Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä on kaikkein tappava maligniteetti maailmassa, ja joka vuosi tuhansia ihmisiä kuolee tähän sairauteen. Varhainen havaitseminen on osoitettu lisäävän 5 vuoden pysyvyys tähän syöpään yleensä riippumattomia lähdeverkkona sivuston keuhkoissa. Puuttua tähän haasteeseen, olemme käyttäneet solu-pohjainen SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Eksponentiaalinen Enrichment) valitaksesi paneelin Aptameerien voidaan erottaa keuhkojen adenokarsinoomasolua normaaleista keuhkojen epiteelisolujen. Nämä aptameerit sitovat fysiologisissa ja formaliinikiinnitetyt olosuhteet ja näyttö affiniteetti kohteisiinsa näennäinen K

d’s nanomoolialueella. Tulosten perusteella näyttää, että valitut aptameerejä potentiaalia käytettäväksi kliinisissä ympäristöissä, sekä parantaa luokittelu nonsurgical yksilöitä, toinen nykyinen haaste keuhkosyöpään.

Citation: Jiménez E, Sefah K, López- Colón D, Van Simaeys D, Chen HW, Tockman MS, et al. (2012) Generation of Lung Adenokarsinooma DNA Aptameerit Cancer Studies. PLoS ONE 7 (10): e46222. doi: 10,1371 /journal.pone.0046222

Editor: Muy-Teck Teh, Barts London School of Medicine ja hammaslääketieteen, Queen Mary University of London, Iso-Britannia

vastaanotettu: 7. 2012 Hyväksytty: 28 elokuu 2012; Julkaistu: 17 lokakuu 2012

Copyright: © Jiménez et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoittajat: julkaiseminen tämä artikkeli on rahoittaa osaksi Floridan yliopistossa Open-Access Publishing Fund ja National Institutes of Health myöntää # 69953, Washington, DC. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on toiseksi yleisin syöpä ja suurin syy syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti [1]. Yhdysvalloissa on arvioitu, että 226160 uutta tapausta ja 160340 kuolemantapausta tapahtuu vuonna 2012 (Non-pienisoluinen ja pienisoluinen yhdistetty). Verrattuna muihin syöpätyyppeihin, keuhkojen kasvaimet ovat hyvin heterogeenisiä, kasvaimia näyttämään enemmän kuin yhden alatyypin yhteisenä piirteenä [2]. Valtaosa keuhkojen kasvaimet ovat karsinoomat, jotka yleensä luokitellaan joko ei-pienisoluisen keuhkosyövän (NSCLC) tai pienisoluinen keuhkosyövän (SCLC) perusteella morfologinen analyysi värjättyä histologisten näytteiden [3] – [4]. NSCLC on yleisin keuhkosyövän tyyppi, joka käsittää 85% kaikista keuhkosyöpää; mutta se on enemmän passiivinen syöpä tyyppi. NSCLC koostuu kolmesta eri alatyyppiä: adenokarsinooma (ADC), levyepiteelisyöpä (SCC), ja suuri karsinooma (LCL). Toisaalta, SCLC on harvinaisempaa, joka käsittää 15% kaikista keuhkosyöpää, mutta se on enemmän aggressiivinen. Tupakointi on riskitekijä vahvasti liittyvän keuhkosyövän, erityisesti SCC [5] – [10]. Keuhkoadenokarsinooma yleisesti kehittänyt potilaat, jotka eivät ole koskaan savustettu, ja geneettiset muutokset liittyvät usein sen puhkeamista.

Koska useimmat ihmiset keuhkosyöpä alkuvaiheessa eivät näy oireita, yli 70% keuhkosyöpää tapauksia on diagnosoitu myöhemmissä vaiheissa, joiden osalta 5 vuoden pysyvyys on pieni. Siksi tutkimus, jonka tavoitteena on varhainen havaitseminen, joka on kriittinen vähentää kuolleisuutta ja sairastuvuutta, on kääntynyt kehittää soveltuvat aptameereillä. Aptameerit ovat lyhyitä, yksijuosteista DNA: ta tai RNA-oligonukleotidien, jotka ovat erittäin spesifisiä kohteen tunnistuksen elementtejä perustuu niiden ainutlaatuinen kolmiulotteisia muotoja [11] – [12]. Vaikka prosessia kutsutaan SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Eksponentiaalinen Enrichment) käytettiin alun perin valita Aptameerien kohteita vastaan, kuten puhdistettua proteiinit [13] – [14], solu-pohjainen SELEX on tullut uusin tapa valita aptameereillä vastaan ​​kokonaisia ​​soluja , etenkin aptameerit kohdistaminen pintaproteiineille yliekspressoitu syöpäsoluissa.

joukossa niiden monia etuja, aptameerejä ole osoittaneet, tai matalaksi, immunogeenisyys, joka mahdollistaa

in vivo

tutkimuksissa käyttäen näitä koettimia [15] – [18]. He ovat myös suosituksi vaihtoehdoksi vasta, koska Aptameerien ”edullisia (ei eläimiä tuotannon kannalta välttämättömiä), helppo kemiallinen muutos, ja sisäänottoa soluihin valmiudet. Lisäksi, koska aptameerit ovat pieniä, jonka pituus on yleensä 15-100 nukleotidia (nt), niillä on parempi kudokseen tunkeutuminen verrattuna vasta-aineita. Vuonna 2004 Macugen, anti-VEGF (verisuonten endoteelin kasvutekijä) estäjä, tuli ensimmäinen aptameeriin hyväksynyt Food and Drug Administration (FDA) ja ikään liittyvä silmänpohjan rappeuma (AMD) [19]. Muut aptameerit pysyvät kliinisissä tutkimuksissa [20], ja ovat osoittaneet suurta potentiaalia kliinisen kemian alalla, kuten erottaminen, lääkkeiden annostelu ja kohde-anturi mittaus. Tässä raportissa kuvataan käyttöä solun SELEX valita paneelin Aptameerien pystyy erottamaan keuhkojen adenokarsinooma ja normaali keuhkojen epiteelisoluissa.

Tulokset ja keskustelu

Koska niiden löytö, aptameerejä on luotu vastaan ​​eri tavoitteita, mukaan lukien proteiinit, peptidit, ja elävien solujen [21] – [22]. Eristää aptameerit kykenevät erilaistumaan keuhkoadenokarsinooma solujen normaalin keuhkokudoksen epiteelisolujen käytimme soluihin perustuvien SELEX strategiaa. H23 keuhkojen adenokarsinooma ja HBE 135-E6 /E7 normaali epiteelin keuhkojen käytettiin positiivisia ja negatiivisia solulinjoja, vastaavasti. Ensimmäinen ssDNA random-kirjaston, joka sisälsi noin 10

14 eri sekvenssit 80 nukleotidin (nt) rikastettiin peräkkäin sitovia kohdesolujen kanssa, eluointi ja sen jälkeen PCR-monistuksen 18 kierrosta. Nämä DNA-sekvenssit voivat tunnistaa H23 solupinnan kalvon proteiineja, jotka ovat mahdollisia merkkiaineita täsmähoitoihin. Aiemmissa kierrosta prosessin vastavalinta esiteltiin poistamiseksi mahdolliset sekvenssit sitovat yhteiset proteiineja sekä kohde- ja negatiivisia solulinjoja. Tämä menettely suoritettiin krs välein koko valinnan. Sekvenssit sitoutumisen kohdesoluihin eluoitiin ja PCR-monistettiin, jonka jälkeen ssDNA otettiin talteen ja käytetään valvomaan valintaprosessissa virtaussytometrialla. Koska ssDNA altaat rikastettiin sekvenssit spesifisiä kohteelle, lisääntyminen fluoresenssin intensiteetti ensimmäinen huomannut kierroksella 12 (kuvio 1A), mikä osoittaa, että nämä sekvenssit osoittivat parempaa sitoo pinnalle H23 solujen verrattuna alkuperäiseen kirjastoon. Koska valinta edetessä, fluoresenssin voimakkuus myöhemmin altaat lisätään vähitellen, kunnes vakaa tila fluoresenssin intensiteetissä havaittiin kierrosta 17 ja 18 (kuvio 1 B), mikä osoittaa, että suurin sitovia oli saavutettu. Sen sijaan, kuten rikastus ei havaittu, kun rikastetun altaat testattiin normaali keuhkojen epiteelisoluissa (kuvio 1 D), mikä tarkoittaa, että sekvenssit sisältämälle altaat kykenivät erottamaan keuhkoadenokarsinooma solut normaaleista keuhkojen epiteelisolujen. Siksi altaat 14, 16 ja 18 valittiin Sekvensoitavat niin aptameeriin ehdokkaat (kuvio 1 C).

Sidontamäärityksen altaat 11-18 kanssa H23 (A-B) ja altaat 15-18 kanssa HBE135 E6 /E7 (C). Virtaussytometria määritys seurata sitoutumiseen valitun altaan H23-solujen (kohdesolut) ja HBE135 E6 /E7 (negatiiviset solut). Vihreä käyrä edustaa tausta sitova Valikoitumattomien DNA-kirjastoa. Sillä H23 soluista, lisääntyi sitoutumisessa kapasiteetin altaat valinnassa edetessä taas oli vain vähän muutoksia valvontaa varten soluja, HBE 135 E6 /E7. Tavoite kuva 1: tavoitteena tämä luku osoittaa, kuinka solu-valintaprosessi rikastettiin 23N solulinjan muttei HBE135E6 /E7-solulinja.

sekvensointi aloitettiin rakentamalla 454 sekvensointi kirjaston PCR-lisäämällä 454 alukkeita 3′- ja 5′-päät rikastetun altaat. Tunnistaa allas jokaisessa sekvenssin, tunnistuskoodi (keskimmäinen tunnistuskoodi, MID) oli myös PCR-esiteltiin 454 sekvensointi kirjastoon. Lisäämällä alukkeiden rikastetun altaat vahvistettiin geelielektroforeesilla (tuloksia ei ole esitetty). Sen jälkeen 454 sekvenoinnilla UF ICBR ydin, noin 7000 sekvenssit haettiin ja analysoitiin. Ne oli ryhmitelty perusteella MID vastaavat samaa altaan, ja alukkeet poistettiin Perl-ohjelma. Sekvenssit, jotka sisälsivät vain satunnaisesti alueen Sitten rinnastettiin käyttämällä online-ohjelma MAFTT 6.0 [23], ja kuusi aptameerin perheet vastaavat runsain sekvenssit valittiin aptameeriin ehdokkaita. Ne syntetisoitiin kemiallisesti, biotiini-leimattu 3′-päähän, puhdistettiin HPLC: llä, ja määrällisesti. Kaikki aptameerit näkyy sitova H23 keuhkon adenokarsinooma soluissa, kun taas mitään merkittävää sitoutumista ei havaittu ohjaus- solulinjan HBE 135 E6 /E7, normaalit epiteelin keuhkojen solut (kuva 2 ja kuva S1). Nämä tulokset osoittavat, että onnistunut negatiivinen valinta oli tehty, ja että valitut Aptameerien voisi erottaa keuhkojen adenokarsinooma ja normaali keuhkojen epiteelisolujen tulos, joka antaa nämä aptameerit, joilla on potentiaalia käytettäväksi keuhkosyövän diagnosointiin, seurantaan syövän etenemiseen ja hoitoon, tai muita asianomaisten sovellusten.

Virtaussytometria määritys sitoutumisen valitun aptameerin EJ4 kanssa H23 (kohdesolun viiva) ja HBE135 E6 /E7 (negatiivinen solulinja). Vihreä käyrä edustaa taustalla sitoutuminen satunnaisessa järjestyksessä (kirjasto). Tavoite Kuva 2: tavoitteena tämä luku osoittaa, että ehdokas aptameerit ovat todellakin Aptameerien koska ne eivät sitoutua positiivisen solulinjan (H23), mutta eivät sido kanssa negatiivinen solulinja (HBE135E6 /E7).

Kaikki valitut aptameerien osoitti sitoutumisaffiniteetit (näennäinen K

d’s) on H23 solulinja nanomoolialueella (45-250 nM) (taulukko 1 ja kuva S6). Nämä tulokset viittaavat siihen, että nämä aptameerejä on laajasti sovellettavissa, koska ne tiukasti sitoutuvat tavoitteensa. Lisätutkimuksia tehtiin luonnehtia valitun Aptameerien. Sitova edelleen testattiin keuhkosyövän solulinjoja, sekä muut solulinjat, mukaan lukien munasarja- ja paksusuolen, kuten on esitetty taulukossa 2. Aptameerit EJ2, EJ4 ja ADE1 näytetään tunnustusta kohti yksi tai useampi seuraavista solulinjat: TOV21G, DLD1, ja H460. Kun kyseessä on DLD1, paksusuolen adenokarsinoomasolulinjasta oli mielenkiintoista nähdä tunnustaa valitun aptameerejä, mikä viittaa siihen, että mahdollinen yhteinen solun pinnan tavoite on läsnä näissä kahdessa solulinjassa, koska ne kuuluvat samaan histologisten ryhmään. Aikaisemmassa tutkimuksessa meidän lab kohdeproteiini on Sgc8 aptameerin on osoitettu olevan PTK7 [24], pseudo-kinaasi-proteiinin läsnä CEM-soluja (kohde-solulinjan, että valinta), sekä muissa syövissä, mukaan lukien munasarjan , keuhko-, paksusuoli-, rinta- ja joitakin leukemian solulinjoja, mikä osoittaa, että yhteinen proteiinit voivat olla läsnä sen seurauksena syövän [25] – [26]. Aptameerejä, EJ4 ja ADE1 osoitti myös erityisesti spesifisyys kohti keuhkoadenokarsinooma solulinja merkittävästi fluoresenssin intensiteetin lisääntymisen suhteen satunnaisessa järjestyksessä, mutta ei normaalin keuhkojen soluihin. Nämä tulokset viittaavat siihen, että nämä Aptameerien voitaisiin käyttää keuhkosyövän tutkimuksiin.

Joustava sitova Aptameerien eri lämpötiloissa voivat laajentaa valikoimaa sovelluksia. Koska valinta suoritettiin 4 ° C: ssa, teimme sitoutumismääritykset 25 ° C: ssa ja 37 ° C: ssa (kuvio 3 ja kuvio S2). Kuten kuviossa 3 ja kuviossa S3, aptameerit ADE1, ADE2, EJ2, EJ5 ja EJ7 konservoituneista sitoutumisen 25 ° C: ssa ja 37 ° C: ssa fluoresenssi-intensiteetit samanlaisia ​​kuin 4 ° C: ssa. Tämä on erityisen tärkeää määrityksissä suoritetaan fysiologisissa olosuhteissa, kuten arvioitaessa

in vivo

sovelluksissa.

Virtaussytometria määrityksessä valittuun aptameeriin EJ4 kanssa H23 (kohdesolulinjana) fysiologisessa lämpötilassa ( 37 ° C: ssa). Sitova 4 ° C: ssa, käytettiin positiivisena kontrollina. Vihreä käyrä edustaa taustalla sitoutuminen satunnaisessa järjestyksessä (kirjasto). Tavoitteena Kuvio 3: Tavoitteena tämä luku osoittaa sitoutumisen valitun aptameerin EJ4 25 ° C: ssa ja fysiologisessa lämpötilassa, 37 ° C: ssa.

Cancer havaitseminen perustuu tarkasteluun kudoksen biopsioista , jotka on kiinnitetty kemiallisen olosuhteissa eheyden ja antigeenisyys kasvaimen näytteitä myöhempää käyttöä varten. Tärkeä määritys syövän diagnoosi immunovärjäyty-, jossa juuri leikellään kudokset ovat kiinteitä ennen käsittelyä koettimilla, kuten vasta-aineet ja aptameerit, erityisesti tuumorimerkkiaineiden. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että aptameerit kykenevät merkintöjä formaliinilla parafiiniin kudoksen (FFPE) jälkeen deparaffinization ja antigeenin haku [27] – [28]. Sitoutumisen määrittämiseksi käytettävissä valitun aptameereillä näissä olosuhteissa, solut kiinnitettiin 10% formaliinilla ennen inkubointia leimatun Aptameerien. Kontrollina näissä kokeissa, kaksi tunnettua aptameerit leukemia, Sgc8 ja TD05, ja niiden vastaavat sitovia solulinjoja käytettiin osoittamaan, että prosessi kiinnittäminen ei tuota mitään fluoresenssin signaalia. Siksi mikä tahansa fluoresenssin havaitaan pitäisi olla osoitus sitovan tapahtuman välillä aptameerejä ja sen tavoite. Kuten kuviossa S3, sekä hallintalaitteet säilyttäneet alkuperäisen sitova profiili, mikä osoittaa, että mitään keinotekoisia lisäys fluoresenssin intensiteetissä tapahtui seurauksena kiinnitys olosuhteissa. EJ2, EJ5, EJ7, ADE1, ja ADE2 aptameerit ylläpidetään samanlaisia ​​sitoutumisen, että näytetään 4 ° C: ssa (kuvio 4), mikä osoittaa, että aptameerien voi sitoutua tavoitteensa jopa kiinteiden olosuhteissa. Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että valitut aptameerit on mahdollista käyttää tunnistusmolekyyleissä kliinisissä näytteissä.

Sitoutumiskoe Aptameerien kanssa H23 (kohde) soluja esi-kiinnitettiin 10% formaliinilla. Vasen sarake näyttää sitovan valittujen aptameerien kanssa käsittelemättömät solut lämpötilassa 4 ° C. Oikea sarake näyttää sitovan valittujen aptameereillä kiinteitä soluja. Vaaleanvihreä käyrä edustaa taustalla sitoutuminen satunnaisessa järjestyksessä (kirjasto). Tavoite kuva 4: tavoitteena tämä luku osoittaa kyky sitoa valitun aptameerin EJ4 soluihin, jotka on vahvistettu 10% formaliinilla.

aikana solun valintaa, on odotettavissa, että aptameerit vuorovaikutuksessa erityisesti pintojen kanssa kohdesolujen; tämä käyttäytyminen on raportoitu useissa tutkimuksissa [29] – [31]. Meidän kokeessa soluja käsiteltiin kahdella entsyymillä, trypsiiniä ja proteinaasi K, 3 ja 10 minuuttia, pestiin PBS: llä, ja inkuboitiin sitten aptameerejä. Kaikki valitut aptameerit menetti sitoutumisen käsittelyn jälkeen sekä proteaasien (kuvio 5 ja kuvio S5. Kaikissa kokeissa, fluoresenssin intensiteetti väheni merkittävästi, mutta vastaava signaali määrityksiä proteinaasi pieneni taustan, mikä osoittaa, että kohdeproteiini poistettiin kokonaan käsittelyn jälkeen.

Virtaussytometria määrityksessä valittuun aptameerit hoidon jälkeen proteaasien, käsittelemättömiä soluja käytettiin positiivisena kontrollina. (A) solut käsitellään trypsiinillä 3 ja 10 min ennen sitovan valittujen aptameerin EJ4. (B) solut käsiteltiin proteinaasi K: ssa 3 ja 10 minuuttia ennen sitovan kanssa aptameeriin EJ4. tavoite kuva 5: tavoitteena tämä luku on osoittaa, että tavoitteet valitun aptameerit ovat proteiineja esiintyy solun pinnalla syöpäsolujen (H23).

johtopäätös

Yhteenvetona olemme valinneet paneeli aptameerien voidaan erottaa keuhkosyöpä normaaleista keuhkojen epiteelisoluissa. Nämä aptameerien näyttää korkea affiniteetti kohti H23 solulinja näennäinen K

d ’

s nanomoolialueella, mutta ei havaittavaa affiniteettia normaali keuhkojen epiteelisolujen. Aptameerit osoitti myös sitovat fysiologisissa olosuhteissa, sekä sen jälkeen kemiallinen kiinnitys, mikä viittaa siihen, että ne voivat olla sovellettavissa

in vivo

kokeita. Proteinaasi hoito osoitti kaiken Aptameerien tässä paneelissa sitoutuu proteiineja kohdesolun pinnalla. Kaikki nämä tulokset viittaavat siihen laajoja potentiaalisia sovelluksia valittujen aptameerien johtuu niiden spesifisyyden syöpäkudokset mutta ei terveitä soluja. Nämä aptameerit voidaan käyttää myös molekyylikoettimina kliinisissä näytteissä, kuten juuri uuttaa kasvaimia ja säilynyt histologia yksilöitä.

Materiaalit ja menetelmät

Kirjasto Suunnittelu

alukkeet olivat suunnittelu tyydyttää seuraavat ominaisuudet: vähintään hiusneularakenteen, joka on samanlainen sulamislämpötila (T

m) ja minimaalinen emäspariutumisen. Alukkeet ja 80-mer kirjasto suunniteltiin käyttäen IDT Oligo Analyzer 3.1 ohjelmisto [32]. Eteenpäin aluke leimattu fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC), 5′-päähän, ja reverse-aluketta leimattiin biotiinilla 5′-päähän. Kirjasto koostui satunnaistetussa 44 nt alueelle, jota reunustavat 5′-päähän, jonka FITC- leimattua aluketta ja reunustavat 3′-päässä täydentävän leimaamattoman juosteen reverse-aluketta.

instrumentointi ja reagenssit

Kirjastot ja alukkeet syntetisoitiin käyttäen 3400 DNA-syntetisaattorilla (Applied Biosystems). Kaikki reagenssit DNA-synteesiin hankittiin Glen Research. DNA-sekvenssit puhdistettiin käänteisfaasi-HPLC: lla (Varian Prostar käyttäen C18-pylvästä ja asetonitriili /trietyyliammoniumasetaatissa liikkuvana faasina). PCR suoritettiin Biorad Thermocyclerissä, ja kaikki reagenssit hankittiin Takara. Seuranta valintaprosessin sitoutumismääritykset, ja määritys Dissosiaatiovakioiden valitun Aptameerien suoritettiin virtaussytometrianalyysillä käyttäen FACScan sytometrillä (BD Immunocytometry Systems).

Soluviljely ja Puskurit

yhteensä kahdeksan perustettu solulinjoja käytettiin tässä projektissa, kaikki hankittiin American Tissue Culture Collection (ATCC). H23 (CRL-5800) adenokarsinoomaa NSCLC valittiin positiivisen solulinjan, kun taas negatiivinen solulinja valittiin HBE135-E6 /E7 (CRL-2741), normaali ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen. H23 solulinjaa ylläpidettiin RPMI-1640 (ATCC) viljelyalustassa, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS lämpöinaktivoitua) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä. Normaali keuhkoputkien keuhkojen solulinjaa säilytetään Keratiini Serum-Free Medium täydennettynä 5 ng /ml ihmisen rekombinantti EGF, 0,05 mg /ml naudan aivolisäkeuutetta (Invitrogen), 0,005 mg /ml insuliini, ja 500 ng /ml hydrokortisonia (Sigma -Aldrich). Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2-ilmakehässä. Muut solulinjat, joita käytetään selektiivisyys määrityksessä olivat Caov3 ja TOV21G munasarjasyövän solulinjoissa, A549 keuhkoadenokarsinooma, H520 keuhkojen okasolusyöpä, H460 suuri keuhkosyöpä, ja DLD1 paksusuolen adenokarsinooma, ja kaikki pysyivät mukaisesti ATCC vaatimukset. Valinnassa kaksi puskureita käytettiin: pesu Buffer (WB) (glukoosi 0,45% w /v ja MgCl

2 5 mM PBS: ssä) ja Binding Buffer (BB) (1 mg /ml tRNA ja 1 mg /ml BSA: WB). Kaikki aiemmat reagenssit hankittiin Sigma-Aldrich.

In vitro

Selection

Koska molemmat käytetyt solulinjat aikana valinnan, adenokarsinooma ja normaaleihin ihmisen keuhkoputken epiteelisoluissa, ovat kiinnittyneet solulinjat, valinta suoritettiin yksisoluiset kerrokset. Noin 20 nmol syntetisoidun kirjaston liuotettiin 700 ul: aan sitoutumispuskuria. Ennen kuin prosessi aloitettiin, DNA-poolilla, denaturoitiin kuumentamalla 95 ° C: ssa viiden minuutin ajan, jota seuraa nopea jäähdytys jäällä. Tämä pakotti DNA-sekvenssit hyväksymään edullisimman sekundaarirakenteita. DNA-kirjasto inkuboitiin sitten noin 3 x 10

6 kohdesoluja (H23) 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Tämän jälkeen solut pestiin 3 kertaa pesupuskurilla poistamaan sitoutumaton sekvenssejä. Tämän jälkeen sitoutuneet sekvenssit otettiin talteen kuumentamalla 95 ° C: ssa 10 minuuttia ja sitten sentrifugoimalla nopeudella 14000 rpm solujäänteiden poistamiseksi.

sisältävä supernatantti DNA-sekvenssit otettiin talteen, ja valittu pooli PCR-monistettiin käyttäen FITC- ja biotiini-leimattuja alukkeita. Sitten sukupolven yksijuosteisen DNA (ssDNA) saavutettiin inkuboimalla streptavidiinilla päällystettyjä Sepharose helmiä, saada biotinyloitu lohkon. Counter valinta suoritettiin todettuaan joitakin rikastaminen kanssa kohdesolujen. Jotta valita Aptameerien korkea spesifisyys ja selektiivisyys, tiukkuutta pesuissa (lukumäärä pestään samoin aikaa, ja tilavuus pesupuskuria) lisättiin myöhemmissä kehitysvaiheissa. Rikastuminen altaat seurattiin käyttäen virtaussytometria, sekvensoitiin 454 tekniikkaa, ja analysoitiin aptameeriin ehdokkaita.

virtaussytometrianalyysin

Virtaussytometria käytettiin seuraamaan rikastuminen ssDNA sitoutuneiden sekvenssien sisällä altaat valintavaiheessa sekä arvioida sitoutumisaffiniteetin ja spesifisyyden valitun aptameereillä. Viljellyt solut pestiin WB ennen ja jälkeen inkubaation FITC ssDNA-pooli tai valitut DNA-sekvenssit. Fluoresenssi-intensiteetti määritettiin FACScan sytometrillä (BD Immunocytometry).

454 Sequencing and Analysis

Kun 18 valintakierroksen rikastettu altaat 14, 16, ja 18 valittiin sekvensointiin. 454-spesifisiä alukkeita ja MID olivat PCR-monistettiin ja lisätään kuhunkin sisältyvä sekvenssi kuhunkin ryhmään, jolloin saadaan 125 emäsparin tuote. Reaktiot vahvistettiin geelielektroforeesilla, puhdistaa PCR puhdistusta (Qiagen), ja toimitettiin ICBR ytimeen yliopistossa Floridan analysoitavaksi.

Noin seitsemäntuhatta sekvenssit haettiin ja analysoitiin. Ensin sekvenssit ryhmitelty niiden MID määrittää vastaavan rikastetun poolin. Toiseksi, alukkeet ja MID poistettiin Perl ohjelma antaakseen vain satunnainen osa sekvenssin homologia analyysin kanssa MAFFT 6.0 ohjelman.

Så.toutumiskokeet

Eri perheiden Sekvenssien noudetaan useilta sekvenssianalyysit syntetisoitiin, biotiini-leimattu 3′-päähän, ja testattiin sitoutumisen kanssa positiivinen ja negatiivinen solulinja. Lisäksi sitoutumisen selektiivisyys kunkin ehdokkaan määritettiin inkuboimalla 250 nM aptameerin ratkaisu 4 x 10

5 kohde tai vasta-soluja 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Solut pestiin kahdesti WB ja inkuboitiin streptavidiinin PE helmiä 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Pesun jälkeen solut suspendoitiin 200 ul: WB. Fluoresenssi määritettiin FACScan sytometria laskemalla 3 x 10

4 tapahtumaa. Satunnaistetussa 80-meeri-DNA: ta käytettiin kontrollina.

sitoutumismääritykset kiinnitettyjen solujen kanssa

määrittämiseksi kyky aptameerien sitoutua kiinteään soluihin, samanlaisia ​​menetelmiä kuin edellä on kuvattu, minkä jälkeen lukuun ottamatta alkuperäisen hoidon solujen. Lyhyesti, joka tarttuu H23-solut irrotettiin maljalta inkuboimalla ei-entsymaattinen soluhajotusprosessin liuosta, ja kiinnitettiin sitten 10% formaliiniliuokseen 15 minuuttia 4 ° C: ssa, pestiin ja suspendoitiin sitoutumispuskuriin.

valikoivuus ja spesifisyysmittaukset

spesifisyyden määrittämiseksi näiden aptameerien, eri solulinjoja, kuten CaOV3, DLD1, A549, H520, H460, ja TOV21G, käytettiin sitoutumisen määrityksissä. Fluoresenssin intensiteetti mitattiin varmistaakseen sitovia. Kaikki kokeet seurasi virtaussytometria koemenetelmä on kuvattu edellä.

Lämpötilan vaikutus aptameerin sitova

Valinta suoritettiin 4 ° C.To määrittää, jos lämpötila vaikuttaa välinen sitoutuminen aptameerin ja kohdesoluja , sitoutumismääritykset suoritettiin kaksi ylimääräistä lämpötiloissa 25 ° C ja 37 ° C: ssa.

määritys dissosiaatiovakio

affiniteetti aptameerin ja sen tavoite arvioitiin kylläisyyttä määrityksessä. Näyte, joka sisälsi 5 x 10

5 H23-solut pestiin ja niitä inkuboitiin eri pitoisuuksien aptameerin, kunnes kyllästyminen oli saavutettu. Kaikki sitoutumismääritykset toistettiin kolme kertaa, ja keskimääräinen fluoresenssi-intensiteetti laskettiin vähentämällä fluoresenssin intensiteetti salatun sekvenssin. Tiedot kerättiin, ja dissosiaatiovakio (K

d) saatiin sovittamalla yhteen sitoutumiskohtaan kylläisyyttä mallia käyttäen SigmaPlot 11.2v (Jandel, San Rafael, CA).

proteaasidigestiolla

trypsiini ja proteinaasi K hoitoon.

H23-solut pestiin kahdesti PBS: llä ja inkuboitiin sitten 3 ml: lla joko 0,05% trypsiiniä /0,53 mM EDTA Hankin tasapainotettua suolaliuosta (HBSS), Cellgro, tai 0,1 mg /ml proteinaasi K: PBS: ssä 37 ° C: ssa 3 ja 10 minuuttia. FBS lisättiin sammuttamiseksi proteinaasiaktiivisuus. Solut pestiin WB ja käytettiin myöhemmin sitovaa yllä kuvattuja määrityksiä.

tukeminen Information

Kuva S1.

karakterisointi valittu aptameerit. Virtaussytometria määritys, sitoutumisen aptameerien ADE1, ADE2-, EJ2, EJ5 ja EJ7 kanssa H23 (kohdesolulinjana) ja HBE135 E6 /E7 (negatiivinen solulinja). Vihreä käyrä edustaa taustalla sitoutuminen satunnaisessa järjestyksessä (kirjasto).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0046222.s001

(TIF) B Kuva S2.

aptameeriin sitova fysiologisissa olosuhteissa. Virtaussytometria määritys sitoutumisen Aptameerien ADE1, ADE2, EJ4, EJ5 ja EJ7 kanssa H23 (kohdesolulinjana) 25 ° C: ssa ja 37 ° C: ssa. Tässä koesarjassa sitova 4 ° C: ssa, käytettiin positiivisena kontrollina. Vihreä käyrä edustaa taustalla sitoutuminen satunnaisessa järjestyksessä (kirjasto).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0046222.s002

(TIF) B Kuva S3.

Ohjaus kokeilu Fixed käsiteltyihin soluihin. Sitoutumismäärityksessä aptameerin Sgc8 (A) CEM (kohde) solut ja (B) Ramos (kontrolli) soluissa ennen (vasemmalla) ja jälkeen (oikea) kiinnitys, joka osoittaa, että mitään keinotekoisia fluoresenssisignaalin on tuotettu.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0046222.s003

(TIF) B Kuva S4.

sitoutumismääritykset kuluessa tallentamisesta 10% formaliinilla. Sitoutumismääritys Aptameerien kanssa H23 (kohde) solut ennalta kiinnitettiin 10% formaliinilla. Vasen sarake näyttävät sitoutumisen aptameerin ADE1, ADE2, EJ2, EJ5 ja EJ7 kanssa käsittelemättömien solujen 4 ° C: ssa. Oikea sarake esittää sitoutumisen saman aptameerit EJ5 kiinnitettyjen solujen kanssa. Vaaleanvihreä käyrä edustaa taustalla sitoutuminen satunnaisessa järjestyksessä (kirjasto).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0046222.s004

(TIF) B Kuva S5.

Sitoutumismääritykset jälkeen proteinaasi hoidon. Virtaussytometria määritys aptameerejä ADE1 ja ADE2-, EJ5 ja EJ7 hoidon jälkeen proteaasien; käsittelemättömiä soluja käytettiin positiivisena kontrollina. (A) ja (C) Solut käsitellään trypsiinillä 3 ja 10 minuuttia ennen sitovan kanssa aptameerejä ADE1 ja ADE2-, EJ5, ja EJ7 vastaavasti. (C) ja (D) Solut käsiteltiin proteinaasi K: ssa 3 ja 10 minuuttia ennen sitovan kanssa Aptameerien vastaavasti.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0046222.s005

(TIF) B Kuva S6.

Näennäinen Kd: n valituille Aptameerien. Saturaatiositoutumisella käyriä aptameerejä ADE1, ADE2-, EJ2, EJ5 ja EJ7. Soluja inkuboitiin eri pitoisuuksien aptameerin kolmena kappaleena. Keskimääräinen fluoresenssin intensiteetti ei valita kirjaston vähennettiin kustakin vastaavan aptameeriin keskittyminen.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0046222.s006

(TIF) B

Kiitokset

Kiitos Dr. Tahir Bayrac varten neuvoista, jotka vaikuttivat tähän työhön, tohtori Kathryn Williams hänen kriittinen tarkastelu käsikirjoituksen ja DNA: n sekvensointi ydin, ICBR, University of Florida avusta aikana 454 sekvensointi.