Krooninen sairaus

tiivistelmä

Warburg vaikutus, yksi tunnusmerkkejä syöpäsoluja, on luonteenomaista metabolisen kytkin mitokondrion oksidatiivinen fosforylaatio aerobista Glykolyysivaiheen. Viime vuosina lisääntynyt ekspressiotaso pyruvaattikinaasia M2 (PKM2) on todettu olevan videojuttelun tehostettu aerobinen Glykolyysivaiheen syöpäsoluissa. Kuitenkin, ei ole estävänä aineena aerobinen Glykolyysivaiheen kohdistamalla PKM2. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että oleanolihapon (OA) aiheuttama siirtyminen PKM2 ja PKM1, ja johdonmukaisesti, kumotaan Warburg vaikutus syöpäsoluissa. Tukahduttaminen aerobinen Glykolyysivaiheen OA välittyy PKM2 /PKM1 kytkin. Lisäksi mTOR signalointi havaittiin inaktivoituu OA-käsiteltyjen syöpäsolujen, ja mTOR inhibition tarvitaan OA: n vaikutusta PKM2 /PKM1 kytkin. Vähentynyttä ilmentymistä c-Myc-riippuvainen hnRNPA1 ja hnRNPA1 oli vastuussa OA-indusoidun vaihtaa PKM-isoformien. Yhdessä tunnistimme, että OA on kasvainten vastainen yhdiste, joka estää aerobinen Glykolyysivaiheen syöpäsoluissa ja on mahdollista, että PKM2 voidaan kehittää tärkeä tavoite aerobinen Glykolyysivaiheen koulutusjakson kehittää uusia syövän vastaisia ​​aineita.

Citation: Liu J Wu N, Ma L, Liu M, Liu G, Zhang Y, et ai. (2014) oleanolihapon vaimentaa Aerobinen Glykolyysi syöpäsoluissa kytkemällä pyruvaattikinaasia tyyppi M isoformien. PLoS ONE 9 (3): e91606. doi: 10,1371 /journal.pone.0091606

Editor: Ming Tan, University of South Alabama, Yhdysvallat

vastaanotettu 6 marraskuuta, 2013 Hyväksytty: 12 helmikuu 2014; Julkaistu: 13 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat kansallisen innovatiivisen lääkekehityksen hankkeiden (2014ZX-09.102.043-001). Tutkimus myös tukee osittain National Foundation of Natural Sci. Kiinassa (81302906, 81273550 ja 41306157, https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Aerobinen Glykolyysivaiheen, joka tunnetaan myös nimellä Warburgin vaikutus, on perustettu tunnusmerkki syöpäsolujen [1]. Lähes kaikki syöpäsolujen muuttaa aineenvaihduntaan lisäämällä Glykolyysivaiheen ja tukahduttamalla mitokondrion oksidatiivinen fosforylaatio, jopa happiolosuhteissa (määritellään näin ollen aerobinen Glykolyysivaiheen) [2]. Monet glykolyyttisten välituotteita ovat välttämättömiä synteesiä varten molekyylien, joka on välttämätön solun rakenteita ja toimintoja, kuten nukleotidien, aminohappojen ja lipidejä. Siten erittäin lisääntyvien syöpäsolut täyttää vaatimukset solujen rakennusmateriaalien vaihtamalla niiden aineenvaihdunta hapettumisen fosforylaatiossa glykolyysistä, vaikka ATP tuotanto on tehottomampi glykolyyttisissä prosessissa.

PKM

geeni koodaa kahta proteiinia kinaasit, PKM1 ja PKM2, ja nämä kinaasit ovat vastuussa myös konversio fosfoenolipyruvaattia (PEP) ja pyruvaatti, joita voidaan käyttää maitohapon tuotantoon tai enterring mitokondrion oksidatiivinen fosforylaatio. PKM1 ja PKM2 syntyvät yksinoikeudella mRNA (eksoni 9 PKM1 ja eksonin 10 PKM2) [3]. https://en.wikipedia.org/wiki/PKM2 – cite_note-Corcoran-5PKM1 on katalyyttisesti aktiivisempi kuin PKM2. PKM2 ilmentyy kaikissa soluissa, joilla on korkea nukleiinihapon synteesi [4]. Syöpäsolut käyttää PKM2 kerääntyä välituotteiden synteesiä varten nukleiinihapon ja proteiinin ja ylläpitää aerobisen glykolyysin [5]. Lisääntyvä PKM2 toimintaa tai vaihtamalla mRNA välillä PKM2 ja PKM1 pystyy tukahduttamaan Warburg vaikutus, ja näin ollen, kompromissi kasvaimen kasvu [6]. Näin ollen, PKM2 uskotaan lupaava kohde alalla syövän hoidossa. Kuitenkin yhdisteet, jotka voivat lisätä suhde PKM1 ja PKM2 ei ole havaittu.

Oleanolic hapot (OA) on jaettu laajalti monissa kasveissa, ja se on hyvin dokumentoitu, että OA näyttää kasvaimen vastainen aktiivisuus erilaisia ​​ihmisen syöpäsoluja. Aiempi tutkimus laboratoriossamme ovat osoittaneet, että hoito ihmisen haiman yleiseurooppalaisen 28 syöpäsolujen johtaa apoptoosin kautta mitokondrioiden välittämää apoptoottista reittiin [7]. Toinen tutkimus paljastaa myös, että OA voi estää etäpesäkkeiden on glioomasoluihin [8]. Tavoite kuitenkin OA ei ole helposti tunnistettavissa. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että OA voi tukahduttaa aerobinen Glykolyysivaiheen tukahduttamalla PKM2 ilmaisua ja vaikuttaa

PKM

mRNA kautta mTOR /c-Myc /hnRNP signalointi.

menetelmät ja materiaalit

Soluviljely ja kemiallisten yhdisteiden

ihmisen eturauhaskarsinoomasolulinjaa linja, PC-3, ja ihmisen rintasyöpä, MCF-7, hankittiin American Type Culture Collection C (ATCC). PC-3-soluja viljeltiin RPMI-1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, GIBCO-BRL) 37 ° C: ssa kostutetussa 5% CO

2 kunnossa. MCF-7-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM).

oleanolihapon (OA) ostettiin Sigma Aldrich (O5504, St. Louis, MO). OA valmistettiin DMSO: hon pitoisuutena 10 mg /ml varastoliuosta.

Cell transfektio

Plasmidit, mukaan lukien pWZL Neo Myr Flag PKM2 ja pMXs-hcMYC saatiin Addgene (Cambridge, MA). pcDNA Flag GFP (Flag-GFP) säilyi laboratoriossamme ja käytettiin kontrollina. Cell transfektio suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, PC-3 tai MCF-7-soluja maljattiin 96-kuoppalevylle. Kun soluja viljellään noin 85% konfluenssiin, media korvattiin OPTI-MEM. Sitten, 3 ug plasmideja ja 30 ui Lipofectamine-reagenssia sekoitettiin putkeen, joka sisälsi 1500 ui OPTI-MEM vorteksoitiin voimakkaasti. Kun oli inkuboitu 15 minuutin ajan, seos lisättiin soluviljelmiin, ja inkuboitiin tiettyinä aikoina.

Immunoblottaus -määritykset

Solut kerättiin sentrifugoimalla 1000 g 10 minuuttia, ja hajotettiin M- PER Nisäkkäiden Protein Extraction Reagent (Thermo Scientific, IL). Proteiinikonsentraatiot määritettiin käyttäen BCA-proteiinimäärityksellä kit (Thermo Scientific, FL). Proteiinin kokonaismäärän erotettiin elektroforeesissa 10-12% polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin 0,45 um nitroselluloosakalvoille. Membraaneja inkuboitiin blokkausliuoksessa (PBS, 0,1% Tween-20 ja 5% rasvatonta maitojauhetta) ja 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ja sitten niitä inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla (1:1000). Inkubaation jälkeen yön yli, kalvot pestiin PBS: llä, joka sisälsi 0,1% Tween-20 kolme kertaa, ja sitten inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (IgG vuohen anti-kani tai anti-hiiri, 1:2000, Bio-Rad , CA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Proteiinivyöhykkeet visualisoitiin SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (Thermo Scientific, IL). Intensiteetti blotit kvantitoitiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa.

primaaristen vasta-aineiden, joita käytetään myös tutkimuksessa olivat seuraavat: PKM1 (# 7067, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), PKM2 (# 4053, Cell Signaling Technology , Danvers, MA), β-tubuliinia (# 2146, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), Phospho-mTOR (Ser2448) (# 2971, Cell Signaling Technology, Danvers, MA); mTOR (# 2983, Cell Signaling Technology, Danvers, MA); c-Myc, (sc-40, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas); hnRNP A1 (# 8443, Cell Signaling Technology, Danvers, MA); hnRNP A2 (# 9304, Cell Signaling Technology, Danvers, MA).

Immunofluoresenssianalyysi

PC-3 ja MCF-7-soluja (5 x 10

4 /kuoppa) maljattiin 24-kuoppaisille levyille, ja sitten, OA (100 ug /ml) lisättiin. Kun 6 tunnin inkuboinnin jälkeen solut kiinnitettiin 4% Polyoxymethylene 0,5 tunnin ajan, jonka jälkeen inkuboitiin PKM2 vasta-aineella (1:1000) 2 tunnin ajan. Vastaava sekundäärinen vasta-aine lisättiin ja inkuboitiin vielä 1 h visualisoida PKM2. 4 ’, 6’-diamino-2-fenyyli (DAPI) käytettiin värjäämään ytimet. Fluoresenssi havaittiin alle -konfokaalimikroskoopilla (CLS-2SS, Thorlabs).

Metabolinen Analyysit

Analyysit O

2 sisältöä, pyruvaattikinaasin (PK) aktiivisuus, glukoosin oton, laktaatti tuotanto, ja solujen hengitys käytettiin tutkia muutoksia aineenvaihdunnan kytkin syöpäsoluissa käsitelty OA. Pyruvaattikinaasipromoottoriin (PK) Assay Kit (ab83432, Abcam) ja OX-500 O

2 Mikrosensorilaboratorio (Unisense, Tanska) käytettiin määrittämään PK toimintaa ja O

2 sisältöä, vastaavasti, PC-3 ja MCF -7 käsitelty solu OA, seuraten valmistajan ohjeita.

mittaamiseksi glukoosin oton, PC-3 ja MCF-7 ympättiin tiheydellä 5 x 10

3 solua /kuoppa 96- kuoppalevyille. Inkubaation jälkeen yön yli, solut transfektoitiin tiettyjen plasmidit tai käsitelty MHY1485. Sitten soluja käsiteltiin 50 tai 100 ug /ml OA, vastaavasti. Kun oli inkuboitu 6 tai 12 tunnin ajan, elatusaineet kerättiin sentrifugoimalla 3000 g 15 minuuttia. Glukoosin määrä kulutuksen testattiin syövän solujen havaitaan käyttämällä glukoosin imeytymisen Kolorimetrinen Assay Kit I (# K676, BioVision, Milpitas, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Imeytymistä tiheys (OD) 412 nm: ssä luettiin käyttäen BioRad680 mikrolevylukijaa (Bio-Rad, Hercules, CA).

maitohapon tuotantoon määritettiin käyttämällä laktaatti Kolorimetrinen Kit II (# K627, BioVision , Milpitas, CA), kuten valmistajan protokollia. Lyhyesti, PC-3 ja MCF-7-soluja käsiteltiin pWZL Neo Myr Flag PKM2, pMXs-hcMYC ja pcDNA Flag GFP 72 tuntia tai MHY1485 1 tunnin ajan, vastaavasti. OA lisättiin ilmoitettuina pitoisuuksina ja inkuboitiin osoitetut ajat. Sitten elatusaineet kerättiin sentrifugoimalla 3000 g: ssä 15 minuutin ajan, sekoitettiin 45 ul: aan laktaatti testipuskuria. Absorbanssi 450 nm: ssä luettiin käyttäen BioRad680 mikrolevylukijaa (Bio-Rad, Hercules, CA).

hapenkulutus tutkittiin käyttäen hapenkulutuksen Assay Kit (# 600800, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI) valmistajan ohjeita. VICTOR X3 Multilabel Plate Reader (Perkin Elmer) käytettiin havaitsemaan OD-arvo 650 nm: ssä. Hapenkulutuksen on esitetty eliniän ajan funktiona (us /h).

Colony muodostumisen määritys

PC-3 tai MCF-7-solut maljattiin 6-kuoppalevylle, ja transfektoitiin plasmideilla, kuten pWZL Neo Myr Flag PKM2 ja pcDNA Flag GFP. Kun oli inkuboitu tiettyinä aikoina, solut trypsinoitiin, suspensoitiin DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää, maljattiin alemman kerroksen, joka sisältää 0,6% agaria ja peitetään pintakerros, joka sisälsi 0,6% agaria. Soluja viljeltiin 6-kuoppaisen levyn ja median muutettiin viikoittain. Kun oli inkuboitu 10 päivää, kristalliviolettia lisättiin ja pesäkkeiden lukumäärä laskettiin ja analysoitiin ImageJ ohjelmiston.

Tilastollinen analyysi

kokeissa paitsi immunoblot-määritykset suoritettiin vähintään kolme kertaa. Kaikki arvot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD, ja sitä verrataan tiettynä ajankohtana pisteen pariton, kaksisuuntainen t-testi. Tiedot katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä, kun p 0,05 (*) ja p 0,01 (**).

Tulokset

OA Estää Aerobinen Glykolyysi syöpäsoluissa

Aerobinen Glykolyysivaiheen on ominaista lisääntynyt glukoosin oton ja laktaatintuotto, ja vaarantaa hapenkulutus syöpäsoluissa korkean käytettävyyden hapen. Siksi mittasimme OA: n vaikutusta näiden toimintojen syöpäsolun. Alennettu glukoosin kulutus havaittiin useita erilaisia ​​syöpäsoluja, kun OA lisättiin viljelmiin (Fig. 1A). Tuotannon maitohapon näissä syöpäsoluissa havaittiin myös pienentää käsitellyissä soluissa OA (Fig. 1 B). Lisäksi OA parannettu kulutus hapen syöpäsoluissa (Fig. 1 C). Yllä olevat tiedot osoittavat, että OA: n kykeni indusoimaan metabolisen muutoksen syöpäsolujen tukahduttamalla aerobinen Glykolyysivaiheen.

glukoosinkulutus (A), maitohapon tuotanto (B) ja hapenkulutuksen (C) arvioitiin PC- 3 ja MCF-7-soluja käsiteltiin 50 tai 100 ug /ml OA: 6 tai 12 tunnin ajan vastaavasti. Yksityiskohdat menetelmistä on kuvattu osassa Materiaalit ja menetelmät. Suhde kunkin ryhmän valvontaa esitettiin täällä. Palkit osoitti keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta (keskiarvo ± SD). *, P 0,05; **, P 0,01.

Lisäksi vertasimme O

2-pitoisuus syöpäsolujen kanssa tai ilman OA hoitoa. Tiedot osoittivat, että OA ei ole vaikutusta hapen pitoisuus soluviljelmässä, mikä sulkee mahdollisuus, että OA johtaa metaboliseen muutos vaikuttamalla normic olosuhteissa (kuva S1).

OA Indusoi Siirtyminen PKM2 kohteeseen PKM1 ja lisätä PK toiminta syöpäsoluissa

pyruvaattikinaasia lihaksen isoentsyymin 2 (PKM2), joiden entsymaattinen aktiivisuus on vähemmän aktiivinen kuin PKM1, vastaa muuntaminen phosphopyruvate pyruvaatiksi glykolyyttisessä prosessissa. PKM2, varsinkin sen dimeerisessä muodossa, kertyy glykolyyttisiä välituotteiden ja kanavat heidät biosynteesiä nukleotidin ja aminohappoja, mikä edistää solujen kasvua. PKM2 on havaittu olevan erittäin ilmentyy kaikissa lisääntyvien solujen, kuten kasvainsolujen [4]. Tunnistamaan mekanismeja OA vaikuttaa aerobinen Glykolyysivaiheen, me myöhemmin arvioitiin muutoksia ilmentymistason PKM1 ja PKM2 syöpäsoluissa käsitelty OA. Immunoblot-analyysi osoitti, että OA pystyi alentamaan PKM2 runsaus, ja lisätä PKM1 ilmaisun, sekä PC-3 ja MCF-7cancer solulinjoja, annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (Kuva. 2A ja 2B). Väheneminen PKM2 ilmentyminen havaittiin myös immunofluoresenssivärjäyksellä kokeissa. Syövän solujen OA alas-säännelty PKM2 ilmentymistä merkittävästi sekä PC-3 ja MCF-7-solut (Fig. 2C). Lisäksi PK-aktiivisuus osoitettiin olevan koholla OA-käsiteltyjen syöpäsolujen, sekä siirtyminen PKM2 ja PKM1 (kuvio S2A ja S2B).

PKM1 ja PKM2 ekspressiotaso arvioitiin immunoblot-määritykset PC- 3 ja MCF-7-solut, joita käsiteltiin 10, 25, 50100 ug /ml OA vastaavasti 12 h (A) tai 100 ug /ml OA: ssa 0,5, 1, 2, 3, 6, 12 h vastaavasti (B). β-tubuliinia käytettiin endogeenisen viittauksia. (C) PKM2 tasot (Green) oli PC-3 ja MCF-7-soluja käsiteltiin 100 ug /ml OA: ssa 12 tunnin ajan vastaavasti, määritettynä immunfluorescent värjäys. Ytimet (sininen) värjättiin DAPI. Sulautuneella kuvat on esitetty paneelin alaosassa. Fluoresenssin intensiteetti kvantifioitiin ImageJ ohjelmisto. Suhde kunkin ryhmän valvontaa esitettiin täällä. Palkit edusti keskiarvot 5 satunnaisesti valitun kokeita.

kasvusta PK Activity aiheuttamat PKM2 /PKM1 kytkin välittää OA tukahduttaminen Aerobinen Glykolyysi

Perustuen havaintoon, että siirtyminen PKM2 ja PKM1 tapahtuu syöpäsoluissa käsitelty OA, me myöhemmin tutkittiin miten increaed PK toiminnan OA tukahduttaminen aerobinen Glykolyysivaiheen. PC-3-solut transfektoitiin PKM2- tai GFP-ilmentävällä vektorilla ennen OA stimulaatiota (Fig. 3A). OA-indusoitu kasvu PK aktiivisuuden pelastettiin PKM2 yli-ilmentyminen PC-3-soluja (kuvio S3). Tulokset osoittivat myös, että glukoosin kulutuksen laktaattituotanto sekä hapenkulutus olivat kaikki palautettiin soluissa yliekspressoivat PKM2 (Fig. 3B, 3C ja 3D). Tulokset viittaavat siihen, että lisääntynyt PK aktiivisuus johtuu PKM2 /PKM1 kytkin tarvitaan estävää vaikutusta OA aerobista Glykolyysivaiheen syöpäsoluissa.

(A) OA-käsitelty PC-3-solut transfektoitiin pWZL Neo Myr Flag PKM2 (Flag-PKM2) tai kontrollivektorille (Flag-GFP). Immunoblot-määritykset suoritettiin ekspression määrittämiseksi PKM2 proteiinia. β-tubuliinia käytettiin endogeenisen viittauksia. Glukoosin kulutus (B), maitohapon tuotanto (C) ja hapenkulutuksen (D) arvioitiin PC-3-soluja käsiteltiin 100 ug /ml OA: ssa 12 tunnin ajan. Yksityiskohdat menetelmää kuvataan osassa Materiaalit ja menetelmät. Suhde kunkin ryhmän valvontaa esitettiin täällä. Palkit osoitti keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta (keskiarvo ± SD). *, P 0,05; **, P 0,01.

OA Vastustamisesta mTOR välittää Alteration Expression profiilit PKM isoformien ja metabolinen Switch syöpäsoluissa

Olimme kiinnostuneita siitä, miten OA indusoi vähennys siirtyminen PKM2 ja PKM1 syöpäsoluja. mTOR signalointi on osoitettu osallistua kytkin PKM isoformien syöpäsoluissa [9]. Siksi olemme havainneet muutokset aktiivisen tilan mTOR OA-käsiteltyjen syöpäsolujen. Immunoblottaus paljasti, että mTOR aktivaatio väheni, kun OA lisättiin viljelmään syöpäsolujen (Fig. 4A). Uudelleenaktivointi mTOR by MHY1485 suojattu syöpäsolujen OA välittämää lasku PKM2 ilmaisun ja nousu PKM1 tasoilla (Fig. 4B). Meidän lisäksi tutkimus osoitti, että glukoosi kulutuksen laktaattituotanto ja hapenkulutuksen myös palautettu käsitellyissä soluissa MHY1485 (Fig. 4C, 4D ja 4E). Tuloksena paljastaa, että mTOR on vastuussa OA indusoi kytkin PKM-isoformien ja aineenvaihduntaa.

(A) tasot fosforyloitua mTOR tutkittiin PC-3 ja MCF-7-soluja käsiteltiin 50 tai 100 ug: /ml OA 6 tai 12 tuntia vastaavasti määritettynä immunoblot määrityksiä. β-tubuliinia käytettiin endogeenisen viittauksia. (B) immunoblot-analyysi PKM1 ja PKM2 ekspressio tehtiin PC-3-soluja inkuboitiin OA (100 ug /ml) ja /tai mTOR-aktivaattori MHY1485 (2 uM). Glukoosin kulutuksen (C), maitohapon tuotanto (D) ja hapenkulutuksen (E) havaittiin PC-3-soluja käsiteltiin OA (100 ug /ml) ja /tai MHY1485 (2 uM) 12 tunnin ajan. Suhde kunkin ryhmän valvontaa esitettiin täällä. Palkit osoitti keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta (keskiarvo ± SD). *, P 0,05; **, P 0,01.

OA aiheuttama mTOR Suppression Indusoi Switch on PKM isoformien estämällä c-Myc-riippuvaisen hnRNPA1 ja hnRNPA2 Expression

mTOR on osoitettu nostaa PKM2 tason stimuloimalla c-myc-riippuvainen hnRNPA1 ja hnRNPA2 ilmaisun [9], jotka molemmat ovat vastuussa yksinomaan silmukoinnin PKM mRNA [3]. Olemme myöhemmin määritetään vaikutus OA: n ekspressioon hnRNPA1 ja hnRNPA2. Tulokset osoittivat, että OA voi vähentää ekspressiotaso c-Myc, sekä sen kohdegeenin hnRNPA1 ja hnRNPA2 ilmentymistä (Fig. 5A). mTOR-välitteistä aktivoitumista MHY1485 pystyi palauttamaan ilmaisu c-Myc, hnRNPA1, ja hnRNPA2 OA-käsiteltyjen syöpäsolujen (Fig. 5B). Lisäksi transfektio OA-käsiteltyjen syöpäsolujen kanssa ilmentävien plasmidien c-Myc kumosi OA: n vaikutusta muutoksen PKM1 ja PKM2 ilmaisuja (Fig. 5C). Tulokset viittaavat siihen, että OA: n voi aiheuttaa PKM2 /PKM1 kytkin kautta c-Myc-riippuvainen hnRNPA1 ja hnRNPA2 mTOR signaalireitin.

(A) ilmentyminen c-Myc, hnRNPA1 ja hnRNPA2 määritettiin immunoblot-analyysillä PC -3 ja MCF-7-soluja käsiteltiin 50 tai 100 ug /ml OA: 6 tai 12 tunnin ajan vastaavasti. (B) toinen expressionof c-Myc, hnRNPA1 ja hnRNPA2 ilmentyminen määritettiin immunoblot-analyysillä PC-3-soluja käsiteltiin OA (100 ug /ml) ja /tai MHY1485 (2 uM), vastaavasti. (C) taso c-Myc, hnRNPA1, hnRNPA2, PKM1 ja PKM2 määritettiin immunoblot-määrityksiä PC-3-soluja käsiteltiin plasmideilla pMXs-hcMYC (Flag-cMyc) läsnä ollessa tai poissa ollessa OA. β-tubuliinia käytettiin endogeenista viittauksia.

Alennettu Aerobinen Glykolyysi osittain selittää antituumorivaikutuksen OA

Puhuttaessa osuus heikentynyt aerobinen Glykolyysivaiheen kasvaimen suppressoriaktiivisuutta OA syöpäsolujen havaitsimme muutokset pahanlaatuinen fenotyypit OA stimuloiman syöpäsolujen joka vielä koki aerobinen Glykolyysivaiheen takia PKM2 yli-ilmentymisen. OA havaittiin kasvun vähentämiseksi PC-3-solut (Fig. 6A). Myös pesäkkeiden lukumäärä on muodostettu PC-3-soluissa on myös laskenut alle hoitoon OA (OA + GFP ryhmä) (Fig. 6B). Kuitenkin PKM2 palauttaminen merkittävästi poisti OA: n vaikutusta syöpäsolujen, osoituksena nousu kasvu ja lukumäärän muodostivat pesäkkeitä PC-3-solujen yhteistyötä käsitelty OA ja PKM2 ilmentäviä vektoreita (OA + PKM2 ryhmä) ( Fig. 6A ja 6B).

(A) PC-3-solut laskettiin 12, 24, 36 ja 48 tuntia käsittelyn jälkeen OA (100 ug /ml) ja /tai MHY1485 (2 uM) käyttäen hemacytometry. Keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeet on esitetty keskiarvona ± SD. **, P 0,01. Edustaja luku osoitettiin kullekin ryhmälle. (B) Soluja käsiteltiin OA (100 ug /ml) ja /tai MHY1485 (2 uM) ja 10 päivää, pesäkkeiden määrä PC-3-solut laskettiin ja analysoitiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa. Edustaja luku osoitettiin kullekin ryhmälle. (C) OA estää aktivoitumisen mTOR syöpäsoluissa. Tämä estävä vaikutus mTOR signalointi puolestaan ​​kumottu c-Myc /hnRNPA1 /hnRNPA2 riippuvan PKM2 ilme. Näin ollen aerobinen Glykolyysivaiheen estyi syöpäsoluissa käsitelty OA.

Yhteenvetona OA tukahduttaa aktivointi mTOR signaloinnin syöpäsoluissa. Puolestaan ​​inhiboiva vaikutus OA mTOR polku johtaa siirtyminen PKM2 ja PKM1 ilmentymisen, mikä välittyy c-Myc /hnRNPA1 /hnRNPA2 kautta. Lopulta aerobinen Glykolyysivaiheen tukahdutettiin OA-käsiteltyjen syöpäsolujen (Fig. 6C).

Keskustelu

OA, luonnollinen yhdiste laajalti kasveissa, on dokumentoitu omaavan erilaisia ​​bioaktiivisuuksiin mukaan lukien anti-kasvain ominaisuus [10]. Mekanismit OA: n antituumorivaikutuksen liittyy apoptoosin induktio, solusyklin pysähtymiseen ja etäpesäkkeiden estäminen [7], [8]. Kuitenkin vaikutus OA Aineenvaihduntareiteistä syöpäsoluissa on vielä epäselvä. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että OA pystyi tukahduttamaan Warburg vaikutus syöpäsolujen osoituksena lisääntynyt hapen kulutusta, vähentää laktaatin tuotantoa ja alentaa glukoosin sisäänoton (Fig. 1A-1C). Tietääksemme tämä on ensimmäinen kerta paljastaa, että OA vaikuttaa metabolisen kytkin syöpäsoluja. Meidän havainto saattaa auttaa ymmärtämään OA toimia syöpäsoluja ja auttaa kehittämään OA ja sen johdannaiset tehokkaampi tehon kliiniseen käyttöön.

Aerobinen Glykolyysivaiheen uskotaan olevan uusi, tärkeä ja tehokas tavoite syövän kemoterapiassa. Lisääntyvä todisteet osoittavat, että aerobinen Glykolyysivaiheen on keskeisessä asemassa puhkeamisessa ja etenemisessä pahanlaatuisia sairauksia. Useita yhdisteitä on raportoitu tukahduttaa syöpäsolujen kasvua vaikuttamalla aerobinen Glykolyysivaiheen [11] – [15]. Esiintymien, ote Spatholobus suberectus on osoitettu estävän aktiivisuuden laktaattidehydrogenaasin A (LDHA), samalla poistetaan aerobisen glykolyysin rintasyöpäsoluissa [13]. Anti-inflammatoriset yhdiste, kurkumiini, on hiljattain osoitettu, kääntää Warburgin aiheuttamaa tuumorinekroositekijä (TNF) stimulaation rintasyöpäsoluissa [14]. Tutkimuksemme vahvisti, että OA myös hallussaan inhibitive toimintaa aerobista Glykolyysivaiheen. Tutkimus lisää ymmärrystä syövän vastaisen mekanismi OA.

Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että PKM2 avainasemassa aerobista Glykolyysivaiheen syöpäsoluissa [3]. Tässä tutkimuksessa, huomasimme, että PKM2 ilmaisua voidaan estää soluissa käsitelty OA annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (Kuva. 2A-2C). Vielä tärkeämpää on, lisääntynyt PK toimintaa, koska PKM2 /PKM1 kytkin, välittämä vaikutus OA aerobista Glykolyysivaiheen syöpäsoluissa, koska vähentämällä PK-aktiivisuuden yli-ilmentää PKM2 tasolla syöpäsoluja poistetaan OA aiheuttaman metabolisen kytkin (Fig. 3A-3D ). OA on siis tunnistettu ensimmäinen yhdiste vähentää PKM2 runsaus, ja kykenee sen vaikutus aineenvaihduntaan syöpäsoluissa kautta uusi tavoite. Siksi me alustavaan todisteita siitä, että kohdistaminen PKM2 voi olla uusi strategia syövän kehittymiseen aineita ja OA voi olla johtoa yhdiste kehittää syöpälääkkeet kohdistaminen PKM2.

Poikkeava aktivointi mTOR signalointi läheisesti osallisena erilaisia ​​syöpiä [16]. mTOR aktivointi edistää vastustuskykyä syövän solujen indusoiman apoptoosin sekä sytokiinien ja kemoterapeuttiset aineet, kiihdyttää leviämisen monenlaisia ​​syöpäsoluja, ja helpottaa etäpesäkkeiden [16]. Useimmat nykyiset mTOR-inhibiittorit tukahduttaa syöpäsolujen kasvua pääasiassa indusoimalla apoptoosia ja solusyklin pysähtymiseen, tai rajoittavan etäpesäkkeiden [17] – [19]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että OA vähentää ekspressiotason fosforyloitu mTOR syöpäsoluissa (Fig. 4A), joka liittyy sen inhiboivaa aktiivisuutta aerobista Glykolyysivaiheen. Äskettäin, mTOR signalointi on osoitettu moduloivan metabolinen kytkin syöpäsoluja ja tämä vaikutus välittyy muutoksesta PKM2 ilmaisun [14], [20], [21]. Lisäksi mTOR /PKM2 reitti on vastuussa, ainakin, maksan tuumorigeneesin [22]. Nämä uudet havainnot viittaavat siihen, että kohdistaminen aineenvaihdunta voi olla uusi strategia mTOR-estäjän tukahduttaa kasvun syöpien.

Yhdessä olemme osoittaneet todisteita siitä, että OA saattoi siirtyä aineenvaihdunnan kuvioita aerobinen Glykolyysivaiheen ja oksidatiivisen fosforylaation kautta vaikuttavia mTOR /c-Myc /PKM2 reitin syöpäsoluissa. Ottaen huomioon sen alhainen myrkyllisyys normaaleissa kudoksissa, OA ja sen analoges saattaa olla lupaava ehdokas agentti kehittää syöpälääkkeiden kohdistaminen aineenvaihduntaa. Tutkimuksemme edistää parempaa ymmärrystä mekanismi OA: n antitumor omaisuutta, ja myös tutkimus antaa ensisijaista näyttöä, että PKM2 voidaan valita kriittinen terapeuttinen tavoite aerobinen Glykolyysivaiheen väylän kehittää uusia syöpälääkkeiden.

tukeminen Information

Kuva S1.

OA ei vaikuta happipitoisuus soluviljelmässä. PC-3 ja MCF-7-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman OA 12 tunnin ajan. O

2 pitoisuus havaittiin tällä ilmoitettuina ajankohtina. Keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeet on esitetty keskiarvona ± SD.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0091606.s001

(PPT)

Kuva S2.

OA Inkubaation aiheuttama korkeus PK aktiivisuutta syöpäsoluissa. (A) PC-3 ja MCF-7-soluja käsiteltiin OA osoitetussa annokset ja PK-aktiivisuus määritettiin 12 tuntia OA-käsittelyn jälkeen. Keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeet on esitetty keskiarvona ± SD. *, P 0,05, **, P 0,01. (B) aktiivisuus PK arvioitiin myös syöpäsoluja altistetaan 100 ug /ml OA osoitetuissa aikapisteissä. Keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeet on esitetty keskiarvona ± SD. *, P 0,05, **, P 0,01.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0091606.s002

(PPT) B Kuva S3.

PKM2 yliekspressio pelastaa nousu PK indusoimaa PKM2 /PKM1 kytkin. PK-aktiivisuus arvioitiin OA-käsitelty PC-3-solut transfektoitiin PKM2- tai GFP-ilmentävällä vektorilla, 12 tuntia käsittelyn jälkeen 100 ug /ml OA. Keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeet on esitetty keskiarvona ± SD. *, P 0,05.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0091606.s003

(PPT) B