PLoS ONE: rakenteellinen monimutkaisuus Ihmisen BORIS Gene in gametogeneesiin ja Syöpä
tiivistelmä
Background
BORIS Twitter /
CTCFL
on paralogi on
CTCF
, suuret epigeneettiset säätelijä selkärankaisten genomit. BORIS normaalisti ilmaistaan ainoastaan sukusoluilla mutta on poikkeuksellisesti aktivoitu lukuisissa syövissä. Vaikka viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että BORIS on transkriptionaalinen aktivaattori kiveksen-spesifisten geenien, vähän yleisesti tiedetään sen biologisia ja molekyylitason toimintoja.
Menetelmät /Principal Havainnot
Tässä osoitamme, että
BORIS
ilmaistaan 23 isomuotojen ituradan ja syöpäsoluja. Isoformit muodostuvat vaihtoehtoisia N- ja C-päät yhdistettynä vaihtelevan määrän sinkkisormia (ZF) in DNA: ta sitovan domeenin. Malleja
BORIS
isoformin ilmentyminen ovat erillisiä, alkio ja syöpäsoluja. Isoformi ilmentyminen aktivoituu downregulation
CTCF
, voimistuvan väheneminen CpG metylaatio aiheuttama inaktivaatio DNMT1 tai DNMT3b, ja tukahdutettu aktivoimalla
p53
. Tutkimukset ektooppisesti ilmaisi isomuotojen osoittivat, että kaikki on käännetty ja lokalisoitu tumaan. Käyttämällä kiveksiin erityinen kerebrosidin sulfotransferaasien (
CST) B-promoottori ja
IGF2 /H19
painamista ohjaus alue (ICR), osoitettiin, että sitoutuminen BORIS isomuotojen DNA tavoitteet
vuonna vitro
on metylaatioherkät ja riippuu määrä ja erityinen koostumus ZF. Kyky sitoutua kohde-DNA ja läsnäolo tietyn pitkä aminopäässä (N258) eri isoformeja ovat välttämättömiä ja riittäviä aktivoimaan
CST
transkriptio. Vertaileva sekvenssin analyysit paljastivat evoluution räjähtää nisäkkäiden voimakkaiden säilyttämisen BORIS isoproteins keskuudessa kädellisillä.
Johtopäätökset
Laaja ohjelmistoon saumattu
BORIS
variantit ihmisillä, jotka antavat erilliset DNA sitova ja transkription aktivaation ominaisuuksia, ja niiden ero malleja ilmentymisen keskuudessa itusolujen ja neoplastiset solut viittaavat siihen, että geeni on osallisena useita toiminnallisesti tärkeitä näkökohtia sekä normaalin gametogeneesiin ja syövän kehittymisessä. Lisäksi purskeen isoformia monipuolistaminen voidaan evolutionarily sidottu ainutlaatuisia ominaisuuksia kädellinen spesiaatio.
Citation: Pugacheva EM, Suzuki T, Pack SD, Kosaka-Suzuki N, Yoon J, Vostrov AA, et al. (2010) rakenteellinen monimutkaisuus Ihmisen
BORIS
Gene in gametogeneesiin ja Cancer. PLoS ONE 5 (11): e13872. doi: 10,1371 /journal.pone.0013872
Editor: Sebastian D. Fugmann, National Institute on Aging, Yhdysvallat
vastaanotettu: 2. heinäkuuta, 2010 Hyväksytty: 11 lokakuu 2010; Julkaistu: 08 marraskuu 2010
Tämä on avoin-yhteys artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Public Domain ilmoitus, jonka mukaan, kun se on saatettu julkisia, tämä työ saa vapaasti kopioida, levittää, lähetetään, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta.
Rahoitus: Tätä työtä tukivat sisäiset tutkimusohjelman NIAID ja jonka sisäiset avustuksen NIH Office of aIDS Research AVS ja DL rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
BORIS
(veli Regulator painettu Sites) on paralogi moninainen
CTCF
geeni, joka osallistuu lukee epigeneettiset tavaramerkkien transkription geeniaktivaatiota ja tukahduttaminen, X-kromosomin inaktivaatiota, chromatin loop muodostumisen dimerointi- ja globaalissa kolmiulotteinen genomin organisaatio [1], [2], [3], [4], [5]. Vaikka kaksi proteiinia jakavat keskeinen 11 sinkkisormen (ZF) DNA: ta sitovan domeenin, ne ovat erillisiä amino- ja karboksyylipäät [2], [6]. Normaaleissa kudoksissa, kaksi paralogista geenit osoittavat toisiaan poissulkevia ekspressiokuvioiden:
BORIS
mRNA on runsaasti uros sukusolujen, erityisesti ensisijainen spermatosyyteiksi ja pyöreä spermatids, jossa
CTCF
, joka ilmaistaan kaikkialle somaattisissa soluissa, on tukahdutettu [2]. BORIS toimii transkription aktivaattorina useita kiveksen-spesifisten kohdegeenien spermatogeneesin aikana, kun taas CTCF estää samat tavoitteet somaattisten solujen [7], [8], [9]. Sukusoluilla, BORIS ehdotettiin olla mukana palautuksen merkintä on
IGF2 /H19
painamista ohjaus alue (ICR) [10]. Sen sijaan CTCF on tiedossa lukija ja suojelija
IGF2 /H19
merkintä merkkien somaattisten solujen [11], [12], [13], [14], [15]. Erottelu
BORIS
ja
CTCF
sen erilaisissa solutyypeissä nisäkkäillä on tiukasti kontrolloitua. Normaalisti CTCF, p53, ja CpG metylaation tukahduttaa
BORIS
transkriptio somaattisissa soluissa, tehokkaasti rajoittamalla sen ilmaisun Kivessukusolut [8], [16], jossa puuttuminen CTCF [2] ja useita aaltoja genominlaajuisten demetylaation luoda edellytykset
BORIS
aktivointia.
BORIS
on poikkeuksellisesti aktivoitu monissa syöpäsolujen, sen ilme samaan aikaan menetys CpG metylaatio, ensimmäinen epigeneettiset muutos tunnistettu syöpäsoluissa [2], [6], [17]. Poikkeava ilmentymä
BORIS
syöpäsoluissa todennäköisesti johtaa kilpailua BORIS ja CTCF proteiinien sitoutumisesta CTCF DNA sitova tavoite sivustoja (CTSes). BORIS voivat häiritä CTCF toimintoja syöpäsolut eivät vain sen vuoksi ottaa identtiset ZF sitova alue ja päällekkäisten DNA sitova spesifisyys, vaan myös koska sen eri amino- ja karboksyylipäät joka todennäköisesti antaa erillisen joukon molekyylitason toimintojen [2] . Itse asiassa sekä CTCF Boris sitoa
MAGE A1
-promoottorin, mutta vastakkaiset tulokset: kun CTCF toimii transkription repressori, BORIS toimii aktivaattorina [8]. Tuore tutkimus osoitti myös, että BORIS ja CTCF suorittaa erilaisia transkription toimintoja sitoutuessaan promoottori hiiren kiveksen erityisiä
CST
silmukointivariantti [9]. Yhteenvetona voidaan todeta, että vaikka molekyyli- toiminnot BORIS syövän on vielä tutkittu perusteellisesti, poikkeava koekspressio
CTCF
ja
BORIS
on yksi geeni-ilmentymisen allekirjoitukset ominaisuus moniin syöpiin [6 ].
Aiemmat tutkimukset osoittivat, että evoluution syntyminen
BORIS
vuonna amniotes tapahtui ennen eroavuus matelijoiden ja nisäkkäiden ja voitiin katsoa alustava päällekkäisyyden koko
CTCF
sekvenssi [18]. Vaikka BORIS ilmentyy laajalti matelijat ja monotremes, ilmentyminen osoitettiin olevan gonad-spesifinen pussieläimiä ja eutherians, mikä osoittaa, että BORIS tuli toiminnallisesti erikoistuneita aikana nisäkkäiden evoluutio yhteistuumin kehityksen leimautuminen [18]. Kun taas
CTCF
on erittäin konservoitunut Drosophila ihmisille [18], [19], [20],
BORIS
koodaus- ja ei-koodaavilla sekvenssit ovat kehityksellisesti muovia [18]. Itse asiassa vertailu amino- ja karboksipäät ihmisen
BORIS
kanssa ortologeihin muiden lajien paljastaa suhteellisen alhainen samankaltaisuus, 32,3% ja 23,7%, tässä järjestyksessä, kun vastaava samankaltaisuus ihmisen
CTCF
muiden ortologeihin on 90,1% ja 80,7%, tässä järjestyksessä. Kuitenkin, Boris-ZF alueella on 80,4%: n identtisyys sen ortologeille, samanlainen kuin 99,5% säilyttämistä varten CTCF ZFS [18]. Nopea kehittyminen
BORIS
ei rajoitu proteiinia koodaavien sekvenssien. Merkillistä, rakenne uran koko on huomattavan erilainen, vaikka hiiressä ja ihmisessä, mikä saattaa viitata siihen erikoistunut joukko toimintoja ja /tai liittämiseen isoformeja. Ihmisen
BORIS
geeni ulottuu yli 29 kb 20q13 ja koostuu 11 eksonista, joista 10 koodaus [2]. Tämä voi sallia, että muodostuu useita eri isoformien vaihtoehtoisen silmukoinnin. Evolutionarily, vaihtoehtoisen silmukoinnin on yleisimmin käytetty mekanismi lisätä kykenee koodaamaan mRNA-transkriptien mahdollistaa sukupolven eri proteiinin isomuotojen kanssa erillisen toiminnan.
Ensimmäinen todiste vaihtoehto
BORIS
selostukset tuli äskettäinen osoittaminen, että ihmisen
BORIS
ilmennetään vähintään kolme vaihtoehtoista promoottorit hyödyntäen viisi erillistä 5 ’UTR [16]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tunnettu 23
BORIS
silmukoitumisvariantit erillisistä ilmentymisen profiilit tavanomaisissa ituradan ja syöpäsolujen, mutta myös esillä ero DNA-sitova toiminta ja vaihtelevia transkription ominaisuuksia. Siten
BORIS
ilmaistaan ohjelmistoon vaihtoehtoisia selostukset ja proteiineja, mikä osoittaa, että vaihtoehtoisen silmukoinnin generoi monimutkaisen mekanismin BORIS-välitteisen toiminto ituradan ja syöpäsoluja.
Tulokset
ei
BORIS
selostukset ilmaistaan ihmisen kives, ES-soluissa ja solulinjoissa eri syöpien
aiemmin osoittaneet, että ilmaus
BORIS
rajoittuu kives kudosten ja syöpäsolut, ilme riippuvainen CpG-metylaatiostatuksen vaihtoehto
BORIS
promoottorit [8], [16]. Analysointiin
CTCF
ja
BORIS
ilmentymistä ihmisen kives, alkion kantasoluja (ES-solut), ja useita syöpäsolulinjoissa RT-PCR: llä, pystyimme monistamaan täysimittaisen ZF- koodaus alueilla sekä geenejä. Vain yksi PCR-vyöhyke, joka on spesifinen
CTCF
ZF verkkotunnuksen todettiin kaikissa solutyypeissä tutkittiin; kuitenkin useita PCR bändejä kertyi alukkeita monistamalla
BORIS
vastaava alue ZF domain (Fig. 1A). Sekvenssianalyysit kloonattujen
BORIS
PCR-tuotteet havaittiin useita vaihtoehtoisia selostukset erilaisilla yhdistelmillä ZF eksonia, jotka on luotu takia hyödyntämisen vaihtoehtoisten silmukointikohdissa (Fig. 1A). Runsaus ja jakelu
BORIS
transkriptivariantissa erosivat joukossa syöpäsolun linjat ja kiveksissä, mikä viittaa erillisten mekanismit sääntelyn
BORIS
geenin normaalissa ituradan ja syöpäsolujen.
(A) kokonaismäärä RNA: ita osoitetusta solulinjojen ja kiveksen kudos analysoitiin RT-PCR: llä käyttäen alukkeita suunniteltiin monistamaan täysimittaisen
CTCF
ja
BORIS
ZFS aloilla. Sekvenssit alukkeiden on esitetty taulukossa S1. Sisäkkäiset PCR suoritettiin 20 ja 35 syklin ensimmäisen ja toisen kierroksen, vastaavasti. Lähteet RNA näkyvät päällekkäin geeliä. Nuolet yhden
CTCF
transkriptio ja useita
BORIS
vaihtoehto selostukset. (B) 3 ’RLM-RACE strategia kloonaamiseen vaihtoehtoisesti liitettyjä
BORIS
muotoja. Kolme
BORIS
vaihtoehtoisten promoottorien ja 12 eksonien kanssa Koodaamattomat sekvenssit (valkoiset laatikot) tai koodaavat sekvenssit (harmaat laatikot) näkyvät. Kokonais-RNA: ta aikuisen ihmisen kives ja K562-solulinja käsiteltiin GeneRacer PCR Kit monistamista varten täyspitkän cDNA: t. Ensimmäisen kierroksen PCR suoritettiin kolme eteenpäin geenispesifistä (GSP) alukkeet A, B, ja C, jotka on suunniteltu tunnistamaan mRNA: n vastaavasta vaihtoehtoisesta
BORIS
promoottorit A, B tai C, vastaavasti. 3 ’GeneRacer aluke on kiinnitetty poly-A-hännän käytettiin alukkeena taaksepäin. l ui ensimmäisen kierroksen PCR-seosta käytettiin templaattina suorittaa sisäkkäisiä PCR kolme eteenpäin sisäkkäisiä geenispesifisiä (NGSP) alukkeita A1, B1, ja C1. (C) 3 ’RLM-RACE suoritettiin ihmisen kiveksen ja K562-solulinja. Useita
BORIS
transkriptit havaittiin molemmissa näytteissä. PCR-tuotteiden nested PCR on esitetty erotetaan 1% agaroosigeeleillä. M on Kokomarkkerina.
Tietäen, että CpG hypometylaatio osallistuu
BORIS
aktivointi [2], [8], [16], vertasimme
BORIS
ilmentymisen HCT116 koolonisyöpäsolulinja HCT116-solut käsiteltiin 5aza-dC, ja HCT116 joissa kaksinkertainen knockout (DKO) on
DNMT3b
ja
DNMT1
[21]. Dramaattinen lasku CpG-metylaation HCT116 DKO ja HCT116-solut käsiteltiin 5aza-dC, aiemmin on kuvattu [21], korreloi ulkonäkö useita
BORIS
erityisiä RT-PCR-tuotteiden (Fig. 1A), joka puuttuivat vanhempien HCT116-solulinjaa. Mielenkiintoista on, että ihmisen ES-soluja havaittiin ilmentävän ainakin kahdet vaihtoehtoiset
BORIS
selostukset, vahvistaa
BORIS
ilmentyminen ES-solulinjoja osoitettu aikaisemmin immunofluoresenssilla [22]. Yhteenvetona toteamme, että vaikka
CTCF
ilmaistaan yhtenä transkriptin ihmisen kiveksissä ja syöpien,
BORIS
ilmaistaan useita isoformeja kiveksissä, ES-solut ja syöpäsolulinjoissa, erityisesti solut lisääntynyt DNA hypometylaatio.
Kaksikymmentä kolme vaihtoehtoisesti liitettyjä
BORIS
isoformit ilmentyvät kiveksissä ja syöpäsoluissa
herättämänä edellisessä tunnistaminen viisi vaihtoehtoista 5′-UTR liittämiseen
BORIS
variantteja tuotetaan kolme vaihtoehtoista
BORIS
promoottorit (A, B ja C) [16], teimme näyttö täyspitkän vaihtoehtoisesti liitettyjä
BORIS
selostukset ihmisen kiveksissä ja K562 syöpäsolun linja, solut korkeimman
BORIS
ilme. Eristää täyspitkä
BORIS
vaihtoehtoisia transkripteja, käytimme 3′-RLM-RACE lähestymistapa on esitetty kuviossa 1B. Olemme monistetaan useita
BORIS
RT-PCR-tuotteet, jotka sitten kloonattu ja sekvensoitu (Fig. 1 C). Tästä tunnistimme 19 aiemmin tuntematonta
BORIS
silmukointimuunnokset (Fig. 2). Kaksi tärkeimmistä heterogeenisyys
BORIS
mRNA: t olivat käyttö vaihtoehtoisten promoottorien ja silmukointikohdissa. Havaitsimme myös ero käytön erillisten 5′- ja 3′-UTR-alueet sekä vaihtoehtoisia käännös kehyksiä amino- ja karboksipään koodaavat alueet. Linjaus
BORIS
genomisen sekvenssin vaihtoehtoisilla selostukset paljasti, että eksoni-intronirajoista oli klassinen silmu- sekvenssit (taulukko S4). Useimmat vaihtoehto
BORIS
selostukset hallussaan polyA-häntä sijaitsee 20-30 emäsparia alavirtaan kanoninen polyadenylaatiosignaali, AAUAAA (File S1), mikä osoittaa, että
BORIS
isoformit yltänyt lauseketta kypsä mRNA: t.
(A) Kaaviokuva
BORIS
geeni, jossa on kolme vaihtoehtoista promoottorien ja kuusitoista eksonit käytetään sukupolven 23 isoformin mRNA: iden. Eksonit koot on esitetty ohjelman mukaisesti, minimi- ja maksimimäärä nukleotidin vaihtoehtoiselle eksonit. Alku- ja stop-kodonit ORF merkitty ATG ja Lopeta, vastaavasti. Ensimmäinen
BORIS
transkriptio edustaa perin kloonattua
BORIS
muodossa, tässä
B0
;
BORIS
selostukset Alla ovat uusia kloonattu isoformeja. Vasemmalla ovat nimet
BORIS
isoformit, joka vastaa kaavamaisesti tietyn selostukset. Oikealla kuusi
BORIS
subfamilies jaettuna perusteella vastaavien 3 ’päissä, on merkitty. Punainen ja sininen viivoja ylä- tai alareunaan kaavamaisesti isomuotojen kuvaavat sijainnit Taqman. Transloimattomat alueet edustavat auki laatikoita. Intronit (ohuet viivat) ei osoitettu tarkkaa mittakaavassa. (B) vaihtoehtoinen silmukointi luo uuden ZF
C6
isoformin. Aminohapposekvenssien vertailuun ZF 4
B0
ja uusia vaihtoehtoisia ZF 4/9 on
C6,
joka yhdistää ensimmäisen puoliskon ZF 4 ja jälkipuoliskolla ZF 9 (C) Vaihtoehtoinen silmukointi luo uuden koodaus spacer välillä ZFS 5 ja 6
A3
isoformin.
BORIS
isoformit luokiteltiin mukaan promoottorinkäytöllä (Fig. 2A ). Isoformeja ajettu promoottori A sisältyy
BORIS A1
,
A2
,
A3, A4, A5
, ja
A6
. Verrattuna alun perin kuvattu
BORIS
transkriptio [2], joka on nyt nimetty
BORIS B0
isoformin, isoformit
A1
ja
A2
sisälsi vaihtoehto 5 ’UTR: t, mutta on koodattu samalla BORIS polypeptidiä (Fig. 2A, taulukko S3). Isoformi
A3
oli useita uusia ominaisuuksia, jotka erottaa sen
B0
myös pitkään ei-koodaavan 5 ’UTR ja syrjäytymisen eksonin 6 johtuen vaihtoehtoisen silmukoinnin. Tämä johti läsnä vain 9 ZFS, eikä 11
BORIS B0
, mutta myös tuottanut uuden pitkän spacer välillä ZF5 ja ZF8 (Fig. 2A, C). Sillä isoformit
A4
ja
C2
, jotka molemmat koodaavat samaa polypeptidiä, ORF jatkuu introni 4 kunnes vaihtoehtoinen lopetuskodonin johti katkaisu ZF verkkotunnuksen samalla kun se tuottaa vaihtoehtoista COOH-päässä . Isoformit
A5
ja
A6
molemmat koodattu 10 täysi ZFS ja puolet ZF11, joka on vaihtoehtoisesti liitettyjä eksonista 8 uusiin eksonit 9 tai 9 (1), vastaavasti, tuloksena on kaksi vaihtoehtoista karboksi -termini. Isoformivyöhykkeet
B1
on sama 10 koodaus eksonien kuin
BORIS B0
prototyyppi, mutta hallussaan ylimääräisen eksonin 11, joka koodattu vaihtoehtoista karboksipääteryhmä. Lisäksi jotkut isoformit oli vaihtoehtoisia amino-päät, koska käytön eri aloituskodonit, jotka johtuvat vaihtoehtoisesta silmukoinnista eksonin Eb eksoni 2 (in
B3
ja
B4
) tai eksonin 3 (in
B2, B5, B6, B7
).
Useimmat yllättäen, vain 7 pois 23
BORIS
isoformit koodasi täyspitkää 11 ZF DNA: ta sitovan verkkotunnuksen, jossa määrä ZF muissa isoformeja 1-10 (File S1, taulukko S3). Kuten on esitetty seuraavissa esimerkeissä, määrän vähentämisen ja ZFS johtui käyttöä vaihtoehtoisten silmukointikohtien ja lopetuskodonit. Isoformin
C5
oli vain yksi ZF ja vaihtoehtoisen karboksipään johtuvat silmukoinnin keskeltä eksonin 3 eksoni 10b. Vaikka isoformi
C8
sisälsi kaikki 11 eksonia, läsnäolo ylimääräisen eksonin 6a kanssa lukukehyksessä lopetuskodonin johti vain kuusi ZFS. Merkillistä, liittämiseen eksonista 4 eksoni 8 isoformia
C6
luonut uuden hybridi ZF koostuu puolet ZF 4 ja puoli ZF 9. Tämä nostaa esiin mahdollisuuden, että uusi ZF voisi antaa uutta DNA: ta sitova ominaisuuksia tämän isoformin (Fig. 2B). Lopuksi joitakin vaihtoehtoisia eksonit, kuten 5a
B6, B7, C7
, ja
C9
, säilytetty intronisekvensseihin että sisällytetty ennenaikainen lopetuskodonia, ja siksi ei tuota stabiileja proteiinia takia nonsense-välitteinen mRNA hajoaminen (NMD) koulutusjakson, mahdollisuus, että olisi tarkistettava kokeellisesti.
ominaispiirteet
BORIS
vaihtoehtoisia muunnelmia ja niiden evoluution säilyttämistä ihmisillä ja muilla kädellisillä
23
BORIS
mRNA silmukoimisvariantteja ovat mahdollisia koodata 17 erilaista polypeptidiä että Microsoft nimeää BORIS isoformi proteiinit 1 kautta 17. luokitella isoformien, vaihtoehtoiset amino- ja karboksyylipäät nimettiin mukaan määrän aminohappotähteiden ylävirtaan ja alavirtaan ZF domeenin, vastaavasti (taulukko S3). Esimerkiksi, N258 merkitsee aminopäässä 258 aminohappotähdettä ylävirtaan ZF-domeenin, joka on koodattu monilla
BORIS
isoformeja, mukaan lukien
B0, B1, A3, A4, A5, A6, C3, C4, C5, C6, C7 /C9
ja
C8
. Erityisesti N24 ja N53, typistettyjä versioita N258, ei ole aminohappo eroja N258 sisällä 24 ja 53 aminohappoa ylävirtaan ZF1. Yksitoista vaihtoehtoisia karboksyylipäät löytyy erilliset isoformit nimetty ”C”, ja niiden lukumäärä vastaa kodonien määrä alavirtaan viimeisen ZF. Esimerkiksi
B1
on C132,
C3
on C97,
C5
on C53, jne. (File S1, taulukko S3).
haku homologiaa tunnettujen proteiinien tai domeenien, yksitoista ainutlaatuinen vaihtoehto C-päät verrattiin BLAST GenBank aminohapposekvenssejä. Vain yksi vaihtoehto karboksi-terminuksessa, C97, osoitti huomattavan samankaltaisuuden, jossa on useita ei-BORIS proteiineja, mukaan lukien useita mukana prosesseissa transkription tai translaation (Fig. S2). Tämä hiljattain tunnustettu otaksuttu verkkotunnus on aiemmin tuntemattomia osa tunnetun helikaasin kaltainen domeeni (COG0553). Lisäksi analyysit vaihtoehtoisten 3’UTRs joidenkin isomuotojen paljasti erityisiä toistuvia DNA-elementtejä. Esimerkiksi osa 3’UTR varten
B6
ja
C7
isoformit kuuluu by Alu-J konsensus. 3’UTR isoformin
B1
on myös erittäin toistuvat ihmisen ja kädellisten genomien. Isoformit
C3, B2, B3, C4, C5
, ja
C8
on kädellisen erityinen toistuva DNA elementti, MER1 [23] niiden 3’UTRs.
se, että
BORIS
isoformit ovat konservoituneita muiden lajien viittaa niiden biologista merkitystä. Esimerkiksi kaikki ominaisuudet ihmisen
BORIS
isoformit ovat erittäin konservoituneita apinoita
Pan troglodytes
ja
Macaca mullata,
kanssa konservoituneita silmukointikohdista ja vastaava proteiini identiteetit vaihtelevat 96 %: sta 100% ja 53%: sta 97%: iin (Fig. 3). Kaikkein konservoitunut C-päät ovat: C95 (jossa identiteettiä 99% ja 89% vuonna simpanssi ja makakien, vastaavasti), C97 (97% ja 91%), C68 (98% ja 96%), C35 (100% ja 97%), ja C24 (96% ja 96%). C132 on erittäin konservoitunut simpanssi (96%), mutta vähemmän makakeilla (53%). Vaikka kohdistus ihmisen
BORIS
isoformit hiirellä genomisen lokuksen paljastui useita otaksuttu hiiren BORIS karboksyylipäät (C95, C90, C35, ja C34), homologian taso oli melko alhainen, vaihdellen 9%: sta 42% . Tämä viittaa siihen, että vauhti
BORIS
evoluutio nisäkkäillä on ollut varsin nopeaa ja monimutkaisuus
BORIS
lokuksen todennäköisesti samaan aikaan syntymistä kädellisillä. Se, että hiiren
Boris
lokuksen ei ole sama eri isoformien, kuten ihmisten tai muiden kädellisten voivat liittyä kädellisen erityisiä kehittyminen intronisekvenssit
BORIS
loci [18]. Vielä on selvitettävä, hiirillä on vaihtoehto
Boris
isoformin lajeja. Jos ne ovat olemassa, olisi odotettavissa, että ne olisivat erilaisia kuin ihmisellä huolimatta säilyttämistä silmukointikohdista. Syntymistä isoformit kädellisillä voi siis johtua otaksuttu introni liittämiseen parantajia.
(A) Identtisyysprosentti ihmisen (
H.sapiens
) BORIS isoformit C-päät on otaksuttu vaihtoehtoisen aminohapon sekvenssit kuin simpanssi (
P.troglod.
), makaki (
M.mulatta
), ja hiiri (
M.mus
.). Yksitoista vaihtoehto C-päät löytyy erilliset isoformit määritellään kodonien määrä alavirtaan viimeisen ZF. Taulukossa on esitetty nimet BORIS isomuotojen vastaavien C-päät ja identiteettiään prosenttia. (B) rinnastus BORIS vaihtoehtoisten C-päät ihmisen, simpanssin, makakit ja hiiri. Toissijaisesti aminohapposekvenssit ihmisen, simpanssin, makaki ja hiiri linjassa ClustalW (Vector NTI). Ihmisen BORIS silmukointivariantit ovat erittäin konservoituneita kädellisillä, mutta ei hiirillä. Aminohapposekvenssit joidenkin BORIS vaihtoehtoisten C-päät (C132, C97, C68, C53, C36, C30, C24) ovat täysin poissa hiirillä. Keltainen esille sekvenssit ovat 100% identtisiä ihmisen aminohapposekvenssin; sininen korostus osoittaa konservatiiviset substituutiot suhteessa ihmisen homologisia BORIS sekvenssit. Pisteet osoittavat insertioita tai deleetioita.
Alternative
BORIS
selostukset ilmaistaan normaalissa miehen ja naisen sukuelimiin
aiemmin raportoitu, että ilmaus
BORIS B0
normaaleissa ihmisen kudoksissa rajoitettiin kiveksissä [2]. Analysoida kuvioita
BORIS
isoformin ilmentyminen kiveksissä, suunnittelimme sarja alukkeita ja Taqman vahvistamaan vaihtoehtoista transkriptien qRT-PCR. Vain 8 23
BORIS
isoformeja olisi erityisesti syrjiä qRT-PCR koska useimmat isoformeja jakavat sekvenssit, minkä vuoksi on mahdotonta suunnitella alukkeita ja koettimia, jotka tunnistavat jokaisen
BORIS
isoformin omana laji . Näin ollen, olemme toiminnallisesti jaettu 23 isoformien kuuteen alaperheisiin (SF1 SF6), joka perustuu niiden ainutlaatuinen 3 ’terminaaliset sekvenssit, joita käytetään suunniteltaessa 6 Taqman koettimia qRT-PCR: llä (Fig. 2A, materiaalit ja menetelmät). Niistä 13 aikuisten ja 13 sikiön testatuissa kudoksissa ilmentyminen kuuden
BORIS
subfamilies havaittiin vain aikuisille kiveksissä ja alkion munasarja, mutta suhteelliset tasot isoformin ilmentyminen oli toistettavasti eri kahdessa kudoksissa (Fig. 4A , B). Aikuisilla kives, kaikki kuusi subfamilies ilmaistiin samalla tasolla, jossa SF1 on yleisin ryhmä, ilmaisi noin 1,3- ja 3-kertainen korkeampi kuin muut viisi subfamilies (Fig. 4A). Sen sijaan, SF3 oli yleisin muoto alkion munasarjat (Fig. 4B), on ilmaistu tasolla noin 4 kertaa suurempi kuin SF1 ja SF4, ja 11- 127 kertaa suurempi kuin SF6, SF2, ja SF5 ryhmiä ( kuva 4B). Vaikka joukossa aikuisen kudoksissa vain kives oli vahvasti positiivinen
BORIS
isoformit, he ilmaisivat hyvin alhaisilla joskin toistettavissa tasolla useissa kudoksissa sikiön paneelissa, kuten kiveksissä, iho, ja perna (Fig. 4B). Tämä viittaa siihen, että
BORIS
isoformit voivat olla funktionaalisesti aktiivinen ulkopuolella ituradan sikiön kehityksen aikana.
qRT-PCR-analyysi
BORIS
isoformin ilmentyminen normaaleissa aikuisen ihmisen (A) ja sikiön (B) kudoksissa, vastaavasti, kvantitoitiin absoluuttisen määrän lähestymistapaa. 23
BORIS
isoformien jaettiin 6 alaperheeseen, joka perustuu niiden ainutlaatuinen 3′-sekvenssit, jotta suunnitteluun Taqman (Materiaali ja menetelmät). (C)
BORIS
isoformin ilmentyminen ihmisen normaalia aikuisen kives analysoitiin
in situ
-hybridisaatio, RNA FISH. Kaloilla määrityksiä, koettimet kuudelle
BORIS
subfamilies (SF1-SF6) leimattiin digoksygeniini-11-dUTP PCR ja yksilöllisesti hybridisoitiin formaldehydi-kiinteä aikuisen ihmisen kives. Levyjä inkuboitiin anti-DIG-vasta-aineita yön yli ja sitten visualisoidaan rodamiini-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen. Tunnistaa spermatogonioiden ja spermatosyyteiksi, suoritimme immunovärjäys vasta-aineita SCP3 (punainen) ja E-kadheriinin (vaaleanvihreä), tässä järjestyksessä. Sulautunut kuvia DAPI-värjättyä ytimet (sininen) ja
BORIS
isoformin RNA (punainen) otettuja 20X suurennus; suurennettuna kuvat ovat 63x. Nuolet kanssa kirjaimet tarkoittavat: Sg-spermatogonioiden, Sc – spermatosyyteiksi, St – spermatids (pieni, pitkänomainen soluja pitkänomainen ytimet, vastaavasti). Ohjaus (Ctr) on värjäämällä rodamiinikonjugoitu sekundaarinen vasta-aine yksinään.
tunnistaa erityinen solutyyppejä että ilmaista
BORIS
isoformit aikuisten kiveksissä suoritimme RNA
in situ
-hybridisaatio käyttämällä kiinteitä valmisteita normaalin ihmisen kives. Immunovärjäystä kiveksen vasta-aineita SCP3 ja E-kadheriinin käytettiin erottamaan spermatogonioiden ja spermatosyyteiksi, vastaavasti, kun taas spermatids havaittiin morfologisesti pieninä ja pitkänomainen soluja pitkänomainen ytimet (Fig. 4C, E-cad, SCP3). Hybridisaation kuuden leimattuja PCR-koettimien suunniteltu erityisesti havaitsemaan kunkin kuuden
BORIS
subfamilies isoformi transkriptit havaittiin lähes kaikissa spermatogeneesin (Fig. 4C). Kaikki kuusi
BORIS
transkriptio subfamilies olivat vähemmän runsas sytoplasmassa spermatogonioiden kuin spermatosyyteiksi, kun taas spermatids olivat erittäin positiivisia
BORIS
sf2 ja marginaalisesti positiivinen SF5 ja SF6. Siten SF2, SF5 ja SF6 näyttävät luonnehtia myöhemmissä vaiheissa spermatogeneesin välillä spermatosyyttejä ja spermatids. Aiemmassa tutkimuksessa [2] käyttäen kanan anti-BORIS vasta-ainetta ja 5 ’end-leimattu
BORIS
koetin, sekä spesifinen N258 päätepysäkki, osoitti, että ilmaus
BORIS B0
isoformi oli rajoittuu pääasiassa spermatosyyteiksi. Tässä työssä täydentää edellisen arvioinnin
BORIS
transkriptio lokalisointi tarjoamalla näyttöä ilmaus kaikkien kuuden
BORIS
subfamilies aikuisen ihmisen kives. Näennäinen ero ilmentyminen yksittäisten subfamilies aikana etenemistä aikaista myöhemmissä vaiheissa spermatogeneesin osoittaa, että ilmaus
BORIS
isoformien kehityksellisesti säännelty.
BORIS
isoformeja koodaavat otaksuttu syöpä -testis antigeenejä
Aiemmat tutkimukset osoittivat, että
BORIS B0
isoformia poikkeuksellisen ilmaistaan monenlaisia ihmisen syövissä, mukaan lukien sekä primaarisyöpien ja syöpäsolulinjoissa, määrittelemällä sen, joka koodaa oletetun syöpää kives-antigeenin (CTA) [6], [8], [24], [25], [26]. Ymmärtää merkitystä äskettäin löydetty useita
BORIS
isoformit syövän kehittymisen ja etenemisen, testasimme NCI-60 tasyöpäsolulinja paneeli RT-PCR ja havaittiin, että noin 70% näistä solulinjat ilmensivät selostukset jotkut isoformit (Kuva. 5A). Suurin osa positiivisten linjojen kuitenkin ilmaisi tasot
BORIS
selostukset, jotka olivat melko alhaiset alle 500-1,500 selostukset kohden 50 ng kokonais-RNA. Kuitenkin tasot riittivät havaita kaksi eri malleja
BORIS
isoformin ilme. Ensimmäinen malli, esimerkkinä kuvassa 5B varten K562 solulinjan, liittyi yli 20000
BORIS
selostukset (summataan kaikki kuusi
BORIS
subfamilies) per 50 ng kokonais-RNA. Tässä alaryhmässä solulinjojen (8 ulos 60, 13% NCI-60 paneeli), SF1 transkriptit olivat läsnä korkeimmalla tasolla, keskimäärin noin 3 kertaa suurempi kuin tasot sf2, 10-kertainen kuin SF3 ja SF4, 50 kertaa suurempi kuin SF6, ja yli 100 kertaa suurempi kuin SF5 (Fig. 5B). Solulinjat näyttämisen ekspressiokuviota peräisin eri kudoksista, mukaan lukien munasarja-, keuhko-, rinta-, verta, ja iho, mikä osoittaa, että ilmaus
BORIS
isoformia ei nimenomaisesti liittyy syövät erityisesti alkuperää.
(A)
BORIS
subfamilies merkittävästi yläreguloituja syöpäsoluissa verrattuna normaaleihin soluihin. Normaaleille soluille (N) – ilmaus
BORIS
isoformit analysoitiin 13 kudoksissa ja 4 ensisijainen solulinjoissa. Kasvaimen solut (T) – NCI-60 syöpäsolulinjoja analysoitiin. 59 NCI-60-syöpäsolulinjoja, 13 normaaleista kudoksista, ja 4 tavalliset ala- solulinjoissa analysoitiin absoluuttisia lähestymistapaa normalisoinnin GAPDH tasolle, ja piirretään käyttäen logaritmista asteikkoa. Tasot
BORIS
isoformin ilmentyminen vaihtelee suuresti (0-60 tuhatta selostukset per 50 ng kokonais-RNA). Punaiset viivat kuvaavat keskiarvoja kullekin
BORIS
subfamily. (B) ensimmäinen kuvio
BORIS
isoformin ilmentyminen NCI-60 syöpäsoluja, kuten on esitetty K562 syövän solulinja. (C) toinen kuvio
BORIS
isomuotojen ilmentyminen NCI-60 paneeli on esimerkkinä Ovcar3 syövän solulinja. (D-J)
BORIS
isomuotojen ilmentyminen analysoitiin RPA. Alikvootit kokonais-RNA saatujen munuaisten kivesten ja K562-solulinja hybridisoitiin
32P-leimattu antisense RNA-koettimia. RNaasi suojattu fragmentit (nuolenpäät) havaittiin vain kiveksissä ja K562, mutta ei munuaisissa. Ensimmäinen kaista kummallakin geeli on ohjaus, joka on Digeroimaton inkuboitiin hiivan RNA. (D) RPA kanssa Ribokoetin SF1 /SF5 tuottaa 154 bp ja 40 bp fragmentit, jotka vastaavat SF1 ja SF5, vastaavasti.