasta-aineiden syövän solujen kasvua, liikkuvuuteen ja invaasio molemmissa

in vitro

ja

in vivo

olosuhteissa. Meidän viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että MUC4 edistää chemoresistance haiman syöpäsoluissa aktivoimalla anti-apoptoottisia reittejä ja solun eloonjäämisen edistämisessä [15]. Siksi se kiinnostaa tutkia vaikutusta anti-MUC4 vasta apoptoosin syöpäsoluissa ja kasvattavat herkkyyttä kemoterapeuttisten. Edelleen, näitä vasta-aineita on myös arvioitava niiden käyttökelpoisuutta radioimmunodiagnosis ja radioimmunoterapiassa of MUC4 yli-ilmentävät kasvaimet. Funktionaaliset tutkimukset käyttäen ei-tandem-toisto-MAb: voi todennäköisesti antaa ymmärtää paremmin MUC4 mekanismeilla syövän etenemiseen. Nämä vasta-aineet voivat myös tukea ymmärtämistä MUC4 rakenne-toiminta-suhteiden sääntely ilmaisun ja mahdollisesti tunnistaa todennäköinen vuorovaikutuksessa kumppani kasvain solun pinnalla, mikä saattaa olla syynä metastaattisen fenotyypin.

Yhteenvetona tutkimuksemme osoittavat, että MAb: t 2175 ja 2382 ovat erittäin spesifisiä havaita ei-tandem-toistoalueen limakalvon MUC4 eri immunomäärityksiä. Nämä verkkotunnuksen erityisiä vasta-aineita ovat hyödyllisiä reagensseina kehittää kvantitatiivisia analyyseja, ja ne ovat arvokkaita työkaluja tutkimaan MUC4 rakenne-toiminta-suhteiden ja mahdollisesti kohdistaa MUC4 varten kiinteiden tuumorien hoidossa, jotka yliekspressoivat MUC4.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

eläinten käyttö immunisoimiseksi ja eristämiseen pernan hyväksyi Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) Protocol # 94-025-12 otsikolla ”monoklonaalinen vasta-aine Core Facility Immunisointimenettely” .

Ihmisen haiman kasvainten kudokset saatiin University of Nebraska Medical Center (UNMC) kudospankki ja niiden käyttö hyväksyttiin kautta UNMC Institutional Review Board (IRB) hyväksynnän # 491-97-EX.

Generation rekombinantti MUC4 domeenien

alueiden MUC4-α kummallakin puolella TR domeenin kloonattu ja ilmennetty, ja puhdistettuja proteiineja käytettiin immunogeeneinä. Alukkeet suunniteltiin käyttämällä MUC4 sekvenssin AJ000281 monistamiseksi fragmenttien nukleotidit 587-3361 [MUC4α-Amino Terminal (MUC4α N-ter)] ja nukleotidit 1-1293 [MUC4α-karboksiterminaalinen (MUC4α C-ter), joka edustaa alueita välittömästi ylävirtaan ja alavirtaan TR domain, vastaavasti (kuva 1a). BamHI ja EcoRI-restriktiokohdat lisättiin eteenpäin ja reverse-alukkeita, vastaavasti, mikä mahdollistaa in-frame kloonauksen GST ja trombiinikatkaisukohdan pGEX-2TK-vektoriin (Pharmacia). Monistaminen tehtiin Expand Long RT-PCR-järjestelmä (Roche), kuten aikaisemmin on kuvattu käyttäen JER103 ja JER109 templaatteina sekvenssin AJ00281 ja AJ010901, vastaavasti [1]. Konstruktit sekvensoitiin vahvistamaan asianmukaisen lukukehyksen ja säilytetään E. coli BL21 (New England Biolabs Inc.). 5 ml: n yli yön esiviljelmä kutakin yhdistelmä-DNA-kantaa käytettiin siirrostamaan 1 litraan 2 x YTA väliainetta (16 g tryptonia, 10 g hiivauutetta ja 5 g NaCl: a 900 ml: aan deionisoitua vettä, 100 ug /ml ampisilliinia), ja kasvanut sekoittaen 37 ° C 3-4 tunnin päästä absorbanssi 260 nm: ssä välillä +0,6-+0,8, indusoitiin 0,1 mM IPTG: ia, ja viljeltiin lisäämällä 3-4 tuntia. Viljelmät sentrifugoitiin ja pestiin kolme kertaa jääkylmässä PBS: ssä, suspendoitiin uudelleen 5 ml: aan jääkylmää PBS: ää, ja sonikoitiin. Proteiini lysaatit kirkastettiin sentrifugoimalla ja suodattamalla 0,22 um: n suodattimen. Lysaatit läpi 5 ml Glutathione Sepharose Fast Flow -pylvääseen (Pharmacia), pestiin kolme kertaa 5 pylvään tilavuudella PBS: ää, ja eluoitiin 10 ml: lla 15 mM pelkistettyä gluthatione. Eluointifraktiot 1 ml kerättiin ja 5 ui näyte kutakin fraktiota eroteltiin 10% SDS-PAGE, ja proteiinia, jotka havaitaan Coomassie blue -värjäyksellä. Fraktiot, jotka sisälsivät puhdasta GST-fuusioproteiinit yhdistettiin ja kvantitoitiin käyttäen BIO-RAD D /C-proteiinin arviointi kit (BIO-RAD).

Hiiren immunisointi

immunisointi ja valinta-MAb: tä suoritettiin käyttämällä vakiintuneiden menetelmien UNMC Vasta Core Facility [17]. Lyhyesti, erillistä ryhmää hiiriä (BALB /c) immunisoitiin toistuvasti IP-injektioita yhdistelmä-GST-fuusioproteiinien MUC4α-N-Ter ja MUC4α-C-Ter kahden viikon välein. Kussakin ryhmässä, immunisointi rekombinantti proteiini vuorottelevat lysaatin MUC4 positiivinen HPAF /CD18 ihmisen haimasyövän soluja [17]. Näiden hiirten seerumi arvioitiin suoran sitoutumisen määrityksissä vasta-aineen reaktiivisuus rekombinanttia MUC4 fuusioproteiini, ja GST käytettiin negatiivisena kontrollina. Kun sopiva vasta-ainevaste havaittiin ELISA, eläimille annettiin viimeinen tehosteannos injektoimalla yhdistelmä-DNA-proteiinin neljä päivää ennen veren päästämisen ja pernan poistoa. Pernasolut eristettiin ja fuusioitiin NS-1 ja /tai Sp2 /0-myeloomasolujen kanssa. Tuottavat hybridoomat kiinnostavia vasta-aineita, valittiin seulomalla spesifisen vasta-aineen sitoutumisen immunogeeniä kohteisiin (rekombinanttiproteiinien ja HPAF /CD18 lysaatti) ja sitoutumisen puuttumisen merkitystä ohjaus antigeenejä (GST: n ja BSA).

seulonta MUC4-positiiviset hybridoomat

Immulon levyjä päällystettiin 50 ui antigeenisen valmisteen (MUC4 rekombinanttiproteiineja tai GST: n tai proteiinin teissa MUC4 positiivinen solulinjoja) pitoisuutena 2,5 ug /kuoppa bikarbonaattipuskurissa (pH 9,6 ). Levyjä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa. Levyt pestiin PBST: llä ja vapaa sitoutumiskohdat kaivojen tyydyttynyt poistaa ei-spesifisen sitoutumisen immunoglobuliinien inkuboimalla 200 ul /kuoppa 2% rasvatonta rasvaton maito PBS: ssä 2 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja levyt pestiin PBST: llä. Sata ui supernatanttia siirrettiin kuoppiin soluviljelylevyille vastaaviin kuoppiin ELISA-levyjä. Hiiren pre-immuuniseerumia käytettiin negatiivisena kontrollina jokaisessa määrityksessä, inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa, ja sitten levyt pestiin jälleen PBST: llä. Sata pl /kuoppa peroksidaasiin konjugoitua vasta-ainetta (anti-hiiri-HRP: tä, Amersham Biosciences, 1:2000 laimennos PBS: ssä) lisättiin ja inkuboitiin 1 h 37 ° C: ssa. Levyt pestiin PBST: llä ja 100 ui TMB-substraattia (Dako Substrate) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 37 ° C: ssa. Reaktio lopetettiin lisäämällä 100 ui 2 M rikkihappoa ja levyt skannattiin 450 nm: ssä Biotech ELISA-levyn lukijalla.

immunosaostus

Protein lysaatit päässä MUC4 ilmentävien HPAF /CD18-solut immunosaostettiin käyttäen 5 ug /ml 2382, 2214, 2175, 8G7 (anti-TR-vasta-aine), ja K2G6 (isotyyppiä kontrolli-MAb reagoimaan KLH). Antigeeni-vasta-aine-komplekseja muodostuu purettiin käyttämällä Protein A /G-helmiä (Calbiochem) ja kompleksit solublized käyttämällä SDS-näytepuskuria, joka sisälsi 2-merkaptoetanolia. Näytteet erotettiin 2% SDS-agaroosigeelissä ja immunoblotattiin käyttämällä 8G7.

Immunoblottausmääritys

sarja haiman solulinjoja käsitellä proteiiniuutto ja Western blottaus käyttämällä standardimenetelmiä [17] . Lyhyesti, solut pestiin kahdesti PBS: ssä ja raaputettiin radioimmunosaostuskokeella (RIPA) puskuria [50 mM Tris, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl: a, 0,25% natriumdeoksikolaattia, 1% NP40: tä (pH 7,5)], joka sisältää proteaasi-inhibiittori-seosta (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa) ja fosfataasi-inhibiittorit (5 mM NaF ja 5 mM Na3VO4; Sigma Chemicals, St. Louis, MO), ja pidettiin 4 ° C: ssa vähintään 30 minuutin ajan.