Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä (EOC) on morfologisesti heterogeeninen luokitellaan vakavien, endomet-, kirkas solu, tai mucinous. Molecular geneettinen analyysi on ehdottanut rooli tuumorisuppressorigeeneille sijaitsee kromosomissa 3p vuonna vakavasta EOC synnyssä. Tavoitteena oli arvioida ilmaus

HYAL1

, joka sijaitsee kromosomissa 3p21.3, näissä EOC alatyyppejä, ja tutkia sen korrelaatio ilmaus steroidihormonireseptoreihin.

Menetelmät /Principal havainnot

määrittää mRNA ilmaus

HYAL1

, estrogeenireseptori (ER) -α, ER ja progesteroni reseptorin (PR) in EOC tuumorinäytteissä ja solulinjoissa käyttäen kvantitatiivista RT-PCR. Tutkimme myös näiden geenien ilmentymistä on julkisesti saatavilla microarray aineisto. HYAL-1-entsyymin aktiivisuus mitattiin EOC solulinjoissa ja plasmassa näytteitä potilaista. Olemme havainneet, että

HYAL1

mRNA: n ekspressio oli koholla selvää solu- ja mucinous EOC kudosnäytteet, mutta ei vakavien ja endomet- näytteitä, normaali munasarjat tai hyvänlaatuisia kasvaimia. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kahdella eri tekniikoita ja kudosnäyte kohortteja kahdesta itsenäisestä laitosten. Yhtäpitävästi,

HYAL1

mRNA-tasoja ja entsyymiaktiivisuus kohosivat vain EOC johdetut solulinjat selkeä solujen ja mucinous alatyyppiä. Osoitimme myös, että

HYAL1

mRNA korreloi käänteisesti kuin ERa nimenomaan selkeä solujen ja mucinous EOCs. Lisäksi ektooppinen ilmentyminen ERa selkeällä solu- EOC solulinja (ER- ja PR-negatiivinen) indusoi 50%: n vähennys

HYAL1

mRNA ilmaisu, joka tukee roolia ERa in

HYAL1

geeni säätö. On merkittävää, HYAL-1-aktiivisuutta oli myös korkea plasman potilaiden näitä EOC alatyyppejä.

Johtopäätökset /merkitys

Tämä on ensimmäinen raportti osoittaa korkea HYAL-1 tasot EOC ja osoitetaan

HYAL1

geeni tukahduttamisen ERa. Tuloksemme tunnistaa Hyaluronidase-1 mahdollisena kohteena /biomarkkeri selkeitä solun ja mucinous EOCs ja erityisesti kasvainten alhainen ERa tasolla.

Citation: Yoffou PH, Edjekouane L, Meunier L, Tremblay A, Provencher DM, Mes-Masson AM, et ai. (2011) alatyyppi Erityiset Kohonnut ilmentyminen hvaluronidaasin-1 (HYAL-1) in epiteelikasvaimet munasarjasyöpä. PLoS ONE 6 (6): e20705. doi: 10,1371 /journal.pone.0020705

Editor: Nai Sum Wong, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu 15 joulukuuta 2010 Hyväksytty: 08 toukokuu 2011; Julkaistu: 10 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 Yoffou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoitti luonnontieteiden ja tekniikan tutkimuksen toimikunta Kanadan (avustus # 262142 EY). Kasvaimen pankki tukivat Banque de kudosten et de données on Réseau de Recherche sur le syöpä Fonds de la Recherche en Sante Québec sidoksissa Kanadan kasvain Repository Network. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä (EOC) on johtava kuolinsyy peräisin gynecologic syöpä useimmissa länsimaissa [1]. Koska sen oireettomia kasvun ja tehottomuuteen seulontamenetelmiä, noin 70% kaikista tapauksista diagnosoidaan pitkälle edenneessä vaiheessa, jossa vain vaatimattomia parannuksia selviytymisen 40 viime vuoden aikana [1]. Vaikka useimmat potilaat reagoivat kemoterapian aluksi, uusiutuminen on hyvin korkea johtaa yleisesti huonon ennusteen näillä potilailla havaitusta [2]. Lisäksi EOCs ovat morfologisesti heterogeenisiä, ja erilaiset histopatologiset alatyyppejä on erilaiset molekyyli- ominaisuudet ja monipuolinen hoitovastetta [3]. EOC voidaan luokitella vakavien, endomet-, kirkas solu tai mucinous jotka vastaavat erilaisten epiteelin läsnä naisten lisääntymisterveyttä tract [4]. Erot kemoterapiaa vasteen ja hoitotuloksia todennäköisesti seurausta molekyyli- heterogeenisyys nämä morfologisesti erillisten EOCs [3]. Esimerkiksi

TP53

mutaatiot havaitaan usein vakavasta ja endomet- syöpiä, mutta ne tuskin havaitaan selkeä solujen ja mucinous EOCs [3]. On myös tunnettua, että taajuus kromosomi epävakaus on suurempi serooseista EOC kuin muihin alatyyppeihin [3].

vakavien EOC, molekyyli- geneettinen analyysi on ehdottanut rooli tuumorisuppressorigeeneille sijaitsee lyhyen varren kromosomin 3 (3p) patogeneesissä tämän taudin [5]. Transcriptome analyysi kromosomin 3 geenien havaittiin useita ilmennetty eri geenien EOC solulinjoissa ja munasarjojen kasvaimia verrattuna normaaliin munasarjojen pinnan epiteelisolujen (NOSE) solut [6], [7]. Kromosomimuutoksia 3p21.3 esiintyvät usein keuhko-, munuais- ja rintasyöpiä, mikä viittaa siihen, että ne satama tuumorisuppressorigeeneille [8]. Sijaitsee kromosomissa 3p21.3 on klusterin geenien, nimeltään hyaluronidaaseista (

HYAL1

,

HYAL2

ja

HYAL3

), jotka ovat yleisin kohde Homotsygoottisen poistot keuhkosyöpä [8].

Mammalian hyaluronidaaseista (EY 3.2.1.35) ovat endo-

N

-acetylhexosaminidases jotka hydrolysoivat glykosaminoglykaanin hyaluronaani. Ne käsittävät perheen 6-7 geenien kanssa noin 40% identiteetti keskenään [9], [10]. Ihmisillä, ne on ryhmitelty kolmen ryhmissä kromosomeissa 3p21.3 (

HYAL1

,

HYAL2

ja

HYAL3

) ja 7q31.3 (

HYAL4

,

PH20 Twitter /

SPAM1

ja

HYALP1

), jossa

HYALP1

ollessa pseudogeenin ja

HYAL4

koodaavat kondroitinaasin entsyymi [9], [11]. Näin ollen, ihmisillä, on neljä hyaluronidaaseista, HYAL-1, -2, -3 ja PH20 /Spam1, jolloin viimeksi mainittu on pääasiassa ilmaistaan ​​uroksen lisääntymiselimistössä ja jolla on tärkeä rooli hedelmöityksen [12]. Toisaalta, hyaluronidaaseista sijaitsee kromosomissa 3 ekspressoituvat. HYAL-1 ja HYAL-2 ovat tärkeimmät somaattiset hyaluronidaaseista vastaa hyaluronaanin liikevaihdon ja tiedetään olevan useita fysiologisia ja patologisia rooleja [9], [13], kuten haavan paraneminen, tulehdus ja nivelrikko. Sen sijaan, HYAL-3 on kuvattu olevan vailla hyaluronaanin entsymaattisen aktiivisuuden [14], ja sen fysiologinen rooli on vielä määritettävä.

munasarjasyöpä, alleelinen epätasapaino näiden kolmen geenin (

HYAL1

,

HYAL2

ja

HYAL3

) on osoitettu kasvaimeen ja strooman kudoksissa [15]. Erityisesti

HYAL-1

mRNA-ekspressiota havaittiin merkittävästi pienentää vakavien EOC verrattuna normaaliin munasarjat [16], kun taas ennallaan tai taipumus vähentynyt HYAL-1-aktiivisuus on raportoitu EOC kudosuutteilla [ ,,,0],16], [17]. Tämän mukaisesti havainnon, ekstrasellulaarinen kerääntyminen hyaluronaanin on usein havaittu munasarjojen kasvainten stroomassa ja perisellulaarinen matriisi, ja siihen liittyy huono tautiin tulos [17], [18]. Lisäksi useat raportit ovat osoittaneet vuorovaikutuksia Hyaluronaani ja kalvon reseptoreihin, kuten CD44, joka edistää yhdistys CD44 tiettyjen sytoskeletaaliset proteiinien (esim ankyriiniproteiinista, RhoGTPases, Cdc42) spesifisten signalointi tapahtumia edistetään munasarjasyövän soluadheesiota, muuttoliike ja selviytyminen [ ,,,0],19].

Sitä vastoin tasot sekä hyaluronaani ja HYAL-1 on raportoitu lisätään virtsarakon, eturauhasen ja pään ja kaulan alueen syövät, ja jotka osallistuvat kasvaimen etenemisen ja etäpesäkkeiden [20] – [ ,,,0],22]. Mielenkiintoista, kohonnut solunulkoisen hyaluronaaniin esiintyy pääasiassa kasvaimen strooman taas kohonnut HYAL-1 tasot havaitaan tuumorikudoksissa, mikä viittaa ylikuuluminen näiden kahden kudoksen tyyppiä. Korkea HYAL-1 ilmentymisen on havaittu myös rintasyövän ja glioblastoomat, ja korreloidaan etäpesäkkeitä [22], [23]. Mielenkiintoista on, estrogeenireseptori (ER) rintasyöpä solulinjoissa, jotka ovat yleensä aggressiivisempia, on parannettu hyaluronidaasia aktiivisuus verrattuna ER-positiivisissa solulinjoissa [24]. Mekanismilla vielä tuntematon, HYAL-1 indusoi solusykliä siirtyminen ja ajan säätelee tasot positiivinen säätelijöitä G2-M siirtyminen (esim cdc25c, sykliini B1, cdk10) virtsarakon, eturauhasen ja suun squamous syöpäsolulinjat [25] – [27]. HYAL-1 lisää myös angiogeneesiä, luultavasti tuottaa hyaluronaani fragmentteja erillisten koot, joilla on kyky stimuloida endoteelisolujen proliferaatiota ja kapillaarin muodostumisen [28].

Siksi tasot hyaluronidaasia ilmentyminen voi vaihdella kasvaimen tyypistä ja sen aggressiiviseen käyttäytymiseen. Tässä työssä me tehdään yksityiskohtaisen tutkimuksen ilmentymistä HYAL-1 munasarjasyövän kudosnäytteistä edustaa neljää eri histopatologisia alatyyppiä ja osoitti kohonneet tämän entsyymin selkein solussa ja mucinous EOCs, mutta ei vakavien tai endomet-. Olemme myös osoittaneet, että tasot

HYAL1

mRNA selkeä solujen ja mucinous EOCs oli korreloi käänteisesti kuin ERa. Merkittävästi, osoitimme, että ektooppinen ilmentyminen ERa aiheutti 50%: n lasku

HYAL1

mRNA ilmaisu on selkeästi solu- EOC solulinjassa. Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti: i) osoittamaan kasvoi HYAL-1 ilmentymisen tiettyjä morfologisia EOC alatyyppejä, ii) osoittaa käänteinen korrelaatio

HYAL1

ja steroidihormonien kudosnäytteistä, ja iii) syytetään

HYAL1

geeni kuin ERa kohteena geenin tukahduttaminen. Lopuksi me osoitti 2,1-2,8 kertainen lisäys plasman tämän entsyymin potilailla, joilla on selkeä solujen ja mucinous EOC, mutta ei niitä, joilla vakavien tai endomet- kasvaimissa verrattuna, joilla on hyvänlaatuinen kysta. Meidän esillä olevat tulokset tunnistaa HYAL-1 mahdollisena biomarkkerina havaitsemiseksi näiden kahden erillisen EOC alatyyppiä.

Materiaalit ja menetelmät

Kliiniset näytteet

Tissue kasvaimen näytteitä ja EDTA- kerätty plasma saatiin, jossa tietoon perustuvan suostumuksen osallistujien meneillään leikkauksia suoritetaan Centre hospitalier de l’Université de Montréal (Chum) Hôpital Notre-Dame. Linjaukset keräämiseen ja käyttöön kudos- ja verinäytteitä hyväksynyt tutkimuseettinen komitea Chum. Vain kasvainten kemoterapiaa saamattomien potilaiden käytettiin. Histopatologia, laatu ja vaihe kasvaimet jaettiin mukaan International Federation of Gynecology and Obstetrics (FIGO) kriteerit. Koska normaali munasarja on vähäinen epiteelin sisältöä, hyvänlaatuiset serous munasarjakasvaimia käytettiin kontrollina. Tiedot näytteitä käytetään esillä olevassa tutkimuksessa on esitetty yhteenvetona taulukossa 1.

Cell Lines

primaariviljelmät normaalin munasarjan pintaepiteelin (NENÄ) solut saatiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [ ,,,0],29], munasarjoista kolmen osallistujien ei ole aiempaa munasarjasyöpä, seuraava profilactic oophorectomy klo Chum Hôpital Notre-Dame ja tietoisen suostumuksen. EOC-solulinjat perustettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [29] – [31], ja ne, jotka ovat peräisin vakavasta munasarjan epiteelin kasvaimissa (TOV81D, TOV2223, TOV1946) tai askitesnesteestä (OV1946, OV866), peräisin endomet- munasarjakasvain (TOV112D), joka on kirkas cell carcinoma (TOV21G), ja mucinous epiteelin munasarjasyöpä (TOV2444). Soluja viljeltiin OSE väliaineessa (Wisent Inc., St-Bruno, QC, Kanada), joka sisälsi 2,5 ug /ml amfoterisiini B: tä ja 50 ug /ml gentamysiini (molemmat Invitrogen, Burlington, ON, Kanada). Culture media täydennettiin 15% naudan sikiön seerumia (FBS, Invitrogen) ja nenän kulttuureja ja 10% FBS: ää EOC solulinjoissa.

Quantitative reaaliaikaisen RT-PCR (Q-PCR) B

Kokonais-RNA uutettiin Trizol-reagenssia (Invitrogen) jäädytetyistä kasvaimen näytteitä tai suoraan soluista, joita kasvatettiin 80%: n konfluenssiin, kuten aiemmin on kuvattu [32]. RNA laatua valvottiin rutiininomaisesti agaroosigeelielektroforeesilla ja 2100 Bioanalyzer, käyttäen RNA 6000 Nano LabChip kit (Agilent Technologies, Waldbronn, Saksa). CDNA-synteesi suoritettiin protokollaa QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen Inc., Mississauga, ON, Kanada) käyttämällä 1 ug kokonais-RNA: ta. Saatu cDNA laimennettiin kymmenen kertaa ja 5 ul: n alikvootteja käytettiin kussakin Q-PCR-reaktiossa. Kvantitatiivinen monistukset saatiin käyttämällä Platinum® SYBR® Green Q-PCR SuperMix UDG (Invitrogen) ja seuraavat parin alukkeita: 5′-AAGCCCTCCTCCTCCTTAACC-3 ’ja 5′-AGCCAGGGTAGCATCGAC-3’ ja

HYAL1

, 5′-CGCGCTCTACCCTGCACTC-3 ’ja 5′-TGAATCCGGCCTCAGGTAGTT-3′ ja ERa, 5’-TGGGCTTACTGACCAACCTG-3 ’ja 5′-CCTGATCATGGAGGGTCAAA-3′ ja ER, 5’-AGAGTCCCTGGTGTGAAGCAA-3 ’ja 5′-GACAGCGCAGAAGTGAGCATC-3 ”progesteroni reseptorin (PR), 5’-GCGCTGGCTCACCCCTACCT-3 ’ja 5′-GCCCCAGGGTGCAGAGATGTC-3’ varten

ERK1

. Edellä mainittu ERa, ER ja PR-alukkeen sekvenssit saatiin edellisestä julkaisu [33].

ERK1

valittiin ohjaus geeni perustuu vakaaseen ilmaisun munasarjanäytteiden, joka koostuu normaalin ja eri EOC alatyyppejä [34], [35], ja kuten aiemmin on kuvattu [34]. Fluoresenssi vangittiin käyttäen iCycler iQ reaaliaikainen tunnistusjärjestelmä (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Monistukset suoritettiin 50 ° C: ssa 2 minuuttia (UDG inkubointi), 95 ° C: ssa 3 minuuttia (denaturointi), ja 50 sykliä 95 ° C /30 sekuntia, 58 ° C /30 s ja 72 ° C /45 s , jonka jälkeen sulamiskäyrä 70 sykliä 0,5 ° C lisäys /sykli alkaa 60 ° C: ssa. Positiiviset ja negatiiviset kontrollit otettiin käyttöön kaikissa kokeissa ja puhtaus ja spesifisyys PCR-tuotteet satunnaisesti seurattiin agaroosigeelielektroforeesilla. PCR-reaktiot suoritettiin vähintään kolme kertaa kullekin cDNA näytteen erillisissä kokeissa. Suhteellinen ekspressio arvo saatiin käyttämällä 1/2

ACt-menetelmällä käyttäen

ERK1

kontrollina geenin. Tässä menetelmässä ero C

T (ACk

T) välillä kohteen ja kontrolli geenejä käytettiin määrittämään geenien ilmentymisen kaavalla 2

ACt. Normalisoitu arvo lausekkeen kohdegeenin viitaten ohjaus geeni saatiin sitten laskettaessa 1/2

ACt. Kaikki mRNA ilmaisu arvot olivat suhteet suhteessa kontrolliin

ERK1

geeni.

Voit seurata biologisen vasteen ERa kohdunulkoisen ilmentymisen TOV21G soluissa (katso alla), Q-PCR suoritettiin mitata mRNA tasot tunnetaan ERa tavoitteiden, kuten

GREB1

(kasvua sääntelyn estrogeenin rintasyövän 1) ja

TFF1

(apilatekijän 1, joka tunnetaan myös pS2 geeni) [36], [37]. PCR-reaktiot suoritettiin kuten edellä on kuvattu käyttäen seuraavia alukeparia: 5′-TTCCCCGAAGTGCCAACAAC-3 ’ja 5′-ATGGAGATTCTGGAGACCACCC-3’ ja

GREB1

, ja 5′-TGGAGAACAAGGTGATCTGCG-3 ’ja 5’- CGAAACAGCAGCCCTTATTTGC-3 ’ja

TFF1

.

GEO Aineisto Analyysi

Geenien ilmentyminen profiileja useiden kudosnäytteiden neljästä morfologisesti erillistä munasarjojen syöpien ja normaalin munasarjat on suoritettu käyttämällä Affymetrix HG_U133A array [35] ja tehtiin saatavilla kautta National Center for Biotechnology Information (NCBI) (GEO aineisto GSE6008). Esillä olevassa tutkimuksessa olemme ladannut raaka taulukko kutakin kasvaimen näytteen ja valitut normalisoidut arvot [quantile-normalisoitu lohkottu-keskiarvo, log-transformoitiin log (max (x + 50,0) +50] varten hybridisaatio koettimien kiinnostavia. kun kyseessä on

HYAL1

ja PR, Affymetrix HG_U133A array sisälsi vain yhden koettimen kullekin näistä geeneistä (210619_s_at ja 208305_at, vastaavasti). Näin ollen näitä arvoja käytettiin sellaisenaan meidän analyysi arvioida näiden geenien ilmentymistä yksittäisissä kudosnäytteistä. kuitenkin ERa ja ER useita koettimia oli saatavilla (205225_at, 211233_x_at, 211234_x_at, 211235_s_at, 211627_x_at, 215551_at, 215552_s_at, 217163_at, 217190_x_at varten ERa ja 210780_at, 211117_x_at, 211118_x_at, 211119_at , 211120_x_at ja ER), ja keskiarvo normalisoidut arvot koettimet kunkin geenin käytettiin työmme analysoida näiden geenien ilmentymistä yksittäisissä kudosnäytteistä. koskevat tiedot histologia, laatu ja vaihe nämä näytteet saatiin käytettävissä täydentävä materiaali [35], ja on esitetty yhteenvetona taulukossa 1.

hyaluronaani tsymografialla

seurata hyaluronidaasia aktiivisuus solulysaateista peräisin munasarjasyövän solulinjoissa, hyaluronaani tsymografialla suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [38] . Solut kerättiin 80% konfluentteja viljelmiä suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin (10 mM imidatsolia, 0,25 M sakkaroosi), sonikoitiin ja niiden proteiinipitoisuus määritettiin Bio-Rad Protein Reagent. Näytteet (joka sisältää 30 ug proteiinia) erotettiin natiivi-PAGE (20 mA, 4 ° C) 8% geeliä, joka sisälsi 0,25 mg /ml ihmisen napanuoran Hyaluronihapon (Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario, Kanada). Geeli oli sitten lyhyesti tasapainotettu määrityspuskurissa spesifinen hyaluronidaasia-1 tunnistus (100 mM natrium- formaatti, 150 mM NaCl, pH 3,7) ja sen jälkeen inkuboitiin yön yli samassa puskurissa 37 ° C: ssa. Inkubaation jälkeen geelejä käsiteltiin 0,01 mg /ml pronaasia (Sigma-Aldrich) 20 mM Tris-puskuria (pH 8,0) 4 tuntia, huuhdeltiin tislatulla vedellä ja värjättiin peräkkäin 0,5% Alcian sininen ja 0,1% Coomassie Blue R sekä 30% methanol:10% etikkahappoa. Geelit de-värjättiin vasta clearing bändejä pilkottu Hyaluronaani olivat ilmeisiä. Geelitsymografiaa toistettiin kolme kertaa kullekin solulinjan kanssa käyttäen solu-uutteita eri kulttuureissa.

HYAL-1 entsymaattinen aktiivisuus plasmanäytteistä

kvantifiointi HYAL-1-aktiivisuutta plasmassa näyte analysoitiin jonka kolorimetrinen menetelmä arvioimiseksi

N

asetyyli-D-glukosamiini (NADG) vapautunut hyaluronaania ruuansulatusta [39], [40]. Lyhyesti, alikvootteja EDTA-käsitellyn plasma (noin 4 ui, joka sisältää 30 ug proteiineja, kuten määritettiin Bio-Rad Protein Reagent) inkuboitiin 40 ug hyaluronaanin ihmisen napanuoran (Sigma-Aldrich) 200 ul: n lopullisessa tilavuudessa reaktiopuskuria (79 mM natrium- formaatti, 150 mM NaCl, 0,2 mg /ml BSA: ta, pH 3,9) 37 ° C: ssa 24 tuntia. Reaktio lopetettiin lisäämällä 40 ui 1,2 M kalium-tetraboraatti, pH 9,1 ja keitettiin 3 min. Värinmuodostus paljastuu lisäämällä 1,2 ml

p

-dimethylaminobenzaldehyde reagenssia (valmistettu kuten aikaisemmin on kuvattu [39], [40]), ja inkuboimalla 37 ° C: ssa 20 min happamassa ympäristössä tätä reagenssia . Näytteet heti luettiin 585 nm: ssä. Hyaluronidaasi aktiivisuus, arvioitiin NADG (Sigma-Aldrich) standardikäyrä (1-10 nmol), ja ilmaistiin nmol /ug proteiinia. Plasman proteiinipitoisuus määritettiin BioRad Protein Assay. Aihioita saatiin jättämällä pois plasmanäytteet. Kukin plasma näyte mitattiin vähintään kolme kertaa erillisissä kokeissa.

TOV21G transfektion

pCDNA-plasmidia (Invitrogen), joka sisälsi ihmisen estrogeenireseptori alfa-sekvenssin (nimetty pERα) on kuvattu [41] , [42]. TOV21G soluja viljeltiin täydellisessä OSE (Wisentin) väliaineessa, kuten edellä on kuvattu, kunnes solut olivat noin 60% konfluentteja. Solut transfektoitiin lyhytaikaisesti 1 ug pERα DMEM-F12 -alustassa (Wisentin) ilman täydentää käyttäen GeneJuice transfektioreagenssia (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ), mukaisesti valmistajan ohjeiden. Yön yli transfektion jälkeen elatusaine korvattiin täydellisen OSE väliaineessa, ja soluja viljeltiin ylimääräiset 24 h proteiinin ilmentymisen. Lopussa kokeen, solut kerättiin trypsiini-EDTA-käsittely (0,25% trypsiiniä, 1 mm EDTA; Invitrogen), pestiin PBS: ssä ja niitä käytetään RNA: n uutto- ja Q-PCR: llä tai proteiinin uuttamalla ja immunoblottaus. Transfektiokokeet toistettiin vähintään kolme kertaa.

immunoblottauksella

Solut hajotettiin Tris-puskuroidulla suolaliuoksella (20 mM Tris-HCI: a, 150 mm NaCl, pH 7,4) (TBS), joka sisälsi 0,1% Triton X-100, 1 mM tiiniinia, 1 mM NaF, 0,1 mM PMSF ja 1 × proteaasiestäjäseostabletit (Complete-mini, Roche Diagnostics Kanada, Laval, QC, Kanada). Proteiinipitoisuus määritettiin BioRad Protein Reagent käyttäen BSA standardikäyrää. Näytteet (lysaatit noin 30 ug proteiinia), tehtiin 12% SDS-PAGE, pelkistävissä olosuhteissa, ja siirrettiin sähkön nitroselluloosamembraaneille. Ei-spesifinen sitoutuminen kalvoon blokattiin 5% kuivattu kuorittu maito TBS. Sitten kalvoja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla (4 ° C, yön yli), pestiin TBS: ssä, joka sisälsi 0,1% Tween, ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasiin konjugoitu sekundäärisen vasta-aineita. Ensisijainen IgG käytettiin työmme olivat anti-ERa (H-184, 1:1000, kanin vasta-aine; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ja anti-aktiini (pan Ab-5, 1:1500, hiiren vasta; Lab Vision Corp., Fremont, CA). Nämä vasta-aineet testattiin meidän olosuhteissa olevan tyypillinen tavoitteensa proteiineja. Peroksidaasi-konjugoitua anti-hiiri-IgG (1:1000, vuohen vasta-aine; Sigma) ja anti-kani-IgG (1:3000, vuohen vasta-aine; Bio-Rad) käytettiin sekundäärisiä vasta-aineita. Proteiini-vasta-aine tunnustamisesta havaittiin Western Lightning kemiluminesenssin Reagent Plus (PerkinElmer, Boston, MA), mukaan valmistajan ohjeiden.

Tilastollinen

Koska tasot HYAL-1 ja hormonireseptorit ei aina normaalisti jakautunut, nonparametric testejä käytettiin analysoimaan geeni-ilmentymisen kudosnäytteistä ja entsymaattinen aktiivisuus plasmassa näytteissä. Ensin suoritetaan parametristä Kruskal-Wallisin varianssianalyysi ja kun havaittu merkitseviä eroja, teimme Mann Whitney joissa verrattiin ryhmään normaalien (for microarray) tai hyvänlaatuinen (Q-PCR ja aktiivisuus) näytteet kunkin kasvaimen alatyypeistä erikseen . Tilastollinen merkittävyys harkita

P

0,05. Spearmanin rank korrelaatiokertoimet laskettiin ja pidettiin tilastollisesti merkitsevä, kun

P

0,05. Erot geenin ilmentymisen transfektoiduissa ja ei-transfektoituja TOV21G solut analysoitiin Studentin

t

-testiä (two-tailed, tasa-varianssi), ja niitä pidetään merkittävinä, kun

P

0,05 . Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen Prism4 for Windows version 4 (GraphPad Software, Inc.).

Tulokset

Hyaluronidase-1 ilmentyminen on kohonnut selvästi solussa ja mucinous muttei serous ja endomet- EOC

aiemmin ilmentymisen hyaluronidaasia-1 munasarjasyövän on kuvattu erityisesti vakavien kasvaimissa [16], [17], todennäköisesti koska tämä on yleisin EOC alatyyppi [4]. Tässä tutkimuksessa olemme analysoineet mRNA: n ilmentymisen tämän entsyymin Q-PCR: llä munasarjan syövän kudosnäytteitä saatiin potilailta, joilla on erilaiset morfologiset alatyyppejä tämän sairauden, esim. vakavien (11 näytettä), endomet- (9 näytettä), kirkas cell (11 näytettä) ja mucinous (8 näytettä). Ekspressiotasoja verrattiin sitten kuin 15 hyvänlaatuisia munasarjojen kasvaimia. Hyvänlaatuiset kasvaimet valittiin vertailun vuoksi niiden runsas pitoisuus pintaepiteelissä joka on hyvin vähän normaalissa munasarjat. Lisäksi halusimme välttää mahdolliset häiriöt of HYAL-1 ilmaisunvapautta muissa munasarjojen solutyypeissä. Esimerkiksi, olemme osoittaneet, että tämä entsyymi ilmentyy hiiren munasarjan soluihin [38]. Kuten kuviossa 1A, tasot

HYAL1

mRNA ovat selvästi kohonneet selvästi solussa ja mucinous karsinoomat (Mann Whitney testi,

P

0,05), mutta ei vakavien ja endomet- kasvaimia.

A) Q-PCR

HYAL1

mRNA: n ekspression hyvänlaatuinen kasvain (valkoinen palkki) ja vakavien (pilkullinen bar), endomet- (viivoitettu pylväs), kirkas cell (tummennetut bar) ja mucinous (musta palkki) EOC kudosnäytteitä potilailta. Pylväät edustavat keskiarvoa ± SEM suhteellinen

HYAL1

ilmaus normalisoitui ohjaamaan geenin

ERK1

eri potilasta molemmissa ryhmissä. Arvo kunkin cDNA näyte on keskiarvo 3-4 erillistä Q-PCR mittauksia. * Merkitsee

P

0,05 Mannin Whitneyn testi. B) normalisoidut arvot

HYAL1

koetin hybridisaatio Affymetrix HG_U133A array (GEO aineisto GSE6008) RNA näytteitä normaalista munasarjan kudosten (valkoinen bar), ja vakavien (pisteviiva bar), endomet- (viivoitettu pylväs), kirkas cell (tummennetut bar) ja mucinous (musta palkki) EOCs. Pylväät edustavat keskiarvoa ± SEM raaka-arvojen normalisoidaan

HYAL1

hybridisaatio. * Merkitsee

P

0,05 Mannin Whitneyn testi. C) Q-PCR:

HYAL1

mRNA: n ilmentymisen solulinjoissa, jotka ovat peräisin normaalista munasarjan epiteelin (NOV2667D, NOV2809D, NOV2206D; valkoiset pylväät), ja vakavien (TOV81D, TOV2223, TOV1946, OV1946, OV866, täynnä baareja ), endomet- (TOV112D; haudottu bar), kirkas cell (TOV21G; tummennetut bar) ja mucinous (TOV2444; musta palkki) EOCs. Pylväät edustavat keskiarvoa suhteellinen

HYAL1

ilmaisu normalisoitu ohjaamaan geenin

ERK1

kunkin solulinjan. Q-PCR mittaukset toistettiin vähintään kolme kertaa kunkin solulinjan cDNA: sta. Solulinjat peräisin eri EOC alatyypeistä ovat edustettuina eri baareissa siis ole virhepalkkeja ovat edustettuina. Vertical nuolet osoittavat selkeää solu ja mucinous solulinjoja, joilla on korkea

HYAL1

mRNA ilmaisun. D) Hyaluronaani Tsymogrammi solulysaattien edellä mainituista vakavien, endomet-, selkeä solujen ja mucinous munasarjasyövän solulinjoissa. Vaakasuora nuoli merkitsee selkeä bändi pilkottu Hyaluronaani. Kuva edustaa kolmen itsenäisen Tsymogrammi kokeita.

Koska koko meidän näyte kohortin voitaisiin pitää pieninä, päätimme vahvistaa tuloksemme analysoimalla

HYAL1

mRNA ilmentymistä julkisesti saatavilla microarray aineisto [35] (GEO aineisto GSE6008), joka sisältää 41 seroosinen, 37 endomet-, 8 selkeä solu ja 13 mucinous EOC näytteitä, ja 4 normaali munasarjojen kudosnäytteitä. Kuvio 1B esittää normalisoidut arvot [quantile-normalisoitu lohkottu-keskiarvo, log-transformoitiin log (max (x + 50,0) +50] varten hybridisaatio kunkin näytteen kanssa

HYAL1

koetin (210619_s_at) ja Affymetrix HG_U133A array. Yhdenmukaisesti Q-PCR-tuloksiin, mitään merkittävää eroa ei havaittu

HYAL1

mRNA: n ilmentymisen välillä normaalin munasarjan kudosten ja että vakavien tai endomet- kasvainnäytteet (kuvio 1 B). Kirkas solukarsinoomat oli taipumus ilmaista korkeampi

HYAL1

mRNA kuin normaali munasarjakudoksen mutta ei ole tilastollista merkitystä saavutettiin. mukaisesti meidän tuloksia, mucinous näytteillä oli tilastollisesti merkitsevä korkeampi

HYAL1

kuin normaali kudos (Mann Whitney testi,

P

0,05) (kuvio 1 B).

Munasarjasyöpä solulinjoissa tuumorinäytteistä näiden eri morfologiset alatyyppejä on aiemmin tunnettu ja se osoitti käyttäytyminen on samanlainen kuin kasvaimen näyte, josta ne ovat peräisin [29] – [31]. ne tarjoavat tehokkaita työkaluja tutkimaan molekyylitason tapahtumia liittyen kuhunkin morfologisesti erillisen munasarjasyöpä. Siksi seuraava vaihe oli analysoida ilmentymisen tasoon

HYAL1

mRNA ja proteiini näissä solulinjoissa. Primääriset soluviljelmät normaalista munasarjan pintaepiteelissä (NOSE) [29] käytettiin verrokkeina. Kuvio 1C esittää, että, kuten odotettua, mRNA: n ilmentyminen

HYAL1

olivat erityisen suuria solulinjoissa TOV21G (peräisin selkeä cell carcinoma) ja TOV2444 (peräisin mucinous EOC). Keskitason taso

HYAL1

mRNA: n ekspressio havaittiin solulinjassa TOV112D, joka on johdettu endomet- munasarjakasvain. Johdetut solulinjat vakavien munasarjan epiteelin syövän ensisijaisen paikan päällä (TOV81D, TOV2223, TOV1946) tai askitesnesteestä (OV1946, OV866) osoitti vähäistä

HYAL1

ilmentyminen, jotka ovat verrattavissa NENÄ solulinjat. Osoittaakseen, että mRNA ekspressiotasot mitattuna määrällisesti meidän alukesetti, heijastuu määrä HYAL-1-proteiinia näissä näytteissä, mittasimme HYAL-1 entsyymiaktiivisuuden substraatti-geeli Tsymogrammi. Tämä on tavanomainen tapa mitata hyaluronidaasia aktiivisuutta ja se on spesifinen Hyaluronidase-1, kun määritettiin happamassa pH: ssa [38]. Kuvio 1D esittää selvästi kaistalla pilkottu substraatti (hyaluronaani) vain solulysaateista TOV21G ja TOV2444 solulinjat. HYAL-1 entsyymiaktiivisuus vakavien ja endomet- näytteissä oli alle määritysrajan tasolle meidän määrityksen.

Koska kohonnut HYAL-1 tasot ovat aikaisemmin korreloivan korkeamman asteen virtsarakon ja eturauhasen kasvaimia [21], [22 ], päätimme tutkia, onko taso

HYAL1

mRNA selkeä solujen ja mucinous munasarjojen kasvaimia olisi korreloi sairauden asteen tai vaiheessa (katso taulukko 1 potilaiden tietoja). Kuitenkin Spearmanin korrelaatio analyysit eivät paljastaneet merkittävää positiivista korrelaatiota tasojen

HYAL1

mRNA ja joko luokan tai vaiheessa selkeä solussa (r = 0,262 ja -0,322-luokan ja vaiheen vastaavasti meidän tietokokonaisuus, ja r = 0,055 varten vaiheessa microarray data, kaikki

P

0,05) tai mucinous kasvainnäytteet (r = -0,655 ja -0,577-luokan ja vaiheen vastaavasti meidän tietokokonaisuus, ja r = -0,094 ja – 0,378-luokan ja vaiheessa microarray data, kaikki

P

0,05). Global analyysi mukaan lukien kaikki alalajit eivät osoittaneet merkittävä positiivinen korrelaatio joko (r = -0,234 ja -0,251-luokan ja vaiheen vastaavasti meidän tietokokonaisuus, ja r = 0,185 ja 0,042-luokan ja vaiheessa microarray data, kaikki

P

0,05). Nämä tulokset viittaavat siihen, että HYAL-1 ilme voi olla luontainen fenotyyppinen ominaisuus selkeitä solun ja mucinous EOCs ja että sitä voitaisiin käyttää diagnostisina /havaitseminen markkeri näiden munasarjasyöpä alatyyppejä.

Hyaluronidase-1 aktiivisuutta voidaan havaita ilmastoituna kasvatusalustaa TOV21G solulinjan ja on mahdollisesti seerumin /plasman biomarkkeri selvää solu- ja mucinous EOC

on osoitettu, että HYAL-1 on läsnä viljelyalustassa eturauhasen ja virtsarakon syövän solulinjat sekä virtsaan potilaita, joilla on virtsarakon syöpä [21], [26], [27]. Tässä työssä, halusimme tarkistaa, onko HYAL-1 myös erittämät EOC solulinjojen ja voitaisiinko se käyttää seerumi /plasma merkkiaine kaksi morfologisia alatyypeistä, jossa sen ilmentymistaso on kohonnut, esim. selkeää solu ja mucinous EOC. Kuvio 2A osoittaa, että läsnä HYAL-1 aktiivisuutta (selkeä bändi pilkottu hyaluronaani) konsentroidussa seerumivapaa keskipitkällä TOV21G soluviljelmässä sekä sen solulysaatissa. Sitä vastoin ei ole entsymaattista aktiivisuutta voidaan havaita konsentroitiin väliainetta ja solu- lysaatti päässä TOV1946 solulinja (peräisin vakavasta EOC). Todettuaan, että HYAL-1 erittyy munasarjasyövän soluja, jotka ilmentävät tätä entsyymiä, tutkimme, onko tämä entsymaattinen aktiivisuus voidaan differentiaalisesti havaittu plasmassa potilailla, joilla on erilliset morfologiset EOC alatyyppejä.