Krooninen sairaus

tiivistelmä

kehittää tehokkaita syövän hoitoon on ollut aihe voimakasta kiinnostusta useita vuosikymmeniä. Yhdistetty antaminen tiettyjen molekyylien ja immuunijärjestelmän solujen on osoitettu olevan tehokas muoto syövän hoitoon. Tässä me tutkimme vaikutuksia annetaan immuunivasteen stimuloiva peptidi (WKYMVm), 5-fluori-urasiili (5-FU), ja kypsä dendriittisolut (MDC) vastaan ​​heterotooppisen syövän eläinmallissa. Hallinto kolmoissidos voimakkaasti vähensi kasvainten tilavuus CT-26-ympätty heterotooppi- syövän eläinmallissa. Indusoidun anti-kasvain aktiivisuus korreloi hyvin FAS ilmaisu, kaspaasi-3-aktivaation, ja syöpäsolujen apoptoosia. Kolmoissidos hoito aiheutti rekrytointi CD8 T-lymfosyyttien ja luonnollisten tappaja (NK) solujen kasvain. Tuotanto kaksi sytokiinien, IFN-γ ja IL-12, voimakkaasti kannustanut anto kolmoissidoksen. CD8 T-lymfosyyttien tai NK-solujen antamalla anti-CD8 ja anti-asialoGM1 vasta-aine inhiboi anti-kasvain aktiivisuutta ja sytokiinien tuotantoa kolmoissidoksen. Kolminkertainen yhdistelmä esti voimakkaasti etäpesäke paksusuolen syöpäsoluissa heterotooppi- syövän eläinmallissa sekä metastasoitunut syöpä eläinmallissa, ja parannettu eloonjäämisaste hiirimallissa. Adoptiovanhemmat siirto CD8 T-lymfosyyttien ja NK-solujen entisestään eloonjäämisaste. Yhdessä ehdotamme, että käyttö kolmen yhdistelmähoidon WKYMVm, 5-FU, ja MDC: t voivat olla vaikutuksia kiinteiden kasvainten ja etäpesäkkeiden hoitoon.

Citation: Kim SD, Lee HY, Shim JW, Kim HJ , Baek SH, Zabel BA, et al. (2012) WKYMVm sisältävien yhdistelmä saa aikaan Voimakkaat antituumorivaikutuksen in Heterotooppista Cancer eläinmallissa. PLoS ONE 7 (1): e30522. doi: 10,1371 /journal.pone.0030522

Editor: Hana Algul, Technische Universität München, Saksa

vastaanotettu: 12 elokuu 2011; Hyväksytty: 18 joulukuu 2011; Julkaistu: 25 tammikuu 2012

Copyright: © 2012 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Research Development Program for Cancer Control Terveys-, sosiaali- ja perheasiain, Korean tasavalta (0920220) (Y-SB); National Research Foundation Korean se rahoitettiin Korean hallitus (2009 0093198) (Y-SB); ja National Institutes of Health myöntää AI-079320 (BZ). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kehittäminen syövän hoitoon on ollut tärkeä asia useiden vuosikymmenien ajan [1], [2]. Hoidon syöpälääkkeet on yksi laajimmin käytetty muotoa kasvainhoitojen. Erilaisia ​​syöpälääkkeet on kehitetty, mukaan lukien 5-fluori-urasiili (5-FU) [3]. Mekanistisesti, syöpälääkkeet on raportoitu aiheuttavan apoptoosia syöpäsoluissa, mikä indusoi aloittamisesta syövän immuunivasteen [4]. Vuonna isännän immuunijärjestelmän, dendriittisolut (DC: t) näyttävät olevan keskeisessä asemassa antituumorivaikutus. DC tunnistaa ja käyttöönottoon kasvaimen antigeenejä, ja esittää käsitellyt antigeenit kudossopeutuvuuskompleksin molekyylejä [5], [6], [7]. Siten DC voi stimuloida T-lymfosyyttejä, jolloin sytotoksinen T-lymfosyyttien aktiivisuutta. DC erittävät myös useita sytokiinejä, jotka ovat tärkeitä tehokkaaseen antituumorivaikutus [7].

WKYMVm todettiin immuuni-stimuloiva synteettinen peptidi peptidi kirjaston seulonta [8], [9]. WKYMVm stimuloi leukocytic solujen, kuten monosyyttien, neutrofiilien, luonnollisten tappajasolujen (NK-solut), ja DC: [9], [10], [11], [12]. Koska monosyyttien ja neutrofiilien stimulaatio, kemotaktisia muuttoliike, superoksidianionituotanto, ja tuotanto tiettyjen tulehduksellisten välittäjäaineiden, kuten leukotrieeni B

4 indusoi WKYMVm [9], [13], [14]. NK-solujen stimulaation WKYMVm tuloksia sytolyyttisen aktiivisuuden ja kemotaktinen muuttoliike [11]. Peptidi stimuloi kemotaktinen migraatio DC [12]. Kolme jäsentä formyyli peptidin reseptorin (FPR) perhe on raportoitu olevan kognitiivisen solun pinnan reseptorien WKYMVm ihmisillä [15], [16]. Hiiren FPR on myös raportoitu toimimaan WKYMVm reseptorin [17]. Vaikka WKYMVm on raportoitu stimuloivan leukosyytit, jotka tärkeä rooli syövän antigeenejä, tiedetään vähän rooli WKYMVm on syövän vastainen vaikutus.

Yhdistetty antaminen tiettyjen molekyylejä voidaan indusoida tehokas syövän vastainen vaikutus. Vaikka eri syöpälääkkeet tai syöpähoitojen on raportoitu, uusien syöpälääkkeiden, jotka ovat tehokkaita ja erityisiä alhainen myrkyllisyys on edelleen tarpeen. Tässä tutkimuksessa selvitettiin terapeuttinen vaikutus WKYMVm kun se oli ylläpitäjä kanssa syövän vastaisen aineen (5-FU) ja luonnollinen rokotteen adjuvanttia (kypsä DC, MDC: t). Vaikutusmekanismia triple yhdistelmähoito oli myös ominaista.

Tulokset

Yhdistetty anto WKYMVm, 5-FU, ja MDC: t aiheuttaa antituumorivaikutuksen in heterotooppi- syövän eläinmallissa

oletettu anti-kasvain aktiivisuus WKYMVm, 5-FU, tai MDC: t tutkittiin. WKYMVm, 5-FU, tai MDC: t ensin annettuna yhtenä. Esimerkiksi, kuten on esitetty kuviossa. 1A, WKYMVm (100 ug /eläin) injektoitiin neljä kertaa 12 tunnin välein. Yhden hallinto aiheutti lievää laskua kasvaimen tilavuus (Fig. 1 B). Kun aine testattiin pareittain (WKYMVm + 5-FU; WKYMVm + MDC: t, MDC: t + 5-FU) vastaan ​​eläinmallissa, antituumorivaikutuksen tehostui (Fig. 1 B). Kun läsnä oli 5-FU näytti edelleen voimistaa kasvaimen vastaisen aktiivisuuden (Fig. 1 B, 5-FU + WKYMVm ja 5-FU + MDC: t). Lisäksi, kun kolmoissidoksen (WKYMVm + 5-FU + MDC: t) annettiin heterotooppi- syövän eläinmallissa, tehokkain antituumorivaikutus havaittiin (Fig. 1 B).

(A) Menetelmä tutkimus anti-kasvain aktiivisuus WKYMVm, 5-FU, ja MDC: t. (B) kolmoisyhdistelmä WKYMVm, 5-FU, ja MDC: t on tehokkain antituumorivaikutus. CT-26-soluja (5 x 10

5 solua 100 ul: ssa PBS: ää) injektoitiin s.c. oikeaan kylkeen Balb /c-hiiriä (n = 8) päivänä -3. Hiirille protokollan mukaisesti (A). Kasvaimen tilavuus mitattiin, ja tulokset on esitetty keskiarvona ± SEM (n = 8).

***,

P

0,001 kontrolliin verrattuna.

Yhdistetty anto WKYMVm, 5-FU, ja MDC: t herättää kasvaimen apoptoosin

Koska kasvaimen apoptoosiin liittyy läheisesti antituumorivaikutuksen, vaikutus kunkin annon kasvaimen apoptoosin mitattiin. Kuten on esitetty kuviossa. 2, yksittäinen anto WKYMVm, 5-FU, tai MDC: t indusoi alhainen kasvainsolun kuoleman, ja kaksinkertainen yhdistelmät osoittivat lisääntyvän edelleen solukuoleman, jossa kolminkertainen yhdistelmä johtaa lisääntynyt dramaattisesti kasvainsolukuoleman heterotooppi- syövän eläinmallissa (kuvio . 2). TUNEL-positiivisia soluja samaan aikaan FAS ilmaisu, joka ilmaisee, että kasvainsolun kuoleman havaittu johtuu apoptoosin (Fig. 2). Kaspaasi-3 aktiivisuutta käsiteltäessä määritettiin immunofluoresenssivärjäyksen käyttäen anti-fosfo-kaspaasi-3-vasta-aine. Yhdenmukainen TUNEL värjäys ja FAS ilmaisun tuloksia, kaspaasi-3 aktivointi kasvoi määrä yhdistetyn aineiden kasvaa, minkä WKYMVm + 5-FU + MDC kolmoisyhdistelmä indusoi dramaattisen kasvun kaspaasi-3: n aktiivisuuden (kuvio. 2). Tasot tuumorisolujen apoptoosin ja kaspaasi-3: n aktiivisuuden korreloivat hyvin kasvaimen tilavuuden tiedot kuvassa. 1B.

Balb /c-hiiriin istutettiin CT-26-soluja ja käsiteltiin WKYMVm, 5-FU, ja MDC: t protokollan mukaisesti kuvion. 1A. Hiiret lopetettiin 42 päivää tuumorin istuttamisen jälkeen ja kasvaimia kirurgisesti leikattiin, ja käsitellään hematoksyliinillä ja eosiinilla, immunohistokemiaa FAS värjäystä, kaspaasi-3-värjäys, ja TUNEL värjäys, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Esitetyt tiedot on tyypillinen kolmen erillisen kokeen.

hallinto kolmoissidoksen aiheuttaa rekrytointi CD8 T-solujen ja NK-solujen kasvaimeen

Aloita anti-kasvain immuuni vastauksena leukosyyttistä soluja täytyy rekrytoidaan kasvaimen alueelle [18]. Koska anto kolmoissidoksen (WKYMVm + 5-FU + MDC) sai aikaan voimakkaita antituumorivaikutuksen vastaan ​​heterotooppi- syövän eläinmallissa, tutkimme millaiset soluja rekrytoidaan kasvaimeen immunohistokemiallisesti käyttäen anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD11 tai anti-DX5-vasta-ainetta. Hallinto kolmoissidos aiheutti dramaattisen rekrytointi CD8 T-lymfosyyttien ja NK-solujen kasvaimeen alueelle, sekä vähäistä rekrytointi CD4 T-lymfosyyttien (Fig. 3A).

(A) Balb /c-hiiriin ympättiin CT-26 soluja ja käsiteltiin WKYMVm, 5-FU, ja MDC: t protokollan mukaisesti kuvassa. 1A. CD8 T-solut, CD4-T-solut tai NK-solut köyhdytetty i.p. injektion 100 ug anti-CD8 (B), anti-CD4 (C) tai anti-asialoGM1-vasta-aine (D) Balb /c-hiirissä. Hiiret lopetettiin 42 päivää tuumorin istuttamisen jälkeen ja kasvaimia kirurgisesti leikattiin, ja käsitellään immunovärjäyksellä käyttäen anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-asialoGM1 vasta-aineita, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. CD3

+ CD8

+ soluja, CD3

+ CD4

+ soluja, ja CD11

+ DX5

+ solut osoittavat CD8 T-lymfosyyttejä, CD4 T-lymfosyyttejä, ja NK-soluissa, vastaavasti . Esitetyt tiedot on tyypillinen kolmen erillisen kokeen.

Hallinto anti-CD8 monoklonaalinen vasta-aine ennen kolmoissidoksen aiheutti dramaattisen eston CD8 T-lymfosyyttien rekrytointi kasvaimeen alueelle, vaikuttamatta NK-solujen rekrytointi ( kuva 3B). Kun anti-asialoGM1-vasta-ainetta annettiin ennen injektiota kolmoissidoksen, NK-solujen rekrytointi kasvaimeen alueella voimakkaasti estetty, mutta CD8-T-lymfosyyttien rekrytointi ei vaikuttanut (kuvio. 3D). Anti-CD4-vasta-aineen anto ennen injektiota kolmoissidoksen ei vaikuttanut CD8-T-lymfosyyttien tai NK-solun rekrytointi (Fig. 3C).

CD8-T-solujen ja NK-soluilla on keskeinen asema anti-kasvain aktiivisuus kolminkertainen yhdistelmähoito

tehokas aktivointi syövän vastaista aktiivisuutta in koe-eläin, useita leukosyyttien tyypit kommunikoida keskenään ja toimivat concertedly. Tutkimme suhteellinen osuus yksittäisten valkosolujen tyyppejä antituumorivaikutuksen aiheuttama kolminkertainen yhdistelmähoitoa, jonka hallinnosta vasta-aineita kutakin valkosolujen. Kun anti-CD8-vasta-ainetta annettiin heterotooppi- syövän eläinmallissa, anti-kasvain aktiivisuus kolmoissidoksen oli estää lähes täysin (Fig. 4A). Antaminen anti-asialoGM1-vasta-aineen aikaansaama osittainen inhibitio anti-kasvain aktiivisuus kolmen yhdistelmähoitoa (Fig. 4B). Kuitenkin anto anti-CD4-vasta-aine ei vaikuttanut anti-kasvain aktiivisuus kolmoissidoksen (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset osoittavat, että CD8-T-solujen ja NK-soluilla on keskeinen asema anti-kasvain aktiivisuus kolmoisyhdistelmä WKYMVm, 5-FU, ja MDC: t.

Balb /c-hiiriin istutettiin CT-26-soluja ja käsiteltiin WKYMVm, 5-FU, ja MDC: t protokollan mukaisesti kuvassa. 1A. CD8 T-solujen tai NK-solut köyhdytetty i.p. injektion 100 ug anti-CD8 (A) tai anti-asialoGM1-vasta-aine (B) Balb /c-hiirissä. Kasvaimen tilavuus mitattiin, ja tulokset on esitetty keskiarvona ± SEM (n = 8).

*

P

0,05,

***,

P

0,001 kontrolliin verrattuna.

hallinto WKYMVm, 5-FU, ja MDC: t kolmoisyhdistelmä saa aikaan muutoksen sytokiiniprofiilia on heterotooppi- syövän eläinmallissa

Testasimme onko anto WKYMVm, 5-FU, ja MDC: t eri yhdistelminä aiheuttaa muutoksia sytokiiniprofiilin verrattuna valvontaan kasvain lysaatin. Kuten on esitetty kuviossa. 5A, anto kolmoissidoksen aiheuttanut dramaattisia muutoksia IFN-γ ja IL-12 tuotetaan kasvain lysaatit heterotooppi- syövän eläinmallissa. IFN-γ kasvaimen vähitellen lisääntynyt, kun määrä yhdistetyn aineiden lisääntynyt, kaksinkertainen yhdistelmien yleensä näkyy enemmän IFN-γ tuotantoa kuin yksi hallinto, ja kolmoissidos osoittaa korkeimman tason IFN-γ tuotantoon (Kuva. 5A ). Kun IL-12-tasot mitattiin, huomasimme, että yksi kunkin aineen antamisen ei indusoinut IL-12, ja joukossa kaksinkertainen yhdistelmä, vain yhdistelmä WKYMVm + MDC parannettu IL-12 tuotantoa eläinmallissa (Fig. 5B). Hallinto kolmoissidos (WKYMVm + MDC: t + 5-FU) on kasvanut dramaattisesti IL-12 tuotantoa tasolle, joka oli kaksi kertaa suurempi kuin WKYMVm + MDC kaksinkertainen yhdistelmä (kuvio. 5B).

Balb /c-hiiriä inokuloitiin CT-26-soluja ja käsiteltiin WKYMVm, 5-FU, ja MDC: t protokollan mukaisesti kuvion. 1A. (A, B) IFN-γ: n ja IL-12-tasot mitattiin kasvainkudoksen lysaattia. (C-F) IFN-γ ja IL-12 tasot ääreisverenkierron upon kolmen yhdistelmähoidon mitattiin. 100 ug anti-CD8 (C, D) tai anti-asialoGM1-vasta-aineen (E, F) injektoitiin i.p. Balb /c-hiirissä. Data on esitetty keskiarvona ± SEM (n = 8).

*

P

0,05,

***,

P

0,001, verrattuna kontrolliin arvoa;

#

P

0,05, poikkeaa merkittävästi WKYMVm + 5-FU + MDC-käsiteltyjen ohjaus.

hallinto kolmoissidoksen havaittiin myös parantaa IFN-γ: n ja IL-12: n perifeerisen veren (Fig. 5C-5F). Jotta voidaan tutkia roolia CD8-T-lymfosyyttien ja NK-solujen tuotannossa näiden kahden sytokiinin kun kolmoissidos annon, anti-CD8 ja anti-asialoGM1-vasta-ainetta annettiin ennen kolmoisyhdistelmä hoitoon. Antaminen anti-CD8 ja anti-asialoGM1-vasta-aine esti kolmoissidoksen indusoiman IFN-γ: n ja IL-12 tuotantoa perifeerisen veren (Fig. 5C-5F). Nämä tulokset osoittavat, että CD8 T-lymfosyytit ja NK-solujen rooli IFN-γ ja IL-12 tuotantoa aiheuttama kolmoisyhdistelmä hoitoa.

Anti-etäpesäke aktiivisuus yhdistettynä hallinnon WKYMVm, 5-FU, ja MDC: t

Kun kehittää tehokas kasvaimen vastainen terapeuttinen aine, on tärkeää kehittää aineita, jotka estävät kasvaimen uusiutumisen [19]. Metastaattista kykyä syöpäsolujen siirtyä niiden alkuperästä muihin kohdekudoksissa on yksi tärkeimmistä syistä, jotka vaikeuttavat kehittää tehokas solunsalpaajaksi [20], [21]. Meidän heterotooppisen syövän eläinmallissa, havaitsimme, että ihon alle inokulaation CT-26 paksunsuolen syöpäsolujen aiheutti spontaanin etäpesäke solujen keuhkokudoksen (Fig. 6A). Anto kolminkertainen WKYMVm + MDC: t + 5-FU yhdistelmällä esti lähes täysin etäpesäkkeiden paksusuolen syövän solujen keuhkoihin (Fig. 6A). Tämä kolmoisyhdistelmä aiheuttamaa anti-etäpesäke aktiivisuus estettiin antamalla anti-CD8 tai anti-asialoGM1 vasta-aineella (Fig. 6A), mikä osoittaa, että anti-etäpesäke aktiivisuus välittyy CD8 T-lymfosyyttien ja NK-solujen toimintaa.

(A) Balb /c-hiiriin istutettiin CT-26-soluja ja käsiteltiin WKYMVm, 5-FU, ja MDC: t protokollan mukaisesti kuvion. 1A. CD8 T-solujen tai NK-solut köyhdytetty injisoimalla 100 ug anti-CD8 tai anti-asialoGM1-vasta i.p. Balb /c-hiirissä. Päivänä 42 hiiret tapettiin ja kasvaimen kyhmyt keuhkojen pinnan havaittiin. (B) CT-26-soluja (2 x 10

5 solua 100 ul: ssa PBS: ää) injektoitiin häntälaskimoon Balb /c-hiirissä. 14 päivän jälkeen hiiret tapettiin ja hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäys suoritettiin käyttäen eristettyä keuhkoihin. Näissä kuvissa edustavat kahdeksan itsenäistä kokeita.

**,

P

0,01,

**,

P

0,01 verrattuna kontrolliryhmään.

Käytimme myös keinotekoinen etäpesäke eläinmallissa vaikutuksen testaamiseksi eri yhdistelmiä WKYMVm, 5-FU, ja MDC: t vastaan ​​etäpesäke. Injektio CT-26 paksunsuolen syöpäsolujen häntälaskimoon aiheuttaa etäpesäkkeitä keuhkoihin. Keuhkot eristettiin 14 päivän kuluttua CT-26 solujen injektio. Dramaattinen keuhkometastaasitestissä havaittiin ajoneuvon hoidetut hiiret (Fig. 6B). Yhden tai kahden yhdistelmiä WKYMVm, MDC: t, ja 5-FU esti kasvaimen etäpesäke eriasteisesti vähentävän keuhkojen etäpesäke, ja voimakkaimpia vaikutus havaittiin kolminkertainen yhdistelmä (Fig. 6B).

Yhdistetty anto WKYMVm, 5-FU, ja MDC: t parantaa eloonjäämisluvut joka heterotooppi- syövän eläinmallissa

eloonjäämisaste heterotooppisen syövän eläinmallissa upon yhdistetty hoito tutkittiin. Testasimme yhdistelmiä, jotka osoittivat suhteellisen korkea antituumorivaikutuksen edellisessä määrityksissä edellä; 5-FU yksin, 5-FU + WKYMVm, 5-FU + MDC: t, ja 5-FU + MDC: t + WKYMVm. Anto 5-FU yksin, 5-FU + MDC: t, tai 5-FU + WKYMVm vain hieman lisääntynyt eloonjäämisaste, mutta anto triple 5-FU + MDC: t + WKYMVm yhdistelmä voimakkaasti parannettu eloonjäämisaste (Fig. 7A). Kaikki hiiret kontrolliryhmässä olivat kuoli 65 päivää, kun taas 80% kolmoissidoksen saaneessa ryhmässä oli elossa 80 päivää (Fig. 7A).

(A) Survival määrä hiiriä hoidettiin yhdistelmiä WKYMVm, 5-FU, ja MDC: t. Balb /c-hiiriin istutettiin CT-26-solut (5 x 10

5 solua /eläin) ja käsiteltiin WKYMVm, 5-FU, ja MDC: t protokollan mukaisesti kuvassa. 1A. (B) Adoptive siirto CD8 T-lymfosyyttien tai NK-solut voidaan parantaa eloonjäämisaste kolmoissidoksen saaneista heterotooppi- syövän eläinmallissa hiirillä. Balb /c-hiiriin istutettiin CT-26-solut (1 x 10

6 solua /pää) ja käsiteltiin WKYMVm, 5-FU, ja MDC: t protokollan mukaisesti kuvassa. 1A, ja eristetty CD8 T-lymfosyyttejä (1 x 10

6 solua /eläin) tai NK-solut (1 x 10

6 solua /pää) siirrettiin häntälaskimoon. Eloonjäämisaste seurattiin 80 päivän ajan.

**,

P

0,01,

***,

P

0,001 kontrolliin verrattuna.

Voit testata jos adoptiovanhemmat siirto CD8 T-lymfosyyttien ja NK-solut voitaisiin parantaa kolmoissidoksen aiheuttama selviytymisen heterotooppi- syövän eläinmallissa hiiriä, me ympättiin lisääntynyt määrä koolonkarsinoomasoluissa (1 x 10

6 solua /pää) hiiriin. Tässä mallissa vaikutusta kolmoissidoksen pienennettiin, vähentää eloonjäämisaste 40% 80 päivää (Fig. 7B). Näissä olosuhteissa adoptiovanhemmat siirto CD8 T-lymfosyyttien tai NK-soluissa suoritettiin. Adoptiovanhemmat siirto CD8 T-lymfosyyttien tai NK-soluissa lisäsi vain hieman selviytymistä mitoitettu aiheuttama kolmoisyhdistelmä annosta, kun taas yhdistetty adoptiovanhemmat siirto CD8 T-lymfosyyttien ja NK-solujen lisääntynyt dramaattisesti eloonjäämisaste (Fig. 7B). Nämä tulokset osoittavat, että sekä CD8 T-lymfosyytit ja NK-solut voivat parantaa eloonjäämisaste aiheuttama kolmoissidoksen heterotooppi- syövän eläinmallissa.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että anto kolmoisyhdistelmä synteettisen peptidin WKYMVm, MDC: t, ja 5-FU hankkii voimakas anti-syöpä immuniteetin. Yhden (WKYMVm, MDC: t, tai 5-FU) tai kahden (WKYMVm + MDC: t, 5-FU + WKYMVm tai 5-FU + MDC: t) hiirten laski hieman kasvaimen tilavuus, mutta anto kolmoissidoksen dramaattisesti inhiboi kasvaimen kasvua (kuvio . 1). Kasvaimen tilavuuden mittauksen tulokset korreloivat hyvin FAS ilmaisu, kaspaasi-3: n aktiivisuuden, ja TUNEL värjäys tuloksia (kuviot. 1 ja 2). Aiempien raporttien, IFN-γ tiedetään indusoida solukuoleman reseptoreihin, kuten FAS [22], [23]. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että hallinnon eri yhdistelmiä WKYMVm, 5-FU, tai MDC: t voivat indusoida IFN-γ ilmaisua, jossa kolminkertainen yhdistelmä aiheuttaa eniten parantaa IFN-γ tuotantoon (Kuva. 5A). Ilmentymistaso IFN-γ oli hyvin korreloi kasvaimen vastainen aktiivisuus kunkin yhdistelmän, mikä viittaa siihen, että IFN-γ aikaan antamalla kunkin aineen tai yhdistelmä on kriittisesti mukana kasvaimen vastaisen aktiivisuuden eläinmallissa.

IL-12 voi prime tai stimuloida CD4-T-solut, CD8-T-solujen ja NK-solujen [24], [25], [26]. Tässä tutkimuksessa vain tietyt yhdistelmät, nimittäin WKYMVm + MDC: t ja kolmoissidos voi aiheuttaa IL-12 ilmentyminen heterotooppi- syövän eläinmallissa (kuvio. 5B). Yhden anto WKYMVm tai MDC: t ei aiheuttanut IL-12 tuotantoa (kuvio. 5B). Tämä viittaa siihen, että stimulaatio MDC: t, joilla WKYMVm vastaa tehokas induktio IL-12: n eläinmallissa. Koska WKYMVm on ligandi FPR perheen, on todennäköistä, että aktivointi FPR perheen indusoi IL-12 lausekkeen MDC: t. Vuonna eloonjäämisaste kokeilu, kolminkertainen anto WKYMVm + 5-FU + MDC: t indusoi voimakkaan lisääminen eloonjääntiprosentin on heterotooppi- syövän eläinmallissa, mutta 5-FU + MDC hoito oli paljon pienempi vaikutus (Fig. 7). Koska IL-12 tuotanto on voimakkaasti indusoi kolmoissidoksen, mutta ei 5-FU + MDC: t (kuvio. 5B), se voi olla mahdollista, että kolmen aineen yhdistelmä parantaa eloonjäämisaste stimuloimalla liukoisten tekijöiden, kuten IL-12.

NK ja CD8-T-solut raportoitiin äskettäin olevan tärkeitä syövän regressio [27], [28], [29]. Tässä me osoitimme, että CD8 T- ja NK-solut rikastetaan kasvaimia, kun kolmoissidoksen annettiin (Fig. 3), ja CD8 T-solujen tai NK-solujen lisääntynyt kasvaimen kasvua (Fig. 4). Lisäksi, CD8-T-solujen tai NK-solujen vähensivät indusoi IFN-γ: n ja IL-12 (Fig. 5C-5F). Nämä tulokset osoittavat, että CD8-T-solut ja NK-solut ovat mukana kasvaimen vastaisen vaikutuksen kolmoissidoksen. Triple anto WKYMVm, MDC: t ja 5-FU myös esiin anti-etäpesäke vaikutuksen tuottamisessa heterotooppi- syövän eläinmallissa (Fig. 6). Laskimonsisäinen injektio ATRA-kationisen liposomin /IL-12 pDNA kompleksien on osoitettu parantaa kasvun estäminen metastaattisen keuhkosyövän hiirissä [30], joka tukee myös käsitystä, että IL-12-tuotantoa voidaan yhdistää anti-etäpesäkkeitä aktiivisuus kolmoissidoksen .

tässä tutkimuksessa osoitimme, että CD8-T-solujen ja NK-solujen tärkeitä rooleja siinä antituumorivaikutuksen kolmoissidoksen. Aiemmin raportoitu, että NK-solut ilmentävät funktionaalista FPR perhe, ja stimulaatio NK-solujen kanssa FPR agonistilla WKYMVm nostattaa IFN-γ tuotantoon [11]. Tässä tutkimuksessa havaittiin myös, että hiiren NK-solut ilmentävät FPR perheen, ja stimulaatio hiiren NK-solujen kanssa WKYMVm nostattaa IFN-γ (tuloksia ei ole esitetty). Tämä havainto selittää WKYMVm aiheuttama NK-solun aktivaation on olennaisesti tarvitaan antituumorivaikutuksen kolmoissidoksen vastaan ​​heterotooppisen syövän eläinmallissa. Mitä aktivaation CD8 T-solujen ja niiden rooli heterotooppi- syövän eläinmallissa, aiemmin olemme osoittaneet, että T-solut eivät ilmennä reseptorit WKYMVm [31]. Koska CD8 T-solut voidaan aktivoida MDC: t ja IL-12 [32], [33], se on järkevää ajatella, että hallinto kolmoissidoksen sisältäviä WKYMVm voi aktivoituvat CD8 T-solujen tulee välittyy MDC: t tai IL -12.

Yhteenvetona kolmoissidoksen immunoterapia MDC: t, synteettisen peptidin WKYMVm, ja 5-FU oli ylivoimainen yhden tai kahden hoidon estossa perustettu ensisijainen kasvaimia ja etäpesäkkeitä, sekä pidentää eloonjäämisen. Kasvu terapeuttista tehoa johtui vaikutuksia esiintyi paikallisesti (kohonneelta FAS ja kaspaasi-3: n ekspressio) ja systeemisesti (lisääntynyt IFN-γ: n ja IL-12). Siksi käyttö kolmoissidoksen hoito saattaa olla vaikutuksia kiinteiden kasvainten ja etäpesäkkeiden hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

Hiiret

Institutional Review Committee for Animal Care ja tipat Dong-A University erikseen hyväksynyt tämän tutkimuksen (hyväksyntä ID: DIACUC 07-6). Balb /c-hiiriä (uroksia, ikä 6-8 viikkoa) saatiin Jackson Laboratory.

Soluviljely ja materiaali

CT-26-soluja (CRL-2638; ATCC American Type Culture Collection ) ovat paksusuolen adenokarsinooma solulinja on peräisin Balb /c-hiirissä. CT-26-soluja ylläpidettiin RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), joka sisälsi 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia ja antibiootteja 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa kosteassa inkubaattorissa. Synteettinen peptidi, WKYMVm, syntetisoitiin Anygen (Kwangju, Korea). Puhtaus syntetisoitiin WKYMVm oli 98%. 5-FU hankittiin Choongwae, Pharma Co (Seoul, Korea).

DC valmistelu ja kypsymisen

Luuytimen soluja viljeltiin 5 päivää DC (RPMI 1640, väliaine, jossa oli 10 % FBS: ää, 2 mM L-glutamiinia, 50 uM β-merkaptoetanolia, antibiootteja) läsnä hiiren GM-CSF (1000 U /ml) ja IL-4 (500 U /ml), kuten on kuvattu [34]. GM-CSF: n ja IL-4 oli täydennetään päivänä 2 ja 4. Päivänä 5 solut kerättiin ja siirrettiin uuteen levy DC keskipitkän ja stimuloitiin lipopolysakkaridilla (100 ng /ml; Sigma), CpG-oligonukleotidin 1826 (10 ug /ml), ja CT-26 lysaattia (100 ug /ml) 2 päivää indusoida kypsymisen. Päivänä 7, DC kerättiin käytettäväksi rokotteina.

Kasvaimen kasvu ja eloonjääminen

mittaamiseksi kasvaimen kasvua, CT-26-soluja (5 x 10

5 solua 100 ul: ssa PBS) injektoitiin sc oikeaan kylkeen Balb /c-hiiriä (n = 8) päivänä -3. Päivinä 0 ja 1, 5-FU (100 ug /100 ui) injektoitiin s.c. Balb /c-hiirissä. Päivänä 2, hiiriä käsiteltiin neljä injektiota WKYMVm (100 ug /100 ui), ja MDC: t (1 x 10

6 solua) 12 h-välein. Päivinä 4 ja 5, 5-FU (100 ug /100 ui) injektoitiin s.c. Balb /c-hiirissä. Tämän jälkeen hiiriä käsiteltiin s.c. injektio 5-FU, MDC: t ja WKYMVm kerran viikossa 4 viikon ajan. Kasvaimen tilavuus määritettiin seuraavan kaavan mukaan: kasvainten (mm

3) = pituus (mm) x leveys (mm)

2/2 [35]. Lisäksi seurannan kasvaimen kasvua, hiiriä tarkkailtiin selviytymisen jälkeen, tuumorin istuttamisen ja hoitoon.

hematoksyliinillä ja eosiinilla ja immunofluoresenssivärjäyksen

Hiiret uhrattiin 42 päivää tuumorin istuttamisen jälkeen, ja kasvaimia kirurgisesti leikattiin , kiinteät 24 h 10% neutraaliin fosfaattipuskuriforaliinissa (NPS), upotettiin parafiiniin ja leikattiin ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla morfologinen analyysi. Immunovärjäystä, seuraavat ensisijaiset vasta-aineita käytettiin: anti- hiiri-Fas (Santa Cruz), anti-hiiri-katkaistuun kaspaasi-3 (Cell Signaling), FITC-konjugoitu anti-hiiri-CD3 (BD ​​Pharmingen), PE-konjugoitu anti-hiiri-CD4- (BD Pharmingen), PE-konjugoitu anti-hiiri-CD8 (BD Pharmingen), FITC-konjugoitu anti-hiiri-CD11 (BD Pharmingen), ja PE-konjugoidun anti-hiiri-DX5 (BD Pharmingen) vasta-ainetta. Sillä konfokaalimikroskopialla, kiinteän kasvaimen kudokset värjättiin FITC-konjugoidulla anti-hiiri-IgG ja Alexa 594-konjugoitua anti-hiiri-IgG: tä (BD Pharmingen).

In situ

TUNEL värjäys

Terminal deoksi-nucleotidyl välittämällä digoksigeniini-dUTP nick end merkintöjä (TUNEL) suoritettiin havaitsemiseksi apoptoottisten solujen kasvainkudoksessa. Parafiinisektioista poistettiin parafiini, sammutettua, käsiteltiin 3% H

2O

2 5 minuuttia, ja huuhdeltiin PBS: lla 15 minuutin ajan, ja

In situ

Death Detection Kit, POD, käytettiin (Roche, Penzberg, Saksa). Lyhyesti, digoksigeniini-dUTP end-leimattu DNA havaittiin anti-digoksigeniini-peroksidaasi-vasta-ainetta ja sen jälkeen peroksidaasilla havaitseminen diaminobentsidiinillä (DAB). Kudokset vastavärjättiin Mayerin hematoksyliinillä.

Entsyymi-immunologinen määritys (ELISA) B

Päivänä 42 verta kerättiin sydämestä hiirten ja kirkastettiin sentrifugoimalla. Seerumi varastoidaan -80 ° C: ssa, kunnes valmis sytokiinin analyysia. Hiiren IL-12 (p70) ja IFN-γ mitattiin käyttäen standardoitua sandwich-ELISA-menetelmällä (BD Biosciences Pharmingen).

In vivo

immuunijärjestelmän solujen osajoukko ehtyminen

heikentävistä CD4, CD8-T-solujen ja NK-solujen, hiiriä käsiteltiin vastaavalla vasta-aineella päivinä -1, 0 ja 5 (jossa päivä 0 päivä on ensisijainen kasvaimensiirrostuspäivänä). Monoklonaalinen rotan anti-hiiri-CD4 (klooni GK1,5), rotan anti-hiiri-CD8 (klooni 53-6.7) ja rotan anti-hiiri-asialoGM1 vasta-aineita käytettiin immunodepletion. Kun valkosolujen ehtyminen tutkimukset, 100 ug anti-CD4, anti-CD8, tai anti-asialoGM1-vasta-ainetta injektoitiin i.p. Balb /c-hiirissä.

keuhkometastaaseja

heterotooppisen keuhkometastaasitestissä kokeessa, CT-26-soluja (5 x 10

5 solua 100 ul: ssa PBS: ää) injektoitiin s.c. oikeaan kylkeen Balb /c-hiiriä (n = 8) päivänä -3. 5-FU, WKYMVm, ja MDC: t annettiin 3 viikkoa, kuten edellä on kuvattu koe, jossa mitattiin tuumorin tilavuuden. Päivänä 42 hiiret tapettiin ja kasvaimen kyhmyt keuhkojen pinnan havaittiin. Sillä metastaattinen eläinkoe, CT-26-solut pestiin kahdesti PBS: llä, ja injektoidaan häntälaskimoon Balb /c-hiiriä (2 x 10

5 solua 100 ul: ssa PBS: ää). 14 päivän jälkeen hiiret tapettiin ja keuhkojen punnittiin.

Adoptive siirto

saamiseksi CT26 kasvain-reaktiivisen CD8-T-solujen, Balb /c-hiiret immunisoitiin kolme kertaa (1-viikon välein) 1 x 10

7 CT26 kasvain lysaatit (sc injektio). On 21 päivä, immunisoidut hiiret tapettiin, ja CD8-T-solujen tai NK-solut eristettiin käyttäen CD8 T-solujen eristäminen kit tai NK-solun eristys-kittiä (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Saksa) niiden perna. Adoptiiviseen hoito, kasvaimia perustettu s.c. pistämällä 5 x 10

6 CT26 kasvainsoluja oikealla kylkeen Balb /c-hiirissä. Kouraantuntuva kasvaimet (-5 mm halkaisijaltaan) muodostetaan yleensä injektiokohdassa jälkeen 4-5 päivää. Ennen kolminkertainen yhdistelmähoito, puhdistettujen CD8 T (1 x 10

6 solua /100 ui) soluja tai NK (1 x 10

6 solua /100 ui) solut siirrettiin (iv injektio) ja CT26 kasvaimeen ladattu hiirillä ja sitten alkaa kolminkertainen yhdistelmähoito.

Tietojen analysointi

tulokset esitetään keskiarvona ± SEM kokeiden toisto. Erojen tilastollinen merkitsevyys määritettiin käyttäen ANOVA. Survival Aineisto analysoitiin log-rank-testi.

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Kiitokset

Kiitämme tohtori Min Sung Choi Sungkyunkwan yliopiston editointiavun.