Krooninen sairaus

tiivistelmä

RECEPTEUR d’origine Nantais (Ron) yli-ilmennetään paneelin haimasyöpäsoluissa ja kudosnäytteitä haimasyövän potilaille. Ron voidaan aktivoida sen ligandin makrofagin stimuloiva proteiini (MSP), ja aktivoi näin onkogeenisen signalointireittejä. Ylikuuluminen välillä Ron ja EGFR, c-Met tai IGF-1 R voi tarjota mekanismin taustalla lääkeresistenssin. Näin ollen, Ron saattaa edustaa uutta terapeuttista strategiaa. IMC-RON8 on ensimmäinen Ron monoklonaalinen vasta-aine (mAb) syöttämällä kliinisen tutkimuksen kohdentamiseksi Ron yli-ilmentymisen. Tutkimuksemme osoittavat, IMC-RON8 downmodulated Ron ilmentymistä haimasyöpäsoluissa ja merkittävästi estänyt MSP stimuloimaa Ron aktivointi, loppupään Akt ja ERK-fosforylaation, ja surviviinin mRNA ilmaisun. IMC-RON8 estyneet MSP aiheuttaman solumigraatio ja vähentää solutransformaatiota. Histonideasetylaasi-inhibiittorit (HDACi) raportoidaan kohdistaa ekspression eri geenien muokkauksella nukleosomeihin histonien ja ei-histoniproteiinien. Työmme osoittaa HDACi TSA ja Panobinostat (PS) väheni Ron mRNA ja proteiinin ilmentyminen haiman syöpäsoluja. PS vähensi myös alavirran signalointi Pakt surviviiniperäiset, ja XIAP, sekä tehostettua solujen apoptoosin. Mielenkiintoista, PS vähensi pesäkkeenmuodostusta Ron knockdown soluissa suuremmassa määrin kuin Ron scramble ohjaus solujen pesäkkeiden muodostumisen ja pehmeä agaroosi määrityksissä. IMC-RON8 voi myös herkistää haimasyöpäsoluissa PS, mikä heijastuu vähensi pesäkkeiden numeroita ja koko yhdistettynä käsittely IMC-RON8 ja PS verrattuna hoitoon yksinään. Yhteistyössä hoito vähentää edelleen Ron ilmaisun ja Pakt, ja lisääntynyt PARP pilkkominen verrattuna jompikumpi hoito yksinään. Tämä tutkimus viittaa siihen mahdollisuuksia uuden yhdistelmän lähestymistapaa, joka voi lopulta olla arvokkaita hoidossa haimasyöpä.

Citation: Zou Y, Howell GM, Humphrey LE, Wang J, Brattain MG (2013) Ron Knockdown ja Ron monoklonaalinen vasta-aine IMC-RON8 herkistää Haimasyöpä on histonideasetylaasi- estäjät (HDACi). PLoS ONE 8 (7): e69992. doi: 10,1371 /journal.pone.0069992

Editor: Lu-Zhe Sun, University of Texas Health Science Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 29 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 13 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 29 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Zou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Institutes of Health rahoitusta: CA34432, CA38173, CA72001 ja CA54807, myönnetään MG Brattain. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on erittäin pahanlaatuinen sairaus, jossa on noin 40000 uutta tapausta diagnosoitiin Yhdysvalloissa vuonna 2012 [1]. Viiden vuoden eloonjääminen on hyvin alhainen (alle 5%) [2]. Tällä hetkellä alle 10% potilaista ovat oikeutettuja parantavaa leikkausta, kun taas yli 90% paikallisesti levinnyttä tai metastaattista sairauksia hoidetaan sädehoidon ja /tai kemoterapian [3]. Haimasyöpä lopulta kehittyy vastustuskykyä näitä hoitoja. Molecular tutkimukset paljastivat, että geneettiset ja epigeneettiset muutokset ajaa haimasyöpä [4]. Parempi ymmärtäminen molekyylitasolla haimasyövän hyödyttää kehittää uusia terapeuttisia strategioita.

Äskettäin Ron on todettu yliekspressoituvan osajoukko haiman syöpäpotilaiden ja vahvistettu syöpäsolulinjoissa [5], [ ,,,0],6]. Ron kuuluu MET Reseptorityrosiinikinaasin (RTK) perhe. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että Ron tasot ovat kohonneet monissa epiteelisyövissä lukien rinta- [7], paksusuolen [8], keuhko [9], ja virtsarakon [10] syöpiä. Ron yliekspressio oli ennustetekijöiden huonosta selviytymisen ja korreloivat taudin etenemiseen [11].

Funktionaaliset tutkimukset osoittivat, että Ron voidaan aktivoida sen ligandin MSP aloittaa lukuisiin molekyyli signalointi, kuten PI3K /Akt, MAPK, β kateniinin, JNK ja FAK polkuja säädellä solujen eri toimintojen [12]. MSP /Ron akseli on osoitettu vaikuttavan solujen vaeltamiseen ja invaasiota, ja mahdollisesti edistää tuumorietäpesäke [12], [13]. Downregulation Ron mukaan Knockdown johti alentuneeseen solujen lisääntymisen, transformaatio, kasvaimen kasvu, etäpesäke ja lisääntynyt solujen apoptoosin, paksusuolen syöpäsoluissa [14], [15]; ja säteilyherkälle haimasyöpäsoluissa gemsitabiiniannokseen [16]. Näin ollen, Ron on tärkeä rooli ylläpitää pahanlaatuisen fenotyyppejä ihmisen syövissä. IMC-41A10 oli ainoa ihmisen anti-Ron mAb, joka on raportoitu olevan syövän vastaista aktiivisuutta [17]. IMC-41A10 esti MSP sitoutumisen Ron, vähentää MSP välittämän Ron fosforylaatio, PI3K /Akt ja MAPK aktivointi, ja solumigraatio

in vitro

. Äskettäin uusi ihmisen mAb IMC-RON8 synnytettiin ja siirtyi vaiheen I kliinisen tutkimuksen ensimmäisenä Ron mAb.

Lääkeaineresistenssi on merkittävä este syöpähoitojen. Ylikuuluminen välillä RTK voi edustaa yksi mekanismeja lääkeresistenssin. Ron on raportoitu hetero-dimerisoituvat kanssa c-Met [18], ja cross-talk EGFR [19], [20] aktivoi RTK vastavuoroisesti tavalla. Integriini ja IGF1-R voi myös aktivoida Ron kautta MSP-riippumattomalla tavalla [21], [22]. Yliekspressio Ron lisääntynyt huumeiden vastustuskykyä IGF1-R-estäjä BMS-536924 lapsuudessa sarkooma [23]; kun taas Knockdown Ron herkisti resistenttien solujen BMS-536924 [23]. Nämä havainnot korostavat potentiaalinen hyöty järkevä yhdistelmä hoitojen perustuu Ron tyrosiinikinaasin verkoissa.

Epigeneettiset muutoksia, kuten asetylointi ja metylointi, ovat keskeisiä translaation jälkeiset modifikaatiot latautuneita lysiinitähteiden ydin nukleosomaalisten histonien. Muutokset histoni asetylaatio ovat sen valvonnassa vastakkaisten toimintojen histoni acetytransferases (HAT) ja histonideasetylaaseja (HDAC: t) [24], jotka määräävät transkription aktivaation tai repression geeniekspression. HAT ja HDAC: t on myös tärkeä rooli asetylointi ja deasetylointi ei-histoni-proteiinien [25], [26].

yli-ilmentyminen HDAC: iden on havaittu paksusuoli-, rinta-, haima-, ja muut syövät [27] – [31], mikä viittaa siihen, että ne voivat olla houkuttelevia syövän vastaisia ​​tavoitteita. HDAC-inhibiittorit ovat raportoitiin kohdistaa ekspression eri geenien muokkauksella nukleosomeihin histonien ja ei-histoniproteiinien. Yleiseurooppalainen HDACi TSA, Vorinostat, Belinostat ja Panobinostat (PS) on laajalti tutkittu. PS aiheutti vankka syöpää ehkäisevistä vaikutuksista leukemiasoluissa kautta hyperasetylaation nukleosomin histonien ja transkription säätelyä p21 ja p27 ilmaisun [32]. PS vähensi haimasyövän kasvua estämällä solujen lisääntymisen ja induktion apoptoosin [33]. TSA tehostettu vaste haimasyövän soluja tavanomaisen kemoterapian, mukaan lukien 5-FU: n ja gemsitabiinin [2], [34]. Kuitenkin tarkka mekanismeista HDACi hoito ovat suurelta osin tuntemattomia. Meidän lab osoitti, että HDACi Belinostat indusoi ilmentymisen epigeneettiseltä hiljainen TGFp RII ja siten palauttaa TGFp signalointi-välitteistä solujen kasvun estäminen in Smad4 villityypin (wt) haimasyövän soluja (esim MiaPaca-2), [35]. Ron ilmentyy erittäin Smad4 mutantti haimasyövän soluja. Villityypin Smad4 ilmentymistä raportoitu tukahduttaa Ron ilmaisun [36]. Knockdovvn Smad4 tai esto TGFp signaloinnin johti induktioon Ron ilmaisua. Tutkimukset tässä osoittavat, että HDACi PS ja TSA vaimentua Ron ja sen loppupään signalointi haiman syöpäsoluja. Ron KD tai Ron mAb herkistynyt haimasyöpäsoluissa PS. Suun PS on käytetty vaiheen II kliinisessä tutkimuksessa aikuisilla potilailla, joilla on tulenkestävä /uusiutunut Hodgkinin lymfooma ja vaiheen I kliinisestä tutkimuksesta kokeneille kiinteä kasvain [32]. Tutkimuksemme ovat tutkittu mahdollisen mekanismin taustalla PS hoitoon haimasyövän ja antanut merkittävää näyttöä potentiaalin järkevä yhdistelmähoidon Ron ilmentävien haiman syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Cultures

Ihmisen haimasyövän solulinjoissa Capan-1 ja CFPAC-1 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD), ja L3.6pl solut ovat peräisin tohtori IJ Fidler [37]. Soluja viljeltiin SM väliaineessa (McCoyn 5A seerumittomassa väliaineessa pyruvaatin, vitamiineja, aminohappoja ja antibiootteja), jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Kaikki soluja pidettiin kosteutetussa ilmakehässä ja 5% CO

2 37 ° C: ssa.

Vasta-aineet ja reagenssit

Vasta-aineet Ron C-20, surviviini, MAPK ja pERK1 /2 ostettiin Santa Cruz Biotechnology Inc. Poly- (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP), Pakt (Ser

473), Akt, kaspaasi 9-vasta-aineita saatiin Cell Signaling Technology. XIAP vasta-aine oli peräisin Abcam. Anti-pTry klooni 4G10 hankittiin Millipore. Vasta-ainetta aktiinin ostettiin Sigma.

Rekombinantti ihmisen MSP ostettiin R

0,05. Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa itsenäisesti.

Tulokset

IMC-RON8 Downmodulated Ron Expression ja Inhibioitu MSP-riippuvaisen Ron fosforylaatio ja loppupään Signaling

vaikutuksen arvioimiseksi IMC- RON8 Ron ekspressiota Ron yli-ilmentäviä haima- syöpäsoluja, Capan-1 ja CFPAC-1-soluja käsiteltiin 100 nM IMC-RON8 eri aikavälein ja sen jälkeen western blot -analyysillä. Kuva 1A osoitti, että Ron lieveneminen jatkui jälkeen 4h hoidon IMC-RON8 ja kesti jopa 48 tuntia molemmissa solulinjoissa. IMC-RON8 arvioitiin sitten sen kyky estää Ron aktivointi ja sen alavirran efektoreja, MAPK ja Akt. CFPAC-1-soluja seerumia yli yön ja käsiteltiin IMC-RON8 seurasi MSP stimulaatio 30 minuuttia. Tulokset IP (Fig. 1 B) osoittivat, että IMC-RON8 itse ei indusoi Ron fosforylaation, mikä osoittaa, että IMC-RON8 ei ollut agonistia vaikutuksia. Tyrosiinifosforylaatiota Ron lisäsi merkitsevästi MSP stimulaation, mutta suurelta osin kumottu IMC-RON8 hoitoa. Aiemmassa tutkimuksessa on todettu, että MSP stimulointi aktivoi Ron alavirran signalointia PI3K /Akt ja MAPK haiman syöpäsoluissa [6]. Näin ollen tutkimme rooli IMC-RON8 on MAPK ja Akt-fosforylaation Capan-1, L3.6pl ja CFPAC-1-soluissa. Tuloksemme osoittivat, että kaikki haimasyövän solulinjoissa tutkimme osoitti voimakasta MSP-riippuvainen fosforylaatio Akt ja MAPK, ja että IMC-RON8 hoito esti MSP aiheuttaman Akt ja MAPK aktivointi kaikissa solulinjoissa (Fig. 1 C). Sen määrittämiseksi, ovatko Ron aktivointi voi lisätä surviviinin ja XIAP ilmaisun, käsittelimme Capan-1 ja CFPAC-1-solujen IMC-RON8 seurasi MSP stimulaatio 12 tunnin kuluttua seerumistarvaatio yön yli. Tulokset osoittivat, että MSP stimulointi kasvoi surviviinin mRNA: n ilmentymisen (Fig. 1 D), mutta ei XIAP mRNA-tasolla (tuloksia ei ole esitetty). IMC-RON8 voi estää tämän lisätä surviviinin mRNA ilmaisun. Emme havainneet merkittävää lisäystä XIAP ja Surviviiniproteiini ilmaisun jälkeen MSP stimulaation western blotting.

A) vaikutus IMC-RON8 (100 nmol) Ron ilme. Western blot Ron. β-aktiini toimi latauskontrollina. B) vaikutus IMC-RON8 MSP aiheuttama Ron aktivointia. Solut seerumia yli yön ja käsiteltiin IMC-RON8 1 ​​tunnin seurasi MSP stimulaatio puoli tuntia. Solulysaatit altistettiin IP, ja IB varten pron. C) vaikutus IMC-RON8 loppupään signalointi. Saman kohtelun kuin B). Western blot varten Perk ja Pakt. D) Ron aktivointi ja surviviinin mRNA: n ilmentymisen. Capan-1 ja CFPAC-1-soluja käsiteltiin IMC-RON8 seurasi MSP stimulaatio 12 tuntia sen jälkeen, kun seerumistarvaatio yli yön. RT qPCR suoritettiin kokonais-RNA määrittämään mRNA-tasolla surviviinispesifisten. GAPDH mRNA käytettiin sisäisenä kontrollina.

IMC-RON8 ehkäisi merkittävästi MSP-driven soluliikkuvuus

vaikutuksen arvioimiseksi IMC-RON8 on solun liikkuvuus, Transwell migraatiokokeessa suoritettiin Capan-1-solut, joissa IMC-RON8 hoidon läsnä ollessa tai poissa ollessa MSP. IMC-RON8 vähensi MSP- aiheuttamaa soluvaelluksen Capan-1-soluissa 80~90% (Fig. 2A).

In vitro

haavan paranemista määrityksissä vahvistivat lisäksi kyky IMC-RON8 estää solujen vaeltamiseen. Capan-1-soluja stimuloidaan MSP alkoivat siirtyä haava-alueen 24 tunnin kuluttua alusta (Fig. 2B). Haava oli lähes parantunut vaeltavien solujen 48 tunnin kuluttua MSP hoidon, kun taas IMC-RON8 vähensi merkittävästi solujen liikkuvuutta.

Capan-1-solut ilman seerumia yön yli. Solumigraation arvioitiin siirtokuoppaan määrityksessä MSP kuin kemoattraktantti in alaosaan. A) Kuvia solujen siirretty onnistuneesti pohjan puolelle transwell kalvo. B) kvantifiointi siirtynyt soluja. C.

In vitro

haavoja määrityksessä.

HDACi vaimentua Ron mRNA ja Protein Expression ja loppupään signalointi

vaikutuksen määrittämiseksi HDACi Ron ilme, Capan -1, L3.6pl ja CFPAC-1-soluja käsiteltiin pan-HDACi PS 8, 24 ja 48 tuntia. Tulokset osoittivat, että PS köyhdytettyä Ron ilmentymistä kaikissa Ron-ilmentäviä solulinjoja tutkittiin (Fig. 3A). Vähentäminen Ron Todettiin 8 tunnin kuluessa yhä ehtyminen esiintyvien yli 48 tunnin jaksoja (Fig. 3A). Tuntuva downregulation Ron nähtiin myös haimasyöpäsoluissa hoidetaan toisella yleiseurooppalaisen HDACi, TSA (Fig. 3B), mikä osoittaa, Ron vähentäminen on yhteinen ominaisuus Pan-HDACi hoitoa. Sitten määritetään, onko muutoksia Ron proteiinia olivat ainakin osittain muutoksista johtuvat sen transkription. Hoito PS vähensi mRNA taso Ron on ajasta riippuva tavalla (Kuva. 3C). Lisäksi solut, joita käsiteltiin pelkästään DMSO: lla (liuotin PS ja TSA) ei ollut vaikutusta Ron ilmentymisen sekä mRNA ja proteiini tasoilla. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että Ron fosforylaatio aktivoi kaskadin alavirran signalointimolekyylien kuten Akt-fosforylaation [6], [15], [17]. Me seuraavaksi määrittää vaikutukset PS loppupään solusignalointia. Capan-1, L3.6pl ja CFPAC-1-soluja käsiteltiin PS. Hoidon jälkeen 8 ja 24 tuntia, Akt fosfory- alennettiin pitoisuudesta riippuvalla tavalla kaikissa 3 haimasyövän solulinjoissa (Fig. 3d). PS hoitoa 24 ja 48 tunnin vähensi myös sekä XIAP ja surviviini-proteiini- tasojen pitoisuudesta riippuvaisella tavalla haiman syöpäsoluissa (Fig. 3d).

A) haimasyöpä soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla PS 8h, 24h, ja 48 tuntia. Western blot Ron suoritettiin. β aktiini toimi latauskontrollina. B) Soluja käsiteltiin TSA IB Ron. Huomattava määrä solut olivat kuolleet (noin 80%) in 1000 nM TSA saaneilla Capan-1 solujen 48 tuntia. C) Soluja käsiteltiin 50 nM PS: 8, 24 ja 48 tuntia. RT qPCR suoritettiin kokonais-RNA määrittämään mRNA tason Ron. GAPDH mRNA käytettiin sisäisenä kontrollina. D) Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla PS osoitetuissa aikapisteissä. Western blot varten Pakt, XIAP ja surviviinin ilme. B-aktiini käytettiin latauskontrollina.

PS Alennettu Cell kasvu ja solukuoleman kautta solusyklin Säädin p21 ja kaspaasiaktiivisuus

Funktio IAP perheenjäsenten XIAP ja surviviini on estää kaspaasi 3, 7, 9 toimintaa ja kaspaasiriippuvaisen apoptoosia sitoutumalla aktiiviseen kaspaasit [42]. Osoitamme, että sen jälkeen, kun 48 tunnin inkuboinnin PS vähentää solujen lisääntymistä (Fig. 4A) ja lisääntynyt solujen apoptoosia (Fig. 4B) pitoisuudesta riippuvalla tavalla kaikissa 3 testatuissa solulinjoissa määritettynä MTT: n ja DNA: n fragmentoituminen. Aiemmat tutkimukset raportoitu että HDACi käsittely johtaa heikentynyt leviämisen haimasyöpäsoluissa vuoksi pidätys solusyklin ja induktion kaspaasiriippuvaisen ohjelmoidun solukuoleman [33]. Olemme havainneet kasvua sykliiniriippuvaisen kinaasi-inhibiittori (CDK) p21 haiman syöpäsoluissa jälkeen HDACi hoidon (Fig. 4C). Lisääntynyt Capase-9 ja PARP pilkkominen seuraava kaspaasin aktivaatio havaittiin myös Capan-1 ja L3.6pl soluja (Fig. 4C). Olemme havainneet, että CFPAC-1-soluissa, lisääntynyt kaspaasi 9 lohkaisu havaittiin vain suurilla pitoisuuksilla PS hoitoa 48 tuntia, mutta ei 24 tunnin kuluttua. Vastaavasti PARP pilkkominen nähtiin vasta runsaasti PS hoidon CFPAC-1-soluissa, mikä osoittaa, että CFPAC-1-solut ovat suhteellisen resistenttejä PS indusoi solun apoptoosin verrattuna Capan-1 ja L3.6pl soluja.

Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla PS, A) solujen kasvu mitattiin MTT; B) solujen apoptoosin mitattiin DNA: n fragmentoituminen; C) Western blotit p21, ja kaspaasiaktiivisuus (PARP ja kaspaasi 9 cleavages). B-aktiini käytettiin latauskontrollina.

Ron Knockdown tai Ron mAb IMC-RON8 herkistettyyn haimasyöpäsoluissa PS Hoito

Sekä IMC-RON8 ja PS downmodulated Ron ilme. IMC-RON8 vähentää onkogeenisen signalointi kautta Pakt ja Perk ja estää migraatiota haiman syöpäsoluja. Kuitenkin, IMC-RON8 ei vaikuta solujen lisääntymisen ja apoptoosin

in vitro

osoituksena MTT, PARP ja kaspaasi 9 cleavages, joka on sama Ron pudotus (tuloksia ei ole esitetty). PS kuitenkin merkittävästi indusoi apoptoosia ja vähentää solujen lisääntymistä haiman syöpäsoluja. Yhdistelmä välillä Ron Knockdown tai IMC-RON8 ja PS voivat kompensoida puutetta eston solujen hengissä Ron kohdistaminen IMC-RON8 tai Ron knockdown. Voit selvittää proliferatiiviset vaikutukset Ron Knockdown ja PS hoitoa, vakio pesäkkeiden muodostumisen määritys suoritettiin. Ensinnäkin, salattu (SC) ja Ron shRNA plasmidit toimitettavaan L3.6pl soluihin transfektiolla-infektio perustaa L3.6pl SC ohjaus ja Ron knockdown stabiileja solulinjoja. Yksisoluklooneista A6 ja B21 valittiin jälkeen puromysiiniä hoidon. Ron shRNA nimenomaan tippuu alas Ron ilmaisua, koska c-Met, joka on korkea identtisyys Ron, ei osoittanut mitään muutosta (Fig. 5A). Sitten L3.6pl SC ja Ron KD kloonit A6 ja B21-soluja käsiteltiin pieninä pitoisuuksina PS. Tulokset osoittivat, että sekä L3.6pl SC ja Ron KD solujen kasvua merkittävästi estyy PS pitoisuudesta riippuvaisella tavalla (Kuva. 5A). PS hoito samana pitoisuutena vähentää pesäkkeenmuodostusta Ron KD L3.6pl soluja enemmän kuin Ron SC kontrollisolut (Fig. 5A). Ron KD itse ei muutu soluproliferaatiota haiman syöpäsoluja. Me seuraavaksi suoritettu pehmeä agaroosia määrityksiä täsmentämiseksi muutosta ominaisuuksia L3.6pl solujen Ron KD ja PS hoitoa. Kuvio 5B osoitti, että L3.6pl Ron KD kloonit tuottivat vähemmän pesäkkeitä (30~40%) kuin Ron SC solut pehmeä agaroosi. PS vähensi merkitsevästi pesäkkeitä muodostettu molempiin L3.6pl Ron SC ja KD solukloonien (Fig. 5B). Mielenkiintoista, PS hoito johti merkittävästi edelleen vähemmän pesäkkeitä numerot L3.6pl Ron KD soluissa kuin L3.6pl SC soluissa ollenkaan PS pitoisuuksilla (Kuva. 5B). Koot pesäkkeiden PS käsiteltiin L3.6pl Ron KD-solut olivat ilmeisesti pienempi kuin PS käsiteltiin SC-soluja (tietoja ei esitetty). Täsmentämiseksi roolin Ron haimasyövän, IMC-RON8 esiteltiin mitata mahdollisia yhdistelmäefektit yhdessä PS. Molemmissa L3.6pl (Fig. 5c) ja CFPAC-1 (Fig. 5D) solut, salpaaminen Ron IMC-RON8 voisi vähentää pesäkkeiden muodostumista verrattuna kontrolleihin ilman käsittelyä (jopa 50%). Yhdistelmähoito PS ja IMC-RON8 edelleen syntyy huomattavasti vähemmän siirtomaa numerot pienempiä kuin yksittäinen lääkehoito yksin sekä L3.6pl ja CFPAC-1-soluissa (kuvio. 5C ja 5D).

A) L3. 6PL solut transfektoitiin stabiilisti Ron SC ja shRNA plasmideja. Ron KD klooneja A6 ja B21 valittiin klonogeeniset määritys: L3.6pl Ron SC ja KD kloonit A6 ja B21 käsiteltiin päivänä 2 PS merkityillä pitoisuuksina 48 tuntia. Pesun jälkeen soluja viljeltiin vielä 10 päivää 10% FBS: ää sisältävässä väliaineessa. Cell pesäkkeet visualisoitiin jälkeen MTT värjäyksen ja määrällisesti DMSO. B). Kiinnittymisestä riippumaton kasvu L3.6pl SC ja Ron KD kloonien käsitelty PS määritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Pehmeä argrose määritys suoritettiin myös C) L3.6pl solut ja D) CFPAC-1-soluja käsiteltiin joko IMC-RON8 tai PS yksin tai niiden yhdistelmät.

mekanismien taustalla IMC-RON8 herkistyminen haimasyöpäsoluissa PS

vaikutuksen määrittämiseksi yhdistelmä hoidon PS ja IMC-RON8 Ron ilmaisu, Capan-1, L3.6pl ja CFPAC-1-soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla IMC-RON8 , PS tai niiden yhdistelmä. Huomasimme, että Ron oli hajonnut IMC-RON8 jälkeen 24 hoidon (Fig. 6A). PS yksittäinen hoito vähensi Ron, Pakt ja lisääntynyt PARP pilkkominen. Kuitenkin co-hoito alentaa enempää Ron lauseke (Fig. 6A), verrattuna hoitoon yksinään kaikissa kolmessa haimasyövän solulinjoissa tutkimme. Lisäksi co-hoito myös alhaisempi Pakt ja lisääntynyt PARP pilkkominen (Kuva 6B). Nämä saattavat selittää alennettu pesäkkeenmuodostusta hoidossa yhdistelmähoito verrattuna monoterapiana yksin.

A) Ron ilmaisu jälkeen yhteistyössä hoitoon Capan-1, L3.6pl ja CFPAC-1-solujen IMC-RON8 ja PS. B) Vaikutus yhteistyön hoidossa IMC-RON8 ja PS Pakt ja PARP pilkkominen. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa tunnistettiin mahdollisen Uusi terapeuttinen lähestymistapa haimasyövän yhdistämällä strategian kautta hyödyntämällä sekä geneettiset ja epigeneettiset ominaisuuksia. Haimasyöpä on yksi haastavia ongelmia syövän hoidossa. Nykyinen kemoterapian gemsitabiini on hyvin alhainen vastausprosentti ( 20%) ja lääkeresistenssi kehittyy nopeasti johtaen hoidon epäonnistumisen [2]. Siten uusia terapeuttisia strategioita tarvitaan kiireesti.

Ron on äskettäin raportoitu olevan erittäin ilmaistaan ​​haimasyöpäsoluissa ja potilaan näytteitä [5], [6]. Stimulaatio MSP aktivoi Ron ja sen loppupään signalointi, kuten PI3K /Akt ja MAPK ja edistää solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Kuitenkin Ron aktivointi ei ollut vaikutusta proliferaatioon haiman syöpäsoluissa [6]. Knockdown Ron osoitti lisääntynyt alttius apoptoosiin koolonkarsinoomasoluissa Kasvutekijähoidosta puutteesta stressiä mutantti p110α aktivointi [14], [15]. Kuitenkin, haimasyövän solut eivät sisällä p110α mutaatioita. Ron KD ei ollut vaikutusta solujen lisääntymisen ja apoptoosin arvioimana MTT, PARP ja kaspaasi 9 cleavages

in vitro

(tuloksia ei ole esitetty) haiman syöpäsoluja.

Tutkimustemme tässä osoittivat, että IMC -RON8 downmodulated Ron ilme, joka oli yhdenmukainen aiempien tutkimusten että hiiren anti-Ron mAbien Zt /g4, Zt /f2 ja Zt /c9 pienentää Ron ilmentymistä koolonkarsinoomasoluissa [43]. Ihmisen mAb IMC-41A10 tehokkaasti pienentää MSP-välitteisen Ron aktivaation ja sen loppupään PI3K /Akt ja MAPK aktivointi [17]. MAPK signalointi vähentäminen IMC41A10 näkyi Perk väheneminen kaikissa syöpäsolulinjoissa valittu. Kuitenkin vaikutus IMC41A10 on Pakt ei ole yhdenmukainen kaikissa solulinjoissa. Esimerkiksi IMC41A10 oli suuri vaikutus vähentämiseen Akt aktivoinnin HT29, Du-145 ja AGS, kun taas IMC-41A10 eivät muuttuneet Pakt muissa soluissa kuten haimasyövän solulinja BxPC3 [17].

IMC-RON8, toinen täysin ihmisen anti-Ron mAb, näytetään antituumoriaktiivisuus ihmisen paksusuolen, keuhkon ja haiman nude-hiirissä [44]. Tutkimuksemme tässä osoittaneet, että IMC-RON8 esti tehokkaasti Ron fosforylaation CFPAC-1-soluissa, sekä alavirran pMAPK ja Pakt aktivointi kaikissa haimasyövän solulinjoissa me tutkimme, mukaan lukien BxPC3 (tuloksia ei ole esitetty). Tämä osoitti, että IMC-RON8 on toiminnallinen inhiboimiseksi MSP-välitteisen signalointireittien ja esittelee vahva tehokkuus voidaan taata estää PI3K /Akt-reitin.

Edellinen työ meidän lab ja muut ovat osoittaneet, että Akt aktivaatio liittyy