Krooninen sairaus

tiivistelmä

MicroRNA-449A on ilmaistu alhaisena useissa kasvaimissa ja syöpäsolujen linjat, ja indusoi G1 pidätys, apoptoosin, ja vanhenemista. Tunnistaa toiminta miR-449A ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), keskustelimme Ilmiön merkitystä miR-449A ja kliinis ominaisuuksien ja ennusteen NSCLC. Olemme myös tutkineet vaikutusta miR-449A maahanmuutosta ja hyökkäyksen NSCLC soluissa. Ilmaisu Mir-449A in NSCLC kudoksissa ja solulinjoissa detektoitiin käyttämällä RT-qPCR.

In vitro

, saavat-of-function, keskeytys- toiminto kokeita, ja fluoresenssi määritykset suoritettiin tunnistamaan mahdollisia tavoite miR-449A ja toiminta miR-449A in NSCLC soluissa. MiR-449A säädeltiin vähentävästi sekä NSCLC kudoksissa ja solulinjoissa. Lisäksi alhainen ilmentymistaso miR-449A näytti korreloivan imusolmuke etäpesäke ja huono selviytymistä.

In vitro

, miR-449 säänneltyä solumigraatio ja hyökkäyksen NSCLC soluissa mahdollisena tuumorisuppressori, ainakin osittain kohdistamalla c-Met. Lisäksi vastavuoroinen ilmentyminen miR-449A ja c-Met näytettiin NSCLC kudosnäytteistä. Tämä tutkimus osoittaa, että miR-449A saattaa liittyä NSCLC etenemiseen, ja ehdottaa ratkaiseva rooli miR-449A in NSCLC.

Citation: Luo W, Huang B, Li Z, Li H, Sun L, Zhang Q, et ai. (2013) MicroRNA-449A Onko vaimentua in ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ja estää Migration ja Invasion kohdistaminen c-Met. PLoS ONE 8 (5): e64759. doi: 10,1371 /journal.pone.0064759

Editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 9. joulukuuta, 2012 Hyväksytty: 17 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 29, 2013

Copyright: © 2013 Luo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Science Foundation of China (nro 30972967) avustukset, Erikoistunut Research Fund tohtorikoulutuskeskukseen korkeakoulutusalueen (nro 20092104110018), Program for Liaoningin Erinomainen Talents in University, Liaoningin maakunnan Natural Science Foundation (nro 20102122) ja Shenyang Science and Technology Program (F10-149-9-41). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat luokka pienet ei-koodaavat RNA: t, noin 20-25 nukleotidia, jotka säätelevät geenien ilmentymistä posttranscriptionally. Sitomalla komplementaarinen sekvenssi havaitaan pääasiallisesti 3′-UTR: kohde-mRNA: iden, miRNA joko huonontavat näiden mRNA: iden tai estää ne on käännetty proteiineja. Lähes 50% ihmisen miRNA sijaitsevat hauras sivustoja ja genomialuetta mukana syövistä [1]. Kehittyvät näyttöä siitä, että miRNA korreloidaan eri ihmisen syöpien ja toimivat sekä onkogeenien ja tuumorisuppressoreita [2], [3], [4].

MicroRNA ilmaisun vapauttamiseen ihmisen syövissä ovat osoittaneet, että miRNA dysregulation liittyy monia syöpiä kuten keuhkosyövän [5], [6], [7], [8], [9]. Korkea ekspressio miR-155 ja alhaisen ilmentymisen anna-7, miR-126 raportoidaan ennustaa huonoon ennusteeseen keuhkojen adenokarsinooma [6], [7], [10]. Raponi ja työtovereiden kuvattu selvästi miRNA ilmaisuja keuhkojen okasolusyöpä (SCC) verrattuna normaaliin keuhkokudoksessa [11]. Perustuu miRNA ilmaisun vapauttaminen, miRNA voisi tarjota uusi menetelmä syövän diagnosointiin.

MiR-449 ilmentyy alhaisella tasolla useissa syöpäsolulinjoissa ja kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien eturauhassyövät [12], mahasyöpä [13 ], virtsarakon syöpä [14] ja keuhkosyövän [15]. Biologinen tavoitteet miR-449 on osittain tunnistettu, ja miR-449 indusoi G1 pidätys, apoptoosin, ja vanhenemista asetuksella avaintekijöitä solusyklin ja apoptoosin kuten histonideasetylaasi- 1 (HDAC1) [12], CDK6 [16] , [17], [18], CDC25A [16], [18], sykliini D1 (CCND1) [19], ja SIRT1 [17]. Kuitenkin tiedetään vähän roolista miR-449A in NSCLC etenemistä. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että miR-449A säädeltiin vähentävästi NSCLC kudoksissa ja liittyvät ennusteeseen viittaavia merkkejä ja ennustetta. Olemme tutkineet vaikutus miR-449A in NSCLC solumigraatioon ja invaasion ja sen sääntely kohdegeenin c-Met. Vastavuoroinen ilmentyminen miR-449A ja c-Met havaittiin NSCLC kudosnäytteistä ja mahdolliset roolit miR-449A ja c-Met: in NSCLC etenemistä käsitellään.

Materiaalit ja menetelmät

Näytteet

Tuoreet näytteet keuhkosyöpä ja vastaava normaali viereinen kudos (NAT, 5 cm syöpäkudoksessa) saatiin potilailta First Affiliated sairaala China Medical University ja Liaoningin Cancer Hospital välillä tammikuussa 2008 ja marraskuu 2009 kanssa tietoon perustuvan suostumuksen. (Sairaalan Eettinen Review antoi hyväksyntä). Yksikään 84 Tutkimukseen osallistuneiden potilaiden saanut kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen leikkausta. Kymmenen normaali keuhko näytteet saatiin suostuu potilaiden leikkauksen aikana hyvänlaatuisen keuhkosairaus. Mir-449 kvantitatiivinen analyysi formaliinikiinnitetyt parafinoidut kudokset (FFPETs) keuhkosyöpään tapausta valittiin satunnaisesti potilaiden Liaoningin Cancer sairaalan tammikuu 2004-joulukuu 2005 tietoon perustuvan suostumuksen ja hyväksynnän. Ennusteeseen viittaavia tietoja oli saatavilla ja kaksi patologeja itsenäisesti määritelty diagnoosit ja histologinen arvosana perustuu Maailman terveysjärjestön ohjeita. Ennusteeseen viittaavia tietoja ja seurantatietoja on yhteenveto taulukossa S1.

Tämä tutkimus suoritettiin suostumuksella paikallisen Institutional Review Board First Affiliated sairaala China Medical University ja Liaoningin Cancer Hospital. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta ja kaikki kliinisen tutkimuksen ole tehty.

Reaaliaikainen kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (RT-qPCR) Mir-449A

Kokonais-RNA eristettiin tuoreesta kudosten ja solujen käyttäen Trizol (Invitrogen, NY, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA FFPETs erotettiin käyttäen miRNA Isolation Kit Am1975 RecoverAllTM (Ambion, Austin, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. MicroRNA kvantifiointi poimituista RNA suoritettiin käyttäen TaqMan MicroRNA määritykset (Applied Biosystems, Foster City, USA). RT pohjamaali ja TaqMan anturi miR-449A (Applied Biosystems, Foster City, USA) käytettiin PCR-analyysi ABI 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, USA) mukaisesti valmistajan protokollaa. RNU6B, sisäisenä kontrollina, suoritettiin samalla tavalla kuin edellä. Kukin RT-qPCR analyysi suoritettiin kolmessa riippumattomassa kokeessa, käyttäen kolme riippumatonta näytettä. Suhteellinen määrä miR-449A kudoksissa ja NSCLC solulinjoja keskimääräiseen verrattuna ilmentymisen 10 normaalin näytteen, käyttämällä yhtälöä RQ = 2

-ΔΔCT [20], [21].

Cell Culture ja transfektio

ihmisen keuhkosyöpä A549 ja H1299 solulinjat saatiin American Type Culture Collection. Muut NSCLC solulinjoja BE1 ja LH7 soluja aikaisemmista julkaisi paperin tiimimme [8]. A549 kasvatettiin Dulbeccon modifed Eagle Medium (Gibco® Invitrogen, Carlsbad, USA). BE-1, LH-7 ja H1299 kasvatettiin RPMI-1640 (Gibco® Invitrogen, Carlsbad, USA). Kussakin tapauksessa, alustaan ​​lisättiin 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone, Logan, USA), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 U /ml streptomysiiniä. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO

2.

matkivat negatiivinen kontrolli, joka on miR-449A matkivat, estäjä negatiivinen kontrolli ja miR-449A-inhibiittori, olivat RiboBio (Guangzhou, Kiina). A549 ja H1299-solut transfektoitiin käyttäen HiPerFect transfektioreagenssia (Qiagen, Hilden, saksa). Lyhyesti, kompleksit, jotka sisältävät jäljittelee tai inhibiittorit valmistettiin valmistajan protokollaa. Seos lisättiin soluihin loppupitoisuuteen 100 nM. Neljä ryhmää olivat: solut transfektoitu matkia negatiivinen kontrolli, transfektoidaan miR-449A matkivat, transfektoitu estäjä ohjaus, transfektoidaan miR-449A estäjä. Lisäksi c-Met: pieni häiritsevä RNA (siRNA) ja negatiivinen kontrolli on suunniteltu ja syntetisoitu GenePharma (Shanghai, Kiina) ja transfektoitiin A549-soluja. Sekvenssit c-Met: siRNA olivat 5′-GUC AUA GGA AGA GGG CAU UTT-3 ’(sense), ja 5′-AAU GCC CUC UUC CUA UGA CTT-3’ (antisense).

Cell Migration ja Invasion analyysit

TranswellTM kammiot (Corning, NY, USA), jonka huokoskoko 8 pm käytettiin solumigraatioon ja invaasion määrityksissä. Soluja kasvatettiin 60% konfluenssiin ja transfektoitiin kanssa miRNA tai siRNA. 24 tunnin kuluttua, sillä migraatiokokeessa, solut trypsinoitiin ja 5 x 10

4 solut suspensoitiin seerumittomassa väliaineessa ja sijoitetaan ylempään kammioon. Kuten kemoattraktantti, alempi kammio sisälsi 10% FBS: ää. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 5% CO

2 16 tuntia, ja nonmigrating solut poistettiin pumpulipuikolla. Siirtyneet solut pestiin kahdesti PBS: llä ja kiinnitettiin 100% metanoli, värjättiin hematoksyliinillä. Stained solut tarkastella mikroskoopilla (x 200 suurennus), ja määrä siirtynyt solujen laskettiin viidellä satunnaisesti aloilla. Invaasiolle määrityksiä, ylempi kammio esipäällystetty Matrigel sekoitetaan seerumia (laimennettu 1:03, BD Biosciences, San Jose, USA). Jähmettymisen jälkeen seoksen, 5 x 10

4 solut seerumivapaassa väliaineessa pantiin yläkammioon. Alempi kammio sisälsi 10% FBS kuin kemoattraktantti. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 5% CO

2 18 tuntia, ja ei tunkeutuvat solut poistettiin pumpulipuikolla. Invasiivisia solut kiinnitettiin, värjättiin ja laskettiin. Stained solut tarkastella mikroskoopilla (x 200 suurennus), ja määrä siirtynyt solujen laskettiin viidellä satunnaisesti aloilla. Määritykset suoritettiin kahtena kappaleena kolmesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta.

RT-qPCR analyysi miR-449A Target Gene

Kokonais-RNA uutettiin soluista, ja cDNA-synteesi suoritettiin PrimerScript RT reagenssipakkauksen ( Takara, Dalian, Kiina). Saatu cDNA monistettiin käyttämällä c-Met-alukkeiden kanssa SYBR Esiseos Ex Taq II (Takara, Dalian, Kiina) parametrien kanssa 95 ° C: ssa 30 s, jonka jälkeen 40 sykliä 95 ° C 5 sekuntia, 60 ° C: ssa 30 s . Alukkeet c-Met olivat F: 5′-GGCTGGTGGCACTTTACTTA-3 ’ja R: 5’CTTGTCTCTCGGTTGGCTA-3′, ja alukkeiden endogeenisen β-aktiini olivat F: 5’-AGCACAGAGCCTCGCCTTTG-3 ’, R: 5’- ACATGCCGGAGCCGTTGT -3 ’. Sulamiskäyräanalyysillä suoritettiin lopussa syklien varmistaa tuotteen spesifisyyttä. Suhteellinen määrä c-Met, normalisoidaan P-aktiini, lasketaan yhtälön RQ = 2

-ΔΔCT.

Western blot -analyysi

kudosnäytteitä 0,2 g jauhettiin jauhe nestemäisessä typessä. Tissue-aine ja solut uutettiin lyysipuskurilla (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS: ää, 2 mg /ml aprotiniinia ja 1 mM PMSF) 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Yhtä suuri määrä proteiinia erotettiin 10% SDS-PAGE-geeleillä. Anti-c-Met (21220, Signalway Antibody, Maryland, USA), anti-MMP2 (sc-13595, Santa Cruz, CA, USA), anti-MMP-9 (sc-13520, Santa Cruz, CA, USA), anti- β-Actin (sc-1616, Santa Cruz, CA, USA) käytettiin seurasivat valmistajan ohjeita. Image J ohjelmisto (National Institutes of Health, Md, USA) käytettiin mittaamaan intensiteetti proteiinin bändejä.

fluoresoiva Reporter Assay

Jotta suorittamiseksi fluoresoiva reportteri määritys, seuraavia alukkeita käytettiin monistamaan 3’UTR c-Met-geeni ihmisen cDNA: n (NM_000245): forward-alukkeen 5′-GATCCTGCTAGTACTATGTCAAAGCAACAGTCCACACTTTGTCCAATGGTTTTTTCACTGCCTGAG -3 ’, käänteinen aluke 5′-AATTCTCAGGCAGTGAAAAAACCATTGGACAAAGTGTGGACTGTTGCTTTGACATAGTACTAGCAG-3’.

plasmidi, joka sisältää c-Met 3’UTR fluoresoivaan toimittaja rakennettiin (Sauer Biotechnology Inc., Kiina). A549-soluja ympättiin 48-kuoppalevyille, viljeltiin yön yli, sitten kotransfektoitiin matkivat ohjaus, miR-449A matkivat, estäjä-ohjaus, miR-449A-inhibiittori, minkä jälkeen pcDNA3 /EGFP-c-Met: n 3′-UTR toimittaja vektori 24 tunnin kuluttua. Parannettu vihreän fluoresoivan proteiinin (EGFP) aktiivisuus normalisoitiin punainen fluoresoiva proteiini (RFP) aktiivisuus. 72 tunnin jälkeen proteiinit uutettiin, ja fluoresenssispektrofotometriä F-4500 (HITACHI, Japani) käytettiin määrittämään fluoresenssi-intensiteetti. Määritykset suoritettiin kahtena kappaleena kolmen erillisen kokeen.

Tilastollinen analyysi

SPSS13.0 tilastollinen ohjelmistopaketti (SPSS, Chicago, USA) käytettiin tilastolliseen analyysiin. RT-qPCR, ilmentymistason miR-449A keuhkosyövässä ja pariksi NAT oli log2 muuttunut. Kaikki arvot ilmoitetaan keskiarvona keskihajonnan (SD). Laitepari-näytteet T-testiä käytettiin erojen analysoimiseksi miR-449A ilmaisun välillä keuhkosyövän ja Hyväksytty NAT. Chi-neliö testiä käytettiin analysoimaan suhdetta miR-449A ekspressiotasot ja ennusteeseen viittaavia merkkejä. Mann-Whitneyn U-testiä käytettiin analysoimaan asetetuilla tiedoilla histologisten asteen ja patologinen vaiheessa. Spearmanin määritetään korrelaatio miR-449A ilmaisun ja patologinen vaiheessa ja imusolmuke tila. Kaplan-Meier menetelmää käytettiin eloonjäämiskäyrien, ja log-rank-testiä käytettiin vertailussa. Coxin käytettiin tutkimaan vaikutusta covariables. Tulokset Solukokeita analysoitiin riippumaton näytteitä T-testi ja yksisuuntainen ANOVA.

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

1. MiR-449A säädeltiin vähentävästi NSCLC Kudokset ja Associated kanssa imusolmukemääritysmenetelmä Etäpesäke

Olemme havainneet ilmentymistä miR-449A RT-qPCR 84 tuoretta NSCLC kudosnäytteiden kanssa pariksi NAT. Verrattuna NAT, ilmentymistason miR-449A (77/84) oli merkittävästi vaimentua NSCLC kudoksissa (pariksi T-testi,

P =

0,004,

t

= -2,997, kuva 1A). Downregulation miR-449A havaita RT-qPCR NSCLC kudoksissa, myös esitetty boxplot (kuvio 1 B). RNU6B käytettiin sisäisenä standardina.

. Parilliset pylväsdiagrammi osoittaa downregulation miR-449A in NSCLC kudoksissa. RT-qPCR tulos miR-449A 84 tuoretta NSCLC kudosten ja pariksi NAT. Kolmena kappaleena kokeet täytettävä jokaista näytteen suhteellinen ilmentyminen laskettiin käyttäen yhtälöä RQ = 2

-ΔΔCT. Verrattuna NAT, miR-449A oli merkittävästi vaimentua NSCLC näytteistä (pariksi T-testi,

P =

0,004,

t

= -2,997). B. Boxplot osoittaa downregulation miR-449A in NSCLC kudoksissa. C. Korrelaatio miR-449A ekspressiotason ja patologinen vaiheessa imusolmuke tila 84 tuoretta pariksi näytteitä keuhkosyöpään potilailla. D. Kaplan-Meierin käyrä 5 vuoden yleinen eloonjäämisluvut (14,29%) on 70 FFPET näytteiden keuhkosyöpäpotilaita. E. 70 FFPET näytteissä keuhkosyöpäpotilaita, Kaplan-Meier käyrän keuhkosyöpäpotilaita luokiteltu korkea tai matala miR-449A ilme, alhainen ilmentymistaso miR-449A korreloi merkitsevästi potilaiden huono selviytyminen (log-rank testi,

P

0,001).

määrittämiseksi vaikutusten miR-449A ilme kasvaimen aloittamisesta ja etenemiseen, NSCLC potilaat jaettiin kahteen ryhmään, matala ja korkea ilmaisun mukaan keskimääräinen ekspressiotaso miR-449A in syöpäkudokset (log2-arvo, mediaani = 1,47). Korrelaatio miR-449A ilmaisun ja ennusteeseen viittaavia muuttujia keuhkosyöpään on esitetty taulukossa 1. Merkittäviä korrelaatioita havaittiin välillä miR-449A ilmaisun ja patologinen vaiheessa (

P

= 0,012) (U-testi). 17 tapauksessa, joilla oli patologinen vaiheessa III, 13 (76,47%) tapauksista oli matala ilmentymisen miR-449A, kun taas heikkoa ilmentymistä oli 16/32 (50,00%) patologisten stageII ja 13/35 (37.14%) patologisten vaiheen I (kuvio 1C). Muutokset miR-449A ilmentyminen oli myös merkitsevästi yhteydessä imusolmuke etäpesäke. 40 keuhkosyöpää kanssa imusolmuke etäpesäke, 25 (62,5%) oli alhainen ilmentyminen miR-449A. Sitä vastoin 44 tapauksessa ilman imusolmuke etäpesäke, vain 17 tapausta (38.64%) oli matala miR-449A lauseke (

P

= 0,029, chi-neliö testi, kuvio 1 C). Ei havaittu korreloivan miR-449A ilmaisun ja sukupuoli, ikä, histologia tyyppiä tai histologisia laatu.

Ymmärtääksemme paremmin korrelaatio miR-449A ilmaisun ja patologinen vaiheessa imusolmuke etäpesäke, Spearman korrelaatio -testiä käytettiin lisäanalyysiä varten. Tulokset osoittivat negatiivista korrelaatiota miR-449A ilmaisun ja patologinen vaiheessa (r = -0,276,

P

= 0,011), ja imusolmukkeesta etäpesäke (r = -0,238,

P

= 0,029 ).

2. Korrelaatio miR-449A Expression ja ennuste keuhkosyöpäpotilaiden

MiR-449A ekspressiota havaittiin FFPETs 70 keuhkosyöpää sairastavien potilaiden seurannan (taulukko S1). Yleinen eloonjääminen käyrä kuviossa 1D on esitetty 5 vuoden yleinen eloonjäämisluku 14,29% 70 tapauksista. Mukaan Kaplan-Meier selviytymisen analyysin pienisoluista keuhkosyöpää alhainen miR-449A ilme oli huomattavasti huonompi ennuste kuin ne, joilla on korkea miR-449A ilmaisu (log-rank testi,

P

0,001; Kuva 1 E). Lisäksi miR-449A ilme, muut ennusteeseen viittaavia tekijöitä, kuten histologinen arvosana (log-rank testi,

P

= 0,004), patologinen vaiheessa (log-rank-testi, P 0,001) ja imusolmuke etäpesäke (log -rank testi,

P

0,001) olivat myös liittyy ennusteeseen keuhkosyöpäpotilaiden mukaan selviytymisen analyysin. Univariate Coxin suhteellinen vaara regressioanalyysi suoritettiin löytää voimakkaimmin ennakoivan tekijä huonon ennusteen potilaita, joilla on keuhkosyöpä. Huomasimme, että miR-449A lauseke (

P

0,001, riskisuhde [HR] = 0,345), histologinen arvosana (

P

= 0,002, HR = 1,725), patologinen vaiheessa (

P

0,001, HR = 3.254), ja imusolmukkeesta etäpesäke (

P

0,001, HR = 6,535) olivat ennustavia tekijöitä huonon ennusteen potilailla keuhkosyöpä (taulukko 2) .

Monimuuttujatestaus Coxin suhteellista vaara regressioanalyysi osoitti, että ilmentymistaso miR-449A (

P

= 0,041, HR = 0,558, 95% luottamusväli [CI]: 0.319- 0,976) oli tärkeä myönteinen ennustetekijä riippumaton muista ennusteeseen viittaavia tekijöitä, esimerkiksi patologinen vaiheessa (

P

= 0,002, HR = 2.162, 95% CI: 1,338-3,491), imusolmukkeesta tila (

P

= 0,001, HR = 3.104, 95% CI: 1,615-5,966; taulukko 2).

3. MiR-449A säädeltiin vähentävästi NSCLC Solulinjat ja Vaikuttavat Migration and Invasion

in vitro

tarkasteltiin ilmentymisen miR-449A 4 NSCLC solulinjoissa: A549, BE-1, LH- 7, H1299 käyttäen RT-qPCR. Kuten kuviossa 2 on esitetty, verrattuna keskimääräiseen ilmentymistä 10 normaalin keuhkojen yksilöitä, kaikki 4 solulinjat osoittivat merkittävää downregulation miR-449A. Lisäksi ilmaus miR-449A havaittiin olevan huomattavasti vähentynyt erittäin invasiivisia NSCLC solulinja BE1 verrattuna vähemmän invasiivisia LH7 solulinjassa.

suhteellinen määrä miR-449A 4 NSCLC solulinjoissa verrattiin keskimääräiseen ekspressiotason 10 normaalin keuhkojen näytteitä perustuen yhtälöön RQ = 2

-ΔΔCT.

miR-449A ilmentymistä sekä kudoksissa ja NSCLC solulinjoissa ehdotti, että miR-449A liittyi metastasiaa. Siksi selvitimme mahdollisia vaikutuksia miR-449A maahanmuutosta ja invaasio keuhkojen syöpäsoluja. Mukaan ilmentymisen miR-449A in NSCLC solulinjoissa, valitsimme A549 ja H1299 solulinjojen, joka oli suhteellisen maltillista ilmentymistä miR-449A varten Transvvell- määrityksiä. Määrittämään vaikutuksen miR-449A solun muuttoliikettä ja invaasiota, A549 ja H1299-solut transfektoitiin matkivat ohjaus, miR-449A matkivat, estäjä ohjaus ja miR-449A estäjä. Varmistaakseen transfektion vaikutuksia, RT-qPCR tehtiin tunnistaa ilmentymisen miR-449A 24 tunnin kuluttua (kuva S1). Suhteellinen ilmentyminen miR-449A A549 ja H1299-soluja, jotka on transfektoitu matkia lisääntyi merkittävästi.

Kuten kuviossa 3 on esitetty, verrattuna kontrolleihin, muuttavia ominaisuuksia transfektoitujen solujen miR-449A matkivat alennettiin noin 42,9% ja A549-soluja ja 36,4% ja H1299 soluista. Sitä vastoin solut miR-449A estäjä ryhmässä oli suurempi maahanmuutto kyky kuin valvontaa, siirrettyjä soluja kasvoi 62,5% A549 ja 48,5% ja H1299 soluja (kuva 3). Matrigel invaasio määritykset suoritettiin myös, ja ulkoisesti lisääntyminen miR-449 ilmaisun vähensi invasiivisen solujen merkittävästi 44,8% A549 ja 38,2% ja H1299 soluja (kuva 3). Määrä invasiivisen solujen kasvoi merkittävästi 58,1% A549 ja 46,9% ja H1299 soluja transfektoidaan miR-449A estäjä (kuva 3).

A B. MiR-449A säännelty solumigraation ja invaasiota. A549 /H1299-solut transfektoitiin Mimic Control miR-449A Mimic, Inhibitor Ohjaus ja miR-449A Inhibitor, altistetaan sitten muuttoliikettä ja invaasiota määrityksiä kuten Kohta 2. Migration /invasiivisia soluja kuvattiin edustavien valokuvien värjäyksen jälkeen hema-. Alkuperäinen suurennus, × 200. C 0,01.

4. Mir-449A Kohdennettu c-Met

Voit selvittää mahdollinen kohdegeenien miR-449A in NSCLC soluissa, käytimme kolme algoritmeja analysoida mahdollisia kohteita miR-449A: TargetScan 5.2 (kesäkuu 2011), Miranda (elokuu 2010 ), ja Diana-microT (heinäkuu 2011). Kun potentiaalinen kohde luettelosta, c-Met, joka on kahden ennustetun sitoutumiskohtia kanssa miR-449A on osallisena keskeisenä välittäjänä solumigraation, invaasio ja metastaasi kasvainten synnyssä ja syövän etenemistä eri kasvaimia, mukaan lukien NSCLC (kuva S2). Me tutki c-Met säädeltiin miR-449A in NSCLC kudosnäytteistä ja

in vitro

. Määrittämiseksi kliinistä merkitystä miR-449A ja c-Met, valitsimme 27 paria alkaen 84 tuoreista NSCLC kudosnäytteiden kanssa pariksi NAT mukaan keskimääräinen ekspressiotaso miR-449A 84 syöpä- näytteissä kudoksiin, mukaan lukien 13 miR-449A alhainen ekspressoivat ja 14 miR-449A Voimakkaasti ekspressoivat. Kuten kuviossa 4 on esitetty A B, western blotit tehtiin ekspression tutkimiseksi taso c-Met: Näiden 27 parin näytteet, c-Met: n ilmentyminen oli merkitsevästi korkeampi NSCLC kudoksissa verrattuna NAT (pariksi T-testi,

P

0,001,

t

= 6,352), kun taas miR-449A oli alassäädetty samassa paneelissa NSCLC kudoksissa havaittu tulos 1 (kuvio 4C). Lisäksi kasvaimet alhainen ilmentymistaso miR-449A paljasti suuria pitoisuuksia c-Met, kun taas kasvaimissa, joissa korkea ilmentymistaso miR-449A suorittaa pieniä pitoisuuksia c-Met (

P

= 0,037, kuvio 4D) . Nämä tulokset osoittivat, että käänteinen korrelaatio miR-449A ja c-Met ilmentymistä kudosnäytteistä.

A B. Expression of c-Met: havaitaan Western Blot 27 paria tuoretta NSCLC näytteitä. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. Intensiteetti Proteiinivyöhykkeet mitattiin, y-akselin boxplot perustui OD. Arvot Western Blot. C. Suhteellinen ilmentyminen miR-449A samassa paneelissa 27 pariksi NSCLC näytteitä. D. Expression of c- Met osoitettiin ryhmitelty keskimääräinen ekspressiotaso miR-449A 84 syöpä- näytteissä kudoksiin. Ilmaisu c-Met in miR-449A alhainen ekspressoivat oli suurempi kuin miR-449A Voimakkaasti ekspressoivat. Intensiteetti Proteiinivyöhykkeet mitattiin, y-akselin boxplot perustui OD. Arvot Western Blot (

P

= 0,037).

Voit selvittää miR-449A kohdistettuja c-Met

in vitro

, transfektoimme A549-soluja ja H1299 solut miR-449A matkivat tai -estäjä ja havaitaan tasosta c-Met mRNA käyttäen RT-qPCR 48 h transfektion jälkeen. Yli-ilmentymisen miR-449A merkittävästi vähentynyt c-Met mRNA kontrolleihin verrattuna, kun taas esto miR-449A suurensi c-Met mRNA (kuvio 5A). Western blot -analyysi suoritettiin testata proteiinin ilmentyminen c-Met. Tulokset osoittivat yli-ilmentymisen miR-449A johti dramaattiseen laskuun c-Met-proteiinia, kun taas väheneminen miR-449A huomattavasti kasvanut c-Met-proteiinia (kuvio 5B). Nämä tulokset osoittivat, että miR-449A säädellä ilmentymistä c-Met sekä mRNA ja proteiini tasoilla.

. Vaikutus miR-449A on c-Met mRNA NSCLC soluissa. A549 /H1299-soluja transfektoitiin Mimic ohjaus, joka on miR-449A Mimic, estäjä ohjaus ja miR-449A Inhibitor, sitten RNA uutettiin ja sille suoritettiin RT-qPCR. Suhteellinen määrä c-Met, normalisoida p-aktiini, verrattiin Mock ryhmään perustuen yhtälöön RQ = 2

-ΔΔCT. * P 0,01. B. Vaikutus miR-449A on c-Met-proteiinin NSCLC soluissa. A549 /H1299-soluja transfektoitiin matkia ohjaus, joka on miR-449A matkivat, estäjä ohjaus ja miR-449A estäjä. 48 tunnin jälkeen, solujen proteiini uutettiin ja sille suoritettiin Western Blot-analyysi c-Met. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. C. MiR-449A sitoutumiskohtia 3’UTR c-Met arvioitiin käyttäen fluoresoivaa toimittaja määrityksiä. Vektorilla, joka sisältää c-Met: 3′-UTR: n, A549-soluja transfektoitiin matkia ohjaus, joka on miR-449A matkivat, estäjä ohjaus ja miR-449A Inhibitor, sitten proteiini uutettiin ja fluoresenssi-intensiteetti määritettiin. * P 0,05.

Voit selvittää, c-Met oli välittömänä kohteena miR-449A, fluoresoiva reportteri määritykset suoritettiin. 3′-UTR: c-Met, jossa kahden ennustetun sitoutumiskohdat miR-449A kloonattiin fluoresoiva reportteri-vektoriin. Kuten kuviossa 5C esitetään, ylössäätely miR-449A alennettu intensiteetti EGFP fluoresenssin soluissa, jotka on transfektoitu vektorilla, joka sisältää c-Met: 3′-UTR verrattuna kontrolleihin, kun taas miR-449A estäjä ryhmä intensiteetti EGFP fluoresenssi kasvoi merkittävästi . Nämä tulokset osoittavat, että miR-449A sitoutuu c-Met 3’UTR alue suoraan.

edelleen vahvistaa, jos miR-449A säännelty maahanmuutto ja hyökkäyksen kautta kohdistaminen c-Met, c-Met siRNA käytettiin vaientaa c Met ilme. Western blot analyysiä käytettiin tulosten validointiin (kuvio 6A). Loppupään muutoksia MMP2 ja MMP-9 (kuvio 6B), kotransfektoimalla miR-449A estäjä ja c-Met siRNA poisti vaikutuksia miR-449A maahanmuutosta ja hyökkäyksen A549-soluja (kuvio 6C 0,01.

Keskustelu

Huomasimme, että miR-449A oli merkittävästi vaimentua NSCLC kudoksissa ja solulinjoissa, sopusoinnussa raportti että miR-449 väheni useissa ihmisen kasvaimia ja syövän solulinjat [16]. Lisäksi Liang ja työtovereiden totesi, että miR-449 havaittiin ihmisen keuhkoissa, kives, ja munanjohtimet, mutta ei muissa normaaleissa ihmisen kudoksissa [22], [23]. Lisäksi downregulation miR-449 havaittiin mahasyövässä. Ekspression miR-449 oli alhainen tai havaitsemattomia 8 10 mahasyövän kudoksissa, vaikka mitään korrelaatiota ei havaittu väheneminen miR-449 ilmentyminen ja kliiniset ominaisuudet mahasyövän 10 paria kudosten [13]. Äskettäin Jeon ja työtovereiden totesi, että miR-449A /b on vähentynyt ilmentyminen keuhkosyöpä kudosten kohdegeenin HDAC1 yliekspressoitu mRNA tasolla [15]. Kuitenkin tiedot suuri otos asetettu ilmentymistilanne Mir-449 ja sen merkitys viittaavia tekijöitä ovat epäselviä. Tässä olemme käyttäneet 154 NSCLC näytteet (mukaan lukien 84 tuoreet näytteet ja 70 FFPET näytettä) havaitsemiseksi mahdollisia suhdetta ilmentymisen aseman miR-449A ja eri ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia, sekä eloonjäämisen potilailla, joilla on NSCLC. Mukaan RT-qPCR tuloksia 84 tapausta tuoreen NSCLC kudosten ja pariksi NAT, miR-449A oli merkittävästi vaimentua vuonna NSCLCs verrattuna pariksi NAT. Tilastollinen analyysi suoritettiin, ja alhainen miR-449A näytti korreloivan kehittyneitä patologinen vaiheessa ja imusolmuke etäpesäke. Tietääksemme analyysimme osoitti ensimmäistä kertaa, että miR-449A liittyi imusolmuke etäpesäke. Lisäksi tietoja 70 FFPETs osoitti, että keuhkosyöpäpotilaita alhainen miR-449A ilme oli huono ennuste. Coxin monimuuttuja regressioanalyysi osoitti, että alhainen ilmentymistaso miR-449A on itsenäisesti liittyy huonompi ennuste sekä kehittyneet patologinen vaiheessa ja imusolmukemetastaaseja. Nämä tulokset viittaavat siihen, miR-449A saattaisi olla hyödyllinen ennustetekijöiden ennustaja riippumaton muista ennusteeseen viittaavia tekijöitä.

Tarkat molekyylitason mekanismeja muuttuneen ilmentymisen miR-449 kasvaimissa, ei tunneta. MIR-34 perheen, joka jakaa saman siemenen sekvenssi miR-449 on kasvain heikentävän ja metyloitu keuhkosyövän [24], [25], [26]. Lisäksi ilmaus miR-449 inaktivoidaan histoni H3lys27 (H3K27mes) ja korjaantuu epigeneettisiä lääkkeitä histonimodifikaation [16]. Yhdessä poikkeava epigeneettiset tapahtumat saattavat olla tärkeitä mekanismeja miR-449 dysregulation. MiR-449A sijaitsee ensimmäisessä intronin CDC20B kromosomissa 5q11, joka on usein sivusto poikkeavuuden keuhkosyövän [27], [28]. Toiminta miR-449 syövän tukee lisäksi kokeissa useissa syöpäsolulinjoissa jossa miR-449 indusoi G1 pidätys, apoptoosin, ja vanhenemista asetuksella sarjan avaintekijöitä solusyklin ja apoptoosin [14], [16 ], [17], [18], [19].