Krooninen sairaus

tiivistelmä

Autophagy liittyvä geeni-5 (ATG-5) on yksi tärkeimmistä säätelijöinä autophagic solukuoleman. Se on pidetään yleisesti suojaava molekyylimekanismiksi kasvainsolujen aikana kemoterapiaa. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet ekspressiokuviota ATG-5 ja monilääkeresistenssiin liittyvä proteiini-1 (MRP-1) 135 syöpien (GC) potilailla, jotka saivat epirubisiini, sisplatiini ja 5-FU adjuvanttihoitoa (ECF ) leikkaushaavan resektion ja tutkia niiden potentiaalista kliinistä merkitystä. Huomasimme, että molemmat ATG-5 (77,78%) ja MRP-1 (79,26%) olivat erittäin ilmaistaan ​​GC potilailla. ATG-5-ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä syvyys seinästä hyökkäystä, TNM vaiheet ja etäinen etäpesäke GC (P 0,05), kun taas MRP-1-ilmentyminen merkitsevästi liittyy kasvaimen koko, syvyys seinä hyökkäystä, imusolmuke etäpesäke, TNM vaiheita ja erilaistumista tila (P 0,05). ATG-5 ilmentyminen korreloi positiivisesti MRP-1 (rp = 0,616, P 0,01). Lisääntynyt ilmentyminen ATG-5 ja MPR-1 korreloi merkitsevästi huono kokonaiselinaika (OS; P 0,01) ja taudista vapaan eloonjäämisen (DFS; P 0,01) meidän GC kohortin. Lisäksi osoitimme, että ATG-5 oli mukana lääkkeille vastustuskykyiset GC soluja, jotka oli pääasiassa säätelemällä autophagy. Tuloksemme viittaavat siihen, että ilmen- tymisen lisääntymisen ilmentyminen ATG-5, joka on tärkeä molekyyli ominaisuus suojaava autophagy, liittyy chemoresistance GC. Expression of ATG-5 ja MRP-1 voi olla riippumattomia ennustetekijöitä merkkiaineita GC hoitoon.

Citation: Ge J, Chen Z, Huang J, Chen J, Yuan W, Deng Z, et al. (2014) lisääntymisen merkkejä Autophagy liittyvistä Gene-5 (ATG-5) liittyy Chemoresistance Human syöpään. PLoS ONE 9 (10): e110293. doi: 10,1371 /journal.pone.0110293

Toimittaja: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 elokuu 2014; Hyväksytty: 18 syyskuu 2014; Julkaistu 17. lokakuuta 2014

Copyright: © 2014 Ge et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Natural Science Foundation of Hunan, Kiina (nro 2012FJ6088). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

huolimatta huomattavan laskua sen esiintyvyys monissa kehittyneissä maissa, mahasyövän (GC) jää neljänneksi yleisimmin diagnosoitu maligniteetin ja toiseksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti [1]. Viimeisten vuosikymmenten aikana, standardi multimodaalinen hoito strategiat yhdessä muiden suositellut vaihtoehtoja (esim D2 leikkely ja adjuvanttihoitoa) eivät ole parannuskeinoa suuri osa potilaista sairastaa GC, erityisesti niille, joilla on edennyt ja metastaattinen sairauksia, jossa huonompi eloonjäämisluvut nähnyt johtunee läsnä chemoresistance hoidon aikana [2]. Siksi tunnistaminen uusia molekyylitason tapahtumien taustalla kehittämistä tämän maligniteetin ja sen huonon ennusteen sekä ymmärrystä mekanismeja GC chemoresistance tarvitaan pikaisesti tehokkaampia kliinisiä interventioita parempaan hallintaan potilaista.

Fysiologisissa olosuhteissa autophagy on lysosomifuusio riippuva itse sulattamaan järjestelmä ensisijaisesti vastuussa poistamista ja kierrätystä pitkäikäisen proteiinien ja vaurioitunut /vanhentuneet intracellularorganelles säilyttämiseksi solun homeostaasin [3]. Proteiinit ja soluelimiin tarkoitus tuhota ovat erottautuvat sisällä ”double-kalvo” vacuoles (autophagosomes), jota seurasi fuusiolla lysosomeihin rakentaa komplekseja tunnetaan autophagosomes, jos sisältö hajoavat lysosomaalisen hydrolaaseissa [4]. On todistettu, että autophagy voitiin indusoida vastauksena moniin epäsuotuisissa olosuhteissa kuten ravinteiden puutteesta, oksidatiivisen stressin tai DNA vahingoista ja toimii adaptiivisen solun mekanismi, lopulta mahdollistaa solujen hengissä ja lisääntyä, kun taas laaja tai pysyviä autophagy johtaa solun kuolemaan [ ,,,0],5]. Arvonalentumiset fysiologisessa aktivointi, kokoonpano ja toiminta autophagic reitin on yhä havaittu monenlaisia ​​ihmisen syövissä, vaikka tarkkaa roolia autophagy syövän synnyssä ja etenemisessä on edelleen kiistaa. Joitakin tietoja suosivat sitä ajatusta, että autophagy estää kasvaimen kehittymisen, kun taas muut todisteet viittaavat siihen, että autophagy pystyy laukaista kasvaimen aloittamista ja suojaa kasvainsolujen apoptoosin [6]. Mielenkiintoista on, että esto autophagy on äskettäin havaittu parantavan anti-kasvain aktiivisuutta useiden sytotoksisten aineiden. Li ja työtovereiden raportoitu että autophagy aktivoitiin kuin suojamekanismi vastaan ​​solujen vaikutuksia 5-FU-hoidon ja eston autophagy 3-metyyliadeniinin täydennetty 5-FU aiheuttama apoptoosin koolonkarsinoomasoluissa [7], [8]. Toisaalta, jotkut syöpälääkkeiden (esim. Setuksimabi ja Dasatinibin) on osoitettu aiheuttavan autophagic solukuoleman kautta eri mekanismien joissakin syöpäsoluissa [9] – [13]. Molekyyli koneet, joilla autophagy säätelee eloonjääminen tai kuolema kasvainsolujen edelleen suurelta osin epäselvä tähän asti. Autophagy polku on erittäin moduloitua dynaaminen prosessi pääasiallisesti suorittama autophagy liittyvien (ATG) perheen geenien, jotka säätelevät useita keskeisiä kinaasien kuten mTOR, PI3K /Akt, AMPK ja MAPK [14], [15]. ATG-5 on Keskussäätimen tarpeen autophagy kannalta sen osallisuudesta autophagosome venymä [16]. Pakotettu ilmentymä ATG-5 herkistyneet syöpäsolujen syöpälääkettä hoitoon sekä

in vitro

ja

in vivo

; toisin siRNA estoa ATG-5 johti osittaiseen vastustuskyky kemoterapia [17].

Leikkauksen jälkeinen adjuvanttihoitoa on nykyään merkittävä hoitoon GC; Kuitenkin yleinen tehokkuus kemoterapian edelleen huono mahdollisesti seurauksena läsnäolo monilääkeaineresistenssi (MDR) fenotyyppi. Toisin kuin muut kasvain yksiköt, ilmaus klassisen MDR-välittävien molekyylien, kuten glutationi-S-transferaasin ja monilääkeresistenssi geeni 1 ei ole kovin yleistä GC kudoksissa, mikä osoittaa, että saattaa olla monimutkainen mekanismi kehittämiseen MDR tässä pahanlaatuinen sairaus [ ,,,0],18]. Yhtenä klassisen lääkeresistenttien mekanismeja, monilääkeresistenssiin liittyvä proteiini 1 (MRP1 /ABCC1), on havaittu olevan voimakkaasti ilmaistaan ​​GC ja voi siten käyttää keskeisiä rooleja välittäjänä MDR GC [19], [20]. On kuitenkin vielä tiedetä, MRP-1 ilmentyminen liittyy ATG-5 ilme. Ja onko autophagy osallistuu chemoresistence GC potilailla on epäselvä.

Tässä tutkimuksessa, ensin käytetty immunohistokemia tutkia ilmaisun profiilia ATG-5 ja MRP1 on summa 135 GC potilailla, jotka saivat ECF (epirubisiini, sisplatiinin ja 5-FU) adjuvanttihoitoa leikkaushaavan resektion. Korrelaatiot ATG-5 ja MRP-1 ilmentymisen sekä niiden ilmaisun eri kliinis-GC ja kliinisiin tuloksiin arvioitiin myös.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaiden ja kudosnäytteiden

kaikkiaan 135 GC potilaiden koostuu 91 urosta ja 44 naarasta, jotka tehtiin leikkaus laitoksella Ruoansulatuskanavan Surgery, Xiangya sairaala, Keski Etelä yliopisto (CSU), Kiina, välillä 01 tammikuu 2007 ja 31 joulukuu 2008 otettiin Tämä tutkimus. Keski-ikä kohortin oli 53,62 ± 9,73 vuotta, joiden valikoima 26 72. Theprimary GC kasvain tissuesand sovitettu ei-syöpä (NC) kudoksiin sijaitsevat vähintään 5 cm: n päässä kasvaimen ytimen jälkeen saatiin kirurgisen resektion ja käsitellään välittömästi ja tallennetaan myöhempään käyttöön saakka. Yhdelläkään palvelukseen potilaista oli kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen kirurgista toimenpidettä. Histopatologisen diagnoosi tehtiin ennen leikkausta ja vahvistettiin leikkauksen. Kaikki osallistujat, joilla on vaiheen IB IV kasvaimia saanut ECF kemoterapiaa leikkauksen jälkeen (annos: epirubisiinia 50 mg /m

2 päivänä 1, sisplatiinia 60 mg /m

2 päivänä 1 ja jatkuvana infuusiona 5-FU: 500 mg /m

2 /vrk 4 päivän ajan, toistettiin 3 viikon välein jopa 24 viikkoa). Kliininen ominaisuudet näistä potilaista on lueteltu taulukossa 1.

Kaikki tapaukset tässä tutkimuksessa käytiin läpi ja kaikki näytteet histopatologisesti tarkastellaan uudelleen lokakuussa 2012. syvyys seinästä hyökkäystä, alueellinen imusolmuke etäpesäke, ja histologinen luokka vahvistettiin samaan kaksi kokenutta vanhempi patologia. Potilaat luokiteltiin erilaistumiseen asemasta syöpäsolujen kolmeen histologiseen laadut: hyvin, kohtalainen ja huono. Perustuu yhdistelmä paikallista alueellista etäispesäkkeitä ja läsnäolo etäpesäkkeitä, kaikki tapaukset lavastettuja mukaan TNM luokittelu pahanlaatuiset kasvaimet (TNM) vaihe ryhmittymän [21]. Analysoitaessa selviytymisen, päivämäärä operaation käytettiin edustamaan alkupiste seurannan vierailun. Potilaat, jotka kuolivat muiden sairauksien sijaan GC tai muut odottamattomat tapahtumat eivät kuuluneet kyseessä kokoelma. Kuolinsyynä palvelukseen tässä tutkimuksessa oli pahenemista GC. Yleinen (OS) laskettiin joka alkaa siitä päivästä, jona alkuperäisen leikkaus kuolinpäivästä tai viimeisimmän seurannan päätepisteeksi. Tauti elinaika (DFS) määriteltiin aikaväli leikkauksesta asti paikallisen uusiutumisen tai ensimmäisen kaukainen elin etäpesäke. Tietoon kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan ennen leikkausta ja tämän tutkimuksen hyväksyi Research eettiselle toimikunnalle Keski Etelä yliopisto, Kiina. Kaikki näytteet käsiteltiin ja tehdään nimettömiä mukaan eettisiä ja oikeudellisia suuntaviivoja.

immunohistokemia

tuoreet näytteet fiksattiin 10% neutraaliin puskuroituun formaliiniin ja myöhemmin upotettu parafiiniin. Parafiini-sulautettujen kudokset leikattiin 4 um ja sitten parafiini ksyleenillä ja nesteytyksestä edelleen H MRP1: ab32574; Abcam Inc., Cambridge, UK) vastaan ​​vastaavien kohdeproteiineja laimennuksessa 1:500 yön yli 4 ° C: ssa. PBS-pesun jälkeen, peroksidaasilla leimattua polymeerin ja alustan-kromogeeni käytettiin sitten, jotta visualisoida immnohistochemical värjäytymistä. Lopuksi leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä, kansi-liukastui kanssa kiinnitysväliaine ja tutkittiin valomikroskoopilla. Kaikki menettelyt suoritettiin patologian osaston, Xiangya sairaala, C.S.U. Objektilasit tulkittiin itsenäisesti kaksi kokenutta patologia, jotka olivat sokea potilaiden tietoja. Olemme määrällisesti värjäytymisen intensiteettiä ja prosenttiosuus värjäytyneiden solujen käyttäen aiemmin kuvattua lähestymistapaa [22], [23]: prosenttiosuus positiivisesti värjäytyneiden solujen (0% -100%) kerrottiin hallitseva intensiteetti värjäysmallia, ottaen huomioon 1 negatiiviseksi tai jäljittää, 2 heikko, 3 maltillisena ja 4 niin vahva. Siksi yleisarvosanaksi vaihteli välillä 0 400. Potilaat myöhemmin luokiteltu neljään eri alaryhmään: pisteet 0-99, pisteet 100-199, pisteet 200-299 ja pisteet 300-400.

Western blot-analyysi

koko solu-uutteet valmistettiin käyttäen 0,14 M NaCl, 0,2 M trietanoliamiini, 0,2% natriumdeoksikolaatti, 0,5% Nonidet P-40, ja johon oli lisätty proteaasi-inhibiittori (kaikki tuotteet olivat yhtiöltä Sigma, St. Louis, Missouri , USA). Sitten proteiini näyte ajettiin läpi 12% natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) geelillä ja siirrettiin membraanille. Siirretyn kalvot myöhemmin inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaarisen vasta-aineen. Pesun jälkeen kaivoa inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) -sidoksellisia sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Ensisijainen vasta-aineet olivat anti-ATG-5 (Santa Cruz, CA, USA), anti-LC3A /B (Abcam, Cambridge, UK) ja anti β-Actin (Santa Cruz, CA, USA). Kaikki raportoidut tulokset ovat keskiarvoja suhteet kolmen eri riippumattomassa kokeessa.

Soluproliferaatiomääritys

Solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille (10000 solua /kuoppa) 24 tuntia ennen käsittelyä. MTT-määrityksissä käytettiin arvioimaan soluproliferaation eri aikapisteessä hoidon jälkeen. MTT-koe suoritettiin seuraavasti: MTT lisättiin kuhunkin kuoppaan ja levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 h. MTT väliaine seos poistettiin sitten ja 150 ui dimetyylisulfoksidia (DMSO) lisättiin jokaiseen kuoppaan. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 570 nm käyttäen monikerroksista spektrofotometriä.

RNA-interferenssi

siRNA-dupleksit kohdistaminen ATG-5 syntetisoitiin seuraavasti: siRNA-ATG5-486: GACGUUG GUAACUGACAAATT; siRNA-ATG5-695: GUCCAUCUAAGGAUGCAAUTT ja siRNA-ATG5-938: GACCUUUCAUUCAGAAGCUTT. siRNA-dupleksit, jotka sisältävät ei-spesifisiä sekvenssejä käytettiin negatiivisena kontrollina (NC): UUCUCCGAACGUGUCACGUTT. Eri siRNA: t transfektoitiin erikseen soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 reagenssia, ja väliaine korvattiin 6 h transfektion jälkeen.

Reaaliaikainen RT-PCR

Kokonais-RNA solulinjoissa ja kudoksissa oli eristettiin käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, USA), seuraten valmistajan ohjeita. Pitoisuus RNA mitattiin käyttämällä spektrofotometriä. CDNA-allas syntetisoitiin käyttäen 1 ug kokonais-RNA: ta ja TaqMan Reverse Transcription Reagenssit (Applied Biosystems, Foster City, USA), kuten valmistaja on kuvannut. Ilmaisu kohdegeenin arvioitiin käyttämällä suhteellisen kvantifioinnin lähestymistapa (2

-ΔΔCt menetelmä), jossa β-aktiini sisäisenä viitteenä.

immunofluoresenssimäärityksellä

Solut tehtiin läpäiseviksi 0,3 % Triton X-100: ssa 10 min, minkä jälkeen kiinnityksen 2-4% metanaali 15 minuutin ajan, ja blokattiin 3% lampaan seerumia huoneenlämmössä 60 min. Sitten testattiin primaarisilla vasta-aineilla anti-LC3B (Santa Cruz, CA, USA) yön yli huoneenlämpötilassa, ja solut pestiin kolme kertaa PBS: llä. Värjättiin Alexa Fluor 488 konjugoitu 488 kaniinin anti-vuohi-IgG: tä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ja sitten solut pestiin kolme kertaa PBS: llä. Tumat tehtiin näkyviksi värjäämällä DAPI (Sigma, USA), 2 minuutin ajan. Värjätyt solut havaittiin fluoresenssikäänteismikroskooppia.

Tilastollinen

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin SPSS ohjelmistopaketti 15.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Kvantitatiivisia tietoja esitetään keskiarvona ± SD. Pearsonin χ

2 testiä käytettiin vertaamaan niiden erot sijoittui tietoja, kun taas yksisuuntainen ANOVA suoritettiin vertaamaan niiden erot määrällisiä tietoja. Survival analyysit tehtiin käyttämällä Kaplan-Meier menetelmällä ja verrattiin log-rank-testi. Cox-regressiomalli suoritettiin arvioimaan riippumattomien riskisuhde kunkin muuttujan monimuuttujamenetelmin. Korrelaatio ATG5 ja MRP1 ilmentyminen tutkittiin käyttäen kahden muuttujan korrelaatio (Pearson) testi. Erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä, kun

P

arvot olivat alle 0,05.

Tulokset

Expression of ATG-5 ja MRP-1 in GC

ilmaisu kuvio ja sijainti ATG-5 ja MRP-1 meidän GC potilailla, jotka saivat epirubisiini, sisplatiinin ja 5-FU adjuvanttihoitoa (ECF) kirurgisen resektion, tutkittiin käyttäen immunohistokemiallista analyysiä. Niistä 135 GC yksilöt, 105 (77,78%) olivat positiivisia ATG-5 immunoreaktiivisuus, ja 107 (79,26%) oli MRP-1 positiivisia. Kuten on esitetty kuviossa 1, havaitsimme, että ATG5 on ekspressoituu pääasiassa sytoplasmassa. Lisäksi yli-ilmentyminen ATG-5 korreloi positiivisesti että MRP-1 GC. (R = 0,616,

P

0,001), mistä kertoo kahden muuttujan korrelaatio testin. Positiivinen ilmaus vierekkäisiin kuin syöpäkudokset olivat 113 (83,70%) ja ATG-5 ja 89 (65,93%) ja MRP-1. Tulokset osoittivat, että sekä ATG-5 ja MRP-1 positiivisesti ilmaistuna syövän ja ei-syöpä kudoksissa, mikä viittaa siihen, että ATG-5 ja MRP-1 voivat indusoida kemoterapian sekä kasvaimen ja ei-tuumorikudoksissa. Kuten kaikki potilaan näytteitä käsiteltiin ECF kemoterapiaa, ja huomasimme, että molemmat ATG-5 ja MRP-1 olivat erittäin ilmaistaan ​​ja korreloivat positiivisesti Näytteiden. Samaan aikaan edellinen tutkimus osoittaa, että MRP-1 ehkä liittyy monilääkeaineresistenssi GC. Yhdessä edelliset havainnot, tulokset viittaavat siihen, että ATG-5 ja MRP-1 voi olla osallisena chemoresistance GC potilailla.

(A) ATG-5 värjäytymisen ei-syöpä mahan kudoksissa sai 285 (x 200) ; (B) ATG-5 värjäytymisen GC tuumorikudoksissa sijoitettiin 50 (x 400); (C) ATG-5 värjäytymisen GC tuumorikudoksissa sai 270 (x 400); (D) ATG-5 värjäytymisen GC tuumorikudoksissa sai 400 (x 200).

Associations välillä ilmentymistä ATG-5 tai MRP-1 ja kliinis ominaisuudet GC

yhteenliittymien ATG-5 ja MRP1 ilmaisun eri kliinis parametrien GC on esitetty taulukossa 1 ja taulukossa 2, vastaavasti. Expression of ATG-5 oli merkitsevästi yhteydessä syvyys seinästä invaasion, etäinen etäpesäke ja TNM vaiheissa GC (

P

0,001,

P

= 0,018,

P

0,001 vastaavasti). MRP-1-ilmentyminen merkitsevästi liittyy lisääntynyt kasvaimen koko, syvyys seinä hyökkäystä, alueellisten imusolmukkeiden etäpesäkkeiden TNM vaiheet (

P

= 0,032,

P

0,001, P = 0,016, P 0,001 vastaavasti) ja erilaistumista tila (

P

= 0,005). Täsmentämiseksi osallistumista O f ATG-5 ja MRP-1 GC kehittämiseen, suoritimme selviytyminen analyysi sisällä potilaan näytteitä. Meidän selviytyminen analyysit osoittivat, että kokonaiskorkeus (OS) nopeudella meidän GC kohortissa oli 43.70% ja keskimääräinen eloonjääminen 39,849 kuukautta (95% CI, +35,636-+44,061kuukausi); kun taas taudista elinaika (DFS) oli 34,07% ja keskiarvo selviytymisen +35,802kuukausi (95% CI, +31,618-+39,986kuukausi). Me seuraavaksi luokitteli potilaat neljään eri alaryhmiin tulokset Immunohistokemian värjäystä. Kaplan-Meier selviytymisen analyysi osoitti korkeampaa ATG-5 ilmentyminen oli merkitsevästi yhteydessä heikompaan OS (

P

0,001) ja DFS (

P

= 0,003). Pairwise vertailu osoitti, että potilaat kuljettavat korkeimman ATG-5 lauseke (pisteet 300-400) oli köyhimpien eloonjäämisluvut verrattuna muiden alaryhmien (kuvio 2A ja 2B). Johdonmukaisesti, ilmen- tymisen lisääntymisen MRP-1 ilmentymisen havaittiin merkitsevästi yhteydessä huonoon OS (

P

= 0,001) ja DFS (

P

= 0,018) meidän GC potilaista. Alaryhmä korkein MRP1 lauseke pisteet (0-99) näytti olevan pahin ennuste (kuvio 2C ja 2D) verrattuna muihin alaryhmiin. Tuloksemme osoittivat myös, että oli olemassa merkittävä korrelaatio TNM vaiheet ja selviytyminen GC potilaista. Potilaat, joilla on vaiheen III ja IV kasvaimet näkyvät huonompi ennuste verrattuna niihin kätkeminen vaiheen IB ja II kasvaimet (

P 0,01

) (kuvio 2E ja 2F). Enemmän Mielenkiintoista, Cox monimuuttuja vaaran regressiomallin osoittivat, että ATG-5 ja MRP-1 ekspressiotasot ja TNM vaiheet olivat kaikki itsenäisiä ja merkittäviä prognostisia indikaattoreita ennustamiseksi OS (

P

= 0,037,

P

= 0,005,

P

0,001 vastaavasti) ja DFS (

P

= 0,004,

P

= 0,008,

P

0,001 vastaavasti) GC (taulukko 3). Tuloksemme osoittivat ATG-5 ja MRP-1 olivat tiiviisti sidoksissa GC kehittämiseen ja voi toimia huonon ennusteen merkkiaineiden GC hoidossa.

(A ja B) Potilaat jaettiin neljään seuraaviin alaryhmiin perustuu ATG -5 immunovärjäyksen: teki 0-99 (käyrä a), sijoitettiin 100-199 (käyrä b), sijoitettiin 200-299 (käyrä c) ja sai 300-400 (käyrä d). Ero eri alaryhmien välillä oli tilastollisesti merkitsevä arvioituna yleistä Log-rank vertailuja (OS:

P

0,001, DFS:

P

= 0,003). Parittainen Log-rank vertailut osoittivat, että alaryhmä D näytteillä köyhimpien eloonjäämisluvut verrattuna muihin alaryhmiin (OS:

P

0,05, DFS:

P

0,01). (C ja D) Potilaat jaettiin neljään seuraaviin alaryhmiin perustuu MRP-1 immunovärjäys: teki 0-99 (käyrä a), sijoitettiin 100-199 (käyrä b), sijoitettiin 200-299 (käyrä c) ja sijoitettiin 300-400 (käyrä d). Ero kesken eri alaryhmien välillä oli tilastollisesti merkitsevä Kokonaiselinajan Log-rank vertailuja (OS:

P

= 0,001, DFS:

P

= 0,018). Parittainen Log-rank vertailut osoittivat, että alaryhmän A oli suotuisinta ennusteen joukossa neljä alaryhmää (OS:

P

0,05, DFS:

P

0,001). (E ja F) Potilaat jaettiin neljään alaryhmään mukaan eri TNM vaiheisiin. Ero eri alaryhmien välillä oli tilastollisesti merkitsevä Kokonaiselinajan Log-rank vertailuja (OS:

P

0,001, DFS:

P

0,001). Parittainen Log-rank vertailut osoittivat, että alaryhmiä III tai IV näytteille huonompi eloonjäämisaste kuin alaryhmien IB ja II (OS:

P

0,01, DFS:

P

0,001).

ATG-5 oli merkittävästi yläreguloituja solunsalpaajaresistentti soluissa

edelleen tutkia roolia ATG-5 vuoden kasvainten synnyssä ja lääkkeille vastustuskykyiset. Havaitsimme proteiinin ilmentymistä useissa mahasyövässä solulinjoissa (AGS, BGC-832, SGC7901, SGC7901 /DPP ja MKN45) sekä käytettäessä kuolemattomaksi ihmisen mahalaukun epiteelin limakalvoon solulinja (GES). Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että ATG-5 dramaattisesti yli-ilmentynyt DPP kestävä solulinjassa, SGC7901 /DPP-soluja, kun kaikki muut solulinjat, jotka sisältävät DPP herkkien SGC7901 soluja (kuvio 3A). Olemme lisäksi vahvistaneet, että SGC7901 /DPP-solut ovat resistenttejä DPP hoitoon. IC 25, IC50 ja IC75 oli 15,4 uM, 38,7 uM ja 93.53 uM SGC7901 soluissa. Sen sijaan, IC 25, IC50 ja IC75 oli 120,03 uM, 271,9 uM ja 423,7 uM SGC7901 /DPP (kuvio 3B). Se on noin 5-9 kertaa suurempi kuin ei-lääkkeille vastustuskykyiset solut. Löydämme viittaa vahvasti siihen, että ATG-5 edistää lääkkeille vastustuskykyiset GC soluja.

(A) taso ATG5 havaittiin solulinjoilla, Western blot -analyysiä käyttämällä. β aktiini käytettiin sisäistä valvontaa. (B) IC 25, IC50 ja IC75 on SGC-7901 ja SGC-7901 /DDP solut testattiin käyttämällä MTT määritysten jälkeen DPP hoidon.

esto ATG-5 herkistyneet solunsalpaajaresistentti solujen lääkehoidon

edelleen todistaa, että ATG-5 edistää lääkkeille vastustuskykyiset GC soluja, käytimme pieniä häiritseviä RNA: ita (siRNA: t) ja pudotus ilmentymisen ATG-5. Kolme siRNA: t suunniteltiin. Meidän reaaliaikaista PCR: ää ja western blot-tulokset osoittivat, että kaikki kolme siRNA: t inhiboivat ilmentymistä ATG-5 sekä mRNA: ta ja proteiinia tasolla (kuvio 4A ja 4B). Valitsimme yhden, siRNA-ATG5-695, jossa korkein knockdown hyötysuhde seuraavien toimenpiteiden suorittamiseksi kokeen. Meillä pudotus ATG-5 ilmaisua ja käsitellään sitten solut DPP. Soluproliferaatiota kyky tutkittiin 0, 48 ja 72 tuntia hoidon jälkeen. Tuloksemme osoittivat, että knockdowning ATG-5 ei vaikuttanut solujen lisääntymiseen SGC7901 /DPP soluja verrattuna ohjaus siRNA (siRNA NC). DPP hoito yksinään hieman inhiboivat solujen. Mielenkiintoista on, kun pudotus ekspressiota ATG-5 ja käsiteltiin solut DPP samalla, soluproliferaatioon kyky edelleen tukahdutetaan verrattiin käsiteltyihin soluihin DPP yksin 48 ja 72 tuntia käsittelyn jälkeen (kuvio 4 C). Tuloksemme tukevat edelleen, että ATG-5 edistää lääkkeille vastustuskykyiset GC soluja.

(A) mRNA taso ATG-5 havaittiin reaaliaikainen PCR-hoidon jälkeen siRNA. GAPDH käytettiin sisäisen valvonnan. (B) proteiini taso ATG-5 havainnoitiin Western blot-hoidon jälkeen siRNA: t. β aktiini käytettiin sisäisen valvonnan. (C) lisääntyminen kyky testattiin käyttäen MTT-määritystä 48 tunnin tai 72 tunnin kuluttua erilainen kohtelu.

Autophagy oli mukana lääkkeille vastustuskykyiset DC-solujen

ATG-5 on keskeinen säätelijä autophagy, me arveltu, että autophagy voi olla osallisena lääkeaineille GC soluja. Joten käytimme 3mA, joka on autophagy estäjä, hoitoon huumeiden resistentit solut. Kuten odotettua, huomasimme, että 3mA yhdessä DPP käsittely oli samanlainen vaikutus ATG-5 kncokdown yhdessä DPP käsittely (kuvio 4C ja 4D). Tiedot osoittavat, että autophagy edistää lääkeaineille. Sitten me tutki autophagy muutettiin hoidon aikana. Käytimme immunofluoresenssimäärityksellä havaitsemaan LC3B ilmentymisen taso, joka on autophagy markkeri soluissa. Tuloksemme osoittivat, että autophagy tukahdutettiin jälkeen hiljentäminen ATG-5 tai käsittelemällä soluja 3mA (kuvio 5A). Ja western blot tulos edelleen vahvisti, että LC3A /B-proteiinin ekspressio vaikuttaa ainoastaan ​​käsitellyissä soluissa siRNA-ATG5 tai 3mA. Näin ollen solujen lisääntyminen oli edelleen esti vain silloin, kun autophagy estyi (kuvio 4 ja kuvio 5). Näin ollen tietomme paljasti, että ATG-5 oli mukana lääkeaineille DC-solujen, joka on pääasiassa vaikuttaa autophagy syöpäsolujen.

(EN) autophagy havaittiin immunofluoresenssimäärityksellä of LC3B vuonna soluja 48 tunnin kuluttua erilainen kohtelu. (B) proteiini tasot LC3A ja LC3B testattiin Western blot. β-aktiini käytettiin sisäisen valvonnan.

Keskustelu

GC edelleen yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia maailmanlaajuisesti huolimatta sen vähenemässä esiintyvyys ja kokonaismäärän ennustetaan jatkuvasti kiivetä seurauksena väestönkasvua. Miehillä GC sijalla toinen kuolleisuus; naisilla, se on neljäs kuolleisuus [24], [25]. Raaka kuolleisuus GC Kiinassa oli 25,2 per 100 000 [26]. Tutkimuksessamme selvitimme ilmaus ATG-5 ja MRP-1 kohortin GC potilaan kemoterapian jälkeen. Sitten osoitimme, että ATG-5 yläreguloituja sisplatiinia (DDP) resistentti solulinja. Lisäksi sen jälkeen kun ATG-5 ekspression tai aotophogy estyi, syövän solut herkistynyt DPP hoitoon. Tuloksemme antaa uutta tietoa mekanismista solunsalpaajaresistentti GC etenemiseen.

Arvioimme exression profiilia ATG-5 ja MRP-1 135 kiinalaisen GC potilaille. Vuonna sopimuksen aiemman raportin [22], tuloksemme osoittivat, että suuri osa GC kudosten ilmaistu ATG-5, ja ATG-5-ilmentyminen tilastollisesti liittyy syvyys seinästä invaasion, etäinen etäpesäke ja TNM vaiheissa GC. Nämä havainnot tukevat käsitystä, että korkean ilmentymistason ATG5 voivat edistää, jossain määrin, aggressiivisempi ja pahanlaatuisen fenotyypin GC. Tämä näkökulma tukee myös meidän toteaminen yhdistyksen välillä korkeampi ATG5 ilmaisun GC ja huonompi ennuste potilaiden (ks enemmän keskustelua alla). Vielä tärkeämpää on, tunnistimme positiivinen korrelaatio ATG-5 ja MRP1 ilmaisun meidän GC kohortissa. Ottaen huomioon, että MRP1 on ABC transmembraaninen kuljetus proteiinin hyvin tiedetään edistävän MDR fenotyyppi GC, on kohtuullista ehdottaa, että ATG-5 voidaan myös osallisena annetaan GC chemoresistance tietyillä tuntematon molekyylitason mekanismeja.

on yleisesti hyväksytty, että toistuminen ja etäpesäke ovat kaksi merkittävää esteitä pyrkimyksemme parantaa alhaisen OS ja DFS eloonjäämisaste GC. Chemoresistance edelleen yksi tärkeimmistä syistä johtavan kasvaimen harvenneiden /uusiutumisen hoidon jälkeen. Sopiva vaihtoehto yksittäisten hoito on epäilemättä hyödyllistä parantaa kliininen tulos; kuitenkin, nykyinen hoito päätös on enimmäkseen riippuvainen TNM vaiheissa [27], [28]. Meidän selviytyminen analyysit 135 GC potilaiden vaiheen IB IV kasvaimia paljasti, että molemmat ATG-5 ja MRP-1 ilmentymisen pystyivät itsenäisesti ennakoida käyttöjärjestelmän ja DFS hoidon jälkeen adjuvantti ECF kemoterapiaa, mikä viittaa siihen, että seuranta niiden ekspressiotasot yhdistelmä tavanomainen ennustetekijöitä markkereita voi tarjota meille lisää arvokasta tietoa arvioida paremmin kemoterapian vaikutusta GC potilailla. Mielenkiintoista, löysimme ATG-5 yliekspressoitiin lääkkeille vastustuskykyiset GC solulinjoja. Ja hiljentäminen ATG-5 voi herkistyneet huumeiden resistenttien solujen kemoterapiaa uudelleen. Tuloksemme viittaavat siihen, että ATG-5 voi olla kohde solunsalpaajaresistentti paitents.

Kertyvät tutkimusten mukaan autophagy pystyy laukaisemaan sekä solujen eloonjäämistä ja solukuolemaan eri yhteyksissä. Liu et ai raportoi, että estämällä PI3K /Akt /mTOR-reitin, β-elemeenin voi aiheuttaa suojaavia autophagy auttamaan GC soluihin paremmin sopeutua rasittavissa olosuhteissa ja ne voidaan suojata apoptoosin kuoleman [29]. Lisäksi viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että PI3K /Akt /mTOR-signalointireitin usein aktivoidaan ihmisen maha-suolikanavan maligniteettien [30]. PI3K /Akt signaloinnin myös moduloi MDR GC solussa säätelemällä p-glykoproteiinin, Bcl2 ja Bax [31]. Samoin jotkut syöpälääkkeiden on raportoitu estävän mTOR signalointia ja aiheuttaa autophagy syöpäsoluissa hajottamalla monet pääkomponenttien mTOR akselilla [14], [32]. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että autophagy voitiin indusoida kemoterapian aikana, ja tukahduttaminen autophagic reittejä käyttäen autophagy estäjä on potentiaalia parantaa kemoterapeuttisen tehokkuutta GC potilaalla on ATG-5 voimakkaaseen ilmentymiseen. Tueksi, huomasimme, että kun autophagy estyi, huumeiden resistentit solut myös herkistyneet lääkehoidon uudelleen hiljentäminen ATG-5 ilme. Joten, tuloksemme tuki autophagy edistää solunsalpaajaresistenttiin potilaan.

Yhteenvetona yliekspressio ATG-5, joka on keskeinen molekyyli pelaaja autophagic reitin, liittyy chemoresistance GC. Expression of ATG-5 ja MRP-1 voidaan pitää itsenäisinä ennustetekijöitä markkereita ennustamiseen OS ja DFS GC potilaiden perustuu nykyisin saatuihin tietoihin. Perusteella TNM vaiheissa, havaitsee niiden ekspressiotasot voivat olla kliinisesti merkityksellisiä ennustaa paremmin kemoterapeuttisen hoitotuloksia potilailla, jotka kärsivät tästä pahanlaatuinen sairaus. Tulevaisuuden tutkimuksia arvioinnin useampia tapauksia, mieluiten toisesta etnisen taustan, ovat varmasti perusteltua vahvistaa havaintomme tässä tutkimuksessa.