Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, kasvain esti roolia seleeni-sitovan proteiinin 1 (SBP1), mutta taustalla olevat mekanismit ovat epäselviä. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että induktio SBP1 osoitti merkittävää inhibitiota peräsuolen syövän solujen kasvua ja etäpesäkkeiden hiirillä. Me käytettiin edelleen isobaaristen tunnisteita suhteellisen ja absoluuttisen määritysrajan (iTRAQ) proteiinien tunnistamiseksi, jotka olivat mukana SBP1 välittämää syöpälääkkeen vaikutuksia kasvaimen kudoksissa. Havaitsimme 132 ilmentyvät eri proteiineja, niiden joukossa, 53 proteiinit voimistunut ja 79 proteiinit vaimentua. Tärkeää on, monet eri tavoin muuttaa proteiinit, jotka liittyvät lipidi- /glukoosin aineenvaihduntaa, jotka liittyvät myös Glykolyysi, MAPK, Wnt, NF-kB, NOTCH ja epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) signalointireittejä. Nämä tulokset ovat paljastaneet tuntematon mekanismi SBP1 välittämä syövän eston kautta muuttamalla lipidi- /glukoosi aineenvaihdunnan signalointireitteihin.

Citation: Ying Q, Ansŏng E, Diamond AM, Lu Z, Yang W, Bie X (2015 ) Kvantitatiivinen proteomiikan analyysi paljastaa, että Anti-Cancer vaikutukset Seleeni-sitova proteiini 1

In vivo

liittyy metaboliareitteihin. PLoS ONE 10 (5): e0126285. doi: 10,1371 /journal.pone.0126285

Academic Editor: Chih-Xin Tang, Kiina Medical University, Taiwan

vastaanotettu: 13 tammikuu 2015; Hyväksytty: 31 maaliskuu 2015; Julkaistu: toukokuu 14, 2015

Copyright: © 2015 Ying et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat osittain avustuksia National Natural Science Foundation of China (avustus # 91229115 ja 81272251), avustusta Innovatiiviset Team of Science ja teknologia, Henanin maakunnassa Kiinassa.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ihmisen seleeni sitovan proteiinin 1 (SBP1, SELENBP1) kuuluu luokkaan seleeniä sisältävien proteiinien, jossa seleeni on tiiviisti liittyy peptidin sijasta sisällyttää yhdessä translaation kuin aminohappo selenokysteiini (Sec) toiseen luokkaan seleeniä sisältävä proteiini-glutationiperoksidaasi 1 (GPx1). Ihmisen SBP1-geeni koodaa 472 aminohapon proteiinia, jonka molekyylipaino on yhtä suuri kuin 56 kDa. Se ilmaistaan ​​eri solujen ja kudosten (maksa, sydän, keuhko ja munuainen), ja se sijaitsee tumassa ja /tai sytoplasmassa riippuen solutyypistä, erottelua ja ympäristön signalointi [1-4]. Vähentynyt SBP1 on havaittu useimmissa ihmisen syövissä, mukaan lukien maksasyöpä, eturauhassyöpä, rintasyöpä, keuhkosyöpä, paksusuolen ja peräsuolen syöpä [5]. Tämä vähennys SBP1 liittyy huono kliinisiä tuloksia. Kuitenkin biologisia toimintoja on SBP1 ihmisen syövissä ovat edelleen epäselviä.

On raportoitu, että SBP1 on tavoite hypoksia-indusoituva factor-1 α (HIF1α) reagoida reaktiivisen hapen (ROS) [3] . SBP1 voisi myös säätelemään negatiivisesti glutationiperoksidaasi 1 (GPx1) aktiivisuutta muuttamatta sen proteiinin ilmentymisen kautta fyysisen proteiini vuorovaikutuksen [6]. von Hippel-Lindaun proteiini (pVHL) – vuorovaikutuksessa deubiquitinating entsyymi 1 (VDU1) hiljattain löydetty kuin toisen proteiinin kumppanina SBP1, joka oli mukana ubiquitination- ja deubiquitination välittämä proteiini hajoamisreitit [7]. Kaikki tämä työ osoittaa, että SBP1 voivat olla vuorovaikutuksessa muiden proteiinien välityksellä eri signalointireitteihin.

Saada kattavampi käsitys SBP1 toimintoja syöpään, käytimme proteomic menetelmä, isobaaristen tunnisteita suhteellisen ja absoluuttisen määritysrajan (iTRAQ) . iTRAQ on tällä hetkellä yksi vahvimmista menetelmiä, jotka määrällisesti proteiinit perusteella peptidin merkintöjä. Toisin geeli-pohjainen proteomic menetelmä, iTRAQ näyttelyitä paljon parempi herkkyys ja mahdollistaa tunnistamisen ja tarkka kvantifiointi proteiinien useiden näytteiden sisällä laajan dynaamisen valikoimia proteiinin runsauden [8].

poistamiseksi mahdollisia sivuvaikutuksia transfektion, me perustettu vakaa SBP1 indusoituva solulinjan kanssa käyttämällä Tet-on indusoituvaa geeniekspressiota, joka tekee SBP1 ilmaisun erittäin hallittavissa ja saavuttaa erittäin korkean induktion taso soluissa. Kasvain esto rooli SBP1 havaittiin

in vivo

. Differentiaalisesti ilmaisi proteiinit SBP1 aiheuttama hiiren ksenograftikasvaimissa analysoitiin iTRAQ ja muutoksia joidenkin tunnistettu proteiinien todensi immunoblottauksella. Tuloksemme osoittivat uudenlainen syöpälääkkeen mekanismi SBP1

in vivo

, joka liittyi lipidi /sokeriaineenvaihduntaan ja liittyy MAPK /Wnt, NF-kB, NOTCH ja EMT signalointireittejä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tutkimus hyväksyi Xinxiang Medical University Animal Care ja käyttö komitea. Kaikki Leikkaus suoritettiin pentobarbitaalianestesiassa ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Soluviljely

HCT116 ihmisen koolonkarsinoomasolulinja saatiin ATCC (American Type Culture Collection, USA) ja ylläpidetään McCoyn 5a väliaineessa (Mediatech, Manassas, VA). GP2-293 solulinja hankittiin Clontech (Mountain View, CA) ja pidettiin DMEM (Life Technologies, Carlsbad, CA). Kaikki media on täydennetty 10% FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Kaikki solut viljeltiin 37 ° C: ssa 5% CO

2 kosteutetussa inkubaattorissa (Thermo Fisher Scientific).

plasmidikonstruktion

kehitettäisiin retrovirusta ekspressioplasmidin pRetroX-Tight-Pur -SBP1, ihmisen SBP1 cDNA monistettiin ja subkloonattiin pRetroX-Tight-Pur vektorin (Clontech, Mountain View, CA) käyttäen Notl- ja EcoRI-restriktiokohdat. Seuraavia alukkeita käytettiin: eteenpäin 5’ATAGCGGCCGCTACAGCATGGCTACGAAAT-3 ’ja reverse 5′-ACGAATTCGCTCAAATCCA GATGTCAGAGC-3’. Kaksi plasmidia pRetroX-Tet-On Advanced (Tet aktivaattori vektori) ja VSV-G (Packaging vektori) ostettiin Clontech (Mountain View, CA).

Retroviirus pakkaus

pakkaus solut GP2-293 kasvatettiin 25cm

2 pulloihin ja transfek- käyttäen Lipofectamine 2000 (Life Technologies) ja 6 ug VSV-G ja joko 2 ug pRetroX-Tight-Pur-SBP1 tai 2 ug pRetroX-Tight-on Advanced. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen, virus sisältävä supernatantti otettiin talteen ja pakastettiin -20 ° C: ssa. Solulinja HCT116-TetSBP1 synnytettiin infektoimalla HCT116 soluja virus, joka sisältää sekä pRetroX-Tight-Pur-SBP1 ja pRetroX-Tight-On Advanced. Yksittäinen pesäke poimittiin valinnan jälkeen 400 ug /ml G418: aa (Sigma) ja 1 ug /ml puromysiinille (Sigma). Solulinja HCT116-laki syntyi infektoimalla HCT116 soluja virus, joka sisältää pRetroX-Tight-On Advanced. Yksittäinen pesäke poimittiin valinnan jälkeen 400 ug /ml G418: aa (Sigma).

immunoblottaus-analyysi

HCT116-TetSBP1 ja HCT116-lain soluja käsiteltiin 1 ug /ml doksisykliiniä (Sigma) 72 tuntia ennen analyysiä. Kerätyt solut hajotettiin 1x Cell Lysis Buffer (Cell Signaling, Danvers, MA), joka sisälsi 1 mM PMSF: ää (Cell Signaling). Poistetaan solulysaattia kustakin solulinjasta keitettiin NuPAGE LDS Sample Buffer (Life Technologies) ja 10x Pelkistinliuoksen (Life Technologies) 5 minuutin ajaksi ennen kuin se ladattiin 4-12% gradientti Bis-Tris denaturoivalla polyakryyliamidigeelillä (Life Technologies). Sen jälkeen kun näytteen erottamisen elektroforeesilla, proteiinit siirrettiin Immobilon-FL (Millipore) kautta elektroblottaus. Ensisijainen vasta-aineita ja laimennoksia mukaan lukien SBP1 1: 1000 (hiiri, MBL International, Woburn, MA), β-aktiini 1: 10000 (hiiri, Sigma), DKK1 1: 1000 (kani, Proteintech, Chicago, IL), ANXA4 1: 1000 (kani, Proteintech, Chicago, IL), PPIA 1: 1000 (kani, Proteintech, Chicago, IL), FABP4 1: 1000 (kani, Proteintech, Chicago, IL), UGDH 1: 1000 ( kani, Proteintech, Chicago, IL), ALDH2 1: 1000 (kani, Proteintech, Chicago, IL), p21 1: 1000 (kani, Proteintech, Chicago, IL), fosfo-Akt (Ser473) 1: 1000 ( kani, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), Akt 1: 1000 (kani, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), fosfori-FOXO1 1: 1000 (kani, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), fosfori-JNK 1: 1000 (kani, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), JNK 1: 1000 (kani, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), Pc-Jun 1: 1000 (kani, Cell Signaling Technology, Danvers, MA ), fosfori-sykliini D1 1: 1000 (kani, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), sykliini D1 1: 1000 (kani, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), fosfori-p53 (Ser15) 1: 1000 (kani, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), TWIST 1: 1000 (kani, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), β-kateniinin 1: 500 (vuohi, Santa Cruz, Santa Cruz, CA), ja GPX1 1: 1000 (hiiri, MBL International, Woburn, MA) inkuboitiin membraanin 4 ° C: ssa yön yli. Sopiva sekundaarinen vasta-aine (Beyotime Biotekniikan instituutti, Kiina) levitettiin (1: 1000, kaniini tai hiiri) huoneen lämpötilassa 1 tunti. Signaali havaittiin käyttäen BeyoECL Plus (Beyotime Biotekniikan instituutti, Kiina).

In vivo

nude-hiirten kasvainten synnyssä ja etäpesäkkeiden määritys

ksenografti kokeilu, HCT116-laki ja HCT116 -TetSBP1 soluja käsiteltiin 1 ug /ml doksisykliiniä 72 tunnin ajan ja sitten 2 x 10

6 solua 100 ul: ssa PBS: ää injektoitiin subkutaanisesti 6-8 viikkoa vanhoja BALB /c-CD-1-nu-naaraita hiiriä eri puolille ( HCT116-laki oli vasemmalla puolella ja HCT116-TetSBP1 oli oikealla puolella). Doksisykliini (200 ug /ml), liuotettiin 5% sakkaroosia toimitetaan juomavettä vaihdettiin 3 päivän välein. Neljä viikkoa injektion jälkeen, kasvaimet eristettiin ja paino (g) ja tilavuuden (mm

3) kasvainten määritettiin. Kasvaimia säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes se käytettiin immunoblot ja iTRAQ analyysi.

tuottamiseksi kokeellisen keuhkometastaasitestissä, HCT116-lain ja HCT116-TetSBP1 soluja käsiteltiin 1 ug /ml doksisykliiniä 72 tunnin ajan ja sitten 2 x 10

6 solua 100 ul: ssa PBS: ää injektoitiin sivusuunnassa häntälaskimoihin 6-8 viikkoa vanhoja BALB /c-CD-1-Nu-naarashiiriä. Doksisykliini (200 ug /ml), liuotettiin 5% sakkaroosia toimitetaan juomavettä vaihdettiin 3 päivän välein. Kuusi viikkoa myöhemmin hiiret tapettiin nukutuksessa. Keuhkot kerättiin ja kiinnitettiin 10% formaliinilla. Sillä kudosmorfologia arviointi, hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE) värjäys suoritettiin osissa sulautettuun näytteistä.

Proteiini uuttamalla, ruoansulatusta ja iTRAQ merkintöjä

Yhteensä proteiinit uutettu tuumorikudoksessa HCT116-lain pistetään (Act) ja HCT116-TetSBP1 injektoidaan hiiriin (TetSBP1) käyttäen seuraavaa protokollaa. Kolme biologinen rinnakkaista tehtiin kullekin näytteelle ja sekoitetaan yhteen proteiinin uuttamalla. Kasvainkudoksessa keitettiin SDT-puskuria (4% SDS, 100 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7,6) 5 minuutin ajan, homogenoidaan FastPrep-24 (MP Biomedicals, 6M /S, 30s, kaksi sykliä), ja sitten sonikoitiin ( 100W, 30 sekuntia päällä, 30 s pois, 10 jaksoa). Homogenaattia sentrifugoitiin 12000 10 minuuttia 4 ° C: ssa. Proteiinipitoisuudet määritettiin Bradfordin menetelmällä [9]. Yhtä suuri määrä proteiineja, valmistettiin kutakin näytettä. Proteiinidigestio suoritettiin mukaisesti FASP kuvanneet Wisniewski, Zougman et ai. [10], ja tuloksena peptidi seosta leimattiin käyttäen 4-Plex iTRAQ mukaista reagenssia valmistajan ohjeiden mukaisesti (Applied Biosystems). Lyhyesti, 200 ug proteiineja kunkin näytteen sisällytettiin 30 ui STD-puskuria (4% SDS, 100 mM DTT, 150 mM Tris-HCI, pH 8,0). Pesuaine, DTT: tä ja muita alhaisen molekyylipainon komponentit poistettiin käyttäen UA-puskuria (8 M urea, 150 mM Tris-HCI, pH 8,0) toistuvasti ultrasuodatuksella (Microcon yksikköä, 30 kD). Sitten 100 ui 0,05 M jodiasetamidi UA puskuria lisättiin estää vähentää kysteiinitähteiden ja näytteitä inkuboitiin 20 minuutin ajan pimeässä. Suodattimet pestiin 100 ul: lla UA puskuria kolme kertaa ja sitten 100 ui DS-puskuria (50 mM triethylammoniumbicarbonate pH 8,5) kaksi kertaa. Lopuksi, proteiini suspensiot digestoitiin 2 ug trypsiiniä (Promega) 40 ul: DS-puskuria yön yli 37 ° C: ssa, ja tuloksena peptidit kerätään suodos. Peptidi sisältö arvioitiin UV-valon spektrin tiheys 280 nm: ssä käyttäen sukupuuttoihin kertoimen 1,1 0,1% (g /l) liuokseen, joka oli laskettu taajuuden tryptofaanin ja tyrosiinin selkärankaisten proteiineja. Merkintöjä, kukin iTRAQ reagenssia liuotettiin 70 ul: aan etanolia ja lisätään vastaavaan peptidiin seos. Näytteet leimattiin (TetSBP1) -114, (laki) -115, ja olivat multipleksoitu ja tyhjökuivatetaan.

Nestekromatografia (LC) -electrospray (ESI) tandem MS (MS /MS) analyysi Q exactive

peptidi seosta suolat C18 patruunat (Sigma), konsentroitiin sitten vakuumissa sentrifugoimalla ja liuotetaan uudelleen 40 ul: aan 0,1% (v /v) trifluorietikkahappoa. MS-kokeet suoritettiin Q Exactive massaspektrometrillä, joka oli kytketty Easy NLC (Thermo Fisher Scientific). 10 ui näytettä injektoitiin varten nanoLC-MS /MS-analyysi. Peptidiseos (5 ug) ladattiin C18-käänteisfaasikolonnilla (Thermo Scientific Easy pylväs, 10 cm pitkä, 75 um sisähalkaisija, 3 um hartsi) puskurissa A (0,1% muurahaishappoa) ja erotettiin lineaarisella gradientilla puskuria B (80% asetonitriiliä ja 0,1% muurahaishappoa), virtausnopeudella 250 nl /min ohjataan IntelliFlow tekniikan yli 240 min. MS-tiedot hankittiin käyttäen data-riippuvainen top10 menetelmä dynaamisesti valitsevat runsain edeltäjä ionit Kyselyn skannaus (300-1800 m /z) ja HCD pirstoutuminen. Määrittäminen tavoitearvo perustuu ennakoivaan Automatic Gain Control (pAGC). Dynaaminen syrjäytyminen kesto oli 60 s. Survey skannaukset hankittiin resoluutiolla 70000 m /z 200 ja resoluution HCD spektrien asetettiin 17500 m /z 200. Normalized törmäys energia oli 30 eV ja Välitäytteen suhde, jossa määritellään vähimmäisprosenttimäärä tavoitearvon todennäköinen voitaisiin päästä mahdollisimman täyttöaika, määriteltiin 0,1%. Instrumentti ajettiin peptidi tunnustamista tila käytössä.

iTRAQ proteiinin tunnistamiseen ja kvantifiointiin

MS /MS-spektrit etsittiin käyttäen MASCOT moottori (Matrix Science, London, UK, versio 2.2) upotettu Proteome Discoverer 1.3 (Thermo Electron, San Jose, CA) vastaan ​​UniProt Human tietokannasta (136615 sekvenssit, ladatut 7. toukokuuta, 2014) ja syötti tietokantaan. Proteiinin tunnistaminen, seuraavat vaihtoehdot käytettiin: Peptidi massa toleranssi = 20 ppm, MS /MS toleranssi = 0,1 Da, entsyymi = Trypsiini, Missed pilkkominen = 2, Korjattu muutos: karbamidometyyli (C), iTRAQ 4-Plex (K), iTRAQ 4-plex (N-termi), Variable muutos: Hapetus (M), FDR≤0.01. Ottaen huomioon, että useita MS /MS-spektrit ottelu yhden peptidin, normalisointi signaalin intensiteetin jokaisen MS /MS-spektrit suoritettiin löytää todennäköisin ilmaus suhde peptidin. Kvantitatiivista muutoksia, 1,2-kertainen raja oli asetettu määrittämään ylös-kertynyt ja alas-kertynyt proteiineja, joiden p-arvo 0.05.

bioinformatiikan analyysi

Funktionaalianalyysi tunnistettujen proteiinien suoritettiin käyttäen Gene ontologia (GO) huomautus (https://www.geneontology.org/) ja proteiinit luokitellaan niiden biologista prosessi, molekyyli- toiminta ja solusijaintipaikan [11]. Differentiaalisesti kertynyt proteiinit edelleen määritetty Kioton Encyclopedia of Genes and Genomit (Kegg) tietokanta (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html) [12].

Tulokset

SBP1 induktio nude-hiirissä esti kasvaimen kasvua ksenograftien

SBP1 ekspressiotasot HCT116-lain ja HCT116-TetSBP1 solut määritettiin immunoblottauksella analyysi. Kuten kuviossa 1A, HCT116-TetSBP1 solulinjan ilmaisivat korkeaa SBP1 jälkeen doksisykliini induktion verrattuna HCT116-lain soluissa. Sen testaamiseksi SBP1 yliekspressio oli kasvain estävä toiminto

in vivo

kuten raportoitu aiemmin [13], suoritimme vierassiirrekokeissa CD1 Nu nude-hiirissä (n = 10 yhteensä). HCT116-Act ja HCT116-TetSBP1 soluja käsiteltiin 1 ug /ml doksisykliiniä 72 tunnin ajan ja sitten 2 x 10

6 solua 100 ul: ssa PBS: ää injektoitiin subkutaanisesti 6-8 viikkoa vanhoja BALB /c-CD-1-nu-naaraita hiirten eri puolilla, vastaavasti. HCT116-laki oli vasemmalla puolella ja HCT116-TetSBP1 oli oikealla puolella. Ylläpitää jatkuvasti induktion SBP1, doksisykliini (200 ug /ml) liuotettuna 5% sakkaroosia toimitetaan juomavesi vaihdettiin 3 päivän välein. Neljä viikkoa injektion jälkeen, kasvaimet eristettiin, ja tuumorin paino (g) ja tilavuuden (mm

3) analysoitiin. Olemme havainneet, että kasvaimen koossa on johdettu HCT116-TetSBP1 solut olivat paljon pienempiä kuin kontrolliryhmässä HCT116-Act-soluissa (kuvio 1B ja 1C). Lisäksi kasvainten paino johdettu HCT116-TetSBP1 solujen väheni merkittävästi verrattuna HCT116-lain (kuvio 1 D). Nämä tulokset viittasivat vahvasti siihen, että

in vivo

induktioon SBP1 osoittivat kasvaimen esto hiirissä.

(A) SBP1 aiheuttama doksisykliini HCT116-TetSBP1 solut validoitu immunoblot-analyysillä. (B) valokuvat kuvaavat tyypillisiä kasvainten ksenografteissa kanssa SBP1 induktio (TetSBP1, oikealla) verrattuna tuumoreihin SBP1 induktio (laki, vasen). 10 hiirtä yhteensä. (C-D) SBP1 induktio johtaa laskua kasvaimen tilavuus ja paino. Tulokset analysoitiin Studentin t-testiä ja näytetään keskimääräisenä ± SD. ** P 0,01.

SBP1 induktio tukahdutti kasvaimen etäpesäke

in vivo

tarkastella SBP1 tuumorin etäpesäkkeen, The HCT116-lain ja HCT116-TetSBP1 soluja käsiteltiin 1 ug /ml doksisykliiniä 72 tunnin ajan ja sitten 2 x 10

6 solua 100 ul: ssa PBS: ää injektoitiin sivusuunnassa häntälaskimoihin 6-8 viikkoa vanhoja BALB /c-CD-1 Nu naaraspuolisia hiiriä (n = 5 kussakin ryhmässä). Ylläpitää jatkuvasti induktion SBP1, doksisykliini (200 ug /ml) liuotettuna 5% sakkaroosia toimitetaan juomavesi vaihdettiin 3 päivän välein. 6 viikon kuluttua hiiret nukutettiin ja hiiren keuhkoissa otettiin talteen, kiinteät ja leikeltiin. Huomasimme, että hiiret, joihin on siirretty HCT116-lain soluissa oli nähtävissä keuhkojen etäpesäkenystyröiden, vaikka ei hiirellä HCT116-TetSBP1 ryhmä osoitti näkyvää keuhkometastaasitestissä (kuvio 2A). Sen jälkeen hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE) värjäys, numerot keuhkojen etäpesäkenystyröiden laskettiin. Tulokset osoittivat, että hiirten SBP1 induktio (HCT116-TetSBP1 ryhmä) johti vähentynyt merkittävästi keuhkojen etäpesäkenystyröiden (kuvio 2B), mikä osoittaa metastaattisen esto SBP1

in vivo

.

( A) kuvat ovat keuhkojen ja hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE) -staining keuhkojen eristetty hiirillä, jotka saivat häntälaskimoon injektion HCT116-lain solut (Act) ja HCT116-TetSBP1 soluja (TetSBP1). Kukin ryhmä sisältää 5 hiirtä. Nuolet havainnollistaa näkyvän kyhmyjä ja etäpesäkenystyröiden keuhkoissa. Asteikko bar = 200 pm. (B) SBP1 induktio inhiboi kasvaimen etäpesäke

in vivo

. Numerot keuhkojen etäpesäkenystyröiden laskettiin mikroskoopilla ja analysoitiin Studentin t-testiä. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD. ** P 0,01.

määrälliset tunnistaminen ja bioinformatiikan analyysi kasvainkudoksen proteiinien määritettiin iTRAQ

määrittämiseksi mekanismeja SBP1-välitteisen kasvaimen kasvun inhibition ja etäpesäkkeiden hiirillä, poimimamme peräisin olevan proteiinin kokonaismäärän tuumorikudoksessa HCT116-lain pistetään (laki) ja HCT116-TetSBP1 injektoidaan hiiriin (TetSBP1), ja proteiiniprofiileja suoritettiin käyttäen iTRAQ. Lopulta 9147 ainutlaatuinen peptidejä, 2015 proteiini ryhmiä ja 1975 proteiinit tunnistettiin. Jakauma pituudet ja numerot peptidejä, massa ja järjestyksessä kattavuus proteiinien tarjotaan (S1 taulukko).

muutoksia proteiiniprofiilia vastauksena SBP1 induktioon analysoitiin. 132-proteiinit osoittivat merkittävää eroa (p-arvo 0,05), jossa on FDR alle 1%, kuten 53 ilmen- tymisen lisääntymisen proteiineja ja 79 vaimentua proteiineja. Merkitykselliset yksityiskohtaiset tiedot tarjotaan (S2 taulukko). Nämä differentiaalisesti kertynyt proteiinit rikastettu 1364 merkinnät läpi GO analyysin ja luokiteltiin kolmeen ryhmään: biologinen prosessi, molekyyli-toiminto, ja solujen komponentti (kuvio 3A). Pääluokat biologisen prosessin mukana soluprosessiominaisuuksia, single-organismi prosessi, biologinen asetus, aineenvaihduntaa ja vastaus ärsyke. Perustuu eri molekyylien toimintoja, näitä proteiineja jaettiin ryhmiin sitovia, katalyyttinen aktiivisuus, rakenteelliset molekyylin aktiivisuutta, entsyymin säädin aktiivisuus, kuljettaja aktiivisuus ja antioksidantti. Nämä proteiinit olivat myös mukana eri solukomponenttien, kuten solujen, organelle, makromolekyylikompleksi, kalvo ja kalvo umpinaiset lumenia. Nämä differentiaalisesti kertynyt proteiinit edelleen luokitellaan käyttäen Kegg tietokantaa. Merkittävimmät reittejä mukana ilmentyvät eri proteiinien johtuvat SBP1 induktio, mukaan lukien transkription misregulation syövän, tiiviin liitoksen, lysosomifuusio, proteiini käsittely Endoplasmakalvosto, HIF-1 signalointireitin, PI3K-Akt signalointireitin, reittejä syövän, proteoglykaanien syöpä , MikroRNA syövän, ja glykolyysiin /glukoneogeneesin ja muita reittejä. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että lipidi /glukoosiaineenvaihdunnan on erittäin liittyy syövän synnyn [14-17]. Siksi me analysoitiin sitten enimmäkseen muuttuneita proteiineja, jotka liittyvät lipidi- /glukoosiaineenvaihdunnan hiirestä ksenograftikasvaimissa. Mielenkiintoista, kolmetoista rasva-aineenvaihduntaan liittyvien proteiinien ja seitsemän glukoosiaineenvaihdunnan liittyviä proteiineja merkittävästi muuttunut SBP1 induktio hiiren ksenograftikasvaimissa. Kaikki nämä lipidi /glukoosiaineenvaihduntaan liittyvien proteiinit kuviossa 3B perustuu niiden biologisten tehtävien kautta Gene ontologia (GO) analyysi.

(A) Kaikki 132 differentiaalisesti kertynyt proteiinit luokiteltiin kolmeen ryhmään: biologinen prosessi, molekyyli-toiminto, ja solujen komponenttien avulla GO analyysi. (B) numerot rasva /glukoosiaineenvaihdunnan-sukuiset proteiinit osoitettiin kautta GO analyysi.

Muutokset rasva /glukoosiaineenvaihdunnan liittyvien proteiinien vastauksessa SBP1 induktioon

kuviossa 3B, kolmetoista rasva-aineenvaihduntaan liittyvien proteiinien valittiin, mukaan lukien viisi ilmen- tymisen lisääntymisen proteiinit ja kahdeksan vaimentua proteiineja (Taulukko 1). Kaikkein ilmen- tymisen lisääntymisen proteiinien SBP1 induktion sisältyvät DKK1, joka estää WNT reitti [18], DHCR7 joka ohjaa kolesterolia ja D-vitamiinin synteesiä [19], ANXA4 joka estää NFKB polku ja IL-8 [20], ja AGPAT5, joka estää rintasyöpäsolujen lisääntymistä [21]. Kaikki nämä proteiinit on raportoitu näyttää mahdollisia syöpää ehkäisevistä vaikutuksista. Kun taas muut proteiinit, kuten LPCAT2, että ilmentyy voimakkaasti tulehdussolujen [22], BPIFA3, joka on hyvin ilmaistaan ​​keuhkosyövän [23], PPIA joka aktivoi NFKB reitti [24], ja FABP4, joka on pro-angiogeeninen rooli [25 ], oli vaimentua vuonna SBP1 yli-ilmentymiseen ksenograftikasvaimissa. Sen sijaan, seitsemän glukoosiaineenvaihduntaan liittyvien proteiinien merkittävästi vaimentua in SBP1 yliekspressio ksenograftikasvaimissa, mukaan lukien GAA, GAPDH, ALDH2, tioredoksiini, ENO3, UGDH ja Lumican (taulukko 2).

validoidaan ero lipidiaineenvaihdunnan muutoksia /glukoosiaineenvaihduntaan liittyvien proteiinien määritettiin päässä iTRAQ proteomiikka-analyysi hiiren ksenograftikasvaimissa, immunoblotting-analyysit suoritettiin. Yhdenmukaisia ​​havaita iTRAQ profiilin, kaksi proteiinia (DKK1 ja ANX4) on merkittävästi lisääntynyt ja neljä proteiineja (PPIA, FABP4, ALDH2 ja UGDH) olivat merkittävästi vähentyneet SBP1 yliekspressio ksenograftikasvaimissa (S1 Kuva). Korkea johdonmukaisuus osoitti korkean luotettavuuden iTRAQ tuloksia. MS /MS-tiedot näistä kuudesta proteiinit tarjotaan (S2 Kuva).

Kasvain esto SBP1 liittyi useita signalointireittien

in vivo

Voit selvittää lisämekanismien ja SBP1 induktion estoa kasvaimen kasvun ja etäpesäkkeiden, olemme analysoineet kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden liittyvä signalointireittien hiirellä ksenografti tuumoriproteiinia näytteet, joita käytettiin myös iTRAQ proteomiikka-analyysi. Ensin GPX1 säädeltiin vähentävästi vuonna TetSBP1 kasvaimissa (kuvio 4), samankaltaiset kuin ihmisen eturauhassyöpäkudoksille [26], mutta se oli erilainen kuin

in vitro

tutkimuksia, jotka osoittivat, että yli-ilmentävät SBP1 eivät vaikuttaneet GPX1 proteiinin tasot HCT116-soluissa, vaikka GPX1 toimintaa merkittävästi vaimentua [6]. Tämä havainto taas ehdotettu käänteinen korrelaatio SBP1 ja GPX1

in vivo

ei

in vitro

. Toiseksi, induktio SBP1 johti aktivaatioon JNK1 /Wnt-reitin, lisääntymisen suhteen fosforylaation JNK1 ja c-Jun, ja vähentynyt ilmentyminen beeta-kateniinin ja sen loppupään tavoitteet sykliini-D1, erityisesti fosforyloitu sykliini D1 merkittävästi vaimentua ( kuvio 4). Lisäksi beeta-kateniinin estäjät p53 (fosforyloitu p53, p-p53) ja p21, suora alavirtaan kohteena p53, lisättiin vastauksena SBP1 induktioon hiiren TetSBP1 kasvaimissa (kuvio 4). Kolmanneksi induktio SBP1 johtanut merkittävään vähentämiseen TWIST (kuvio 4), kriittinen säädin EMT ja etäpesäkkeitä.

Useita tyypillisiä merkkiaineita eri signalointireittien tutkittiin käyttäen iTRAQ proteomiikka analyysiä proteiinia näytteistä. Nämä syöpään liittyvät signalointireittien reagoivat eri SBP1 induktion.

Keskustelu

Vähentynyt ekspressio SBP1 on havaittu useita erilaisia ​​ihmisen syövissä, mukaan lukien peräsuolen, keuhko-, ruokatorven, mahalaukun, rinta- ja maksan syövät, ja vähentäminen SBP1 liittyy huono selviytyminen [5]. Vähennys SBP1 lisääntynyt solun liikkuvuus, edistää solujen lisääntymistä, ja tukahdutti solujen erilaistumista

in vitro

, vaikka hiiret SBP1 geneettinen puutos (ts SBP1 hiirten) eivät osoittaneet selvää fenotyypit [3,27,28]. Sitä vastoin yhä SBP1 ilmentymistä soluissa transfektoimalla SBP1 ilmentävien plasmidin voisi johtaa vanhenemista, esto syöpäsolujen lisääntymistä, muuttoliike ja kasvaimen kasvua immuunipuutteisilla hiirillä [3,13,29,30]. Meidän aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että SBP1 väheni useimmissa Kolorektaalituumorien verrattuna nontumor kudoksiin ottaa huomioon, että on muuttuva ekspressiotasot erilaisissa syöpäsolulinjoissa [6,13,29]. Esimerkiksi, SBP1 ilmentyy vahvasti LS174T, Caco-2, HT-29 ja MCF-7, mutta huomaamaton HCT116. Joten ihmisen paksusuolen syövän solulinja HCT116 käytettiin yli-ilmentämään SBP1 tutkimuksessamme. Tässä tutkimuksessa käyttämällä indusoituvia järjestelmää ja hiiren ksenograftimallissa, olemme havainneet, että

in vivo

induktion SBP1 osoittivat merkittävää syövän vaikutuksia, mukaan lukien inhiboi kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden nude-hiirissä. Etuja käyttämällä tätä SBP1 Tet-on indusoituva geeniekspression järjestelmä on lueteltu seuraavasti: 1) Tämä indusoituva geeniekspression järjestelmä tekee SBP1 yliekspressio hallittavissa, jolloin solut pidetään ilman SBP1 häiriöitä ja transfektio vahingot voidaan minimoida, kun yli-ilmentymistä on tarpeen; 2) Tässä tutkimuksessa, SBP1 ilmaisu ei ole tunnistetta muutos ja ekspressoidun proteiinin pysyy luonnollisessa tilassa. Kaikki nämä havainto viittasi siihen, että sekä sisäsyntyinen ja kohdunulkoinen SBP1 voisi toimia mahdollisena kasvain vaimennin.

Voit selvittää taustalla molekyylitason mekanismeja, Proteomiikan tekniikka iTRAQ etiketti määrityksessä käytettiin. Niistä 1975 tunnistettu proteiineja, 132 proteiinit differentiaalisesti ilmaistut SBP1 aiheuttama kasvain kudosta. Tarkempi analyysi rajanneet ilmentyvät eri proteiinit kolmeentoista lipidiaineenvaihdunnan liittyviä ja seitsemän glukoosiaineenvaihdunnan liittyviä proteiineja. Niistä kolmetoista rasva-aineenvaihduntaan liittyviä proteiineja, viisi oli voimistunut (DKK1, HSP60, DHCR7, ANXA4 ja AGPAT5) ja kahdeksan oli vaimentua (LPCAT2, GPX5, GAPDH, NMe2, ALDH2, BPIFA3, PPIA ja FABP4). Vuonna voimistunut proteiinien SBP1 induktio, DKK1 tunnetaan estäjä Wnt /β-kateniinin reitin [18]. Säätelyä DKK1 voisi aktiivista N-terminaalista Jun-kinaasia (JNK) ja apoptoosin [31,32], ja voi säädellä negatiivisesti EMT kautta TWIST eston [33]. Itse asiassa, meidän aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että aktivoitu JNK1 voi myös säädellä negatiivisesti β-kateniinin GSK3: n kautta-beta [34]. Lisäksi lisääntyneen ekspression DKK1 voi johtaa downregulation sykliini D1, suoraan alavirtaan kohteena beeta-kateniinin. Meidän edellinen työ on osoittanut sääntelyn vuorovaikutusta JNK1 ja p21 [35]. Tässä olemme havainneet, että vastauksena ylössäätelyyn DKK1 ja JNK1, p21 ja sen ylävirran tavoite p53 nostettiin (kuvio 4). Mielenkiintoista on, että Wnt /beeta-kateniinin signaalireitin, on negatiivinen sääntely vuorovaikutusta beeta-kateniinin /sykliini D1 ja p53 /p21 [36]. Niistä validoitu rasva-aineenvaihduntaan liittyviä proteiineja, ANXA4 säädeltiin voimakkaammaksi ja PPIA säädeltiin vähentävästi. On raportoitu, että ANXA4 voisi estää NF-kB transkriptionaalisen aktiivisuuden vuorovaikutuksessa NF-kB p50-alayksikön [20] ja sytokiinien (esim. IL-8 [37]). Sen sijaan PPIA voisi aktiivinen NF-kB-reitin ja tulehduksellinen signalointi [24]. Lukuisat tutkimukset ovat voimakkaasti osoittaneet, että NF-kB ja krooninen tulehdus keskeisessä asemassa ovat syövän muodostumisen ja etenemisen [38]. Toinen vaimentua proteiini oli FABP4. On raportoitu, että FABP4 välittää VEGFA riippuvainen pro-angiogeeninen vaikutus, joka on yhteydessä KAATOLOVEN signalointia karsinogeneesin ja etäpesäkkeiden [25].

Kaikki seitsemän glukoosiaineenvaihduntaan liittyvien proteiinit vaimentua in SBP1 indusoi-kasvainkudoksen mukaan lukien GAA, GAPDH, ALDH2, tioredoksiini, ENO3, UGDH ja Lumican. UGDH (UDP-glukoosidehydrogenaasia) katalysoi hapettumisen UDP-glukoosin, jolloin saatiin UDP-glukuronihappoa, esiaste hyaluronihappoa (HA) ja muiden glykosaminoglykaanien (GAG: t) on soluväliaineen. Aikaisempi tutkimus on osoittanut, että laskeva UGDH estää solujen aggregaatiota ja muuttoliike [39]. Lisäksi todettiin, että ALDH2 inaktivaatio voisi lisätä sytotoksisuuden tuottama lipidiperoksidaatiossa [40]. Nämä tulokset viittaavat siihen, downregulation UGDH ja ALDH2 saattaa johtua syöpää ehkäisevistä vaikutuksista on SBP1.

Yhteenvetona käyttämällä SBP1 indusoituvan järjestelmän ja

in vivo

hiirimallissa, tutkimuksemme ovat selvästi osoittaneet, että kasvain esto roolit SBP1 liittyvät muutokset rasva /glukoosiaineenvaihdunnan liittyviä proteiineja osallistumisen kautta useiden signalointireittien, paljastaen uusi molekyyli kasvainten inhibition SBP1.