Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA (Mirs) ovat uusi luokka pieniä RNA molekyylien dysregulaatio joka voi edistää syöpään. Yhdistelmävektori lähestymistapaa käytettiin tunnistamaan MIRS jotka edistävät eturauhassyövän etenemistä ainutlaatuisia eturauhassyövän solulinjoissa, jotka ovat peräisin vanhempien p69 solulinja ja ulottuvat erittäin tuumorigeenistä /metastaattinen M12-alalinjan. Yhdessä nämä solulinjat ajatellaan matkivat eturauhassyövän etenemisen

in vivo

. Aiemmat verkon analyysin ja miR paneelit ehdotti, että menetys HSA-miR-125b yhdessä yli-ilmentymisen HSA-miR-22 voisi edistää eturauhasen kasvaimien syntyyn. Dysregulation Näiden kahden Mirs vahvistettiin ihmisen eturauhaskasvainnäytteissä verrattuna viereiseen hyvänlaatuinen rauhasepiteeliin kerätään laser kaapata mikrodissektion radikaalien prostatectomies. Itse asiassa, muutokset HSA-miR-125b ilmentyminen vaikutti varhainen tapahtuma kasvaimien syntyyn. Käänteisfaasi-microarray proteomiikka-analyysi paljasti, ErbB2 /3 ja loppupään jäsenten PI3K /AKT ja MAPK /ERK reitit sekä PTEN olevan proteiinin tavoitteet ilmentyvät differentiaalisesti M12 kasvainsolun verrattuna sen vanhempien p69 solu. Merkitykselliset lusiferaasi + 3′-UTR ilmentymisen tutkimukset vahvistivat suoran vuorovaikutuksen HSA-miR-125b ja ErbB2 välillä HSA-miR-22 ja PTEN. Palauttaminen HSA-miR-125 b tai esto HSA-miR-22 ilmentyminen kautta antagomiR johtanut muuttamista M12 tuumorisolun käyttäytymisen

in vitro

. Siten kaksi toiminta HSA-miR-125b tuumorisuppressorina ja HSA-miR-22 kuin oncomiR osaltaan eturauhasen kasvaimien syntyyn mukaan modulaatiot vuonna PI3K /AKT ja MAPK /ERK signalointireittejä, avain polkuja tiedetään vaikuttavan eturauhassyövän etenemiseen.

Citation: Budd WT, Seashols-Williams SJ, Clark GC, Weaver D, Calvert V, Petricoin E, et al. (2015) Dual toiminta miR-125b tuumorisuppressorina ja OncomiR-22 Edistää Eturauhassyöpä kasvaimien syntyyn. PLoS ONE 10 (11): e0142373. doi: 10,1371 /journal.pone.0142373

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 09 heinäkuu 2015; Hyväksytty: 21 lokakuu 2015; Julkaistu: 06 marraskuu 2015

Copyright: © 2015 Budd et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: saadut tiedot koko microRNA joukko näytön näistä eturauhasen solulinjojen on toimittanut SJS-W kuin tohtorin väitöskirja Virginia Commonwealth University kirjasto (VCU10886). Tiedot on saatavilla NCBI: n Gene Expression Omnibus ja pääsee GEO hakunumerolla GSE49520.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Cancer Institute, Grant Numero R21CA152349 on Zez. Rahoittaja antoi tukea muodossa palkkojen KOH, mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelua käsikirjoituksen. Erityinen roolit tämän kirjoittajan on nivelletty ”kirjoittaja maksut” -osiossa.

Kilpailevat edut: Rahoitusta tuki ei muuttanut kirjoittajan sitoutumista PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Transformation, kasvua ja ekstravasaatio syöpäsolujen tulokset useista geneettisten ja epigeneettisten muutoksia. Viime vuosikymmenen aikana on ollut kasvava määrä kirjallisuutta raportoi, että poikkeava ilmentyminen MikroRNA (Mirs) on mukana kehittämässä useita ihmisen syövistä [1-8]. Mirs ovat tärkeä luokka ei-koodaavat RNA: t, jotka vaikuttavat posttranskriptionaalisella proteiinin tasot ja, kun läsnä on ulkoisten vihjeiden ja ympäristön stressitekijöitä, on kyky aiheuttaa nopeita muutoksia proteomin mahdollistaa solun vastata tarkemman ja energiaa tehokkaasti [2-5]. Lukuisat solujen prosessit vaikuttavat Mirs, mukaan lukien erilaistuminen, kasvu /hypertrofia, solusyklin ohjaus ja apoptoosin [5,6].

säädeltyyn MIRS on osoitettu myötävaikuttavan onkogeneesiin menetys kasvaimen tukahduttamaan Mirs tai lisääntynyt ilmaus oncomiRs [1,9,10]. Joko menetys tuumorisuppressoreilla tai lisääntynyt ilmentyminen oncomiRs lopulta johtaa lisääntyneeseen solujen kasvua, lisääntymistä, invasiivisuuden tai etäpesäke. Poikkeava ekspressio edes yhden miR on mahdollista vaikuttaa useita soluprosesseja, sillä jokainen miR voi vaikuttaa satoja loppupään proteiineja, jotka edullisesti säätelevät keskeisimmät solun signalointi solmujen ja transkriptiotekijöiden [11]. Networks analyysi osoittaa, että tavoitteet Mirs on huomattavasti korkeampi solmu määrin kuin satunnaisesti valitun geenit [11,12]. Häiriön nämä erittäin toisiinsa molekyylien vaikutuksia solujen terveydelle johtaa taudin.

Siksi näyttää olevan tarpeen yhdistää useita lähteitä biologisen tiedon ymmärtää häiriöiden taustalla tietyn patologian peräisin järjestelmien tasolla. Suurikapasiteettisten tekniikoiden kuten DNA-siru, Genomikartoituksen, käänteisfaasi- proteomiikka, ja qRT-PCR profilointi mahdollistaa samanaikaisen hankinnan tuhansia tietojen pistettä. Risteyksessä useita tietolähteitä lisää todennäköisyyttä tunnistaa keskeiset reittejä osallisina syövän aloittamista etenemisen ja etäpesäkkeiden. Tässä työssä kuvataan ainutlaatuista kombinatorisista lähestymistapa ymmärtää vaikutuksen miR säätelyhäiriötä kun eturauhassyövän etenemistä. Vaikka Mirs on havaittu olevan yhteydessä eturauhasen syöpä, ei ole selvää yksimielisyyttä erityisistä MIRS jotka edistävät kasvaimen synnyssä [7,8].

A novel isogeenisiin eturauhassyöpäsolulinja etenemisen mallia käytettiin, koska se arvellaan läheisesti matkivat taudin etenemiseen kuin se esiintyy

in vivo

[13,14,15]. Integrointi miR kvantifiointiin profiilit ja proteomiikka tiedot on potentiaalia parempaan menestykseen identifioida uusia Mirs vaikuttaa kasvaimien syntyyn. Siksi data tuotetaan miR paneelit, Reverse Phase Microarray (RPPA) proteomiikka, sekä tietoa edellisestä verkkoja analyysiä käytettiin listalla säädeltyyn MIRS meidän eturauhassyövän etenemisen malli [12,16-18]. Putatiiviset väärin säädellystä Mirs oli edelleen tarkastettiin RNA eristettiin potilaiden eturauhasen kasvain näytteet laserilla capture mikrodissektion [LCM] [19,20]. Useat väärin säädellystä Mirs joka mahdollisesti ajaa eturauhassyövän etenemistä tunnistettiin [18,21]. Näiden Mirs merkitys HSA-miR-125b (miR-125b), ja HSA-miR-22 (miR-22), kasvaimien syntyyn vahvistettiin edelleen

in vitro

kokeissa. miR-125b ja miR-22 voivat olla käyttökelpoisia asiaan biomarkkereiden tunnistamiseen ja vaihe eturauhassyövän.

Materiaalit ja menetelmät

johtaminen Eturauhasen solulinjojen ja Cell Culture

p69 , M2182, ja M12-solut olivat lahja tri Joy Ware, Virginia Commonwealth University, Richmond VA, ja autentikointia STR analyysi [13,14]. Nämä solulinjat on johdettu kuolemattomaksi ei-neoplastisen eturauhasen epiteeli, jossa on SV40: n suuren T-antigeenin [13]. Emo (P69) solulinja on huonosti tuumorigeenisemmiksi, ja ei-metastaattinen pienemmällä modaalinen kromosomiluku kuin useimmat muut eturauhassyöpäsolulinjoissa eristetään tyypillisesti metastaasien (LNCap, DU145, ja PC3).

in vivo

valintaprosessissa käytettiin luomaan solujen lisääntynyt tuumorigeenisyyteen ja metastaattisen potentiaalia. Sen jälkeen kolme kierrosta ihonalaista injektiota uros kateenkorvattomiin nude-hiiriin, erittäin tuumorigeenisemmiksi ja metastaattinen variantti (M12) eristettiin, joka rutiininomaisesti metastasizes upon sisäistä eturauhasen injektio [14]. M2182 solulinja saatiin jälkeen kaksi kierrosta

in vivo

valinta ja siksi olisi väliaikainen fenotyyppi, joka on pienempi tuumorigeenisia kuin M12 soluja ja on ei-metastasoitunut. Soluja pidettiin viljelmässä 37 ° C: ssa vähemmän kuin kaksi kuukautta RPMI1640 median kanssa L-glutamiinia (Gibco), jota oli täydennetty 5% naudan sikiön seerumia, 0,05 mg /ml gentamysiiniä, 5 ug /ml insuliinia, 5 ug /ml transferriiniä, ja 5 ug /ml seleeniä (ITS Collaborative Research Bedford, MA) [13,14,19]. M12-solut stabiilisti transformoitu pSIREN plasmidivektori (Clontech), joka ilmaisee miR-125b (M12 + miR-125b) pidettiin puromysiinin kanssa (100 ng /ml) [19,22]. M12-solut stabiilisti transformoitu miARREST

™ miR22-3p inhibiittoria (M12 + miR-22i) ekspressioplasmidin (pEZX-AM03) päässä GeneCopoeia (HMIR-AN0332-AM03) pidettiin hygromysiinillä (200 ug /ml). Trypsinisoitiin (0,25% EDTA), solut pelletoitiin, pestiin PBS: llä, flash-jäädytettiin nestetypessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes ne käytettiin.

Cell Pellet RNA uuttaminen

Yhteensä RNA uutettiin jäädytetty solupelleteistä käyttämällä Mirvana

™ miR eristäminen menetelmä (Ambion-Life Technologies) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Eristämisen jälkeen, RNA-pitoisuus arvioitiin käyttämällä Biorad

® Smart Spec

™ 3000 spektrofotometrillä, joka on laimennettu pitoisuuteen 100 ng /ml, ja säilytettiin -80 ° C: ssa.

Cell Pellet DNA Extraction

DNA uutettiin jäädytetyistä solupelleteistä käyttämällä QIAamp DNA mini kit Qiagen (Cat. No. 51304) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Uuttamisen jälkeen DNA: n konsentraatio mitattiin edellä kuvatulla tavalla.

Onco kirjasto ja sekvensointi menetelmä

DNA-kirjastot muodostettiin solulinjat käyttäen Ion AmpliSeq

™ Library Kit 2,0 ja Ion AmpliSeq

™ Cancer hotspot Panel v2 (Cat. No. 4480441 ja 4475346). Syövän Hotspot Paneeli on yksi amplikonin allas, joka vahvistaa 207 amplikoneihin kattaa yli 2800 COSMIC mutaatioita 50 tunnettujen onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille. Kukin näyte valmistettiin käyttämällä 10 ng tulo mukaisen DNA Ion AmpliSeq

™ Kirjasto valmistus protokollan (Julkaisu Part Number MAN0006735 Revision A.0). Ion Xpress

™ Viivakoodi sovittimet 1-16 Kit (Cat. No. 4471250) käytettiin yksittäisten näyte barcoding ja sidonta liittimeen. Agencourt AMPure XP magneettiset helmet (Cat. No. A63882, Beckman) käytettiin esitettyjä Ion AmpliSeq

™ Kirjasto valmistelu käyttöopas. Näyte kirjastot kvantitoitiin käyttäen Qubit 2.0 fluorometri ja Suuri herkkyys dsDNA Assay Kit (Cat. No. Q32851) ja normalisoidaan pitoisuuteen 100 pM. Emulsio PCR suoritettiin Ion OneTouch

™ 2 Instrument (Cat. No. 4474778) kuten Ion PGM

™ malli OT2 200 Kit (julkaisunumero MAN0007220. Revision 5.0) käyttäen Ion PGM

™ Malline OT2 200 Kit (Cat. No. 4480974). Normalisoitu 100 pM näyte kirjastot yhdistettiin ja yhdistettiin OT2 reagensseja ja Ion Sphere hiukkaset (ISP). Reaktiota ajaa OT2 käyttäen 200 emäsparin protokollaa. Sitten näytteet käsitellä edun sen Ion OneTouch

™ ES. Rikastaminen Internet saavutettiin käyttämällä Ion PGM

™ malli OT2 200 Kit (Cat. No. 4480974) ja Dynabeadsilla MyOne streptavidiini C1 helmiä (Cat. No. 65001 Life Technologies) mukaan valmistajan protokollia (Ion PGM

™ Template OT2 200 Kit käyttöopas). Streptavidiini C1 helmiä sitoutuvat spesifisesti rikastettua Internet, jolloin kaikki muut voidaan pestä pois, mitä seurasi eluointi natriumhydroksidilla ja tween sulaa liuosta. Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) oli alustettu käyttäen Ion PGM

™ Sequencing 200 Kit v2 mukaan valmistajan suositusten (Ion PGM

™ Sequencing 200 Kit v2: julkaisunumero MAN0007273 Revision 3.0). Kontrollihelmet piikkeinä osaksi rikastettua helmi näyte, sekvenssointialukkeiden hybridisoitiin Internet ja polymeraasia lisättiin. ISP sekvensoitiin hyödyntäen Ion Torrent Ion 318

™ Chip. Ion Torrent PGM ajettiin mukaan Ion Torrent 200 Kit v2 tiedot hyödyntäen 500 nukleotidin virtoja, jonka jälkeen suuntaus on HG19 viittaus ja analysoitiin Ion Torrent Variant soittajan plugin.

TaqMan

® perustuu miR määritys

tarkastaminen kypsän miR ilmentymisen vahvistettiin käyttäen TaqMan

® miR menetelmää (Life Technologies, Grand Island, NY). cDNA syntetisoitiin 25 ul: n reaktiotilavuudessa kokonais-RNA (20 ng) käyttämällä TaqMan

® MicroRNA Käänteinen transkriptio kit. Reaktioita inkuboitiin 16 ° C: ssa 30 minuutin ajan, 42 ° C: ssa 30 minuutin ajan, ja inaktivoitiin 85 ° C: ssa 5 min. Kukin cDNA analysoitiin kolmena kappaleena kvantitatiivisella PCR: llä (qRT-PCR) käyttäen sekvenssin spesifisiä alukkeita, HSA-miR-125b-1 (ID 000449), HSA-miR-22-3p (ID 000398) tai RNU48 (ID 001006) kanssa Applied Biosystems 7300 reaaliaikainen PCR-instrumentti (Life Technologies). Kukin yksittäinen määritys suoritettiin 20 ul: n reaktiotilavuudessa, jossa 1,33 ui cDNA: ta, 1,0 ui erityisiä miR määrityksessä, 10 ui TaqMan

™ Universal PCR Master Mix II, jossa ei ole AmpErase UNG ja 7,67 ui nukleaasin vapaata vettä. Reaktioita inkuboitiin 50 ° C: ssa 2 min, jota seurasi 10 min 95 ° C: ssa, ja 40 sykliä, joissa denaturaatio 15 sekuntia 98 ° C: ssa, ja hehkutus /pidennys 60 sekuntia 60 ° C: ssa. Aineisto analysoitiin SDS ohjelmistoa v1.3.1 (Life Technologies). Kynnys ja lähtötilanteessa oli määritetty mukaan protokollan suosituksia, joiden lähtötason korjaus syklien välillä 3 ja 12 sekä automaattisen kynnyksen.

Tilastollinen analyysi qRT-PCR Data

suhteellinen määrä miR tasot määritettiin käyttäen 2

-ΔΔCT menetelmää Livak et al jälkeen normalisoinnin RNU48 tavallisena viite [23]. Kaikki näytteet tehtiin kolmena kappaleena ja keskimääräinen kierto kynnys (C

T) arvo määritettiin C

T-arvot ovat välillä 25 35. Keskimääräinen C

T normalisoitui vähentämällä keskimääräinen C

T RNU48 (ACk

T). Kaikki näytteet verrattiin vanhempien P69 solulinja vähentämällä kokeellinen ACk

T päässä ACk

T arvo p69 solulinja kalibraattori. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta 3 riippumattomasta kokeesta. Tilastolliset analyysit tehtiin Microsoft

® Excel ohjelmistoalusta, käyttäen riippumaton Studentin t-testiä, olettaen yhtä suuri varianssi kahden ryhmän välillä. Tilastollinen merkittävyys määritettiin s ≦ 0,05.

Laser Capture Mikrodissektiomenetelmiä (LCM) B

Kasvain ja eturauhasen hyvänlaatuisesta kudokset saatiin eturauhasen näytteistä, kun hyväksynnän Virginia Commonwealth University (VCU), Office tutkimus- ja innovaatio, Institutional Review Board (IRB), paneeli A. Neljä näytettä jäädytettiin kudos VCU: n Tissue ja kerääminen ja analyysi Core (TDAAC at https://www.pathology.vcu.edu/research/TDAAC) ja yksi arkistoidut FFPE näyte oli peräisin VCU: n Patologian osasto [19,22]. Ihmisen kudokset, potilas suostuu, ja kliiniset tiedot siirtänyt VCU TDAAC ydin laitokseen ja patologian osaston potilaan suostumukset. Kaikki potilaan näytteet de-suojelemiseksi määritetyt potilaan luottamuksellisuuden. Diat (10-20) tuotettiin ja tarkistaa hallituksen sertifioitu patologi (DE), joilla on asiantuntemusta eturauhassyövän diagnoosia tunnistaa eturauhasadenokarsinoomaa pesäkkeitä ja normaalissa rauhasepiteeliin sekä hyperplastic rauhasepiteeliin (BPH), eturauhasen intraepiteelisen neoplasia (PIN) ja strooman yhdestä ainutlaatuinen potilaan näytteestä. Eturauhasen adenokarsinooma luokiteltiin mukaista Gleason luokitusjärjestelmä [24]. Lyhyesti, 8 um kudosleikkeitä pantiin varauksettomat lasilevyille kuivattu asteittain kasvavilla pitoisuuksilla etanolia, ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H Dako Cytomation Carpinteria, CA) yhdessä katalysoitu Signal Amplification System (CSA; Dako Cytomation Carpinteria, CA), joka on kaupallisesti saatavilla tyramide-pohjainen avidiini /biotiini-monistus kit, käytettiin monistamaan signaalin havaitseminen. Fluoresoiva tunnistus saatiin käyttäen IRDye 680RD streptavidiini (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) mukaan valmistajan suositusten. Vasta-aine ja SYPRO Ruby värjätään objektilasit skannattiin Tecan laserskannerin (TECAN, Mönnedorf, Sveitsi) käyttäen 620 nm: n ja 580 nm: n paino pituuden kanava vastaavasti. Kuvat analysoitiin MicroVigene Software Version 5.1.0.0 (Vigenetech, Carlisle, MA) kuten aiemmin on kuvattu [16]. Kaiken solulysaatille ajettiin täpläksi 111 liukuu ja kukin inkuboitiin ainutlaatuinen vasta-aineella. Aineisto palautetaan Microsoft Excel, joka sisältää kunkin solutyypin analysoida kunkin vasta-kohteita.

Tilastollinen analyysi RPPA Data

Microsoft Excel käytettiin suorittamaan kahden otoksen yhtä suuri varianssi T -testissä verrata proteiinin ilmentymisen dataa M12 ja p69 solulinjoissa. Yhteensä 45-arvojen keskiarvo laskettiin kullekin vasta-aineelle testattiin proteiinin näyte. Tiukka todennäköisyyden arvo p = 0,001 käytettiin korjaamaan vaihtelua useiden näytteiden ja tunnistaa todella merkittäviä muutoksia. Raportoitiin merkittävät muutokset muunnettiin kertaiseksi muutoksia jakamalla keskimääräinen ilmentymistä proteiinin M12 solulinjassa keskimääräistä proteiinin ekspression vertailevassa p69 solulinjassa.

Tulokset

Seuraava Generation sekvensointi eturauhassyöpäsolulinjat

p69, M2182, ja M12 solulinjat edustavat ainutlaatuisia geneettisesti eturauhassyövän solulinjoissa ehdotetaan etenemistä malli monistaminen molekyyli tapahtumia aikana eturauhasen tumorgenesis

in vivo

[13,14,15]. M12 solulinja on erittäin tuumorigeenistä /metastaattinen muunnos johdettu vanhempien p69 solulinjan M2182 solulinjan näyttämällä välissä, mutta ei-metastasoituneen fenotyyppi. Sen sijaan muita vakiintuneita ihmisen eturauhasen solulinjoissa kuten DU145 tai PC3 edustavat solu- loppupisteet johdettu sekundaarikasvaimia ja siten, ei voida katsoa olevan etenemisen malli.

Uuden sukupolven sekvensointi (NGS) analyysi tehtiin tunnistamiseksi potentiaalisia nukleotidi vaihtelut geenien tiedetään liittyvän syövän etenemiseen, jotka voisivat selittää fenotyyppisen erot näytetään näistä solulinjoista. Yli 200000 lukee saatiin kultakin alalinja, joiden keskimääräinen lukea pituus ~ 110 mukset pituus (taulukko 1). Luettelossa on Somaattiset mutaatiot Cancer (COSMIC) kuvaa yli kaksi miljoonaa koodaussekvenssin pistemutaatioita tunnistettu erilaisia ​​syöpiä. Oli kuitenkin vain kolme KOSMINEN geenimutaatioita merkittävä kaikissa alalinjoja (STK11-COSM29005, PGFRA- COSM22413 ja APC-COSM19099) (taulukko 2). Mielenkiintoista, kaikki COSMIC mutaatioista lisättynä 11 uusia mutaatioita olivat yhdenmukaiset kaikkien jäsenten (P69, M2182 ja M12) eturauhasen syöpäsolun etenemisen malli. Oli yksi siirtyminen tymidiiniä sytosiinin että STK11 * geeni, joka ei ollut läsnä M12 solulinjassa, mutta koska tämä ei ole mutaatio tiedetään korreloivan syöpäriskiä, ​​on epätodennäköistä, että se on yksin vastuussa ainutlaatuisia ominaisuuksia tämän alalinjan. Siten NGS analyysi osoitti, että ei ollut aiemmin tunnettu syöpää geenimutaatioita, jotka voisivat selittää hyvin erilaisia ​​aiheuttavan kasvaimia ja etäpesäkkeitä näytetään nämä liittyvät solulinjoilla.

Analyysi miR Expression in eturauhassyöpäsolulinjat

geenien tunnistamiseksi, joilla voidaan edistää eri tuumorigeenisen /metastaattinen ominaisuuksia näiden soluja, miR array -näytöstä miRCURY LNA

™ Universal RT microRNA PCR -järjestelmää (Exiqon, Tanska) oli toteutettiin kahtena kappaleena [18,21]. Vaikka useita MIRS havaittiin väärin säädellystä, merkittävin oli ero ilmentymisen miR-125b ja miR-22 [18,21]. Koska eturauhasen solulinjojen tuli tuumorigeenisemmiksi edeten vanhempien p69 on M2182 ja lopulta M12 solu, taso miR-125b vähenivät huomattavasti, ≈ 6-kertainen pudotus ilmaisu (kuvio 1). Sen sijaan miR-22 todennäköisesti toimi kuin oncomiR tasoon miR-22 kasvaa 3,5-kertaiseksi, kun solut tulivat tuumorigeenisemmiksi ja lopulta metastasoitunut. Mielenkiintoista, molemmissa tapauksissa suurin kasvu tapahtui alkuvaiheessa kasvaimen välillä P69 ja M2182 vain vähäisiä ylimääräisiä muutoksia siirryttäessä M2182 M12 soluihin.

Comparison of miR-125b (harmaa) ja miR -22 (musta) tasot RNA: ta p69, M2182 ja M12 solulinjoissa SYBR perustuu qRT-PCR kuvatulla Materiaalit ja menetelmät. Kertainen ero laskettiin keskiarvo kolmen erillisen kokeen analysoitiin kolmena kappaleena ja normalisoidaan RNU48 (ACk

T) sisäisenä kontrollina ja ilmaistu suhteessa vanhempien p69 solulinjaan käyttämällä vertailevia C

T-menetelmä [23] . ANOVA testi osoittaa merkittävää eroa, jolla on P-arvo 0.05.

MiR Expression kasvainkudoksessa eristetyn RNA LCM

Vahvista nämä löydökset eturauhassyövän solulinjoissa, miR säätelyhäiriötä arvioitiin ihmisen kasvaimissa jälkeen saatua eturauhasen. Määrittäminen molekyyli muuttuu edistää synnyssä eturauhasen mutkistaa epäyhtenäisyyttä kudosta. Usein, kasvain vaihtelevan Gleason tulokset ympäröivät normaalit rauhaskudoksen kaikki upotettu stroman kuten edellä (kuvio 2). Puhdas solupopulaatioiden saa vain tällaiselta heterogeenisen kudoksen kanssa tekniikoita kuten LCM [19,20,25-29], joka mahdollistaa suoran visualisoinnin ja kerääminen valitut solut, jolloin saadaan puhdas lähde RNA alavirran analyysejä. [23]. 0,05.