Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Epigeneettiset hiljentäminen on yhteinen mekanismi inaktivoimiseksi tuumorisuppressorigeeneille aikana syövän synnyn. Enhancer of Zeste 2 (EZH2) on histoni metyylitransferaasin alayksikön Polycomb tukahduttavia monimutkainen 2 välittävä transkription repression kautta histoni metylaatio. EZH2 yli-ilmentyminen on yhdistetty aggressiivinen fenotyypit tiettyjä syöpiä. Kuitenkin mekanismi, joka EZH2 pelataan edistämisessä syöpään ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) jää epäselväksi. Lisäksi korrelaatio EZH2 yli-ilmentymisen ja ennusteen NSCLC potilaiden ei-Aasian kohortti on määritettävä.

Menetelmät /Principal Havainnot

Up-regulation of EZH2 löytyi NSCLC soluissa verrattuna normaaliin ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen western blot -määritys. Kun EZH2 pudotus käyttäen Sirna (siRNA), leviämisen ankkurista riippumaton kasvu ja invaasion NSCLC-soluja huomattavan tukahdutettiin syvällisiä induktion G1 pidätys. Lisäksi ilmaisu sykliini D1 huomattavasti alennettu taas p15

INK4B, p21

Waf1 /CIP1 ja p27

Kip1 korotettiin NSCLC soluissa jälkeen EZH2-siRNA toimitus. Sen määrittämiseksi, onko EZH2 ilmentyminen myötävaikuttaa taudin etenemistä potilailla, joilla on NSCLC, Taqman kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR: ää käytettiin mittaamaan ilmentymisen EZH2 pariksi kasvain ja normaali näytteitä. Univariate analyysi paljasti, että potilaalla on NSCLC joiden kasvaimet oli korkeampi EZH2 ilme oli huomattavasti huonompi yleistä, tautikohtaisia, ja taudista vapaan eloonjääneiden verrattuna joiden kasvaimet ilmaisivat alempi EZH2 (P = 0,005, P = 0,001 ja P = 0,003 ). Vuonna Monimuuttuja-analyysissä EZH2 ilme oli itsenäinen ennustaja tautivapaan elinajan (riskisuhde = 0,450, 95% CI: +0,270-+0,750, P = 0,002).

Johtopäätökset /merkitys

tulokset osoittavat, että EZH2 yliekspressio on kriittinen NSCLC etenemistä. EZH2 mRNA-tasot voivat toimia ennustetyövälineenä ennustaja potilaille NSCLC.

Citation: Cao W, Ribeiro RDO, Liu D, Saintigny P, Xia R, Xue Y, et al. (2012) EZH2 Edistää pahanlaatuiset käyttäytymistä kautta Cell Cycle säätelyhäiriön ja sen mRNA-taso Associatesin prognoosi Potilaan kanssa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 7 (12): e52984. doi: 10,1371 /journal.pone.0052984

Editor: Qing-Yi Wei, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 22 marraskuu 2012; Julkaistu: 31 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Cao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukee NIH avustuksia R01 CA126818 ja R01 CA136635. WC tukee osittain National Natural Science Foundation of China (Grant nro 81202130). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

keuhkosyöpä on johtava syy syöpään liittyvien kuolemien Yhdysvalloissa, se tappaa yli 160000 amerikkalaiset vuosittain [1], joista ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) osuus on yli 85%: ssa tapauksista. Huolimatta käynnissä parannuksista kirurgisten tekniikoiden ja chemoradiation hoito, 5 vuoden eloonjäämisaste potilailla, joilla on pitkälle edennyt ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ei parantanut puutteen takia tehokkaita hoitoja [2]. Vastaavia muita syöpiä, useita vaiheita, jotka johtivat kertyminen geneettisten ja epigeneettiset vaihtelussa olivat mukana taudin alkamisen ja etenemisen keuhkosyövän [3], [4]. Siksi ymmärtäminen molekyyli- mekanismi syövän etenemisen on kriittinen edistäville Keuhkosyövän hoidossa [5], [6], [7].

metylointi CpG saarten promoottorialueissa on yhteinen epigeneettiset mekanismi inaktivoimiseksi tuumorisuppressorigeeneille, kuten

p16, PTEN, DAPK

[8], [9]. Polycomb- ryhmä proteiineja (PcG proteiinit) ovat tärkeitä epigeneettisellä sääntelyviranomaisten liittyvien geenien solujen lisääntymisen, erilaistumisen, kuvio muodostumista ja kantasolujen uusimista [10], [11], [12]. EZH2 kuuluu PcG proteiinien ja osa Polycomb repressori kompleksi (PRC) 2, joka metyloi histoni H3 lysiinin 27 (H3K27Me3). H3K27Me3 puolestaan ​​toimii maamerkkinä palkkaamalla muuta proteiinia komplekseja, kuten PRC1, välittävän epigeneettiset äänenvaimennusjärjestelmän [13]. On osoitettu, että PRCs voi rekrytoida DNA metyylitransferaaseja suoraan ja indusoida DNA: n metylaatio [14], [15]. Yliekspressio EZH2 on havaittu useita kasvaintyypeissä [16] – [25], ja niihin, joilla on huono ennuste. Kuitenkin EZH2 näyttää olevan selvä biologisia rooleja eri syöpätyyppejä, koska se liittyy enemmän suosikki ennustetta joidenkin syöpien [26], [27].

Vaikka EZH2 proteiinin tasot osoitettiin olevan negatiivinen prognostinen indikaattori NSCLC [17], [18], taustalla olevan mekanismin EZH2 edistämisessä syöpään NSCLC ei ole hyvin tunnettu. Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet määrittämään biologisten vaikutusten EZH2 ovexpression NSCLC ja arvioimaan mahdollisuutta käyttää EZH2 mRNA ekspressiotasot mahdollisena biomarkkereiden ennustaa kliinisiä tuloksia potilailla, joilla on NSCLC.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat ja Potilaat

NSCLC solulinjoissa (H157, H226, H292, H358, H460, H522, A549, H596, H1299, H1792, H1944, Calu-1, ja SK-Vies- 1) käytetään tutkimuksessa saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA) ja niitä kasvatettiin DMEM, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (Mediatech, Manassas, VA). Normaalit ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen solulinjoissa HBE1, HBE2 ja HBE3 (ystävällisesti Dr. John Minna of The University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas TX) viljeltiin keratinosyyttien seerumia 25 ug /ml naudan aivolisäkeuutteella ja 0,2 ng /ml rekombinanttia epidermaalista kasvutekijää (Invitrogen, Carlsbad, CA), kuten aiemmin on kuvattu [28], [29].

Kliiniset näytteet mukana tutkimuksessa koostuvat primaaristen kasvainten ja niiden vastaavat ei-pahanlaatuisten keuhkojen kudokset muodostavat 94 henkilöä jossa patologinen vaiheessa I-IV NSCLC. Kaikki potilaat hoidettiin resektioleikkaukselle primäärikasvaimissa, paitsi ne, joilla on vaiheen III ja IV kasvaimia, jotka saattavat myös saada leikkauksen jälkeinen sädehoito ja adjuvanttihoitoa, MD Anderson Cancer Center vuodesta 1995 vuoteen 2000. Näytteet jäädytettiin välittömästi ja varastoitiin -80 ° C: ssa analyysiin asti. Valinta näistä potilaista perustui saatavuuteen arkistoitu tuoretta kasvain ja vastaava normaali keuhkojen kudosten tutkijoille. Kliiniset tiedot ja seurantatietoa tutkimukseen perustuivat kaavion tarkastelu ja raportit MD Anderson kasvain rekisterin palveluun. Tietoon perustuva suostumus käyttöön jäljellä resektoitiin kudosten tutkimukseen saatiin kaikista osallistuneista potilaista tutkimukseen ja kaikki osallistujat, jos niiden kirjallinen lupa olla mukana tässä työssä. Tutkimus tarkasteli ja hyväksynyt Institutional Review Board of The University of Texas MD Anderson Cancer Center.

RNA ja Taqman Gene Expression Analysis

Yhteensä RNA kudosnäytteistä uutettiin käyttämällä Trizol mukaisen reagenssin valmistajan ohjeiden. Noin 1-2 ug kokonais-RNA: ta kustakin näytteestä muutettiin cDNA: ksi käyttäen SuperScript II käänteistranskriptaasia (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), 20 ul: n tilavuudessa. CDNA-tuote laimennettiin 100 ul: ksi steriilillä vedellä. Sillä Taqman geenin ilmentymisen määritystä, 2,5 ui laimennettua cDNA sekoitettiin aluke rajoitettu glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) endogeeninen kontrollikoettimen (Cat # 432631) ja EZH2 koetin (määritys ID Hs001016789_m1, cat # 4331182) yhteensä 25 il reaktiotilavuudessa ja analysoitiin 7500 Fast Real-Time PCR-järjestelmä (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) mukaan valmistamiseen suositellaan kunnossa. GAPDH-normalisoitu ekspressiotason EZH2 kasvainkudoksissa tai viereisten normaali keuhkojen kudoksiin laskettiin ACt (dCt_Tumor tai dCt_Normal) = Ct

EZH2-Ct

GAPDH. Monistaa ajot suoritettiin ja keskimääräiset ACt käytettiin analyysiin. Käyttämällä ekspressiotasot suhteessa vastaavaan normaaleissa kudoksissa, yksittäiset EZH2 taso määritettiin. Kannen ero EZH2 ilmentymistä kasvainkudoksessa verrattuna vastaavaan normaaliin kudokseen lasketaan 2

-ΔΔCt (vertaileva Ct-menetelmä), jossa ΔΔCt = ACt kasvain (dCt_Tumor) -ΔCt Normaali (dCt_Normal) (25). Taittaa ero 1 pidetään korkeana EZH2 ilmentyminen kasvainkudoksessa.

siRNA Transfektio

Koska EZH2 on kaksi suurta silmukointivariantit, kemiallisesti syntetisoitu siRNA: t suunniteltiin kohdistamaan sekä EZH2 silmukointivariantit ja ostettu Ambion Inc. (siRNA ID: si-4916 ja si-4917). Sekvenssit nämä siRNA ovat 5’GCUGACCAUUGGGACAGUATT-3 ’(si-4916) ja 5′-GUGUAUGAGUUUAGAGUCATT-3’ (si-4917). FAM leimattu Salatut siRNA saatiin myös Ambion Inc: In vitro lyhytaikaista transfektiota tehtiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) seuraten valmistajan protokollaa.

Western blot -analyysi

proteiinit olivat talteen viljellyistä soluista RIPA puskuria plus proteaasinestäjät (Complete proteaasinestäjä, Roche Bioscience). Kaksikymmentä mikrogrammaa kokonais-proteiinin kustakin näytteestä erotettiin natriumdodekyylisulfaatti sulfaatti- polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) käyttäen Bio-Rad Mini-Protean II laitteessa. Erotetut proteiinit geelin siirrettiin nitroselluloosamembraanille (Schleicher 0,1 mm halkaisijaltaan laskettiin alle mikroskooppinen kenttä × 20 suurennus. Keskimääräinen pesäkeluvut laskettiin 6 satunnaisesti valittua kenttiä kullekin käsittelylle kunnossa.

In vitro

Cell invaasiomääritys

In vitro invaasiomääritys suoritettiin BD BioCoat Matrigel invaasio kammiot (Falcon 354480; BD Biosciences). Uudelleenhydratoinnin jälkeen kammioiden, 1 x 10

5 ohimenevästi transfektoituja soluja 500 pl DMEM, joka sisälsi 1% FBS: ää lisättiin kuhunkin ylemmän kammioiden ja 750 ui DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää, pantiin alempaan kammioon. 20 tunnin kuluttua inkubaation jälkeen solut kiinnitettiin 4% formaldehydiä, ja värjättiin 0,5% kristallivioletilla. Ei-tunkeutuvat soluihin yläosassa kammion poistettiin käyttäen pumpulipuikolla. Tunkeutuvat solut valokuvattiin ja laskettiin 8 satunnaisesti valittua kenttiä (suurennos, × 20). Kaikki kokeet suoritettiin kahtena kappaleena ja toistettiin 3 kertaa.

Tilastollinen analyysi

Kliiniset tiedot on koottu käyttäen standardin kuvailevia tilastoja ja taajuus taulukointi. Kruskal-Wallisin testiä ja Wilcoxonin summa testi tehtiin arvioimaan eron jatkuvien muuttujien välillä /joukossa potilaan kliinisen patologisen parametreja. Korrelaatiot EZH2 mRNA ilmaisun ja kliinisiä parametrejä arvioitiin käyttämällä Pearsonin korrelaatiokerrointa. Survival käyrät arvioitiin käyttämällä Kaplan-Meier-menetelmällä. Univariate Coxin suhteellinen vaara mallia sovellettiin vaikutuksen arvioimiseksi kovarianttien eloonjäämiseen, tautikohtaisia ​​eloonjäämisen (eli ne jotka kuoli keuhkosyöpään liittyvien syiden erikseen), ja taudista vapaan eloonjäämisen (eli ne jotka kehitettiin toistuminen ja /tai etäpesäkkeiden). Coxin monimuuttuja mallia käytettiin arvioimaan vaikutuksen EZH2 ajoissa tapahtumaan tulos korjattuna muut covariates esitetty tilastollinen merkitys yhden muuttujan analyysissä. Kaikki tilastolliset testit ovat kaksipuolisia ja P

–

arvo 0,05 tai pienempi pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

t

testi tulospareille käytettiin analyysiin

in vitro

tutkimuksissa. Kaikki laskelmat suoritettiin SAS (Cary, NC) ja S-plus 7.0 for Windows (syvällisiä Corp.).

Tulokset

fenotyyppivaikutukset of EZH2 Down-asetus NSCLC Cells

EZH2 proteiini havaittiin yksittäisenä 91 kDa vyöhykkeenä Western blot kaikissa 13 NSCLC solulinjoissa ja ikuisti ihmisen keuhkoputken epiteelin soluja (HBES). Ilmaisu NSCLC-soluja oli yleensä korkeampi kuin HBES (Fig. 1A). EZH2 värjäytyminen ainoastaan ​​paikallista ytimet keuhkosyövän soluja (Fig. 1 B). H1299 ja A549, joka oli korkea ja kohtuullisesti EZH2 ilmentymisellä, valittiin lisätutkimuksia on suhde EZH2 taso ja pahanlaatuiset fenotyyppien.

(A) EZH2 ilmentyminen NSCLC keuhkosyövän soluja ja ihmisen keuhkoputken epiteeli-soluja (HBES) määritettiin Western blot käyttäen kokosolulysaatissa. Blotti Ensimmäinen koetettiin anti-EZH2 vasta-aine ja uudelleen koetettiin anti-GAPDH-vasta osoittamaan lastaus määrä. (B) Immunosytokemia värjäys viljeltyjen NSCLC-solujen. A549 ja Calu-1 solut kiinnitettiin 1% formaldehydiä värjättiin sitten anti-EZH2-vasta-ainetta, jota seurasi havaitseminen anti-hiiri-vasta-aineen ja DAB: n kromogeenista ainetta. Toissijainen-vasta-ainetta ainoastaan ​​käytetään negatiivisena kontrollina. (C) Esimerkki alas-säätely EZH2 ilmentymisen siRNA transfektiolla. H1299 ja A549-solut transfektoitiin EZH2 suunnattu siRNA si-4916 ja si-4917 siRNA: t tai salattu si-RNA-ohjaus. Kokosolulysaatissa kerättiin 72 tuntia transfektion jälkeen ja analysoitiin, kuten on kuvattu julkaisussa A.

kaksi ei-päällekkäistä siRNA: ita (SI-4916 ja si-4917) käytettiin hiljentää EZH2 ilmentymisen H1299 ja A549 solut. Transfektio si-4916 näissä NSCLC soluissa johti 10-60%: n vähennys EZH2 ilmaisun, kun taas transfektio si-4917 alennettu EZH2 proteiinin tason 70-80% (Fig. 1 C). Vähentää EZH2 ilmentyminen väheni merkittävästi leviämisen H1299 ja A549-solut (Fig. 2A ja 2B). Sen määrittämiseksi, mitkä solupopulaatio oli levoton solusyklin, virtaussytometria analyysi suoritettiin näissä transfektoiduissa keuhkosyövän soluja. Tulokset osoittivat, että vähentämällä EZH2 ilmaisu johtavat kertyminen solujen G1 vaiheeseen ja vähentää solujen S-vaiheessa (Fig. 2C ja 2D).

(A, B) leviämisen juoni solujen alas -regulated EZH2. A549 tai 1299 transfektoitiin EZH2 kohdistamisen siRNA tai sekoitetun siRNA ohjaus 6 tuntia, sitten ympättiin 96-kuoppalevylle kolmena kappaleena käsittelyä kohti. Leviämisen solujen arvioitiin WST-1-määritystä 24 tunnin välein. (C, D) jakautuminen solupopulaation EZH2 pudotus NSCLC soluja. A549 tai 1299 solua transfektoitiin siRNA tai sekoitetun ohjaus. Solut kerättiin 72 tuntia myöhemmin, kiinnitettiin ja värjättiin propidiumjodidilla. Solun DNA-pitoisuus määritettiin virtaussytometrialla, ja solujen jakauma analysoidaan FlowJo ohjelmisto.

Lisäksi, H1299 tai A549-solujen alassäädetty EZH2 ilmentyminen oli merkittävästi vähentynyt pesäkemuodostusta ominaisuus. NSCLC-solut transfektoitu si-4916 tai si-4917 johti 1,5-2,8-kertainen väheneminen muodostuneiden pesäkkeiden pehmeässä agarissa verrattuna soluihin transfektoitu sekoitetun siRNA ohjaus pehmeässä agarissa kiinnittymisestä riippumaton pesäkemuodostusta (Fig. 3A). Lisäksi kyky näiden NSCLC solujen hyökätä läpi soluväliaineen vähensi merkitsevästi myös upon EZH2 alassäätöä määritettynä Matrigel päällystetty Boyden kammion invaasiomääritys (Fig. 3B).

A549 tai 1299 transfektoitiin EZH2 kohdistaminen siRNA tai sekoitetun siRNA ohjaus 6 tuntia. (A) kiinnittymisestä riippumaton pesäkemuodostusta, transfektoidut solut ympättiin 0,35% agaroosia 6-kuoppalevyllä 2 x 10

4 /kuoppa. Pesäkkeet muodostunut laskettiin jälkeen 3-viikkoa inkuboitiin säännöllinen muutos väliaineen. (B) invaasio ja migraatiokokeessa, 1 x 10

5 transfektoituja soluja 1% seerumia ympättiin päälle BD BioCoat Matrigel invaasio kammio 10% FBS alemmassa kammiossa. 24 tunnin kuluttua solut kiinnitettiin 4% formaldehydiä 0,5% kristallivioletilla. Solut tunkeutuneet alempaan kammioon laskettiin matalan suurennus mikroskoopilla. Kokeet ajettiin kahtena ja toistettiin kolme kertaa. Keskimäärin ja standardipoikkeama kunkin käsittelyn piirrettiin täällä.

Impact of EZH2 Down-asetus Cell Cycle Regulators ja Metastaattinen Inhibitor

Korrelaatio EZH2 Expression ja kliinistä tulosta Potilaat NSCLC

Voit selvittää EZH2 lauseke myötävaikuttaa taudin etenemistä potilailla, joilla on NSCLC, mittasimme EZH2 ilmentymistason 94 NSCLC kasvain kudosten ja vastaavat viereisen ei-pahanlaatuisten keuhkojen kudosten Taqman kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR, me analysoidaan korrelaatio EZH2 ekspressiotasoja kliinisten parametrien ja hoitotuloksia.

Niistä 94 potilasta, 59 potilasta kuoli ja 35 potilasta oli elossa aikaan viime seurannan. Mediaani seuranta-aika on 56 kuukautta. Potilaiden ikä aikaan diagnoosi vaihteli 41-84 vuotta, iän mediaani oli 63 vuotta. Neljäkymmentäyksi (43%) potilaista oli naisia ​​ja viisikymmentä-kolme (56%) oli miehiä. Kuusikymmentä-kolme (67%) potilaista oli nykyistä tai virallisia tupakoitsijoita. Histologinen tyypit adenokarsinooma, squamous karsinooma, ja muut havaittiin 51%, 40%, ja 9%: lla, vastaavasti. I ja II vaiheen potilaiden osuus 66% kaikista potilaista, ja loput 34% potilaista oli vaiheen III ja IV sairaus. Yleinen kliiniset ja patologiset ominaisuudet potilaiden on koottu taulukkoon 1.

Emme havainneet merkitsevästi yhteydessä EZH2 ilmentyminen kasvaimen tai viereiseen normaali keuhkojen ja kliinis parametrit, vieressä tilastollisesti merkityksetön yhdistys tupakoinnin ja EZH2 ilmentymisen kasvaimessa (P = 0,1), ja rajatapaus korrelaatio kliinisen vaiheen ja EZH2 ilmentymistä kasvain verrattuna viereiseen normaaliin keuhkojen kudoksiin (P = 0,07, taulukko 1). Kaiken kaikkiaan löydettiin, vaan odottamatonta, että mediaani taso EZH2 ilmentymistä kasvainkudoksessa oli samanlainen kuin viereisen ei-pahanlaatuinen keuhkojen kudoksiin (DCT = 3,86 vs 3,90; mediaani kertainen muutos = 1,0, taulukko 1).

sitten analysoimme assosiaatiot EZH2 ilmaisun ja kliinisiä tuloksia potilaiden. Vuonna yhden muuttujan analyysiin, havaitsimme, että korkean EZH2 ilmentyminen kasvainkudoksessa verrattuna Hyväksytty viereiseen normaaliin keuhkokudoksessa (high EZH2-kertainen muutos) oli voimakkaasti yhteydessä kokonaiselossaoloaika, tautivapaan elinajan ja tautikohtaista potilaiden selviytymiseen NSCLC (riskisuhde = 0,477, 0,414, 0,468 ja P = 0,006, 0,002, 0,004 vastaavasti, taulukko 2). Kliininen vaihe oli marginaalinen yhdessä tautivapaan elinajan (P = 0,090). Kaplan-Meier-analyysi osoitti, että potilailla, joiden kasvaimet olivat korkealla kasvain EZH2 ilmaisun suhteessa pariksi viereiseen normaaliin keuhkokudoksessa oli huomattavasti huonompi kliininen tulos verrattuna, joiden kasvaimet olivat alhaiset EZH2 ilme. 5 vuoden leikkauksen jälkeen, todennäköisyys kokonaiselinaika, tautikohtaisia ​​selviytyminen ja sairauksien elinaika oli 25%, 27% ja 15%, vastaavasti korkean ilmentymisen ryhmässä, verrataan 57%, 59% ja 47% alhaisen ilmentymisen ryhmässä (P = 0,005, P = 0,001 ja P = 0,003 vastaavasti Log rank -testi, Fig. 5A). Mielenkiintoista, EZH2 ekspressiotaso kasvainkudoksessa (dCt_Tumor) ei sinänsä riitä ennustamaan ennuste potilaan kanssa NSCLC (Fig. 5B). Monimuuttuja Coxin suhteellisen analyysit sairauden vaiheessa yhteistyössä tekijä, EZH2 ilmentyminen kasvainkudoksessa verrattuna Hyväksytty viereiseen normaaliin keuhkokudoksessa oli riippumaton ennustajia tautivapaan elinajan (riskisuhde = 0,045, 95% CI: 0,270-0,750, P = 0,002) (taulukko 2).

keskustelu

Polycomb- ryhmä proteiinit ovat tärkeitä säilyttää paikkatietojen malleja homeotic geenin ilmentymisen, jotka muodostetaan alussa alkion kehitykseen pitämällä vaiennettu tila ja homeotic geenien [30], [31]. Epänormaali ilmaus Polycomb ryhmän proteiinit voivat muokata solun geeniekspressiomalli. Yliekspressio EZH2 on osoitettu aiheuttavan epiteelin hyperplasian maitorauhasineen [32], ja edistämään pahanlaatuisten muutosta syövän esiasteita syöpiin useissa epiteeli- kudoksissa [33] – [36]. Lisäksi yhä todisteet viittaavat siihen, että yliekspressio EZH2 syövät edistää aggressiivisempia kliininen käytös [16], [25], joka on todennäköisesti välittämää osittain läpi hiljentäminen ilmaus solusyklin estäjät p15

INK4B ja p16

INK4a [37], [38]. Kuitenkin tarkka rooli EZH2 pelataan keuhkosyövän etenemisen jää epäselväksi.

Nisäkässoluissa CDK4 /6-sykliini D ja CDK2-sykliini E ovat ensisijainen G1 /S solusyklin Checkpoint sääteleviin tekijöihin sitoutumisesta solujen kulkea alkaen G1 vaiheeseen ja aloittaa DNA-synteesin. Vaikka CDK4 /6-sykliini D ja CDK2-sykliini E kompleksit edistävät solujen pääsy S-vaiheeseen kautta lievittää estämällä pRb transkriptioon S-vaiheessa edistävät geenit, p15

INK4B, p16

INK4a ja p21

Waf1 /CIP1, P27

Kip1 ovat alipaineensäätöventtiileillä näiden kahden kompleksit vastaavasti [39], [40]. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että EZH2 yliekspressio tarvitaan kasvuun NSCLC edistämällä G1-S siirtymistä; nakutuksen alas ilmentymistä EZH2 NSCLC-soluissa indusoi solujen kerääntyä G1 vaiheessa samalla vähentää solujen S-vaiheessa. Ilmiöt olivat samanlaisia ​​kuin mitä havaittiin muun tyyppisiä transformoitujen ylemmän aerodigestive radan epiteeli-soluja [33], [41]. Muutokset solusyklin jakeluun liittyy alennettu ilmaus sykliini D1, ja lisääntynyt ilmentyminen p15

INK4B, p21

Waf1 /CIP1 ja p27

Kip1 jompaankumpaan tai molempiin NSCLC solulinjojen, verrattavissa havainnot in muissa elimissä [33], [42], [43], [44], mikä osoittaa EZH2 voi edistää pahanlaatuisen samanlaisilla mekanismin eri kasvaintyypeissä. Kokonaisvaikutus EZH2 alassäätöä on vähentynyt toiminnan CDK4 /6-sykliini D ja CDK2-sykliini E kompleksit, mikä vähentää solujen lisääntymistä. Tämä viittaa siihen, yksi tärkeimmistä vaikutuksista EZH2 säätelyhäiriötä NSCLC on muuttunut solusyklikontrollin.

Lisäksi havaitsimme EZH2 alas sääntely vaikutti merkittävästi muiden aggressiivista käyttäytymistä NSCLC-solujen, kuten kyky muodostaa pesäkkeitä vuonna kiinnityskohdassa riippumaton muodin ja tunkeutuvat läpi soluväliaineen. Havaitsimme, että ilmaus DIAB2IP, aggressiivisuutta vähentävänä ja tavoitteeksi EZH2 välittämää epigeneettiset hiljentäminen eturauhassyövässä [45], [46], on lisääntynyt merkittävästi, kun EZH2 knockdown, mikä viittaa mahdolliseen rooliin DIAB2IP säätelyssä Ras-signalointi keuhkojen epiteelin solut, ja sen inaktivointi osana onkogeeninen prosessi keuhkoissa.

lisäksi olemme havaittu, että ekspressio kaspaasi 3, apoptoottiset markkerit pilkottiin PARP Asp214 ja pilkottiin kaspaasi-3 Asp175 lisättiin A549-soluissa jossa EZH2 pudotus (Fig. 4B), mikä viittaa siihen, EZH2 yli-ilmentyminen saattaa olla anti-apoptoosin toiminto joissakin NSCLC-soluja.

H1299 (A) tai A549 (B) transfektoitiin EZH2 kohdistaminen siRNA tai sekoitetun siRNA ohjaus kuten osoitettu. 72 tuntia transfektion jälkeen solut kerättiin ja koko proteiini uutettiin. Kaksikymmentä mikrogrammaa proteiinia kuoppaa kohti erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Blotti koetettiin osoitetun vasta-aineen ja visualisoitiin HRP-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta ja ECL. Filmille skannattiin käyttäen Canon filmiskannerilla. Ilmaisu taso kvantitoitiin digitoitu pikselimäärä count Adobe Photoshop ja ilmaistiin kertamuutoksia alla kuvia.

Kaplan- Meier arvio kokonaiselinaika, tautikohtaisia ​​selviytyminen ja taudista vapaan eloonjäämisen ( A) EZH2 ilmentyminen kasvainkudoksissa suhteessa viereisiin normaaliin keuhkokudoksille (EZH2-kertainen muutos); ja (B) EZH2 ekspressiotasot kasvainkudoksessa itse (dCt_Tumor). Mediaani Kunkin toimenpiteen käytettiin dichotomize potilaspopulaatiota.

Kohonnut EZH2 immunoreaktiivisuus kasvaimen liittyi haitallisia kliinistä tulosta, mikä näyttää olevan pääasiallisesti itämaisia ​​NSCLC potilasaineistoihin [17], [18 ]. Määrittää korrelaation EZH2 ilmaisun ja kliinistä tulosta Yhdysvaltain potilaan kohortin käytimme kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-menetelmällä. Tuloksemme osoittavat, että EZH2 ilmentyminen kasvainten suhteessa viereiseen normaaliin keuhkokudoksessa on vahva ja itsenäinen ennustaja kliiniseen tulokseen näillä potilailla. Havaitsimme myös suhteellisen vahva EZH2 ilmentyminen kasvaimen viereiseen pahanlaatuisissa keuhkokudoksessa, jotka voivat johtua kroonisesta karsinogeeni altistuminen koko keuhko. Tämän mukaisesti mahdollisuus, meidän tutkimus osoitti, että EZH2 ilmentyminen kasvaimissa tupakoitsijoita oli hieman korkeampi kuin kasvaimissa none tupakoitsijoita.

Merkittävä rajoitus Analyysimme on sen suhteellisen pieni otoskoko. Siellä, emme voineet nähdä vahva yhdistys taudin lopputuloksesta kliinisessä vaiheessa, emmekä noudata mitään yhdistys EZH2 ilmaisun kanssa esiintyminen etäpesäkkeiden.

Yhteenvetona osoitimme, että yliekspressio EZH2 vaikuttaa omalta solusyklin sääntelyn ja aggressiivinen fenotyyppien NSCLC-solujen, mahdollisesti muuttamalla solusyklin valvontajärjestelmä ja edistämään pahanlaatuisten kasvainten. Olemme myös osoittaneet, että kasvain-specific säätely ylöspäin EZH2 mRNA ilmaisu on itsenäinen tekijä huono eloonjäämisen potilailla, joilla on NSCLC. Nämä tulokset viittaavat myös siihen, että alaryhmä NSCLC potilailla, joiden kasvain on korkea EZH2 ilmentyminen voi hyötyä therapys jotka kohdistuvat EZH2 [47].