Krooninen sairaus

tiivistelmä

5-atsa-2′-deoksisytidiini (5- atsa-CDR) on käytetty laajasti demetyloivan aineena ja toimii yhteistoiminnassa histonideasetylaasi-estäjät (HDACI) apoptoosin tai soluproliferaation inhibointi ihmisen syöpäsoluja. Onko toiminnan 5-atsa-CdR tässä synerginen vaikutus johtuu demetylaatio tämä aine ei ole vielä selvä. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että soluproliferaation inhibointi ei havaittu, kun soluja knockdovvn DNA metyylitransferaasi 1 (DNMT1), tai kaksinkertainen kaataa of DNMT1-DNMT3A tai DNMT1-DNMT3B hoidettiin HDACI, mikä tarkoittaa, että demetyloiva funktio 5- atsa-CdR voidaan ei mukana tässä synergistinen vaikutus. Lisäksi tutkimus osoitti, että oli syy suhde 5-atsa-CdR aiheuttama DNA-vaurioita ja määrä [

3H] -5-atsa-CdR sisällytetty DNA. Kuitenkin sisällytetty [

3H] -5-atsa-CdR vähitellen laski, kun soluja inkuboitiin [

3H] -5-atsa-CdR väliaineessa, joka osoittaa, että 5-atsa-CDR, joka on epänormaali base , voidaan sulkea solun korjaus järjestelmä. Se oli kiinnostavaa, että HDACI merkittävästi lykkäsi poistamisen sisällytetty [

3H] -5-atsa-CdR DNA. Lisäksi HDAC estäjä näytti valikoivan synergia nukleosidianalogi aiheuttama DNA-vaurioita estävän solujen lisääntymistä, mutta ei osoittanut mitään tällaista vaikutusta muihin DNA vaurioita rasitukset kuten γ-ray ja UV, etoposidin tai sisplatiinia. Tämä tutkimus osoittaa, että HDACI synergistisesti inhiboi soluproliferaatiota kanssa nukleosidianalogit tukahduttamalla poistamalla sisällytetty haitallisen nukleotidianalogeista DNA.

Citation: Chai G, Li L, Zhou W, Wu L, Zhao Y, Wang D, et al. (2008) HDAC estäjät Act 5-atsa-2′-Deoksisytidiini estämään Cell Proliferation tukahduttamalla poistaminen Incorporated Abases Lung Cancer Cells. PLoS ONE 3 (6): e2445. doi: 10,1371 /journal.pone.0002445

Editor: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 15 maaliskuu 2008; Hyväksytty: 12 toukokuu 2008; Julkaistu: 18 kesäkuu 2008

Copyright: © 2008 Chai et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukevat National Natural Science Foundation of China (No.30425017, 30670417 ja 30621002), ja avustukset (2005CB522403, 2006AA02Z101, 2006CB910300 ja B07001) ministeriön Science and Technology of China.

Kilpailevat edut: Tällä kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

on hyvin tunnettua, että DNA: n metylaatio liittyy histoni asetylaatio asema geenin ilmentymisen säätelyyn [1] – [4] tai lisääntyminen ja ikääntyminen [5]. Tämä kytkös histoni aseman ja DNA: n metylaatio oli hyvin varmistettiin Cameron

et al

jotka havaitsivat, että useat geenit vaiennetaan metylaation otettiin uudelleen hoidetuilla demetyloivan agentti 5-atsa-CdR ja histonideasetylaasi estäjä (HDACI) trikostatiini (TSA) yhdessä, mutta joita ei ole uudelleen, kun läsnä on 5-atsa-CDR- tai TSA yksin [6]. Myöhemmin useat laboratoriot lukien oma laajennetaan näitä havaintoja perustaa terapeuttinen strategia syövän hoidossa, jossa 5-atsa-CdR toimii yhdessä depsipeptidin /TSA aiheuttaa merkittäviä apoptoottisen solukuoleman [7] – [10]. Koska DNA: n metylaatio promoottorialueella liittyy HDAC1, jonka metyyli-sitova proteiini MeCP2 [11], se on uskottava, että tiettyjen geenien, jos hypermetyloitunut niiden promoottorialueen, ovat tiukemmin pakattu histonien ja siten transkriptiotekijöiden käyttää niiden DNA: ta sitovan sivustoja vain hyvin suurten vaikeuksien. Niinpä solukuolema liittyviä geenejä, jotka on vaimennettu takia hypermetylaation, voitaisiin aktivoida käsittelemällä 5-atsa-CdR; Uudelleenaktivointiin olisi vahvistettava HDACI, ja samaan aikaan, solukuolemaa tulisi olla helpommin havaittavissa kuin hyvin.

Kuitenkin 5-atsa-CdR myös soittaa kasvaintenvastaise- rooli, joka on metylaatio riippumaton [ ,,,0],12] – [14]. 5-atsa-CdR voi toimia suoraan mitokondrioita ja apoptoosin indusoimiseksi nisäkässoluissa [14]. Suora metylointi riippumaton näyttöä 5-atsa-CdR solukuolema on se, että 5-atsa-CdR lisää merkittävästi ekspressiota Rahastolla-1 tai p19

INK4d indusoida solukuoleman, mutta promoottorialueet näiden geenien ovat täysin metyloimaton [12], [13]. 5-atsa-CdR on myös raportoitu aiheuttavan synergististä vaikutusta lisäämällä sisplatiinin DNA: han sitoutuneina, kautta muutos topologian DNA aikaan 5-atsa-CdR ilman sen toiminnan kuin demetyloivan aineena [15]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että 5-atsa-CdR lähettää erilaisia ​​rooleja soluissa, jotka sisältävät sekä demetyloivan toiminnot ja metylointi riippumattomia toimintoja.

sytotoksisuus 5-atsa-CdR tulokset sen kyky vahingoittaa DNA: ta, kuten 5-atsa -CdR on nukleosidianalogi (NA) ja voidaan sisällyttää DNA-rungon [16], [17], joka puolestaan ​​voi aiheuttaa muodostumista kovalenttisen adduktin välillä 5-atsa-CdR molekyylin ja methyltranferases [16]. On osoitettu, että toimistojen, kuten 5-atsa-CDR- tai sytarabiini (Ara-C), on fosforyloitiin niiden trifosfaatiksi ja sisällytetään sitten DNA-replikaation aikana [18]. Myöhemmin sisällytetty NA toimia nöyryyttää, jotka voivat aiheuttaa DNA-vaurioita, mutaatioita ja pysähtyminen DNA replikaatiohaarukan [19], [20]. Nämä muutokset DNA selkäranka ovat haitallisia, ja DNA-vaurioita anturit kuten DNA-PK, p53, ATM ja ATR tunnistaa nämä vaurioituneet sivustoja ja korjata epänormaali DNA [21], [22]. Aiemmin sekä ryhmämme ja muut tutkijat suoraan vahvisti, että 5-atsa-CdR aiheuttaa DNA-vaurioita ja saa aikaan p53-riippuvaista biologisia reaktioita [23] – [25]. Kuitenkin, jos epänormaali DNA aiheuttamien muutosten sisällyttämällä toimistot ovat hukkua, tai DNA: n korjautumiseen järjestelmät ovat vakavasti estyy, solut käyvät läpi apoptoosin [26].

HDAC-inhibiittorit ovat uusia ja tehokkaita syövän vastaiset aineet [27 ], [28], jotka ovat mukana säännellä monia geenejä, mukaan lukien aktivoituminen p53 [29], tai vähen- tämisessä anti-apoptoottisia geenejä [28], [30] aikaansaamaan antineoplastisen vaikutuksen. Siksi tutkimus vai ei HDACI vaikuttaa myös DNA: n korjaukseen entsyymejä parantaa NA aiheuttama DNA-vaurio vaatinut.

Tässä tutkimuksessa olemme vahvistavat, että 5-atsa-CdR toimii yhteistuumin HDACI aiheuttamaan merkittävä inhibitio soluproliferaatiota metylaation riippumattomalla tavalla. 5-atsa-CdR sisällytettiin DNA annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla, joka selvästi liittyy induktioon yksittäisen DNA-säikeen katkoksia (SSB) 5-atsa-CdR. HDAC-inhibiittorit merkittävästi tukahdutti poisto on sisällytetty 5-atsa-CdR DNA ja näin tuotettu synergistinen vaikutus, tuloksena soluproliferaation inhibointi

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja kemiallisen käsittelyn

Ihmisen keuhkosyöpä solulinjat A549 ja H719 käytettiin tässä tutkimuksessa. Sekä 5-atsa-CDR (liuotettuna 50% etikkahappoa) ja Ara-C (liuotettuna DMSO: hon) (molemmat ostettu Sigma, St Louis, MO) lisättiin tuoretta väliaineeseen välein 24 tuntia. TSA (Sigma) liuotettiin etanoliin. Depsipeptidi (saatiin ystävällisesti NIH) liuotettiin DMSO: hon.

määritys soluproliferaation MTT-määrityksellä

Yhtä suuret määrät soluja (noin 5000 /kuoppa) ympättiin 96-kuoppalevylle 24 tuntia ennen koetta. Soluja käsiteltiin 5-atsa-CdR, Ara-C, γ-säteilytys ja HDACI yksinään tai yhdistelmänä. Hoidon jälkeen MTT-väriaineen liuosta (Sigma), lisättiin 96-kuoppaiselle levylle. Oikea absorbanssi jokaisen näytteessä laskettiin verrattuna käsittelemättömään kontrolliin.

RT-PCR

Voit selvittää knockdovvn DNA metyylitransferaaseja (DNMTs) on tehokas DNA demetyloivan ja aktivoiminen vaiennettu geenejä, RT-PCR suoritettiin muutosten havaitsemiseksi ilmentymistä p21, joka on vaimennettu vuoksi hypermetylaation

p21

promoottori [31]. PCR-alukkeet olivat seuraavat: p21, vasen pohja- GGA AGA CCA TGT GGA CCT GT ja oikealla pohja- GGA TTA GGG CTT CCT CTT GG;

β

aktiini, vasen pohja- TGG AGA AGA GCT ACG AGC TGC CTG ja oikealla pohja- GTG CCG CCA GAC AGC ACT GTG TTG.

Western Blot

Tunnistaa muutokset proteiinin ilmentyminen soluissa käsiteltiin knockdovvn DNMTs tai 5-atsa-CdR, solut kerättiin kaapimella ja sitten pestiin kerran kylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella. Sitten solut lyysattiin lyysipuskurissa (50 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 0,15% Igepal CA-630, ja 1,5 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia). Yhtä suuret määrät proteiineja (100-150 ug) fraktioitiin koon 7,5-12,5% SDS-PAGE. Lisäksi, määrän määrittämiseksi kromatiinin sitoutuneen RPA, solut hajotettiin liuosta A (50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 420 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,34 M sakkaroosia, 10% glyseroli, 1 mM Na

3Vo

4 ja proteaasiestäjäseostabletit). Saada tumauutteita, solut hajotettiin puskurissa B (10 mM HEPES, pH 7,9, 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl

2, 0,34 M sakkaroosi, 10% glyserolia, 0,1% Triton X-100, proteaasiestäjäseostabletit) . Eristetyt tumat pestiin kerran puskurilla B ja edelleen hajotettiin puskurissa A kuten edellä. Saadakseen chromatin sitoutuneet proteiinit, eristetty tumat hajotettiin puskurissa C (3 mM EDTA, 0,2 mM EGTA, 1 mM DTT) ja edelleen hajotettiin puskurissa A kuten edellä.

Käytetyt vasta-aineet olivat anti-PARP ( Santa Cruz, F-2), anti-RPA (Santa Cruz, MA34 ja MA70-2), anti-γ-H2AX (Upstate, 05-636), anti-DNMT1 (Santa Cruz, H-300), anti-DNMT3A (Santa Cruz, P-16), anti-DNMT3B (lahja tri Xu, G, Shanghai Institute of Biological Science) ja β-aktiini vasta ostettiin Santa Cruz.

DNA bisulfiittikäsittelyn ja bisulfiitti sekvensointi

muutosta arvioidaan DNA: n metylaatio tila hoidon jälkeen pudotus on DNMTs, DNA käsiteltiin natriumbisulfiitin ja puhdistettu PCR kuten aiemmin on kuvattu [31]. Alukkeet sekventoimiseen

p21

promoottori olivat seuraavat: vasen pohjamaali, 5′-GGG AGG AGG GAA GTG TTT TT -3 ’ja oikea aluke, 5′-ACA ACT ACT CAC ACC TCA ACT-3’ . PCR-tuotteet geeli uutettiin (Qiagen, Valencia, CA) ja ligoitiin pGEM-T-easy-vektoriin käyttämällä TA-kloonausvektoriin (Promega, Madison, WI). Transformoidut bakteerit DH5a viljeltiin yön yli, ja plasmidi-DNA eristettiin käyttäen kittiä (Qiagen). Vähintään 10 erillistä kloonia valittiin sekvenssianalyysillä.

Comet määritys

Komeetta määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [24]. Lyhyesti, himmeä mikroskooppisen Objektilasit peitettiin 0,5% normaalia sulamispiste agaroosia 60 ° C: ssa. Noin 10

5 5-atsa-CdR käsitellyt tai käsittelemättömät solut PBS: ssä sekoitettuna yhtä suuren määrän kanssa 1% alhaisen sulamispisteen agaroosia muodostamiseksi solususpensio. Elektroforeesin jälkeen objektilasit tutkittiin 600 x suurennus ja kuvat on otettu fluoresenssimikroskoopilla (TCS, Leica, Manheim, Saksa).

analyysi syrjäytymisen sisällytetty [

3H] -5-atsa- CdR DNA

radioaktiivisesti nukleosidianalogin sisällyttämistä määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu, joissa muutokset [32]. [

3H] -5-atsa-CdR hankittiin Moravek Biochemicals (MT1676, 1 mCi /ml, Brea, CA). H719 ja A549-soluja käsiteltiin [

3H] -5-atsa-CdR 1 uM 48 tuntia tai ilman depsipeptidin 0,1 uM lopullinen 6 tuntia (42-48 tuntia), ja solut pestiin sitten kylmällä PBS. Sitten solut korvattiin [

3H] -5-atsa-CdR väliaineessa ja inkuboitiin 6, 12 tai 24 tuntia. Cold trikloorietikkahappoa (TCA, 50%) lisättiin sitten solu liuokseen ja TCA-liukenematon DNA laitettiin lasimikrokuitusuodatinpaperin suodattimen (Whatman, Maidstone, Englanti). Tämä lasi suodatin TCA-liukenematonta DNA laitettiin pulloon laskea radioaktiivisuus Beckman LS 5000 nestetuikelaskurilla.

perustaminen solulinjan vakaan DNMT1 puutosta klooni

pCMVneo -DNMT1 antisense plasmidi toimitti ystävällisesti Dr. SB Baylin [33]. Vektori transfektoitiin H719-soluihin käyttäen Qiagen Effectene Transfection Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, kun ensimmäisen transfektion, toinen transfektio suoritettiin vahvistaa tehokkuutta RNAi, ja sitten 800 ug /ml G418: aa lisättiin valita stabiileja solujen DNMT1 antisense.

RNA häiritsevät DNMT3A , DNMT3B

RNAi suunnattu oligonukleotidisekvenssien ovat seuraavat: CAT CCA CTG TGA ATG ATA ATT (DNMT3A) ja GAT CAA GCT CGC GAC TCT C (DNMT3B) (ostettu Shanghai GeneChem Company). Oligonukleotidit ja DNMT3A ja DNMT3B siRNA transfektoitiin soluihin käyttämällä lipofektamiinia 2000 48 tuntia.

Tulokset

5-atsa-2′-deoksisytidiinin on yhteistoiminnassa HDACI aiheuttaa inhibitio soluproliferaation metylointi riippumaton mekanismi

on raportoitu, että 5-atsa-CdR toimii yhdessä HDAC-inhibiittorit synergistisesti indusoida solukuoleman tai soluproliferaation inhibointi [7] – [10]. Sen tutkimiseksi, rooli 5-atsa-CdR mukana tässä synergistinen inhibitio soluproliferaatiota yhdistettynä HDACI on epigeneettiset, kaksi kahden hengen kaataa (DKD) klooneja (DKD of DNMT1 /DNMT3A ja DKD on DNMT1 /DNMT3B) perustettiin. Välttää indusoi ero transfektion tehokkuus, kun solut transfektoitiin kaksi vektoria tai kaksi RNAi-oligonukleotidit, eli DNMT1 puutteellinen stabiili klooni todettiin ensimmäisen kerran transfektoimalla vektorin antisense DNMT1 cDNA H719-soluihin ja valita G418: aa. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, DNMT1 proteiini on hyvin tippuu alas tässä vakaa H719 solulinjassa. Sen jälkeen, DKD on DNMT1 /DNMT3A, tai DNMT1 /DNMT3B suoritettiin transfektoimalla DNMT3A tai DNMT3B RNA oligonukleotidit osaksi DNMT1 pudotus stabiili soluissa. Kuva 1B-C osoittaa selvästi, että DNMT3A ja DNMT3B proteiinin tasot olivat merkittävästi vähentää nämä RNAi hoitoja. Sen arvioimiseksi, ovatko nämä DKDs of DNMTs oli tehokas demetyloivan DNA, metylaatiostatuksen

p21

Waf1 /CIP1

promoottori valittiin testattavaksi bisulfiitti sekvensoimalla, koska

p21

Waf1 /CIP1

promoottori on erittäin metyloitu H719-soluissa [31]. Kuva. 1D esittää kaaviota, joka esittää promoottorialueen

p21

Waf1 /CIP1

ja fragmentti nimetty bisulfiitti sekvensointi. Kuten on esitetty kuviossa. 1E,

p21

Waf1 /CIP1

promoottori H719-soluissa erittäin metyloitua (51.25% CGS

p21

Waf1 /CIP1

promoottorin metyloitavaa 10 valikoitujen kloonien ). Kuitenkin, metyloidut CGS oli laskenut 23,75%, 21,5% ja 12,5%, kun DNMT1, DNMT1 /DNMT3A ja DNMT1 /DNMT3B tehtiin kaksinkertainen kaataa 10 valitaan klooneja (Fig. 1 E), joka osoittaa, että pudotus on DNMT1 ja DNMT3B yhdessä oli tehokkain DNA demetylaatio. Tämä lasku metylaatio

p21

Waf1 /CIP1

promoottorin selvästi ekspressioon liittyviä p21 mitattuna RT-PCR: llä (Fig. 1 F).

(A) edustaja Western blot osoittaa, että DNMT1 proteiinin taso H719-soluissa oli merkittävästi vähentynyt DNMT1 puutosta stabiili klooni verrattuna ei-spesifinen oligonukleotidi hoidetusta kontrolliryhmästä. (B) ja (C) edustaja Western-blotit osoittavat myös, että DNMT3A tai DNMT3B proteiinin taso oli merkittävästi vähentynyt, kun RNAi hoidon DKD on DNMT1 /DNMT3A soluja tai DKD on DNMT1 /DNMT3B soluissa, vastaavasti. β-aktiini on esitetty latauskontrollina alemmassa paneelissa. (D) esittävä kaavio

p21

Waf1 /CIP1

promoottori, mustan alueen osoittaa fragmentti, joka tehtiin bisulfiittia sekvensointi (-233-+2 suhteessa transkription aloituskohdasta). (E) Kun bisulfiitti sekvensointi, 10 kloonia satunnaisesti valittua ja metylaatiostatuksen

p21

Waf1 /CIP1

promoottori määritettiin käsittelemättömän H719-soluissa tai H719: lla käsiteltyjen solujen knockdovvn DNMT1, DKD of DNMT1 /DNMT3A tai DKD on DNMT1 /DNMT3B. (F) RNA uutettiin H719-soluja käsiteltiin DKD on DNMT1 /DNMT3B, ja RT-PCR suoritettiin havaitsemiseksi ilmentyminen p21-mRNA: n. β-aktiini on esitetty latauskontrollina varten RT-PCR-analyysi.

Odottamaton havainto oli, että emme noudata eroa solujen lisääntymisen, kun H719-solujen kanssa DKDs tai TKDs (knockdovvn DNMT1 /3A /3B) käsiteltiin kanssa tai ilman depsipeptidi ja määritettiin MTT (Fig. 2A). Sitä vastoin solujen lisääntyminen väheni merkittävästi sekä A549 ja H719-soluja, joita käsiteltiin 5-atsa-CdR ja HDACI depsipeptidin /TSA, vaikka 5-atsa-CdR yksin ja depsipeptidin /TSA yksin oli vähäinen vaikutus soluproliferaation inhibointi on käytetyt annokset (Fig. 2B-C). Kuitenkin 5-atsa-CDR-indusoidun soluproliferaation inhibointi oli solulinja riippuvainen. Esimerkiksi 5-atsa-CdR osoitti ilmeinen vaikutus proliferaation estossa A549-solut (Fig. 2C), mutta ei ollut vaikutusta H719-soluissa (kuvio. 2B). Nämä erot 5-atsa-CDR-indusoidun vaikutus soluproliferaation välillä A549 ja H719-soluja johtui p53 tilan käsiteltyjen solujen [24]. A549-soluja on villityypin p53, kun taas H719 solun p53 on mutatoitu [31]. Lisäksi, vaikka prokaiini on raportoitu olevan demetyloivan ainetta [34], synergistinen inhibitio soluproliferaatiota ei havaittu, kun H719-soluja käsiteltiin prokaiini (0,5 mM 72 tuntia) ja depsipeptidi (0,1 uM 6 tuntia 66- 72 h) tai TSA (1 uM 6 tuntia 66-72 tuntia) (Fig. 2D). Nämä tiedot viittaavat siihen, että rooli 5-atsa-CdR sen synergistinen vaikutus HDACI indusoimisessa soluproliferaation inhibointi ei saa johtaa sen demetyloivan toiminto.

(A) H719 soluja puutteellinen DNMT1, DKD of DNMT1 /DNMT3A, DKD on DNMT1 /DNMT3B, tai TKD (kolminkertainen pudotus) on DNMT1 /DNMT3A /DNMT3B käsiteltiin kanssa tai ilman depsipeptidin 0,1 uM 6 tuntia, ja solujen proliferaatiota testattiin MTT-määrityksellä. (B) ja (C) 5-atsa-CDR (1 uM 72 tuntia) toimii yhdessä HDAC-inhibiittori depsipeptidi (0,1 uM lopullinen 6 tuntia) tai TSA (1 uM lopullinen 6 tuntia) synergistisesti indusoivat solun leviämisen H719 (B) tai A549-solut (C). (D) H719-soluja käsiteltiin prokaiini (0,5 mM) 72 tunnin ajan, ja depsipeptidi (0,1 uM lopullinen 6 tuntia) tai TSA (1 uM lopullinen 6 tuntia), lisättiin sitten käsiteltyjen solujen. Kaikki tiedot ovat tulokset kahdesta erillisestä kokeesta.

5-atsa-CdR indusoi sytotoksisuuden yhdistyminen DNA: han nukleosidianalogi

On hyvin tunnettua, että 5-atsa-CdR fosforyloituu sen trifosfaatikseen soluissa ja sitten sisällytetään DNA replikoinnin aikana [18]. Sen tutkimiseksi, aste 5-atsa-CdR sisällyttämistä soluihin, [

3H] -5-atsa-CdR lisättiin A549 tai H719-solujen 24 tunnin ajan ja DNA uutettiin sitten TCA-saostuksella. Radioaktiivisuus per ug DNA: ta mitattiin. Kuten on esitetty kuviossa. 3A-B, sisällyttäminen [

3H] -5-atsa-CdR DNA: han oli pitoisuudesta riippuvainen molemmissa solulinjoissa. Radioaktiivisuus per ug DNA: ta 0,1 uM ja 1 uM [

3H] -5-atsa-CdR kasvoi ~2- ja -12-kertaiseksi in H719-soluissa, ja ~10- ja ~110-kertaiseksi A549 soluja verrattuna radioaktiivisuuden 0,01 uM [

3H] -5-atsa-CdR molemmissa solulinjoissa.

(A) H719 tai (B) A549-soluja inkuboitiin [

3H ] -5-atsa-CdR 24 tunnin ajan eri pitoisuuksissa, ja pestiin sitten kylmällä PBS: llä. Soluja inkuboitiin tuoreessa väliaineessa vielä 24 tuntia, ja DNA saostettiin sitten kylmällä TCA. Radioaktiivisuus mitattiin ja suhteellinen radioaktiivisuus per ug laskettiin. Sama määrä DNA ladattiin ja ajettiin 1%: lla agaroosigeelillä 100 V: ssa 5 min, kuten kuormituksen valvonta, joka on esitetty ylä- paneelin kuvion. 3A ja kuvio. 3B, vastaavasti. Esitetyt tulokset ovat kahdesta erillisestä kokeesta (keskiarvo ± SD) DNA-vaurion aiheuttama 5-atsa-CDR: H719-soluissa määritettiin komeetan määrityksessä. (C) Käsittelemätön kontrolli, (D) 5-atsa-CdR 0,1 uM 72 tuntia ja (E) 5-atsa-CdR 1 uM 72 tunnin ajan.

oli suhde sisällytetty 5-atsa-CdR ja DNA-vaurioita määritettynä kanssa komeetta määrityksessä. Kuvio 3C-E osoittavat, että 5-atsa-CdR osoitti annoksesta riippuvaista mahdu DNA-vaurioita A549-soluja, jotka osoitettiin läsnäolo DNA häntää. Suurempi DNA hännän alueella ja pidempi DNA hännän pituus edustavat suurempaa DNA-vaurioita. Taulukossa 1 esitetään tilastollinen analyysi comet vertaamalla 5-atsa-CdR käsiteltyjen näytteiden käsittelemättömään verranteeseen. Tämä data rinnasteinen sisällytetty määrä 5-atsa-CdR, ja viittaa siihen, että 5-atsa-CdR on rooli sytotoksisuuden sisällytetään osaksi DNA.

Koska apoptoosin voi myös antaa positiivisen tuloksen comet [35], me korjataan 5-atsa-CdR käsiteltyjä soluja ja suoritetaan virtaussytometria-analyysi, onko 5-atsa-CdR aiheuttaman DNA-vaurion nostattaa apoptoottisen solukuoleman. Solujen DNA-pitoisuus pienempi kuin G

0 /G

1 (alue M1 kuvassa 4) pidetään apoptoottisia soluja. Kuten on esitetty kuviossa. 4, 5-atsa-CdR ei indusoinut apoptoosia A549-soluja on 0,1 uM (Fig. 4B) tai 1 uM 72 tuntia (Fig. 4C). Lisäksi, A549-soluja käsiteltiin 5-atsa-CdR 1 uM 48 tuntia tai 72 hrsand proteiini uutettiin Western blottaus käyttämällä anti-PARP (lohkaisu PARP on tunnusomaista apoptoosia). Kuva. 4D osoittaa, että 5-atsa-CdR ei indusoinut apoptoottista solukuolemaa vähäisillä annoksilla. Nämä tiedot osoittavat, että 5-atsa-CdR yksinään rajoitettu annoksilla ei kykene indusoimaan apoptoosia ja siten positiivinen tulos komeetta määrityksen tulokset pääasiassa 5-atsa-CdR indusoidun DNA-vaurioita.

(A-C ) sen määrittämiseksi, 5-atsa-CDR-indusoidun DNA-vaurion aiheuttaa soluproliferaation inhibointi kautta apoptoottisen solukuoleman, virtaussytometria-analyysi suoritettiin. Käsittelemättömät A549-soluja (A) tai A549-soluja käsiteltiin 5-atsa-CdR 0,1 uM (B) tai 1 uM: ssa 72 tuntia (C), ja solut kerättiin sitten ja propidiumjodidilla (PI). DNA: n määrä pienempiä kuin G

0 /G

1 pidettiin apoptoottinen DNA (alue M1). (D) A549-soluja käsiteltiin 5-atsa-CdR 1 uM 48 tai 72 tuntia ja proteiini uutettiin Western blottaus käyttämällä anti-PARP havaita PARP katkaisua soluissa, joita käsiteltiin 5-atsa-CDR: ssä. Apoptoottisen positiivinen kontrolli näytettiin lane äärioikeiston, jossa on kaksi bändejä osoittaa PARP (116 KD) ja PARP cleavaged (85 KD).

Yleensä DNA vaurioittavat aineet aiheuttaa yksittäisen DNA-säikeen katkoksia (SSB) tai kaksinkertaisen säikeen katkoksia (DSB). Sen määrittämiseksi, millaisia ​​DNA-vaurio indusoi 5-atsa-CdR teimme Western blottaus käyttämällä anti-RPA (replikointi proteiini A) tai γ-H2AX. Useimmat DNA: ta vaurioittavat aineet indusoivat soluvasteita aktivoimalla ATR (ATM ja Rad3 liittyvä) [36] – [40], ja aktivointi ATR riippuu paljolti Väli- molekyyli RPA [41], [42]. Kromatiinin uutettiin 5-atsa-CdR käsitellylle H719-solujen ja kromatiinin sidottu RPA-pitoisuus määritettiin. Kuva. Kuvio 5A esittää, että kromatiinia sidottu RPA lisättiin vastauksena kasvoi 5-atsa-CdR, mikä osoittaa, että 5-atsa-CdR indusoiman DNA: n vaurioiden voi olla yhden säikeen katkoksia (SSB). Toisaalta, γ-H2AX pidetään tuntomerkki DNA double-säikeen katkoksia (DSB) [43], ja Western blotting suoritettiin siksi käyttäen ANT-γ-H2AX sulkea pois mahdollisuutta 5-atsa-CdR aiheuttama DSB. Kuva. 5B esittää, että 5-atsa-CdR 1 μ ei indusoinut DSB. Kuitenkin 5-atsa-CdR suurempi pitoisuus ( 5 uM) indusoi annoksesta riippuvaa DSB (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tiedot osoittavat, että 5-atsa-CdR aiheuttama DNA SSB tai DSB on annostus riippuvainen. Tässä tutkimuksessa, 5-atsa-CdR oli lähes aina käyttää alemmilla annoksilla (1 uM) ja siten 5-atsa-CdR indusoidun DNA-vaurioita on SSB.

(A-B) H719-soluja käsiteltiin 5-atsa-CdR (0,1-1 pM) 48 tuntia, ja solu-uutteet, mukaan lukien kromatiinin fraktion (A, Chr) ja liukoinen fraktio (B, Sol) eristettiin Western blotting muutosten havaitsemiseksi RPA70 ja RPA32. Yhtye intensiteetti käsittelemätön näyte asetettiin 1. numeerinen arvo kunkin näytteen edustaa prosenttiosuutta kaistan intensiteetin suhteessa kuin käsittelemätön näyte. (C) H719-soluja käsiteltiin myös 5-atsa-CdR 1 uM 24, 48 tai 72 tunnin ajan, ja proteiinia uutettiin sitten Western-blottauksella käyttämällä anti-γ-H2AX. Soluja käsiteltiin doksorubisiinia 1 uM 24 tuntia positiivisena kontrollina (äärimmäisenä oikealla kaistalla).

depsipeptidin nimenomaan estää poistamisen sisällytetty 5-atsa-CdR ja parantaa nukleosidianalogi aiheuttama sytotoksisuuden

Koska DNA-vaurion aiheuttama pieni annos 5-atsa-CdR on palautuva, on erityisen tärkeää ymmärtää, miten HDAC-inhibiittori parantaa 5-atsa-CdR aiheuttamaa toksisuutta. Lisäksi, kuten peräkkäinen hoito 5-atsa-CDR: n ja HDAC-inhibiittori on tehokas indusoimaan solukuoleman [44], olimme johti harkita HDACI lisää sisäänottoa 5-atsa-CdR DNA: han tai vähentää poistamalla sisällytetty 5- atsa-CdR DNA, mikä parantaa 5-atsa-CDR-indusoidun sytotoksisuuden. Ensimmäinen, depsipeptidi (0,1 uM) ja [

3H] -5-atsa-CDR (1 uM) lisättiin yhdessä A549-soluja on aluksi 6 tuntia, ja sitten solut jatkuvasti viljeltiin väliaineessa, jossa oli [

3H] -5-atsa-CdR yksin vielä 42 tuntia. Radioaktiivisuus laskettiin 0-24 tuntia sen jälkeen, kun soluja inkuboitiin radioaktiivisuuden-väliaineessa. Vertaamalla näytteitä käsiteltiin [

3H] -5-atsa-CdR yksin näytteitä käsiteltiin [

3H] -5-atsa-CdR plus depsipeptidin, eroa radioaktiivisuus havaittiin, mikä osoittaa, että depsipeptidin ei edistä sisällyttäminen [

3H] -5-atsa-CdR DNA: han (kuvio. 6A). Sen testaamiseksi depsipeptidin vaikuttaa poisto sisällytetty 5-atsa-CdR, rappeutuminen analyysi sisällytetty [

3H] -5-atsa-CdR suoritettiin A549-soluja. Soluja käsiteltiin [

3H] -5-atsa-CdR 1 uM 48 tuntia, ja ilman depsipeptidin 0,1 uM lopullinen 6 tuntia hoidon, ja solut pestiin sitten ja korvattiin tuoreessa väliaineessa ( ilman kokeellinen reagenssit) 6, 12 ja 24 tuntia. Kuvio 6A osoittaa, että sisällytetty [

3H] -5-atsa-CdR vähitellen laski inkuboitu [

3H] -5-atsa-CdR väliaineessa. Radioaktiivisuus per ug DNA: ta 6, 12 ja 24 tuntia käsitellyissä soluissa [

3H] -5-atsa-CdR yksin, esimerkiksi alennettiin 78,44 ± 7,08%, 57,5 ​​± 3,88% ja 36,05 ± 1,79%: lla verrattuna radioaktiivisuuden alussa inkuboinnin. Tämä kuvastaa poisto [

3H] -5-atsa-CdR DNA. Kuitenkin lisäämällä depsipeptidin merkittävästi siirrettiin poistaminen [

3H] -5-atsa-CdR DNA, ja radioaktiivisuuden per ug DNA: ta 6, 12 ja 24 tuntia oli 80,3 ± 13,21%, 78,71 ± 12,72% ja 82,5 ± 20,47%, vastaavasti, verrattuna radioaktiivisuuden alussa inkuboinnin. Tämä depsipeptidin indusoitu lasku poistaminen [

3H] -5-atsa-CdR oli myös riippuvainen depsipeptidin pitoisuus. Esimerkiksi, radioaktiivisuus käsiteltyjen solujen [

3H] -5-atsa-CDR: n ja depsipeptidin 0,05 uM, 0,1 uM ja 0,2 uM osoitti 1.8-, 2.7- ja 3,25-kertainen nousu vastaavasti yli, että käsiteltyjen solujen [

3H] -5-atsa-CdR yksinään (Fig. 6B). Lisäksi, 5-atsa-CdR indusoiman DNA: n vaurioiden myös vähitellen takaisin, kun soluja viljeltiin 5-atsa-CdR väliaineessa. Pituus ja DNA hännän aiheuttama 5-atsa-CdR olivat lyhyempiä ja pienempiä, kun solut viljeltiin 5-atsa-CdR väliaineessa 12 tuntia verrattuna soluihin ilman huumeettomaan inkuboinnin (Fig. 6C-E ). Tämä toipunut 5-atsa-CdR aiheuttama DNA-vaurioita merkittävästi tukahdutti depsipeptidin, jotta pituus ja alueen pyrstöt komeetta määrityksessä olivat pidempiä ja suurempia, kun soluja käsiteltiin 5-atsa-CdR ja depsipeptidin yhdessä ( Fig. 6F-H). Depsipeptidin aiheuttama suppressio toipuminen 5-atsa-CdR indusoiman DNA: n vaurioiden on esitetty yhteenvetona taulukossa 2. Nämä tulokset viittaavat siihen, että HDAC-inhibiittori voi estää toipuminen 5-atsa-CdR indusoiman DNA: n vaurioiden ja synergistisesti aiheuttaa soluproliferaation inhibointi.

(A) H719-soluja inkuboitiin [

3H] -5-atsa-CdR 48 tunnin ajan, ja läsnäolon tai puuttumisen depsipeptidin 0,1 uM ensimmäisen 6 tunnin ajan (depsipeptidi + [

3H] -5-atsa-CDR) tai viimeisen 6 tunnin ajan ([

3H] -5-atsa-CdR + depsipeptidi) ja pestiin sitten kylmällä PBS: llä. Solut korvattiin tuoretta väliainetta ja inkuboitiin edelleen eri aikavälein, ja DNA uutettiin sitten kylmällä TCA. Suhteellinen radioaktiivisuus kussakin näytteessä eri aikapisteissä verrattiin solujen radioaktiivisuus alussa inkuboinnin. (B) H719-soluja käsiteltiin [

3H] -5-atsa-CdR 48 tuntia, ja depsipeptidin 0,05, 0,1 ja 0,2 uM lisättiin sitten soluihin viimeksi 6 tuntia. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen solut kerättiin ja radioaktiivisuus laskettiin. Sama määrä DNA ladattiin ja ajettiin 1%: lla agaroosigeelillä 100 V: ssa 5 min, kuten kuormituksen valvonta, joka on esitetty ylä- paneelin kuvion. 6A ja kuvio. 6B, vastaavasti. (C-E) Comet määritys osoittaa, että 5-atsa-CdR indusoiman DNA: n vaurioiden talteen, kun käsitellään soluja inkuboitiin 5-atsa-CdR väliaineessa 12 tunnin ajan. (C) Käsittelemätön kontrolli, (D) 5-atsa-CdR 1 uM 24 tuntia ilman inkubaation ja (E) 5-atsa-CdR 1 uM 24 tuntia, minkä jälkeen pestiin edelleen inkuboitu huumeettomassa väline 12 tuntia. (F-H) Recovery DNA-vaurion aiheuttama 5-atsa-CdR estyi depsipeptidin hoitoa (0,1 uM lopullinen 6 tuntia). (F) depsipeptidin käsiteltyjen solujen (0,1 uM) ja 6 tuntia, (G) Soluja käsiteltiin 5-atsa-CDR (1 uM 24 tuntia) ja depsipeptidi (0,1 uM viimeksi 6 tuntia) ilman inkubointia, tai (H) solut käsiteltiin kuten edellä ja inkuboitiin edelleen huume-väliaineessa 12 tunnin ajan.

HDAC estäjä toiminut selektiivisesti nukleotidianalogissa aiheuttaa soluproliferaation inhibointi

Määritä onko HDACI selektiivisesti parantaa NA-indusoitua sytotoksisuutta, H719-soluja käsiteltiin Ara-C, toinen sytidiinianalogi, ja depsipeptidin tai TSA lisättiin sitten soluihin tarkkailla muutoksia solujen proliferaatio määritettiin MTT. Se oli kiinnostavaa, että sekä depsipeptidi ja TSA tehostaa merkittävästi Ara-C indusoidun soluproliferaation inhibointi (Fig. 7A-B). Kuitenkin tämä synergistinen inhibitio soluproliferaatiota ei havaittu soluissa, joita käsiteltiin depsipeptidi ja muut DNA-vaurion indusoijat, kuten γ-ray (Fig. 7C), UV (Fig. 7D), sisplatiini (Fig. 7E) tai etoposidi (kuvio . 7F). Nämä tiedot viittaavat siihen, että HDACI selektiivisesti toimii yhteistoiminnassa toimistojen aiheuttaa soluproliferaation inhibointi.

(A) H719-soluja tai (B) A549-soluja käsiteltiin Ara-C: ssa 0,1 uM: ssa 72 tunnin ajan, kun läsnä tai puuttuminen HDACI (depsipeptidi 0,1 uM tai TSA 2 uM lopullinen 6 tuntia). Sitten solut pestiin ja inkuboitiin edelleen 24 tunnin MTT-määrityksessä. (C) vaikutus vuorovaikutus HDACI ja säteilytys 2 Gy määritettiin MTT-määrityksellä. H719-soluja säteilytettiin 2 Gy, tai käsiteltiin depsipeptidin 0,1 uM, tai TSA 2 uM: ssa 6 tunnin yksinään tai yhdistelmänä.