Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

kaljurotta (NMR) on pitkäikäinen ja syövän resistentit lajit. Mahdollisten syöpälääkkeen ja ikään liittyviä mekanismeja on erittäin kiinnostava ja tekee tämän lajin arvostettuja tutkia syöpälääkkeen strategioita ja ymmärtää ikääntymisen mekanismeja. Koska tiedetään, että NMR-ilmentää korkeamman maksan mRNA-tasot alfa 2-makroglobuliini kuin hiiret, ei ole tietoa sen rakenteesta, toimivuudesta tai ekspressiotaso NMR verrattuna ihmisen A2M.

Tulokset

Tässä näytämme kattavan analyysin NMR- ja ihmisen plasmasta A2M, joka esittää eri ennustuksen glykosylaation NMR-A2M, joka johtaa korkeamman moolimassan verrattuna ihmisen A2M. Lisäksi löysimme korkeamman pitoisuuden A2M (8,3 ± 0,44 mg /ml

vs

. Ja 4.4 ± 0,20 mg /ml) ja pienempi koko plasman proteiinipitoisuus (38,7 ± 1,79 mg /ml

vs

. 61,7 ± 3,20 mg /ml) NMR verrattuna ihmisen. NMR-A2M voidaan transformoida metyyliamiinia ja trypsiinillä johtaa konformaation muutoksen, samankaltainen kuin ihmisen A2M. NMR-A2M on havaittavissa polyklonaalinen vasta-aine ihmisen A2M. Määritys tryptinen ja anti-tryptiset aktiivisuutta NMR ja ihmisen plasman paljasti suurempi anti-tryptinen aktiivisuus NMR plasma. Toisaalta, vähemmän proteolyyttinen aktiivisuus havaittiin NMR plasmassa verrattuna ihmisen plasmaa.

Johtopäätös

Löysimme muuttaneet NMR-A2M sitoutumisen tiettyyn reseptoriin LRP1. Voisimme osoittamaan alhaisempi proteiinin ilmentymistä LRP1 NMR-maksakudosta verrattuna ihmisen mutta korkeammat ilmaus A2M. Tähän liittyi korkeampi EpCAM proteiinin ilmentymisen keskeisinä adheesiomolekyyli syövän etenemiseen. NMR-plasma kykeni lisäämään tarttuvuutta ihmisen fibroblastien

in vitro

todennäköisesti lisäämällä CD29-proteiinin ilmentymisen. Tämä on ensimmäinen raportti, joka osoittaa yhtäläisyyksiä sekä erillisiä eroja A2M NMR ja ihmisen plasmassa. Tämä saattaa olla suoraan sidoksissa kiehtova fenotyypin NMR ja ehdottaa, että A2M voisi todennäköisesti tärkeä rooli syövän vastaisessa ja anti-aging mekanismeja NMR.

Citation: Thieme R, Kurz S, Kolb M, Debebe T, Holtze S, Morhart M, et al. (2015) analyysi Alpha-2 makroglobuliinin päässä pitkäikäisen ja Cancer hylkivät kaljurotta ja Human Plasma. PLoS ONE 10 (6): e0130470. doi: 10,1371 /journal.pone.0130470

Academic Editor: Klaus Roemer, University of Saarland Medical School, SAKSA

vastaanotettu: 10 maaliskuu 2015; Hyväksytty: 20 toukokuu 2015; Julkaistu: 23 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Thieme et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustusta Europäischer Sozialfond – ESR www.esf.de (100098250) GB. Tätä työtä tukivat avustusta Leibniz Association (SAW 2012) www.leibniz-gemeinschaft.de/MP.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kaljurotta (

Heterocephalus glaber

) (NMR) asuu Itä-Afrikassa on eusocial siirtomaa rakennuksen nisäkäs (O’Rianin ym. 2008 Ecology of Social Evolution). Siten aitososiaalisuus on useimmiten nähty hyönteiset, kuten muurahaiset, mehiläiset, ampiaiset, ja toiset, NMR on yksi harvoista tunnettujen eusocial nisäkkäiden-erityisesti kuvattu toistaiseksi vain perheen

Bathyergidae

. NMR on muutamia epätavallisia piirteitä verrattuna muihin nisäkkäisiin. NMR on erittäin pitkäikäinen jyrsijöitä joka käyttöikä on yli 30 vuotta [1]. Tämä viittaa siihen erityisiä vanhenemismekanismit, joiden mukana tai mahdollisesti aiheuttama syöpä vastus. Tähän mennessä ei ole kasvainta koskaan havaittu NMR [2]. On olemassa vahvaa näyttöä siitä, että pitkäikäisyys NMR pääasiassa ylläpitävät syövän vastus, koska neoplasia on ensisijainen kuolinsyy muista nisäkäslajeista, kuten hiiriä [3]. On syntymässä kiinnostaa yhdenmukaistavat pitkäikäisyys ja syövän vastus tunnistamalla taustalla molekyylitason mekanismeja ymmärtää kiehtovin ja ylimääräinen NMR fenotyyppien.

Aiemmin kourallinen artikkeleita oli julkaistu, antaen vihjeitä ja kokeiden selittää nämä mekanismit NMR [4-8]. Tällöin sosiaali- ja biologiset /biokemiallisia ominaisuuksia adduktikompleksien. Sosiaalisesta näkökulmasta eusocial tila elämän osuuskunnan huolta jälkeläisten ja sukupolvelta toiselle eteneminen taitojen [2] sekä elävät ryhmä laajasti liittyy pitempään [9]. Toinen terveys tukeva vaikutus liittyy maanalaiseen elämään. Nämä eläimet ovat suojassa äärimmäiset sääilmiöt ja saalistajia, joka suosii pitkäikäisyys ja alempi kuolleisuus [2, 10]. Matkapuhelinverkon ja biokemialliset taso NMR näytteille useita ainutlaatuisia kasvaimen vastainen ominaisuuksia, kuten hidas solujen kasvua, tehokas kontakti-inhibitio, muodostuminen suuren molekyyli- massan hyaluronaani ja optimoitu proteiinisynteesiä [11].

Alpha-2 makroglobuliinista ( A2M) on suuri solunulkoinen proteiinin veressä. Äskettäin A2M transkriptipitoisuuksissa osoitettiin lisätään NMR maksassa verrattiin hiirten 140-kertaisesti [12]. Toistaiseksi NMR-A2M-proteiini ei ole vielä karakterisoitu. Sen ihmisen vastine on homotetrameeriset proteiini 720 kDa pelaa rooli ylläpitää homeostaasiin sytokiinien ja kasvutekijöiden [13]. Funktio A2M ihmisillä on osittain erilainen verrattuna jyrsijöitä (esim. Hiiret, rotat ja kanit), jossa A2M on tärkeä akuutin vaiheen proteiini [14]. Yleensä A2Ms eri lajeista ovat hyvin kuvattu ja lyhyesti tunnettu tarkasteltavaksi Sottrup-Jensen [15]. Ihmisen A2M kykenee sitomaan hyvin erilaisia ​​sytokiinejä, kasvutekijöitä, erityisesti TGF-SS1, TNF-alfa ja IL-1SS ja hormonit [16-18]. Toinen tärkeä toiminto on kyky inaktivoida hyvin erilaisia ​​proteinaasien, kuten trypsiini, kymotrypsiini, elastaasi tai metalloproteinaasien. Sitoutumisessa proteinaasien, A2M tehdään merkittäviä konformaation muutoksen, joka johtaa ekspressio aiemmin piilossa reseptorisitoutumiskohtaa sen pinnalla. Tämä mahdollistaa sen, että niin sanottu ”transformoitu A2M” (A2M *) sitoutua sen spesifiseen reseptoriin, joka on nimetty LRP1 (CD91) [19, 20]. Ligaatio LRP1 indusoi reseptorin välittämä nopea puhdistuma A2M-proteinaasi-kompleksit verestä ja kudosten [21]. Muiden proteiinien, kuten kasvutekijöiden ja sytokiinien sitoo reversiibelisti A2M. Siten A2M tärkeitä tehtäviä suhteessa kudoksen homeostaasin näiden molekyylien [22, 23].

A2M ehdotetaan tärkeä rooli syövän ja ikääntyminen [24, 25]. Ihmisen A2M pitoisuus veressä korreloi negatiivisesti iän, vähenee noin 4 mg /ml syntyessään 1,5 mg /ml vanhuksilla [26]. Siksi sen toiminta veren homeostaasin ja ikään liittyvien sairauksien on suuri kliininen ja geriatrisen kiinnostusta. Tärkeimmät tekijät vastaavat maligniteetin liittyy myös kiinnikkeistä molekyylejä. Koska tiedetään, että NMR on syöpä kestävä, ne ovat haitallisia kiinnostusta ja syvempää analyysiä adheesiomolekyyli ilmaisun ja toimivat NMR on perusteltua. Esimerkiksi transkriptio taso epiteelin adheesiomolekyyli EpCAM havaittiin lisääntynyt NMR maksassa 290fold verrattuna hiiriin, joka tarjoaa vahvaa näyttöä, että solujen yhtenäisyys ja eheys vaikuttavat adheesiomolekyylien [12].

Tässä tutkimuksessa kartoitettiin plasma A2M alkaen NMR verrattuna sen ihmisen homologi. Ensimmäistä kertaa voisimme osoittaa kohonnut plasman proteiineihin taso NMR-A2M ja yhtäläisyyksiä sekä selviä eroja molekyylirakenteen ja toimintaa verrattuna ihmisen A2M. Lisäksi olemme yllättäen havainneet NMR plasmassa kasvaa soluadheesiota ihmisen fibroblasteissa. Lisäksi meillä on kuvattu ja selityksin NMR-A2M vastaavasti ihmisen-A2M proteiinin translaation jälkeiset modifikaatiot ja voisi tunnistaa yhtäläisyyksiä ja eroja, jotka voisivat olla rooli NMR liittyvissä erityispiirteet.

Tulokset

in silico sekvenssianalyysit

etsiminen NMR-A2M sekvenssit asianomaisissa tietokannoissa johti kahteen käytettävissä mRNA-sekvenssit. Ensimmäisen (Ref.Seq .: NM_001279851.1; UniProt: E3VX34_HETGA) on kuvattu Szafranski et al. (Tietokannan merkintä) ja toinen oli ennustettu genomisen sekvensoinnin NMR genomin (GenBank: JH171302.1; UniProt: G5BPM1_HETGA) [27]. Vain transkriptio NMR-A2M oli todennettu ja kuvattu tähän mennessä. Olemassaolo NMR-A2M-proteiinia oli vain ennustaa. Sekvenssi NMR-A2M tuotti 1475 (UniProt: E3VX34_HETGA) ja 1595 [27] aminohappoa, vastaavasti, tuloksena on laskettu molekyylipaino 162,519 kDa: n ja 175,364 kDa, vastaavasti. Vertaamalla Näiden havaintojen kanssa ihmisen A2M järjestyksessä, NMR-sekvenssi kuvanneet Szafranski et al. (2010) on samankaltainen kuin Kim et al. (2011). Näin ollen, kaikki seuraavat analyysit tehtiin kanssa useampia NMR-A2M-sekvenssi verrattuna ihmisen yhden (UniProt: E3VX34) (taulukko 1).

NMR-A2M on yleinen mRNA identiteetti 85% ja samankaltaisuuden proteiinin sekvenssi on 98% ihmisen A2M. Fylogeneettinen analyysi ClustalW2 johti läheinen suhde NMR-A2M että Ansellin mooli rotta ja marsu A2M (kuvio 1).

Ihmisen A2M sekä NMR-A2M on signalointi peptidisekvenssi (aa kanta 1-23) N-terminaalisessa päässä, joka on selityksin samanlaisuuden. Syötti alue, joka on tunnusmerkki A2M kaikilla lajeilla, sijaitsee NMR asemassa 688 ja 738. Se sisältää kolme trypsiinipilkkomiskohdan sivustoja arginiini n 703, 711 ja 729 (taulukko 2). Analyysi N-glykosylaatiokohtia johti 10 potentiaalista N-glykosyloitu aminohapot asemassa 55, 70, 263, 396, 410, 870, 992, 1078, 1367, ja 1427. Siten, NMR-A2M osakkeita 7 N -glycosylation sivustoja ihmisen A2M, joka on kahdeksan ennustettu N-glykosylaatiokohtia. N-glykosylaatiokohdan asemassa 247 ihmisen A2M ei ole läsnä NMR-A2M. Kaikki disulfidisiltojen ihmisen A2M tunnistetaan NMR-A2M samanlaisuuden (taulukko 2). Mahdolliset iso-glutamyyli lysiini isopeptide cross-link asemassa 693 ihmisen A2M voisi löytyä NMR-A2M kussakin asemassa 694 (taulukko 2). Cys972 ja Gln975 vastuussa tioliesterin sitoutumisen ihmisen A2M sijaitsevat asemassa Cys973 ja Gln976 NMR–A2M.

Fylogeneettinen analyysi A2M proteiinisekvenssien tehtiin käyttäen ClustalW2 onlinetool (https: //www .ebi.ac.uk /Tool /phylogeny /clustalw2phylogeny). Vertailtavat A2M proteiinisekvenssien olivat lukemaksi päässä UniProt tietokannasta.

Plasma koostumus

Eri variaatioita polyakryyliamidigeelillä elektroforeesi (PAGE) tehtiin tutkimaan proteiinin jakautumista NMR plasma yleensä ja läsnäolo ominaispiirteet NMR-A2M erityisesti.

Native polyakryyliamidigradienttigee- geelielektroforeesi (natiivi PAGE) osoitti NMR-A2M ajaa asemassa näyttäessään on pienempi sähköinen liikkuvuus kuin A2M ihmisen plasmassa ja puhdistettua ihmisen A2M, mikä saattaa olla osoitus suurempi molekyylimassa (kuvio 2A). Natiivin ihmisen A2M on tetrameeri, jonka molekyylipaino on 720 kDa. SDS-gradientti-PAGE (4-20%) ei-pelkistävissä olosuhteissa NMR-A2M liikkuu dimeerinä, jonka molekyylimassa on noin samankaltainen kuin ihmisen A2M (360 kDa) (kuvio 2B). Alennetussa olosuhteissa NMR-A2M lohkaistaan ​​monomeerien 180 kDa samankaltainen kuin ihmisen A2M (kuvio 2C). Lisäksi yleinen NMR plasman proteiinipitoisuus havaittiin olevan pienempi kuin ihmisen (38,7 ± 1,79 mg /ml

vs

. 61,7 ± 3,20 mg /ml; n = 5) (kuvio 2D). Ihmisen plasma näyttää sisältävän korkeampia pitoisuuksia immunoglobuliinien (kuvio 2A ja 2B) ja kokonaistulos proteiinimalli näyttää olevan erilainen, too. NMR toisin kuin ihmisen plasman näyttää eri proteiiniryhmänä (väli Alb ja IgG) muissa kuin vähensi SDS-PAGE (välillä merkki 43 kDa ja 212 kDa). Ainakin ihmisen plasmassa, haptoglobin- ja Gc-ryhmän proteiini geneettisiä variantteja liikkua tässä asemassa. Tästä huolimatta yleinen analyysi kolme erilaista elektroforeesi näkyy vahvempi bändi intensiteettejä A2M NMR-plasmassa verrattuna ihmisen plasmaa, mikä osoittaa suurempaa A2M sisältöä NMR.

NMR, ihmisen plasmasta (30 ug) ja puhdistettu ihmisen A2M (2,5 ug) erotettiin natiivi-PAGE (4-20%) (A) ja SDS-PAGE (4-20%) ei-pelkistävissä (B) ja pelkistävissä olosuhteissa (C). Proteiinin pitoisuus NMR ja ihmisen plasman määritettiin Bradfordin (** – p 0,01) (D). Uutteissa Ihmisen ja NMR maksan (20 ug kutakin) erotettiin SDS-PAGE: lla (4-20%) (E) ja alistettiin western blot -analyysillä käyttämällä kanin polyklonaalista anti-ihmis-A2M-vasta-aineen (5 pg /ml) ja hiiren monoklonaalinen ß-alayksikön spesifisen anti-ihmisen LRP1-vasta-aine (10 ug /ml) (F). (A2M alfa-2 makroglobuliini, Alb-albumiini, IgG-immunoglobuliini, Trf-transferriini).

runsain proteiini NMR plasmassa on albumiini kuten ihmisen plasmassa. Transferriini, jonka molekyylimassa on 80 kDa ihmisellä oli vähemmän vaeltavia NMR, mikä osoittaa erilaiset moolimassat tai vaihtelut glykosylaation.

Protein ja immunoblot-analyysi maksan otteita NMR ja ihmisillä paljastivat suuren määrän pienimolekyylimassaisia proteiineja molemmille lajeille. Merkittävä ero on ulkonäkö suurimolekyylimassaista proteiinia lajien NMR maksassa (kuvio 2E). Tämä proteiini band osoitettiin reagoivan vasta-aineita ihmisen A2M Western blot (kuvio 2F), joka osoittaa korkeampaa A2M proteiinin määrä NMR maksauute kuin ihmisen. Sen sijaan pienemmän määrän immunoreaktiivisen LRP1 havaittiin NMR maksauute verrattuna ihmisen (kuvio 2E).

A2M aktivointi

A2M tiedetään esiintyvän kahdessa eri konformationaalisia valtiota. Sitova proteinaasien, johtaa konformaation muutoksen kohti enemmän kompakti proteiinin rakenne.

In vitro

, kuten konformationaalinen siirtymistä A2M voidaan saada myös käsittelemällä A2M metyyliamiinin kanssa, jonka tiedetään pilkkovan A2M: n thioester sidos ja mikä puolestaan ​​johtaa suuren konformationaalisen muutoksen samanlainen proteinaasi hoitoon. Konformationaalinen muutos voidaan visualisoida ns rate PAGE (kuvio 3A). Tämä menetelmä mahdollistaa syrjintää kahden eri A2M, The hitaasti (alkuperäisessä muodossa) ja nopeasti vaeltavat (aktivoitu muoto, jossa katkaistun tioesteri bond) muoto, jonka sanotaan johtuvan muutosten vuoksi globularity [28]. Sitovat trypsiiniä sekä reaktiolla metyyliamiinin osoitti samanlaista liikkuva kuvio, riippuen täydellisyyden konformaation muutoksen, niin, NMR ja ihmisen plasmaa. Kaiken A2M mistä NMR osoitettiin olevan reaktiivisia metyyliamiinia ja trypsiini mikä osoittaa samankaltaisia ​​toiminnallisia ominaisuuksia kuin sen ihmisen analogi. Kuitenkin konformationaaliset vaihdettavuus näyttää olevan monimutkaisempi NMR-A2M osoittaa ulkonäkö proteiinivyöhykkeet kantojen välillä hidas ja nopea muotoja ihmisen A2M.

RATE elektroforeesi suoritettiin käyttäen 50 ug natiivi NMR ja ihmisen plasmaa ja 50 ug metyyliamiinia ja trypsiiniä käsitelty plasma, tässä järjestyksessä. Eristetty ihmisen A2M toimi kontrollina. Metyyliamiini sekä trypsiinin siirtyminen ihmisen ja NMR-A2M alkaen hitaasti että nopeasti liikkuvan muodossa. Visualisoida vastaavan proteiinivyöhykkeet geeli värjättiin Coomassie (A). Puhdistettu LRP1 (100-500 ng) huomattiin nitroselluloosamembraanille ja inkuboitiin joko 10 ug /ml ihmisen tai NMR-plasmaa. BSA toimi negatiivisena kontrollina. A2M sitoutuminen LRP1 havaittiin polyklonaalisella kanin anti-ihmis-A2M-vasta-aineen (5 pg /ml) (B). Estämään sitoutumisen A2M ja LRP1 täplikäs LRP1 oli esi-inkuboitiin 1,5 uM RAP 30 minuuttia, ennen kuin lisättiin ihmisen tai NMR-plasmaa (C). (☐ – natiivi /hidas muoto A2M, ◆ transformoiduista /nopea muodossa A2M).

reseptorin sitomista A2M peräisin NMR ja ihmisen plasmasta

Human A2M * (transformoitu A2M ) tiedetään sitoutuvan spesifisesti liukenevia tai immobilisoituun LRP1. Että puhdistettua ihmisen LRP1 huomattiin nitroselluloosamembraanille ja inkuboitiin ihmisen tai NMR-plasmaa, vastaavasti (kuvio 3B). Kuten nähdään, A2M * molemmista lajeista sitoutuvat immobilisoidun reseptorin, että niissä on reseptoria sitovan domeeneja NMR-A2M. Sitä vastoin ei ole sitovaa havaittiin immobilisoidun albumiiniin vahvistavia spesifisyyden vuorovaikutusta. Reseptori associate proteiini-RAP tiedetään estävän sitoutumista erilaisten ligandien LRP1. Todellakin, RAP todettiin vähentävän vuorovaikutusta NMR-A2M * kohteeseen LRP1 (kuvio 3C). Tulokset osoittavat, että A2M NMR-sisältää konservoituneen alueen C-pään domeeni, joka kykenee sitoutumaan ihmisen LRP1.

A2M kvantifiointi ja immunologista havaitsemista

7% SDS-PAGE käytettiin arvioimaan pitoisuus A2M plasmassa NMR ja ihmisen. Puhdistettu ihmisen A2M toimi sisäisenä standardina. Coommassie Blue värjätään geelit skannattiin ja analysoitiin ImageJ ohjelmistoa. 30 ug NMR ja ihmisen plasman proteiineihin, vastaavasti, ladattiin geeleihin. Luodaan standardikäyrä puhdistettua ihmisen A2M, lasketun A2M pitoisuus NMR ja ihmisen plasmassa oli 8,3 ± 0,44 mg /ml ja 4,4 ± 0,20 mg /ml, vastaavasti (n = 5). Vastaavasti A2M edustaa 6,9 ± 0,37% koko plasman proteiinipitoisuus ihmisellä ja 15,3 ± 0,70% koko plasman proteiinipitoisuus on NMR (kuvio 4A). Lisäksi immunoreaktiivisuus NMR-A2M tarkistettiin käyttäen konformaatiosta spesifistä monoklonaalista hiiren anti-ihmis-A2M-vasta-ainetta (alfa-1), tiedetään tunnistavan spatiaalisen C-terminaalinen epitooppi alttiina vain transformoiduissa A2M (kuvio 4B) ja polyklonaalisella kanin anti-ihmisen A2M-vasta-ainetta (kuvio 4C). Testaamiseksi monoklonaalinen vasta-aine, näytteet ajettiin pakollinen natiivi gradienttigeelejä ennen blotting, koska SDS: n tiedetään muuttaa tilarakenteen A2M. Kuten nähdään, monoklonaalinen vasta-aine havaitaan transformoitu ihmisen A2M (A2M *), mutta ei reaktiivisuutta havaittu kohti NMR-A2M (kuvio 4B). Toisaalta, polyklonaalista kanin vasta-aine odotetusti havaittu ihmisten sekä NMR-A2M (kuvio 4C), jälkimmäinen ilmeisesti pienempi reaktiivisuus koska suunnilleen 3fold määrä NMR-A2M plasmasta on tarpeen saada vertailukelpoista immunologinen signaali intensiteetin kanssa ihmisen A2M (kuvio 4C). Nämä tulokset vahvistavat tulokset, jotka saatiin densitometrisellä tutkittiin värjätyn proteiinijuovat (kuvio 4A).

määritys A2M plasmanäytteissä suoritettiin elektroforeesi 7% SDS-geelillä käyttäen NMR ja ihmisen plasmassa, 30 ug kutakin ja puhdistettua ihmisen A2M (1-2,5 ug). A2M kvantifioitiin Coomassie-värjäyksellä käyttäen eristetty ihmisen A2M valmistelemaan kalibrointikäyrän (A). Western blot -analyysit käyttämällä natiivi gradienttia PAGE (4-20%) levitettiin havaitsemiseksi transformoitu muodossa A2M käyttäen alfa-1-vasta-aine (B) ja 7% ei-pelkistävä SDS-PAGE havaita A2M kanssa polyklonaalista vasta-ainetta käyttäen 9 ja 3 ug NMR tai 3 ug ihmisen plasmaa ja 250 ng eristetty ihmisen A2M (C).

Anti-proteolyyttisen ja proteolyyttistä aktiivisuutta ihmisen ja NMR plasman

plasma kaikista nisäkkäiden ja todennäköisesti NMR sisältää erilaisia ​​proteinaasi-inhibiittorit ja proteolyyttiset entsyymit osallistuvat erityisiä koulutuslinjoja, kuten veren hyytymisen /fibrinolyysin ja komplementtisysteemi tai palvella yleistä toimintoja. Tiedetään, että A2M sitoo ja inaktivoi proteinaaseja kaikista luokista ja erityispiirteet. Sen vuoksi oli kiinnostavaa analysoida anti-proteolyyttisen aktiivisuuden koko plasman käyttämällä trypsiiniä, kuten viite-entsyymin. Trypsiini-estävää kapasiteettia mitattiin laskemalla määrää plasman pystyy estämään 0,05 ug trypsiiniä. Kuten kuviossa 5 on esitetty, inhiboiva kapasiteetti alemmilla proteiinipitoisuus (2,5-20 ug) oli suurempi ihmisen kuin NMR plasmasta, jota edustaa IC

50 17.08 ug ihmisen ja 25,11 ug NMR plasma. Kuitenkin korkeampia plasman proteiineihin pitoisuudet korkeampi yleinen estävä aktiivisuus havaittiin NMR plasmassa verrattuna ihmisen plasmaa. Oli vähemmän jäljellä tryptistä aktiivisuutta NMR plasmassa (8,06%) verrattuna ihmisen plasmasta (17,22%) käyttämällä 100 ug plasman proteiineihin estämään 0,05 ug trypsiiniä (kuvio 5A ja 5B).

inaktivointi 0,05 ug trypsiini titrattiin kasvavia määriä ihmisen (A) tai NMR (B) plasman, joka vastaa 1-100 ug proteiinia ja mitataan muuntaminen BAPNA p-nitroaniliini 405 nm: ssä. Luontainen tryptistä aktiivisuutta NMR ja ihmisen plasmassa määritettiin mittaamalla konversio BAPNA p-nitroaniliini aiheuttama 1-100 ug plasman proteiineihin (C). (* -p 0,05)

luontainen proteolyyttinen aktiivisuus ihmisen ja NMR plasma määritettiin pilkkomalla BAPNA p-nitroaniliini. NMR plasma on huomattavasti alemman endogeenisen proteolyyttisen aktiivisuuden kuin ihmisen plasmasta (kuvio 5C). Heijastava 100 ug NMR plasma vähemmän proteolyyttisesti aktiivisia (noin 40%) kuin vastaava määrä ihmisen plasmaa. Tämä saattaa selittyä suurempaa tärkeimmistä proteinaasinestäjä A2M.

Adheesiomolekyylit alle NMR-A2M hoito

Seuraava sukupolvi sekvenointitulosten jo ilmoittanut korkea adheesiomolekyylien NMR maksassa [12 ]. Voisimme vahvistaa näitä tuloksia proteiinin tason ja löysi korkeampi ilmentyminen EpCAM proteiinin NMR maksauute verrattuna ihmisen (kuvio 6A). Seuraavaksi arveltu, että komponentit NMR plasma voi ilmentymisen moduloimiseksi soluadheesiomolekyylien ja siten soluadheesion. Näin ollen, olemme analysoineet tartuntaominaisuus ihmisen viljellyissä fibroblastien ns trypsination-adheesiomäärityksellä. Viljelyalusta Ihmisen fibroblastien täydennettiin 0,3 tai 1% NMR plasmaa. Lisäravinteen PBS tai 1% ihmisen plasmaa toimivat vertailuryhmänä. Merkittävä lisäys solun tarttumisen havaittiin upon lisäravinteen 1% NMR plasmaa (kuvio 6B). Kohdistaa kysymyksen, joka adheesiomolekyylien voisi olla vastuussa lisääntyneestä tarttuvuus, analysoimme CD29, CD44 ja EpCAM Western blot analyysi valvonnan sekä 0,3 ja 1% NMR plasmakäsitellä ihmisen fibroblasteissa. Havaitsimme kasvu CD29-proteiinin määrään, kun fibroblasteja käsiteltiin 0,3 ja 1% NMR plasmaa. Toisaalta, CD44 tasot eivät muuttuneet saman kohtelun. EpCAM ilmentyi hyvin alhainen määrä fibroblastit mutta edelleen laskenut alle NMR plasmakäsittely (kuvio 6C).

määrittäminen EpCAM proteiinin NMR ja ihmisen maksan näytteet analysoitiin elektroforeesilla 10% SDS geelillä käyttäen 20 ug proteiinia yhdessä immunoblottauksella käyttäen monoklonaalista hiiren anti-humaani-EpCAM-vasta-aine (A). Ihmisen fibroblasteja viljeltiin väliaineessa, jota oli täydennetty 0,3 tai 1% NMR plasma 24 h ja valvonta täydennettiin PBS (CTR) tai 1% ihmisen (hu) plasma), tässä järjestyksessä. Soluja käsiteltiin trypsiinillä /EDTA-liuoksella tasan 1 min, pestään ja jäljellä olevat kiinnittyneet solut värjättiin Gentiana ratkaisu. Absorbanssi vapautuneen väriaineen on suoraan verrannollinen määrä kiinnittyneitä soluja (B) (** – p 0,01; * – 0,05). Western blot analyysi CD29, CD44, EpCAM ja GAPDH suoritettiin elektroforeesi 8% SDS-geelillä käyttäen 10-25 ug proteiinia jälkeen 0,3 tai 1% NMR plasma täydentämistä varten 24. CD29, CD44, EpCAM ja GAPDH havaittiin vastaaviin monoklonaalisia vasta-aineita (C).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa suoritimme vertaileva analyysi plasman komponenttien pitkäikäisiä jyrsijä NMR kanssa ihmiseen. Koska useat omituisuuksia NMR, kuten syövän kestävyys ja pitkäikäisyys nämä tutkimukset ovat erittäin tieteellistä mielenkiintoa. Meidän tulokset suosittelemme joitakin tuntomerkkejä voisi ainakin osittain selittää epätavallinen ominaisuuksia NMR.

Viime geeniekspressioanalyysissä maksassa NMR ja hiirillä, jotka osoittavat 660 geenien merkittävästi 5-kertainen yliekspressoidaan [12]. Näkyvin ilmaus liittyi plasman proteinaasinestäjä A2M ja proteiinit osallistuvat solu-solu vuorovaikutus ja ROS puolustusmekanismi. Selvittämiseksi syöpä kestävät mekanismeja vertasimme kaksi pitkäikäinen laji, NMR ja ihmisillä havainnollistamaan mahdollisia syövän vastaisen mekanismeja ihmisten hyvinvointi.

entinen tutkimuksessa olemme osoittaneet, että ikääntyminen on mukana merkittävä lasku A2M veren [26]. Tällä hetkellä lukuisat tutkimukset kuvaavat erinomainen toiminta A2M sääntelyssä solujen ja kudosten homeostaasin. Tämä proteiini on ainutlaatuinen, koska se estää proteinaasien kaikkien luokkien, on mukana aineenvaihdunnan sairauteen liittyvien kasvutekijöiden ja sytokiinien ja useiden erilaisten sairauksien, kuten syövän, Alzheimer`s taudin, infektion ja tulehduksen [24, 29-31] .

Nämä havainnot sai meidät keskittymään analyysiin rakenteellisten ja toiminnallisten ominaisuuksien A2M molemmista lajeista perustuu olettamukseen, että NMR-tiedot voivat tarjota merkittäviä avustuksia tunnistaa syöpälääkkeen strategioita ihmisillä.

Eri toiminnot A2M välittyvät sitoutumalla reseptoriin, LRP1. Tämä valtava transmembraaniproteiiniksi (600 kDa) on osallisena patogeneesissä ateroskleroosin, syövän solujen vaeltamiseen ja invaasio, rasva-aineenvaihduntaan sekä puhdistumaan Alzheimer peptidin amyloidin ß [32-35]. LRP1 sitoo yli 30 erilaista ligandeja ja näyttää nopein ja tehokkain tilien järjestelmä proteiiniligandien verestä ja kudoksista. Äskettäin on osoitettu, että leptiini muodostaa komplekseja A2M ja verestä reseptorivälitteisen endosytoosin kautta LRP1. Tietokonesimulaatio Tämän kolmen komponentin vuorovaikutuksen paljasti, että paikallaan Plasman leptiini vaikuttaa voimakkaasti tasoon A2M [36]. Tämä on tärkeää, sillä muut kasvutekijät, kuten TGF-SS1 ja VEGF kausaalisesti osallisena kasvaimen etenemistä myös sitoutua A2M ja poistuvat samalla mekanismilla. Lisäksi LRP1 toimivat koreseptorissa lukuisia signaali reseptoreihin mukana ovat Wnt /SS-kateniinin koulutusjakson, uPA /uPAR järjestelmän ym [37]. Tärkeä estäjä kasvaimeen liittyvien metalloproteinaasien ja säädin urokinaasi plasminogeeniaktivaattorin (uPA) järjestelmän syöpä, A2M ohjaa kasvaimen solujen vaeltamiseen ja invaasiota [38]. Nämä muutamat esimerkit saattavat näyttää tärkeyttä A2M-LRP1 akselin säätelyssä kudosten ja veren homeostaasiin.

Ensimmäistä kertaa tunnistimme A2M NMR suoraan vertaamalla ihmisen A2M ja immunologisilla menetelmillä. Huomasimme, että NMR plasma sisältää noin kaksi tai kolme kertaa korkeampi A2M verrattuna ihmisen plasmaa. Testaus ristireaktiivisuus NMR-A2M paneelin kanssa anti-ihmisen A2M monoklonaalisia vasta-aineita emme onnistuneet näe mitään reaktiivisuus. Myös reseptoria sitovan-domeenin (RBD) spesifistä vasta-ainetta, alfa-1, tiedetään reagoivan vain transformoitujen A2M, ei havaittu sitovan. Olemme äskettäin havainneet, että tämä vasta-aine tunnistaa konsensus peptidisekvenssejä, S1349-R-S1351 … D1330-E-P-K1333, kaksi erillistä epitoopit käsittävät konformaatioepitoopin sisällä RBD ihmisen A2M [39]. Puuttuminen sitoutumisen NMR-A2M johtui todennäköisesti aminohappoon vaihtoon jaetun epitoopin N1350-R-P1352 … D1331-GP-K1334 NMR korvaten 3 7 aminohapoista kohdissa 1, 3 ja 5 epitooppiin. Sen sijaan, sitoutuminen NMR-A2M sen spesifiseen reseptoriin (LRP1), kuten kokeellisesti voitiin odottaa, koska kaksi olennaista lysiinitähteiden asemassa 1395 ja 1402 (NMR: Lys1393 ja Lys1400) ja luupin stabiloiva Cys1355 ja Cys1471 ihmisen A2M (NMR: Cys1353 ja Cys1368) ovat läsnä NMR-A2M [40]. Ennustettu kahdeksan beta-levyt ja yksi alfa-kierteen löytyy samankaltaisuutta NMR-A2M [20]. Useimmat rakenteet löydetty ihmisen A2M olivat myös läsnä NMR (disulfidisiltojen, N-glykosylaatio, syötti-alue, trypsiini-sitoutumiskohtia). Kuitenkin ennustaminen N-glykosylaatiokohtia NMR-A2M paljasti kaksi ylimääräistä sivustoja (taulukko 2). Vaikka ihmisen A2M on 8 N-glykosylaatiokohtia, NMR-proteiini on 10. Tämä saattaa selittää korkeamman moolimassan NMR-A2M nähdään natiivi PAGE (kuvio 1A), koska tämä ei voitu selittää pelkästään NMR-A2M aminohappokoostumus. Kuitenkin myös muut muutokset, kuten O-glykosylaatio voi vaikuttaa tähän ilmiöön, koska O-glykosylaatiot ovat enimmäkseen esiintyviä ja monimutkaisin muutoksia eukaryooteissa kanssa lajispesifinen tavalla.

Yksi mahdollinen mekanismi vastaa äärimmäistä cancer resistance in NMR oli aiemmin osoitettu [5]. Korkean molekyyli- massan hyaluronaani (HA) on merkitty, joka erittyy NMR fibroblastit, mutta ei fibroblasteista ihmisten tai hiirillä. Niin kauan kuin nämä solut tuottivat HA ne estettiin maligniteetti. Kaatamalla HA syntetisointi entsyymi (HAS2) tai yli-ilmentyminen hajottavan entsyymin (HYAL2) lisännyt pahanlaatuisuuden NMR fibroblasteissa. Tekstuuri, koostumus ja vakaus soluväliaineen ovat määrääviä tunnusmerkkejä on maligniteetti. Tärkeimmät reseptori HA ihmisen ja hiiren on CD44. Esto CD44 aiheutti viljellyt NMR solut voivat kasvaa nopeammin [5]. Äskettäin on osoitettu, että LRP1 sitoutuu CD44 ja siten säätelee adheesio-ominaisuudet kasvainsolujen [41]. Havaintomme, että NMR-A2M sitoutuu LRP1 ja että tämä sitoutuminen häiritä RAP voi valaista mahdollisesta roolista A2M tässä vuorovaikutus. Viljelemällä ihmisen fibroblastien 1% NMR plasman osoitti kasvua näiden solujen tarttuminen verrattuna lisäämällä ihmisen plasmaa. Western blot analyysi näytetään CD29 nostettava alle NMR plasman lisäravinteen (kuvio 6C). Emme voineet havaita muutoksia CD44 ilmentyminen ihmisen fibroblasteissa upon NMR-plasmakäsittely joka selittäisi havaitun kasvu soluadheesion. Yksi syy voi olla, että muut soluadheesiomolekyylit kuten integriini CD29. Ensisijainen tehtävä integriinin perheenjäsenten on välittää solu-solu- ja solu-matriisi adheesio. NMR-plasma lisäsi ilmentymä CD29, joka voisi siten vakauttaa näiden vuorovaikutusten tekee fibroblastien vähemmän herkkiä trypsination. EpCAM (CD326) ilmaistaan ​​epiteelin terveiden yksilöiden, mutta yli-ilmentyy useimmissa karsinoomissa. Useimmissa kasvaimet korkealla EpCAM ilmentyminen liittyi etäpesäke ja huonoon ennusteeseen. Kuitenkin eri kasvaintyyppien ristiriitaisia ​​tuloksia on raportoitu [42]. Kuitenkin on raportoitu, että ß-kateniinin aktivaation indusoimaa EpCAM transkription sitoutumalla TCF /Lef transkriptiotekijän sen EpCAM promoottorin [43]. Tämä on kiinnostava voisimme äskettäin osoittavat, että A2M estää Wnt /SS-kateniinin reitin kasvainsoluissa [24]. Tämä voisi selittää estävä vaikutus A2M on EpCAM ilmaisu (kuvio 6C).

Siksi päätellä, että merkittävä tekijä vastuussa lisääntyneestä soluadheesiota NMR- plasma-altistus ihmisen fibroblastien voisi olla A2M.