Krooninen sairaus

tiivistelmä

sairastuvuus ja kuolleisuus eturauhassyövän (PCA) ovat viime vuosina lisääntyneet maailmanlaajuisesti. Tällä hetkellä olemassa olevat menetelmät diagnosointiin ja hoitoon ei tee tilannetta parantaa, erityisesti hormoniresistentti eturauhassyöpä (HRPC). Puute molekyylinäytteitä PCA haitannut varhainen diagnosointi etäpesäkkeiden ja tarkka lavastus PCA. Tässä työssä olemme kehittäneet uuden aptameeriin koetin Wy-5a vasten PCa solulinjaa PC-3 solu-SELEX tekniikalla. Wy-5a esittää erittäin spesifinen kohdesolujen kanssa dissosiaatiovakiot nanomoolialueella, ja ei tunnista muita testata Eturauhassyövän solulinjojen ja muiden testattujen kasvainsolulinjoissa. Värjäytyminen kliininen kudosleikkeiden kanssa fluoresoivalla leimatun Wy-5a osoittaa, että osat korkean riskiryhmän metastasiaa näytteillä vahvempi fluoresenssia ja osastoja eturauhasen hyvänlaatuinen liikakasvu (BPH) eivät osoittaneet merkittäviä fluoresenssia, mikä viittaa siihen, että aptameeriin Wy-5a voi sitoutua proteiini liittyvät etenemistä PCa. Korkea affiniteetti ja spesifisyys Wy-5a tekee aptameeriin hold sovellusmahdollisuudet diagnosoinnissa ja kohdentaa hoito Eturauhassyövän.

Citation: Wang Y, Luo Y, Bing T, Chen Z, Lu M, Zhang N, et ai. (2014) DNA aptameeriin Evolved Cell-SELEX for Recognition Eturauhassyöpä. PLoS ONE 9 (6): e100243. doi: 10,1371 /journal.pone.0100243

Editor: Sabato D’Auria, CNR, Italia

vastaanotettu: 18 tammikuu 2014; Hyväksytty: 23 toukokuu 2014; Julkaistu: 23 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat tunnustaa taloudellisen tuen National Natural Science Foundation of China (81172430, 81372728, 21205124 ja 81201694) ja Grant 973 Program (2011CB935800) ja Erikoistunut Research Fund tohtorikoulutuskeskukseen of Higher Education of China (20120171120059). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on yleisin ei-ihon kasvaimen miespuolisesta väestöstä ympäri maailmaa [1]. Viime aikoina useat tutkimukset ovat osoittaneet, että tapaus Eturauhassyövän on huomattavasti suurempi kuin kaksikymmentä vuotta sitten [2]. Päivitys tilastot osoittavat, että sairastuvuus Eturauhassyövän on ylittänyt keuhkosyöpää ja tullut yleisin pahanlaatuinen kasvain miehillä. Yli 238590 miehiä diagnosoidaan PCa ja 29720 kuolee metastaattisen PCa Yhdysvalloissa (US) vuonna 2013, mikä tekee siitä toiseksi suurin syy syövän kuolemaan American men, takana keuhkosyövän [3]. Valitettavasti useimmat PCa potilaat Aasiassa oli edennyt paikallinen tauti tai etäpesäkkeitä, kun he olivat diagnosoitu, ja kuolleisuus Eturauhassyövän voi jatkaa nousuaan useimmissa Aasian maissa. Tämä saattaa johtua muutoksista elämän tai ruokavalion tyyli ja ympäristö [4].

Suorituskyky PCA alkuvaiheessa ilmentää suhteellisen veltto hoito useimmilla potilailla [5]. Tämä ominaisuus tehty PCa vaikea huomataan ja diagnosoitu varhaisessa vaiheessa. Kun potilaat ovat kipu, useimmat niistä ovat tapahtunut luun etäpesäke. Aluksi useimmat PCa potilaat ovat herkkiä androgeenien puute hoitoa (ADT), mutta kesto on heterogeeninen, se voi kestää muutamasta kuukaudesta yli 3 vuotta [6]. Lopulta PCA saattaa kehittyä hormoniresistentti Eturauhassyöpä (HRPC), joka on vastustuskykyinen tavanomainen hoito. Onnistunut syövän hoito perustuu varhaisen diagnoosin ja tarkka lavastus, jotka molemmat vaativat sopivia molekyylinäytteitä ja biomarkkerit [7]. Lisäksi molekyylitasolla erot päättää fenotyyppi; yksilöllisten perustuu näiden eri biomarkkereiden diagnosoida ja erottaa tarkasti. Mutta puute molekyylinäytteitä PCA solujen haitannut varhainen diagnosointi etäpesäkkeiden ja tarkka lavastus PCA. Seerumin prostataspesifisen antigeenin (PSA) on biomarkkeri PCa, ja sitä on laajalti käytetty havaitsemiseen PCa. Pitoisuus PSA liittyy myös pahanlaatuinen asteen ja kasvaimen uusiutumisen. PSA ei kuitenkaan ole spesifinen merkki PCa lähtien suurenna seerumin kanssa eturauhasen hyvänlaatuinen liikakasvu (BPH) ja vaikuttavat monet tekijät, kuten lääkitys (Finasteridi), urologic manipulointia, tulehdus tai jopa siemensyöksy [8], [9] . Vaikka yhdessä yleistymistä seulonnasta prostataspesifisen antigeenin (PSA) testaus, diagnostista korko ja varhainen hoito paransi nopeasti, mutta kliinisessä tutkimuksessa Amerikassa ja Euroopassa osoittavat seulonta ei ole tehokasta vähentämiseen kuolleisuutta PCA [ ,,,0],10], [11]. Joten parantaa kliinisen luokittelun ja henkilökohtainen kemoterapiaa, se on vielä löytää uusia biomarkkereita tai antureista enemmän spesifisyys.

Äskettäin uuden luokan molekyylinäytteitä kutsutaan aptameeriin on herättänyt paljon huomiota molekyylikoettimina taudin diagnosointiin ja terapiassa. Aptameerit ovat yksijuosteisia oligonukleotideja, jotka voisivat taita ainutlaatuinen tertiaarirakenteisiinsa erilaisten molekyylin sisäisiin vuorovaikutuksiin [12]. Samanlainen vasta-aineita, jotka ovat villisti käytetään klinikalla, aptameerit voivat sitoutua spesifisesti eri tavoitteita, jotka vaihtelevat pienistä orgaanisten molekyylien proteiineihin [13], [14]. Vertaamalla vasta-aineet, aptameerit on pienen molekyylipainon omaava, suurempi stabiilius, nopea kudospenetraatio, immunogeenisuuden puuttuminen [15] – [18], ja erityisesti, aptameerit voidaan syntetisoida kemiallisesti ja muunnetut [19]. Nämä edut tekevät Aptameerien monipuoliset työkalut diagnostiikkaan [20], Image Cytometry [21] ja kohdennettuja terapeuttisia [22].

Aptameerit syntyvät SELEX tekniikka (Systematic Evolution of Ligands by Eksponentiaalinen rikastamiseen) [20], [23]. Cell-SELEX on aptameeri valintamenettely käyttäen kokonaisia ​​soluja, kuten kohde, joka tuottaa solu-spesifinen aptameerit käyttämällä eroja molekyylitasolla tahansa kahden solulinjojen [19], [24] – [27]. Cell-SELEX, paneeli Aptameerien jotka specically sitoutuvat kohdesolulinjana voidaan tunnistaa ilman etukäteen tietämättä tarkkaa kalvon proteiineja. Prosessissa rikastamiseen, elävien solujen vakuuttaa tavoitteet olemassa kalvon pitää luonteeltaan muodostumista, joten saatu aptameerit ylläpitää sama affiniteetti ja spesifisyys niiden solujen sovelluksissa [28]. Tässä artikkelissa, me kuvataan aptameeriin valinta vastaan ​​PC-3-solut (PCA solulinja). Kautta solu-SELEX tunnistimme DNA aptameeriin, joka sitoutuu spesifisesti PC-3-solujen ja pystyvät erottamaan BPH näytteitä ja korkean riskin PCa näytteitä klinikalla.

Tulokset ja keskustelu

aptameeriin valinta vastaan PC-3-solujen

menetelmä aptameerin valinta on esitetty kuviossa 1. kohdesolulinjana PC-3 on tyypillinen solulinja androgeenista riippumaton syövän potilaan luun etäpesäkkeitä. Androgeeniriippumattomaksi syöpäpotilaat luinen etäpesäkkeitä ovat kaikkein vaikea hoitaa. Jotta saadaan aikaan Aptameerien suurella spesifisyydellä, käytimme enemmän kuin yhdenlaisen solulinjan negatiivisena kontrollina vastavalinta, kuten nontumor kuolemattomiksi eturauhasen epiteelisolujen linja RWPE-1, ihmisen maksan masolulinjassa SMMC-7721 ja Ihmisen kohdunkaulan syöpäsolujen line Hela.

ensimmäisen kierroksen valinta, kohdesoluja inkuboitiin satunnainen DNA-kirjastosta allas. Pesun jälkeen pysyi sekvenssit soluihin monistettiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR), ja erotettiin yksijuosteinen sekvenssit toisen kierroksen valintaa. Toisen kierroksen valintaa, negatiivinen soluja inkuboitiin rikastetun poolin ennen kohdesoluun sitoutuva, jotta voidaan poistaa sekvenssit, jotka sitoivat yhteiseen molekyylien pinnalla kohdesolujen ja kontrollisoluja. Joka kahden tai kolmen valintakierroksen aptameeri rikastamiseen seurattiin virtaussytometrialla ja konfokaali kuvantaminen. Jos aptameerin sekvenssit rikastettu, fluoresenssin intensiteetti pinnalla PC-3-solujen voimistui inkuboinnin jälkeen soluja valitun altaat. Kuten kuviossa 2A on esitetty, fluoresenssin intensiteetti pinnalla PC-3-solujen lisääntynyt voimakkaasti kymmenen ensimmäisen valintakierroksen ja fluoresenssi parannuksen valvontaa solut (SMMC-7721, kuvio 2B) oli paljon pienempi, mikä osoittaa, että aptameerit kohde solut suuresti rikastuttanut. Kuitenkin, kun suoritetaan vielä viiden valintakierroksen vaikka fluoresenssin PC-3-soluja oli edelleen vahvempi kuin kontrollisolut, fluoresenssi parannuksen PC-3-solut tulivat hitaammin ja että valvonnan solut tulivat nopeammin, mikä viittaa siihen, että enemmän epäspesifinen sekvenssejä että sitoutuneena molemmat solulinjat rikastunut. Confocal imaging (kuvio 2C) osoitti, että aptameerit sidottu kalvo kohdesolujen. Kun toinen kahden valintakierroksen vahvempi laskuri valinta, 17. pyöreä allas kloonattiin ja 50 kloonit sekvensoitiin.

virtaussytometrinen määritys on valittu altaat sitoutumaan kohde-solulinja PC-3 (A) ja negatiivinen kontrolli solu line SMMC-7721 (B), Blank on taustafluoresenssi käsittelemättömän soluja. Lib on FITC-leimattu DNA-kirjasto negatiivisena kontrollina. (C) konfokaali kuvantaminen PC-3-solujen värjätty 15. kierroksen selektiopoolin leimattiin FITC (x 100 öljyssä linssi).

tunnistaminen Aptameerien kohdesoluja vastaan ​​

sen jälkeen kohdistus, saadut sekvenssit 50 kloonien havaittiin jakaudu 5 perheet mukaan yhtäläisyyksiä thier sekvenssit. Analysoimalla ennustettu sekundaarirakenne sekvenssien kussakin perheessä [29] – [31], kuusi sekvenssit katkaistu ja syntetisoitiin sitoutumisen määrityksessä (sekvenssit ei esitetty). Virtaussytometria määritys osoitti, että sekvenssi, Wy-5a esillä vahvin sitoutumisen PC-3-soluja, ja heikoin sitoutumisen muihin solutyyppeihin (kuvio S1); Näin ollen tämä sekvenssi karakterisoitiin edelleen. Sekundäärisen rakenteen ennustaminen [32] osoittivat, että Wy-5a antoi varsi-silmukka-rakenne, jossa on yhden emäksen pullistuma varren (kuvio 3). Poistamalla yhden emäksen pullistuma, täydellinen varsi-silmukka-rakenteen sekvenssi Wy-5b (taulukko 1) syntetisoitiin myös lisäkarakterisointia. Sitoutumismääritys osoitti, että Wy-5a ja Wy-5b spesifisesti sitoutuu PC-3-soluja (kuvio 3). Tasapainodissosiaatiovakio vakiot (

K

d) of Wy-5a ja Wy-5b laskettiin olevan 73,59 ± 11.01 ja 173,1 ± 44.67, mikä osoittaa, että aptameeriin Wy-5a on suurempi affiniteetti PC-3 soluja kuin Wy-5b. Korkeampi affiniteetti Wy-5a viittaa siihen, että yksi-base pullistuma varsi Wy-5a saattaa liittyä sitoutuminen kohteeseensa. Koska korkeamman affiniteetin Wy-5a, se on lisäksi tunnettu siitä uutena koettimena PCa havaitsemiseen.

DNA: n pitoisuuksia ovat 0, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0, 16, 32, 64, 128 ja 256-leimattua DNA-kirjasto (Lib). Ennustettu sekundaarirakenne Wy-5a ja wy-5b (oikealla), olivat rakentaa työkalun, jonka Integrated DNA Technologies (IDT). [Www.IDTdna.com/page/scitools].

erityisyys Selected Aptameerit

spesifisyyttä Wy-5a muille tuumorisolulinjoja tutkittiin virtaussytometrialla ja confocal imaging (kuvio 4). Kaikista testatuista solulinjoista, Wy-5a ainoastaan ​​sidottu PC-3 solulinja, ei sitoudu muihin PCa solulinjoja (esim DU145, PCA aivometastaasi Keskivaikeaa metastaattinen potentiaali, 22RV-1, paikallisten PCa ilman metastaattinen potentiaali), ja muut syövän solulinjat, mukaan lukien keuhkosyöpä solulinja (A549), ihmisen rintasyövän solulinjan (MCF-7), ihmisen kohdunkaulan syövän solulinja (HeLa), hepatoomasolulinja (SMMC-7721), Colon syöpäsolun linjat (LoVo ja HCT-8), -leukemiasolulinjan (Jurkat) ja krooninen myelooinen leukemia solulinjassa (K562) (taulukko S1). Nämä tulokset osoittavat, että aptameerin Wy-5a on erinomainen spesifisyys kohdesoluun linja. Korkea spesifisyys tekee Wy-5a on potentiaalia sovellettavaksi metastaasin havaitsemiseksi PCa tai väline kohde terapiassa.

rivi A, kohdesolulinjana PC-3; Rivi B, SMMC-7721; Rivi C, HeLa; Rivi D, 22RV-1. Colum 1, fluoresenssi kuvaa; Colum 2, overlay fluoresenssin kuvien ja Kirkas kuvia, colum 3, histogrammi Tontti virtaussytometrialla. Blank on taustafluoresenssi käsittelemättömien solujen osalta; Lib on FITC-leimatun DNA-kirjasto negatiivisena kontrollina.

sitoutuminen kohtiin aptameerin kohdesoluihin

confocal imaging on osoittanut, että on saatu aptameerit sitoutunut solun pinnalla ( kuvio 2C ja kuvio 4 rivi A), jolloin proteinaasi digestio koe suoritettiin sen selvittämiseksi, kohdemolekyyli on kalvoon proteiini. Kuten kuviossa 5 on esitetty, käsittelyn jälkeen trypsiinillä tai proteinaasi-K: ssa 2 minuutin ajan, PC-3-solut melkein ei sido Wy-5a, mikä osoittaa, että kohdemolekyyli aptameerin Wy-5 on kalvon proteiini.

hoidon jälkeen trypsiinillä tai proteinaasi K, PC-3-solujen melkein ei sido Wy-5a. Blank on taustafluoresenssi käsittelemättömien solujen vastaavasti.

sisäistämisen Wy-5a

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että oligonukleotidit pidempi kuin 25 emästä voinut vapaasti tunkeutumaan kalvon [33] , [34]. Wy-5a on 52-base oligonukleotidia, se kohdistuu membraaniproteiinina. Sen tutkimiseksi, onko Wy-5a voidaan sisällyttää soluihin kautta reseptorivälitteisen endosytoosin avulla, PC-3-soluja inkuboitiin Wy-5a, 37 ° C: ssa 2 tuntia. Lisääntyminen tempreture 4 ° C: sta 37 ° C: ssa ei ole paljon vaikutusta sitoutumiseen Wy-5a PC-3-soluja (kuvio S2). Virtaussytometria määritys (kuvio 6) osoitti, että esikäsittely solujen trypsiinillä aiheutti lähes täydellinen menetys aptameerin sitoutuminen (verrattuna sitoutumattoman DNA labrary). Kuitenkin hoito solujen trypsiinillä jälkeen aptameeriin sitova ainoastaan ​​aiheuttanut menetettyä osan Aptameerin sitoutumisen, mikä viittaa siihen, että jotkut Wy-5a voi sisäistää soluihin. Vuonna confocal kuvaa PC-3-solujen kanssa inkuboinnin jälkeen Wy-5a, 37 ° C: ssa 2 h (kuvio 6), voimakas fluoresenssi signaali havaittiin solukalvon ja heikko fluoresenssi signaali havaittiin kokonaisia ​​soluja. Mutta Konfokaalinen kuva solujen icubated DNA-kirjaston eivät osoittaneet merkittäviä fluoresenssisignaalisuhteet paitsi jonkin verran epäspesifistä valopilkkuja hajautetusti imeytetty soluissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Wy-5a voi olla osallisena reseptorivälitteisen endosytoosin.

W /O-käsittely: Soluja inkuboitiin Wy-5a; Esikäsittely: solut esikäsiteltiin trypsiinillä ja sitten inkuboitiin Wy-5a; jälkikäsittelylaitteilla soluja inkuboitiin Wy-5a ja käsiteltiin sitten trypsiinillä; Lib: negtive ohjaus, soluja inkuboitiin FITC-leimatun DNA-kirjasto; tyhjä: on taustafluoresenssi käsittelemättömien solujen.

värjäytyminen kliinisen PCa liukuu

Ennen tulokset hav osoittaneet, että aptameeriin Wy-5a on erinomainen spesifisyys PC-3-soluista DU145 ja 22RV-1-soluja. PC-3 solulinja aloitettiin luusta etäpesäke on luokan IV androgeeniriippumattomaksi PCa potilaalle. Lisäksi luuston osallistuminen on yleisin metastaattisen sivusto myöhäisvaiheen PCa, havaittiin jopa 80%: lla potilaista [35]. DU145 oli peräisin PCa aivometastaasi Keskivaikeaa metastaattista potentiaalia, ja eivät ole hormoniherkän [36]; 22RV-1 on ihmisen PCa solulinjassa ilman metastaattista potentiaalia johdettu ksenograftin hiirissä [37]. Siksi kohdeproteiinin of Wy-5a voi olla korrelaatio aggressiivisuus tai etäpesäkkeitä. Näin aptameeriin Wy-5a voi olla potentiaalia kasvain luokitusta ja lavastus. Jotta toteutettavuuden testaamiseksi Wy-5a kasvainten luokittelun ja lavastus, käytimme tätä aptameerin tahraa PCa kudosleikkeiden kliinisistä potilaista. Negatiivinen kontrolli on BPH kudoksiin, vallalla noncancerous muutos ikäinen mies. Kasvaimen kudokset saanut potilailta PCA (tunnistaa vanhempi patologi, kolmas sidoksissa sairaalaan Sun Yat-Senin yliopistossa). Leikkeet leikattiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja (FFPE) kudoksiin, ja kalvo antigeenejä korjattiin keittämällä EDTA antigeenin Retrieval Solution ennen värjäystä. Kuten kuviossa 7 on esitetty, sen jälkeen, kun värjätään FITC (fluoreseiini-isotiosyanaatti) leimatun aptameerin Wy-5a, syöpäsoluissa osoitti vahvaa fluoresenssisignaalin. Kuitenkin fluoresenssisignaali tuskin havaittiin diassa BPH kudosta.

Harvoin fluoresenssisignaalisuhteet (-) havaittiin BPH dioja. Vuonna hyvin erilaistunut eturauhassyöpä, Gleason pisteet: 2 + 3, mitään todisteita muun sellaisen elimen etäpesäkkeiden, hyvin heikko fluoresenssi signaali (+) havaittiin. Matalissa erilaistunut eturauhassyöpä potilas, Gleason pisteet: 5 + 5, luumetastaasipotilailla, voimakas fluoresenssi signaali (+++) havaittiin. (Colum 1) HE värjäystä parafiinia -osio kliinisestä näytteestä, (Colum 2) Kirkas alalla confocal, (Colum 3) Fluoresenssi signaalia konfokaali.

värjäytyminen kaikki diat oli koottu taulukkoon 2 . Täysin, kaikki 10 BPH diat eri potilaista havaittiin negatiiviset tulokset ja 20 syövän liukuu pois 28 syöpätapausta kudoksen osoitti positiivisia tuloksia. Vain 8 syöpätapauksia dioja ei voitu värjätään aptameeriä. Vertaamalla Gleason pisteet syövän kudosten ja terveystiedot potilaista, löysimme mielenkiintoinen ilmiö: diat potilaita suurilla Gleason ( 6) luumetastaasipotilailla osoitti voimakkaampaa fluoresenssia solukalvon kuin alhaiset pisteet (≤6 ) ilman etäpesäkkeiden (kuvio 7). Tämä osoitti, että kohdeproteiinin of Wy-5a erittäin ilmaistu näillä ennätyksensä sairastavilla potilailla etäpesäkkeitä. Gleason luokitusjärjestelmä on tehokas työkalu ennustaa ja tukea hoidettaessa miesten PCA. Perustuen patologinen rakenne rauhanen epiteelin, kudos kuva luokitellaan viiteen tyyppejä. Ensimmäisestä viidenteen tyyppiä, erottelun taso on sama asteittain vähentää [38]. Koska Gleason pisteet heijastaa pahanlaatuisen astetta PCA nämä tulokset voivat merkitä sitä, että kohdeproteiinin of Wy-5a ehkä on joitakin suhde pahanlaatuisia aste tai aggressiivisuus tai etenemisen kasvain. Edelleen proteiinin tunnistaminen ja arviointi tehdään valaista tätä kysymystä. Tämä joukko tuloksia viittaa Aptameerin Wy-5a on potentiaalia toimia koetin diagnosoimiseksi PCa.

PCA potilaat, joiden tauti uusiutui tai pitkälle tulee lopulta HRPC ja osoita mitään vastaa ADT [6]. Kehittyminen sen lääkeresistenssin lisäksi hormonin vastareaktioita, tehdä vaikutus hoidon turhauttavaa [39]. Kuitenkin heterogeeninen kesto osoitti, että lajit ja ilmenemismuodot potilaat ovat erilaisia. Tarkka luokitus tyyppiä tai arvosana on hyödyllistä tehostaa hoitoa. Siksi enemmän diagnostiikkaan tarvitaan, jotta voitaisiin valita optimaalisen henkilökohtaista hoitoa. Jotkut kemoterapeuttiset ovat tehokkaita in vitro, mutta puute cell-valikoivuus, vakava myrkyllisyys ja haittavaikutukset rajoittaneet niiden käyttöä in vivo. Aptameeriin välittämä kohdennettu lääke voi olla hyvä ratkaisu. Tähän asti päivää, vain yksi RNA aptameeriin joilla pyritään PCa on tuotettu perinteisillä SELEX-menetelmä, ts aptameeriin vastaan ​​PSMA (eturauhasspesifinen kalvoantigeeni, vain ilmaistu LNCaP solulinjassa) [40]. Sillä tyypillisesti solulinjaa PC-3, ei ole vielä oligonukleotidi aptameeriin kehittynyt. Äskettäin aptameeriin pohjainen lääkeannostelun on osoittanut hyviä tuloksia [41]. Korkea affiniteetti ja spesifisyys PC-3-solulinjassa ja syövän kudoksiin korkean riskin ja etäpesäkkeiden merkitse sitä, että DNA aptameeriin Wy-5a hold potentiaalia alalla luokitusta, havaitsemisen ja tavoite hoito Eturauhassyövän potilaista.

Experimental §

Soluviljely

Kaksitoista vakiintuneet solulinjat käytettiin: RWPE-1 on kuolematon normaaleissa ihmisen eturauhasen epiteelisolujen linja. PC-3, DU-145 ja 22RV-1 ovat ihmisen PCa solulinjat. SMMC-7721 on ihmisen maksan masolulinjassa. LoVo ja HCT-8 solut ovat kolorektaalikarsinoomasolulinjaa linjat. HeLa on Ihmisen kohdunkaulan syövän solulinjat. A549 on Ihmisen keuhkosyöpä solulinjaa. MCF-7 on ihmisen rintasyöpä solulinja Jurkat on akuutti T-soluleukemiasolulinja, K562 on krooninen myelooinen leukemia cell line. RWPE-1, PC-3, DU-145, 22RV-1, SMMC-7721 ja LoVo solulinjoja ostettiin Tyypillisiä kulttuurin säilyttäminen Komissio solujen pankki, Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, Kiina). HeLa, A549, MCF-7, Jurkat ja K562 ostettiin Institute of Basic Medical Science Kiinan Academy of Medical Sciences (Peking, Kiina). RWPE-1 viljeltiin Keratinosyyttien Serum Free Medium (K-SFM) ja naudan aivolisäkeuutetta (BPE) ja ihmisen rekombinantti epidermaalista kasvutekijää (EGF), muut kasvainsolulinjat viljeltiin RPMI 1640 elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, GIBCO) ja 100 yksikköä /ml penisilliiniä streptomysiiniä (Sigma). Kaikkia solulinjoja pidettiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2-inkubaattorissa. Koko prosessi, joka tärkeä indeksi kasvaa solujen täytyy pitää vakaana ja soluja pidettiin hyvässä, joka luoda vakaa perusta lisäkokeita varten.

Buffer

Pesu puskuri valmistettiin lisäämällä 5 mmol MgCl

2 ja 4,5 g glukoosia 1 L 0,01 M PBS (sisältää 8 g NaCl, 0,2 g KCI, 3,58 g Na

2HPO

4 · 12H

2O, 0,272 g KH

2PO

4 per 1 L DDH

2O. pH = 7,4) ilman kalsiumia ja magnesiumia. Sidospuskuria valmistettiin lisäämällä 1 mg /ml naudan seerumin albumiinia (BSA, Sigma) ja 0,1 mg /ml Herring Sperm DNA (Invitrogen) pesupuskuria.

SELEX ssDNA kirjasto ja PCR-alukkeita

HPLC-puhdistettu kirjasto sisälsi keskeinen satunnaistettu sekvenssi 45 nukleotidin (nt) reunustavat 20-nt alukehybridisaation sivustoja (5′-ACGCTCGGATGCCACTACAG-45nt-CTCATGGACGTGCTGGTGAC -3 ’). Fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) -leimatuilla 5′-aluketta (5’-FITC-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3 ’) ja biotinyloitu (Bio) 3′-aluketta (5′-Bio-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3’) käytettiin PCR-reaktioissa synteesiä varten kaksoisleimattua, kaksijuosteisia DNA-molekyylejä. Denaturoinnin jälkeen emäksisissä olosuhteissa (0,2 M NaOH), The FITC- konjugoitu mielessä ssDNA aptameeriin erotetaan biotinyloitu antisense ssDNA juosteeseen streptavidiinipäällystetyille sefaroosihelmet (Streptavidiini Sepharose High Performance) (GE Healthcare, Ruotsi) ja käytettiin seuraavalla kierroksella valintaan tai sitoutumismäärityksessä. Valintaprosessi seurattiin virtaussytometrialla määritystä ja konfokaalisella kuvantaminen.

työjärjestys SELEX

prosessi solu-SELEX on samanlainen kuin aikaisemmin on kuvattu [42]. Vuonna lyhyesti, prosessi toteutettiin vaiheet (kuvio 1). Ennen jokaista kierroksella SELEX, kohdesolujen PC-3-soluja viljeltiin ja 80~90% konfluenssiin ja negatiivinen soluja viljeltiin loppuun konfluenssiin 60 mm petrimaljaan ja pestiin kolme kertaa esijäähdytetty PBS: llä. 10 nmol alkuperäisen ssDNA kirjasto liuotettuna 1 ml: aan sitoutumispuskuria denaturoitiin 95 ° C: ssa 5 min ja pidetään jäähauteessa 15 minuutin ajan, sitten laitettiin huoneen lämpötilassa noin puoli tuntia ennen käytetty. Inkuboinnin jälkeen kirjaston allas kohdesolujen kanssa 4 ° C: ssa 1 h, alkuperäisen kirjaston liuos poistettiin. Sen jälkeen pestään pesupuskurilla liiman solut kaavittiin pois ja kerätään 2 ml putkeen, pestiin jälleen. Rajattu DNA: t eluoitiin lisäämällä 500 ui DDH

2O putkeen, ja kuumentamalla 95 ° C: ssa 5 min. Sentrifugoinnin jälkeen supernatantti käytettiin templaattina ja monistettiin PCR: llä alukkeilla leimattu FITC tai biotiini (10-15 sykliä 30 s denaturoi 95 ° C: ssa, 30 sekuntia annealing 59 ° C: ssa, ja 30 s laajennus 72 ° C: ssa, viimeinen kierros sen jälkeen 5 min 72 ° C: ssa, pitää tuotannon 4 ° C: ssa. Taq-polymeraasi ja dNTP: t saatiin Takara). FITC-leimattu mielessä ssDNA allas erotettiin PCR tuotteen streptavidiinipäällystetyille sepharose helmiä seuraavaa kierrosta valinta. Vuodesta toisen kierroksen valinta, negatiiviset solut inkuboitiin ssDNA-pooli ensin vastavalinta, sitten negatiivinen solujen sidottu epäspesifinen sekvenssit poistettiin sentrifugilla. Supernatantti inkuboitiin kohdesolujen rikastuttaa spesifisiä sekvenssejä. Valintaprosessi seurattiin virtaussytometrialla ja konfokaali kuvantaminen. 2.-5. kierros, RWPE-1-soluja käytettiin laskuri valinta; alkaen 6.-8 ympäri, SMMC-7721 käytettiin laskuri valinta; alkaen yhdeksäs-kymmenes kierroksen valinta, Hela-soluja käytettiin vastavalinta. Sen jälkeen 10. krs, HeLa ja SMMC-7721-soluja käytettiin vastavalinta erikseen kullakin kierroksella. Saadakseen aptameerit suurella affiniteetilla ja spesifisyys, paine valinta parannettiin asteittain ensimmäinen-viidestoista valinta vähentämällä määrä ssDNA-pooli (100 pmol 50 pmol), inkubaatioaika varten kohdesoluja (60 min 30 min), ja kohdesolun numeron (alkaen 7,5 miljoonaa /10 cm malja 1 miljoonaan /3,5 cm malja) sekä lisäämällä monen pesukerran (kahdesta kolmeen). Kahtena viime kierrosta vahvistui valinta (kuudestoista-seitsemästoista), vähensimme altaan 30 pmol, inkubaatioaika 15 minuuttia ja lisätä pesu neljä kertaa voimakkaampi ravistellen. Täysin 17 kierrosta valinta suoritettiin ennen sekvensointia. Klooni ja sekvensointi suoritettiin Sangon Biotechnology Co., Ltd.,

virtaussytometrianalyysin

Voit seurata rikastaminen Aptameerin yhdessä edistymistä SELEX, kohdesolujen ja negatiivisia soluja oli viljeltiin tulee yksittäis- kerroksissa 80~90% konfluenssiin, sitten hajotetaan solut 0,02% EDTA: lla sen jälkeen, kun pestiin kerran PBS-liuoksella huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen pestiin kylmällä pesupuskurilla kahdesti, solut (2 x 10

5) inkuboitiin FITC-leimatun ssDNA-allas tai valitut DNA-sekvenssit (0,25 uM) 200 ul: aan sitovaa puskuria 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Ennen virtaussytometria-analyysissä solut pestiin kahdesti kylmällä pesupuskurilla ja suodatetaan 400 meshin solun seulan. Fluoresenssi määritettiin FACScan (Becton Dickinson) laskemalla 1 x 10

4 tapahtumaa. FITC leimattu kirjastoa altaan käytettiin negatiivisena kontrollina.

värjäys ihmisen kasvainkudossektioista käyttäen valittua aptameeriin

Parafiini kudosblokeista toimittivat patologian osastolla 3. sidoksissa sairaalassa, Sun Yat- sen yliopiston (Guangzhou Kiina). Esikäsittely osien (5 pm paksu) suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [43], [44]. Antigeeni haku prosessi on samanlainen immunohistokemiallisella-kemiaa. Kudoksen leikkeet vahat poistettu ksyleeniin kahdesti (10 min kerta), kun pidetään vakiolämpötilassa uunissa 60 ° C: ssa 20 min. Käyttämällä gradienttia etanolia (100%, 95% ja 70%), nesteyttää osa ja huuhdellaan levyt deionisoituun veteen. Pesun jälkeen PBS: ssa 5 minuutin ajan, kaikki osat pantiin TE-puskuriin (sisältää 10 mmol Tris, 1 mmol EDTA per 1 L DDH

2O, pH = 8,0) ja kuumennetaan nopeasti kiehuvaksi by mikroaaltouuni, sitten pitää lämpötila 95 ° C: ssa 15 minuutin ajan hakea antigeenien ja luonnollista jäähdytystä huoneenlämpötilaan, pestiin sitten kolme kertaa tuoreella PBS: llä. Jälkeen histologinen prosessi, Kudosleikkeitä inkuboitiin sitovia, joka sisälsi 20% FBS: ää ja 0,1 mg /ml Herring Sperm DNA huoneenlämpötilassa 60 minuuttia ja sitten inkuboitiin 250 nM FITC-leimatun aptameerien sitoutumispuskurissa 60 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Sitten nämä kudosleikkeet pestiin kolme kertaa tuoreella PBS, kuivattu ja sinetöi mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää Polyvinyylipyrrolidoni Mounting Medium. Lopuksi värjätyt leikkeet kuvantaa pyörivän kiekon konfokaali- fluoresenssimikroskopiaan (Olympus IX71, Japani). FITC oli innoissaan 488 nm argonioni laser (Mells Griot, CA) kantavassa fluoresenssisignaalien havaittiin jonka 40 × tavoite (NA 0,90, UPLSAPO, Olympus, Japani). Kuvat analysoitiin FV10-ASW Version 3.1.

Affinity ja spesifisyys Aptameerin

14 solulinjoja käytettiin testaamaan spesifisyyden aptameereillä virtaussytometrialla menetelmää edellä kuvatulla tavalla. Jotta voidaan testata affiniteetti eri aptameerien PC-3cell, eri pitoisuus aptameerit inkuboitiin 2 x 10

5-soluja lämpötilassa 4 ° C, ja sitten analysoitiin virtaussytometrialla. Keskimääräinen fluoresenssi-intensiteetti kunkin näytteen vähennettiin keskimääräinen fluoresenssi-intensiteetti tausta. Tasapainodissosiaatiovakio vakioita (

K

d) on aptameeri-solu-vuorovaikutuksen saatiin sovittamalla riippuvuus fluoresenssin voimakkuus spesifisen sitoutumisen pitoisuudesta ja aptameerien yhtälöön

Y

=

B

max

X Twitter /(

K

d +

X

) käyttäen SigmaPlot (Jandel, San Rafael, CA) [ ,,,0],25].

proteinaasi hoitoa solujen

PC-3-solut pestiin kahdesti lautasen PBS huoneenlämpötilassa, hajotetaan 0,02% EDTAa. Jälkeen pestiin 2 x 10

5cells inkuboitiin 200 ul: lla 0,05% trypsiiniä tai 0,1 mg /ml proteinaasi K: ta 37 ° C: ssa 2, 5 ja 10 min vastaavasti. Reaktio lopetettiin lisäämällä täydellistä kasvualustaa. Pesun jälkeen, käsitellyt solut inkuboitiin aptameeriin ja haki virtaussytometria määritystä edellä kuvatulla tavalla.

konfokaali kuva solujen

konfokaali fluoresenssimikroskopiaan käytettiin tarkkailla sitoutuminen Aptameerien asumiseen solut. 2 x 10

4-soluja viljeltiin 35 mm lasipohjalla lautasen enemmän kuin 1 päivä saada hyvin laajennus. Sen jälkeen pestiin kylmällä pesupuskurilla, soluja inkuboitiin aptameerit (0,25 uM) 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Sen jälkeen pestään kahdesti, solut kuvantaa pyörivän kiekon konfokaali- fluoresenssimikroskopiaan (Olympus IX71, Japani). FITC oli innoissaan 488 nm argonioni laser (Mells Griot, CA) kantavassa fluoresenssisignaalien havaittiin jonka 40 × tavoite (NA 0,90, UPLSAPO, Olympus, Japani). Kuvat analysoitiin FV10-ASW Version 3.1.

sisäistämisen aptameeriä

kohdesolun PC-3 hajotettiin 0,02% EDTAa. Pesun jälkeen solut jaettiin 5 putkeen. Yksi putki ilman hoitoa tyhjinä; yksi putki inkuboitiin 0,25 uM FITC-leimatun DNA kirjastosta negtive valvonta; yksi putki inkuboitiin 0,25 uM FITC-leimattua Wy-5a positiivisena kontrollina; yksi putki on esikäsitelty 0,05% trypsiini 10 min ja inkuboitiin sitten 0,25 uM FITC-leimatun Wy-5a (esikäsittely); yksi putki inkuboitiin 0,25 uM FITC-leimattua Wy-5a ja käsiteltiin sitten 0,05% trypsiiniä 10 min (jälkikäsittely). Kaikki inkuboinnit DNA suoritettiin 37 ° C: ssa 2 h seerumittomassa RPMI 1640-alustassa. Sitten viisi näytettä pantiin virtaussytometriaa menetelmää edellä kuvatulla tavalla. Sillä confocal havainto, PC-3-soluja inkuboitiin 0,25 uM FITC-leimatun Lib tai Wy-5a seerumittomassa RPMI 1640-alustassa 37 ° C: ssa 2 h, sitten käytetään kuvantamiseen kuten edellä on kuvattu.

tukeminen Information

Kuva S1.

Virtaussytometria määrityksiä solujen kanssa inkuboinnin jälkeen tdifferent aptameerejä. Blank: on taustafluoresenssi käsittelemättömien solujen.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0100243.s001

(TIF) B Kuva S2.

Virtaussytometria määrityksessä PC-3-solujen kanssa inkuboinnin jälkeen Wy-5a 4 ° C: ssa tai 37 ° C: ssa. Sitomiskykyä Wy-5a osoita mitään eroa 4 ° C: ssa tai 37 ° C: ssa. Blank: on taustafluoresenssi käsittelemättömien solujen.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0100243.s002

(TIF) B Taulukko S1.