Krooninen sairaus

tiivistelmä

Koska muutokset tyvikalvoissa ovat kriittisiä indikaattoreita erottamiselle normaali, precancerous ja syöpä- paksusuolen kudoksiin, suora visualisointi näistä varoitusmerkeistä on välttämätöntä varhainen diagnoosi ja hoito paksusuolen syövän. Tässä esitämme, että toinen harmoninen sukupolvi (SHG) mikroskopialla voivat koetin muutokset tyvikalvoissa eri paksusuolen syövän vaiheissa. Tuloksemme osoittavat myös kyky käyttää kvantitatiivisia analyysejä kuvien määrällisesti nämä muutokset eri syövän vaiheissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että SHG mikroskopia on potentiaalia in label-vapaasti kuvantaminen muutoksia tyvikalvoissa tehokkaasti erotella normaali, precancerous ja syöpä- paksusuolen kudoksiin. Tietääksemme tämä on ensimmäinen osoitus dynamiikan tyvikalvon muutoksista eri paksusuolen syövän vaiheissa käyttäen täysin luontainen lähde kontrastia.

Citation: Zhuo S, Yan J, Chen G, Shi H, Zhu X Lu J, et al. (2012) Label-vapaa kuvantaminen tyvikalvoissa erottaa normaali, Syövän, ja syöpä Paksusuolen kudokset by Toisen Harmoninen sukupolven Mikroskopia. PLoS ONE 7 (6): e38655. doi: 10,1371 /journal.pone.0038655

Toimittaja: Mitsunobu R. Kano, Tokion yliopisto, Japani

vastaanotettu: 13 tammikuu 2012; Hyväksytty: 08 toukokuu 2012; Julkaistu: 08 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Zhuo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Projekti tukivat ohjelma Changjiang Tutkijat ja Innovative Research Team University (Grant nro IRT1115), National Natural Science Foundation of China (Grant nro. 60908043, 30970783, 81101209), ja Natural Science Foundation of Fujian (Grant nro . 2011J01341, 2010J01136, 2010J01321). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Colonic syöpä on yksi suurimmista syistä sairastavuuden ja kuolleisuuden ihmisen [1]. Yleensä se on helposti käsiteltävä, jos diagnosoitu yksi pre-invasiivisen vaiheessa [2], [3]. Kuitenkin varhaisten leesioiden on edelleen haaste. Paksusuolen syövän kehityksen pahanlaatuiset solut muuttavat tyvikalvoissa (rajapinnoilla crypt ja lamina propria), kuten vaihtelut tyvikalvon koko ja tiheys, menetys tyvikalvon [4], [5]. Muutokset tyvikalvon ovat yksi tärkeimmistä mittareista paksusuolen syövän kehityksen [5], [6]. Kuitenkin nämä varoitusmerkit ovat toistaiseksi vasta havaittavissa histologinen tarkastelu koepalanäytteistä [4], [7]. Siksi uusien ja noninvasive

in situ

kuvantamismodaliteetin luotaa näistä varoitusmerkeistä on suuri lääketieteellinen merkitys.

Paksusuolen limakalvon sisältää krypta, tyvikalvon, ja lamina propriaa kuten on esitetty kuviossa. 1. Se näkyy myös kuviossa 1, että

en kasvot

osa paksusuolen limakalvon voi samanaikaisesti tarkkailla krypta, tyvikalvon, ja lamina propria. Koska crypt koostuu pääasiassa pylväsmatriisien epiteelisolujen ja pikarisolujen, joka ei ole tehokas tuottamaan toinen harmoninen sukupolven (SHG) signaaleja ja lamina propria koostuu pääasiassa kollageenista, joka pystyy emittoimaan vahva SHG signaaleja [8] – [10], SHG mikroskoopilla voi olla hyötyä luotaa muutokset tyvikalvon, jotka eivät ole käytettävissä muiden kuvantamismodaliteetit. SHG mikroskopia on epälineaarinen optinen tekniikka ja on edut ovat label-vapaa, luontainen kolmiulottei resoluutio, lähi-infrapuna-magnetointi erinomaisen optisen levinneisyys, alempi valon aiheuttaman vaurion, ja joka pystyy tarjoamaan kvantitatiivista tietoa [11] – [15]. Tähän mennessä ei ole raportoitu testata mahdollisuuksia tämän tekniikan etiketti-vapaasti visualisointiin tyvikalvoissa indikaattoreina erottaa normaali, precancerous ja syöpä- paksusuolen kudoksiin, ja tämä on mikä motivoi meitä tekemään tätä työtä käyttämällä tätä tekniikkaa.

tulokset

Patologian Results

72 paksusuolen koepalanäytteistä kuvaamisen, 20 diagnosoitiin normaalia, 28 kanssa adenooma, ja 24 adenokarsinooma. Tilastollista analyysia, kudosnäytteet jaettu normaaliin tapauksessa (n = 20), precancer (adenooma, n = 28), ja syövän (adenokarsinooma, n = 24).

SHG Kuvat

koetin muutokset tyvikalvoissa eri paksusuolen syövän vaiheissa, edustaja en kasvoja SHG kuvia normaalista, precancerous ja syöpä- paksusuolen kudokset ovat vastaavasti kuvassa. 2. Kuten odotettua, SHG kuvantamisen tekniikka voi hyvin kuvitella ääriviivat tyvikalvoissa (punaiset ympyrät). Se näkyy kuviossa. 2 että suuret morfologisia eroja ääriviivat tyvikalvoissa havaitaan eri paksusuolen syövän vaiheissa. Normaalissa tapauksessa hunajakenno järjestely pyöreän muotoinen säännöllinen tyvikalvoissa kanssa samankokoisia havaitaan. Vuonna precancer, putkimaisen muotoinen tyvikalvoissa suurempia kooltaan ja asukastiheys saadaan verrattuna normaaliin tapaukseen. Syövän, kellarissa kalvoja löytyy normaalissa tapauksessa puuttuvat.

kvantitatiivinen analyysi tyvikalvoissa

Taulukossa 1 esitetään keskiarvo ja SD ympyrän pituuden tyvikalvon ja väestön tiheys tyvikalvoissa normaalia, precancerous ja syöpä- paksusuolen kudoksiin. Yksityiskohtaisesti, ympyrä pituus tyvikalvon normaali on 342,7 ± 27,2 um (n = 60 alueilla 20 biopsiat) ja precancer on 695,8 ± 79,1 um (n = 84 alueilla 28 biopsiat) ja syöpä on 1767,8 ± 166,3 pm (n = 72 alueilla 24 koepaloja). Lisäksi asukastiheys tyvikalvoissa normaalissa on 103,2 ± 10,6 /mm

2 (n = 60 alueilla 20 koepaloja), in precancer on 27,1 ± 6,3 /mm

2 (n = 84 alueilla 28 koepaloja) ja syöpä on 0,3 ± 1,2 /mm

2 (n = 72 alueilla 24 koepaloja). Nämä tulokset esitetään ympyrän pituuden tyvikalvon ja asukastiheys tyvikalvoissa muuttujia, jotka osoittivat merkittäviä eroja (

P

0,05) välinen normaali, precancerous, ja syöpäkudokset luokat perustuvat unparired Wilcoxonin summa testit .

keskustelu

Tämä työ esittelee että SHG mikroskopia voidaan tehokkaasti koetin muutokset tyvikalvoissa eri paksusuolen syövän vaiheissa. Erityisesti SHG mikroskopia mahdollistaa löydettiin kaksi morfologisia ominaisuuksia (ympyrä pituus tyvikalvon, asukastiheys tyvikalvoissa), jotka osoittavat merkittäviä eroja eri paksusuolen syövän vaiheissa. Nämä havainnot ovat koostuvat kanssa immunohistokemiallista tuloksia (kuvassa. 3), sekä vahvistaa myös se, [4], [16], että ennen syöpä tulla invasiivisia vaiheissa tunnetaan precancer, pahanlaatuiset solut muuttavat ääriviivat tyvikalvon mutta eivät tuhoutuu tyvikalvon; syöpää tullut invasiivisia, pahanlaatuiset solut (ei SHG signaalit) korvaa kollageenikuituja, mikä johtaa menetykseen tyvikalvon.

Kuten todettiin, SHG mikroskopia pystyy tarra-vapaasti kuvantamisen muutosten tyvikalvojen eri paksusuolen syövän vaiheissa ja sellaisena voi toimia

in situ

histologisia työkalu, joka on vapaa merkintävaatimuksesta tavanomaisten menetelmien. Lisäksi perustuu kuvan analyysien, pystyimme saamaan joitakin kvantitatiivisia tietoja eri syövän vaiheissa. Siten SHG mikroskopia antaa meille niin morfologisen sekä määrällisiä, väline, jonka koetin muutoksiin tyvikalvoissa eri paksusuolen syövän vaiheissa. Tärkeää on tämä kyky johtuu siitä, että muutokset tyvikalvon tärkeä rooli paksusuolen syövän kehittymisen [5], [6], ja nämä muutokset ovat toistaiseksi ollut vain havaittavissa histologinen tarkastelu biopsianäytteistä [4], [7]. SHG mikroskopia mahdollistaa havaita nämä vaihtelut, ja niiden mittaaminen mahdollistaa tyvikalvon koon ja asukastiheys on määritettävä. Nämä tulokset osoittavat lupauksen SHG kuvantamisen klinikoille, minkä biolääketieteellisen tutkimuksen välineenä tutkia dynamiikkaa tyvikalvon muutoksista eri paksusuolen syövän vaiheissa. Lisäksi on todettava, että vaikka tulehtuneita leesioita ei pidetty tässä työssä, SHG kuvantaminen pitäisi pystyä erottamaan syöpä- ja tulehdusvaurioiden tappioiden kellarin kalvot syöpäkudokset. Tässä yhteydessä nähdään, että SHG mikroskopia on potentiaalia etiketti-vapaasti visualisoida muutoksia tyvikalvoissa indikaattoreina erottaa normaali, precancerous ja syöpä- paksusuolen kudoksiin.

Johtopäätöksenä tämä työ osoittaa mahdollisuudet SHG mikroskopia leimata-vapaasti kuvan muutosten tyvikalvoissa, kuten tyvikalvon koko ja väestötiheys, tärkeät indikaattorit paksusuolen syövän kehittymisen. Tietääksemme tämä on ensimmäinen kerta näyttää, miten SHG kuvantaminen voidaan käyttää kvantitatiivisesti visualisoida dynamiikkaa tyvikalvon muutoksista eri paksusuolen syövän vaiheissa. Tulevaisuudessa työn laajamittainen tutkimus tehdään määrittää herkkyys, spesifisyys, negatiivinen ennustearvo, positiivinen ennustearvo suhteessa perinteisiin histologista analyysiä. Etuna tässä tekniikan perinteisiin diagnoosimenettelyistä että kudoksia ei ole läpäistävä viipalointi, parafiinivalu tai jäädyttää ja sulattaa prosessi, mikä varata potentiaalia

in vivo

kuvantamiseen. Jolla on mahdollisuus määrällisesti tyvikalvon muuttuu alla olevassa tutkimuksessa, on oletettavissa, että SHG-pohjainen tähystys [17] – [19] voisi helpottaa ja hyödyttää

in vivo

tutkimuksia ja diagnoosia vuosina tulla.

Materiaalit ja menetelmät

kudosnäyte

yhteensä 72 tuoretta paksusuolen koepalanäytteistä saatiin kolmekymmentä-kaksi potilaalle tehtiin endoskooppinen biopsia. Ennen tutkimukseen osallistumista, kaikki potilaat allekirjoittivat tietoon perustuvan suostumuksen, ja tämä tutkimus hyväksyi Institutional Review Board of Fujian Kasvain sairaala. Biopsia näyte pantiin lasipohjalla lautasen (MatTek, peitelevyllä: 0,085-0,13 mm) SHG kuvantaminen. Tässä työssä, näytteen valmistelu ja SHG kuvantamisen saatiin päätökseen 1 tunnin kuluttua Endoskooppinen biopsia.

Imaging instrumentointi

SHG mikroskoopilla saatiin aikaan käyttämällä epälineaarinen optinen järjestelmä, joka on kuvattu aiemmin [20] . Lyhyesti, SHG kuvat hankittiin käyttämällä kaupallista laserskannaus mikroskooppinen kuvantamisjärjestelmä (Zeiss LSM 510 META, Jena, Saksa), joka on kytketty Fs Ti: safiiri laser (Coherent Mira 900-F), joka toimii 800 nm: ssä. Polarisaation suunta laservalon on vaakasuora polarisaatio. Immersioöljyobjektiivilinssillä (× 63 ja NA = 1,4) käytettiin tarkentamiseksi virityssäteen kudosnäytteistä (keskimääräinen teho alle 15 mW), ja käytettiin myös kerätä takaisinsiroavaa luontainen SHG signaaleja. Kuvat otettiin 2,56 mikrosekuntia per pikseli. Hieno keskittyen vaiheessa (HRZ 200 vaiheessa Carl Zeiss) käytetään kääntää näytteiden jälkeen xy skannauksen näytteiden saamiseksi suuri-alue kuvan, ja muuttaa polttopistettä tallentamiseen erilaisia ​​optisia osia.

Histologia Analysis

Kun SHG kuvantaminen, kudosnäytteet kiinnitettiin 10% formaliinilla ja valmistellaan patologinen tutkimus käyttämällä standardimenetelmiä. H & E-värjätyt leikkeet ja osat värjättiin ensisijainen vasta-aineita kollageeni IV saatiin kustakin näytteestä, ja tarkistaa sertifioitu patologi.

kvantifiointi tyvikalvoissa

edelleen määrällisesti muutosten tyvikalvoissa eri paksusuolen syövän vaiheisiin, kolme 415 um 490 um suorakulmainen alueet kussakin biopsia valittiin kvantitatiivinen analyysi. Tässä työssä kaksi analyysit suoritettiin. Ensin mitataan ympyrän pituuden tyvikalvon. Lisäksi paremmin kuvata tätä arvoa, jos on menetys tyvikalvoissa, ympyrä pituus tyvikalvon asetettiin ympyrän pituuden valitun suorakulmainen. Toiseksi, laskimme kokonaismäärä tyvikalvoissa pinta-alayksikköä kohti, eli asukastiheys kellarissa kalvoja. Tässä työssä jokainen kvantitatiivinen analyysi suoritettiin kaikilla tarkasteltavilla koepaloja.

TILASTOANALYYSI

määrälliset tiedot on esitetty yhteenvetona kanssa keskiarvo ja keskihajonta (SD), esitetään ”tarkoittaa ± SD” . Yhteenvetotilasto ympyrän pituuden tyvikalvon ja asukastiheys tyvikalvoissa (liittyvä patologinen määritys) syntyvät moniosaista kustakin 72 paksusuolen koepalanäytteistä otettu kolmekymmentä-kaksi potilasta. varten tilastollisen analyysin mittaukset yksittäisten osa oletettiin perustuvia itsenäisiä havaintoja. kun tiedot tässä tutkimuksessa (ominaista ilmeinen homogeenisuus arvojen sisällä diagnostiset luokat), monimutkaisempia tilastollisia menetelmiä katsottiin tarpeettomaksi, koska ne eivät muuttaisi näytteen avulla, eikä myöskään ne johtavat suurempiin näyte standardipoikkeamat. tässä työssä, Wilcoxonin-summa suoritettiin kokeita sen määrittämiseksi, on merkittäviä eroja ympyrän pituuden tyvikalvon ja asukastiheys tyvikalvoissa normaalin, precancerous, ja syöpäkudokset (pariton vertailu ). Nonparametric Wilcoxonin testit valittiin parittomia vertailua koska pieni otoskoko. Tarkka

P

-arvot laskettiin, ja erot katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä, kun

P

-arvot olivat vähemmän kuin 0,05.

Kiitokset

kirjoittajat haluavat kiittää toimittaja ja kaksi nimettömänä arvioijat heidän rakentavia kommentteja, jotka olivat erittäin hyödyllisiä vahvistamiseksi esittelyn paperia.