Krooninen sairaus

tiivistelmä

monisoluisten steroideja rikastettu Askites epiteelin munasarjasyöpä (OvCa) potilasta. Ne edustavat invasiivinen ja solunsalpaajaresistentti solupopulaation olennainen metastaattisen levittämiseen. Molekyylimekanismeja liipaisu yhden solun invasiivisia ulosmenon pallosia jäävät arvoitukseksi. mDia formins ovat Rho GTPaasina efektoreita jotka ovat keskeisiä säätelijöitä F-aktiinisytoskeletonver- dynamiikkaa. Oletimme, että mDia2-ajettu F-aktiini dynamiikka edistää yhden solun invasiivisia siirtymien kliinisesti merkittäviä kolmiulotteisia (3D) OvCa pallosia. Nykyinen tutkimus on leikkelyn osuus F-aktiini kokoonpano tekijä mDia2 formin in invasiivisia siirtymiä ja käytetään kliinisesti merkittävää munasarjasyöpään pallomainen malli. Osoitamme, että RhoA suuntautuva mDia2 aktiivisuutta tarvitaan tiukka pallomainen organisaatio, ja rikastumista mDia2 invasiivisessa solujen ulokkeet kollageenin upotettu OVCA429 pallosia. Depleting mDia2 ES-2 pallosia tehostettu invasiivisia levittäminen yhden amoeboid muotoisia soluja. Tämä poikkeaa palloset hoidettu ohjaus siRNA, jossa mesenkymaaliset hyökkäyksen ohjelma vallitsevana. Esto toisen RhoA efektori, ROCK, ei ollut vaikutusta ES-2 sferoidiviljelmiä muodostuminen mutta dramaattisesti estetty sferoidiviljelmiä hyökkäyksen kautta induktion erittäin pitkänomainen morfologia. Samanaikainen esto ROCK ja mDia2 tukossa yhden solun invaasion ES-2 pallosia tehokkaammin kuin estämällä joko proteiinia yksinään, mikä osoittaa, että invasiivisia vuotamista amoeboid solujen mDia2-köyhdytettyä palloset on ROCK-riippuvainen. Tuloksemme osoittavat, että useita GTPaasina effektorit täytyy vaimentaa, jotta täysin estää invasiivisia ulosmenon munasarjasyöpä pallosia. Lisäksi tiukasti säänneltyjä vuorovaikutus ROCK ja mDia2 signalointireitteihin sanelee invasiivisia valmiuksia ja tyyppi hyökkäystä ohjelman käyttämät liikkuva sferoidiviljelmiä johdettuja munasarjasyöpäsoluja. Koska menetys koodaavan geenin mDia2,

DRF3,

on yhdistetty syöpään etenemisen ja etäpesäkkeiden, tuloksemme näyttämön ymmärtää molekyylitason mekanismeja mDia2 riippuva vuotamista invasiivisia solujen ensisijainen epiteelikasvaimet.

Citation: Pettee KM, Dvorak KM, Nestor-Kalinoski AL, Eisenmann KM (2014) Lentotoiminnan mDia2 /ROCK Signaling Axis säätelee Invasive ulosmenon epiteelikasvaimet munasarjasyöpä Pallot. PLoS ONE 9 (2): e90371. doi: 10,1371 /journal.pone.0090371

Editor: Pontus Aspenström, Karolinska Institutet, Ruotsi

vastaanotettu 22 lokakuuta, 2013 Hyväksytty: 03 helmikuu 2014; Julkaistu: 28 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Pettee et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat yliopiston Toledo Foundation (KME, ALNK), puolustusministeriön munasarjasyövän Concept Award (KME, OC073269), The DeArce Memorial Endowment Fund tuki Lääketieteellinen tutkimus ja kehitys (KME), ja National Cancer Institute ( KME, ALNK R01CA151632). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä (OvCa) on 5

th suurin syy syöpään liittyvien kuolemien in amerikkalaiset naiset. American Cancer Society ennustaa 22000 uusia diagnooseja ja 15000 kuolemantapaukset epiteelin munasarjasyöpä (EOC) vuonna 2012. Solut peräisin munasarjojen pintaepiteelissä tili 90% ensisijaisen OvCa ja etäpesäkeleesioita [1]. Kuorinnan OvCa soluja havaitaan vatsakalvon askites yksittäisinä soluina, pieniä aggregaatteja tai korkeasti tilata ja puristetun monisoluisten pallosia [1] – [5]. Tiivistetty steroideja huonosti invasiivisia ja solunsalpaajaresistentti rakenteita. Solu-solu kiinnikkeistä, tukee osittain N- ja E-kadheriinin ajaa muodostumista ja tiivistyminen OvCa pallosia [6]. On epäselvää, mitä erityisiä molekyyli- tai ympäristön ärsykkeille myötävaikuttaa invasiivisia siirtymien palloset.

Yhä useammat todisteet osoittavat, että tiivis pallosia edistävät OvCa etäpesäke sisällä vatsaontelossa.

In vitro,

solujen OvCa pallosia läpikäyvät ankkurista riippumaton kasvu, irrottautua siitä kiinni kolmiulotteisia (3D) kollageeni-I geelit ja tunkeutua taustalla mesoteelisolujen [7] – [9]. Tärkeää on, pallojakaantuminen muodostumista ja tiivistymisen suoraan korreloi hyökkäys [3], [4]. Ihmisen OvCa solujen kyky muodostaa kompaktin sferoideja

in vitro

voi tuottaa kestäviä kasvaimia injektoida intraperitoneaalisesti immuunivajaisiin hiiriin. Sitä vastoin ei-pallomainen muodostavien solujen eivät muodostaa kasvaimia hiirissä [10]. Näennäinen yhteys muodostumista kompakti pallosia ja levittäminen invasiivisia OvCa solujen korostaa tarvetta ymmärtää paremmin molekyylitason mekanismit, jotka ylläpitävät näitä prosesseja [11].

Vastauksena solunulkoiseen vihjeet epiteelin johdettuja syöpäsolut voivat muuntaa on mesenkymaaliset kaltainen fenotyyppi. Tämä voidaan saavuttaa dissosiaatio tiukka ja vyöliitos (AJ), irtoaminen yhden soluja epiteelikalvot tai 3D-rakenteita, ja kulkeutuminen viereisiin kudoksiin (tarkistetaan [12] – [15]). Tunnusmerkki solu- ja molekyylitason muutokset liittyvät epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) ja invaasio ympäröiviin strooman kuuluu menetys E-kadheriinin ilmentymisen, säätelyä matriisi-(MMP), aktivointi transkription sääntelyviranomaisten ja hyväksyminen karamaisen, polarisoitunut fibroblastisen morfologia. Aikana mesenkymaaliset muuttoliike, laajennus etureunan ja takaisinveto takareunan liikkuvia soluja liittyy koordinoida sääntely aivokuoren F-aktiini polymerointi ja actomyosin supistuminen. F-aktiini kokoonpano edeltää supistuminen edistää laajentamista aktiini-rikas ulokkeita, ja ROCK-välitteisen fosforylaation myosiinikevytketjua (pMLC) säätelee actomyosin supistuminen [16].

Formins ovat nousseet keskeisiksi säätelijöinä F-aktiini ja mikrotubulusten cytoskeletal dynamiikkaa. Formin perheen proteiinit ovat Rho GTPaasi efektoreja. Nisäkkäiden läpikuultavat (mDia) liittyvien formins (mDia1-3) on kriittinen roolit erilaisissa solun toimintaan, mukaan lukien geenien transkriptio, solusyklin etenemistä, ja kalvokuljetuksessa. mDia proteiinit säätelevät myös F-aktiini verkkojen kriittisiä kokonaisuuden säilyttämiseksi monisoluisten epiteelin rakenteita [17] – [22]. Esimerkiksi, ehtyminen mDia inhiboi solu-solu-liittymissä MDCK-soluissa [23], ja häiritsee MCF-7-yksittäiskerrosten mislocalizing E-kadheriinin päässä solu-solu-kontaktien [24]. Lisäksi tukahduttaa läpikuultavat, The mDia homologin

D. melanogaster,

vähentynyt pMLC klo AJs ja horjuttaa normaalia kudosta rajoja ja lisääntynyt solujen protrusiveness [25]. Yhdessä nämä tiedot syytöstä mDia-Rho signalointi akseli järjestämisessä monimutkaisia ​​3D rakenteita tärkeää morphogenesis, ja mahdollisesti, kasvaimen etenemisen.

Useat tekijät osoittavat, että formins pelata säilytetyn rooleja säätelyssä syöpäsolujen liikkuvuutta , invaasio ja metastaasi. mDia2 vaikuttaa invasiivisen käyttäytymisen rintasyövän soluja, jotka riippuu viime kädessä MMP ja muodostumista aktiini-rikas ulkonemat kutsutaan invadopodia [26]. Vuorovaikutus on mDia2 sen negatiivinen säätelijä, DIP [27], edistää siirtymistä mesenkymaalisten MDA-MB-231-soluja hyvin liikkuvien ja invasiivisia ROCK riippuvaisten amoeboid soluihin [28]. Samoin modulaatio mDia2 vaikuttaa myös amoeboid hyökkäyksen ja muuttoliike DU145 eturauhassyövän solut [29], [30]. Tähän liittyvä formin, mDia1 ohjaa neutrofiilikemotaksista [31], [32], soluinvaasiota [33], ja T-solujen vaeltaminen ja ihmiskaupan oheislaitteiden imukudoselimet [34], [35]. Muut formin perheenjäsenet, mukaan lukien isomuotoja FRL, FHOD ja Formin1, on myös liitetty säännellä muuttavien plastisuus ja toisikseen välillä mesenkymaalisten ja amoeboid potevilla rinta- ja muissa tuumorisoluissa [36] – [41].

geenit, jotka koodaavat mDia tai FMNL /FRL usein menetetään rinnan, eturauhasen, peräsuolen, maksan karsinoomien, ja hematopoieettisen syövät [29], [30], [41], [42]. mDia proteiinit toimivat myös normaalissa munasarjassa sekä munasarja- syöpiä. Häiriöt

läpikuultavat

liittyy ennenaikainen munasarjojen vajaatoiminta [43]. Menetys

DIAPH1 /DRF1

, koodaavan geenin mDia1, on esitetty malli OvCa etenemisen [10]. Lisäksi geenejä, jotka koodaavat mDia2 (

DIAPH3 /DRF3

) ja formin 1 (

FMN1

) on vaimentua alussa ja myöhäisessä vaiheessa OvCa soluja. Tähän liittyi häiriöt F-aktiini keskittymisen ja lisäykset solussa muodonkestävyyskokeita [44], [45]. Yhdessä edellä mainittujen havainnot viittaavat rooli mDia-ohjattu aktiini dynamiikka etenemisessä munasarjojen sairaus. On epäselvää, jos muutokset aktivaatiotilasta mDia vaikuttaa solu-solu kiinnikkeistä ylläpitää OvCa pallomainen eheys, tai jos modulaatio mDia ohjaa siirtymiä toimivat solun invaasion taustalla mesothelium.

tutkia näitä kysymyksiä, tutkimme rooli Rho /mDia signalointi OvCa muuttoliikettä ja invaasiota. Tuloksemme osoittavat, että RhoA /mDia2 /ROCK signalointi akselien käytöt invasiivisia siirtymien ES-2 OvCa solujen 2D kulttuureissa ja 3D sferoidin invaasion malli. Aktivointi RhoA nostettiin aikana pallomainen muodostumista, kun taas tukahduttaminen mDia2 häirinnyt pallomainen arkkitehtuuria. Toisin vaikutuksia mDia2, ehtyminen mDia1 ei ollut vaikutusta muodostumista tai eheyden pallosia. Kun mDia2-köyhdytettyä pallosia oli upotettu kollageeni-I: geelit, että oli mahdollista parantaa yhden solun hyökkäyksen kautta ROCK-riippuvainen amoeboid siirtyminen. Nämä havainnot osoittavat keskinäistä riippuvuutta mDia2 ja ROCK edistämiseksi invasiivisen siirtymien OvCa pallosia.

Tulokset

Spatial lokalisoinnin mDia proteiinien siirtymiseen ihmisen OVCA solujen

Saimme paneeli ihmisen OvCa solulinjojen edustavat useissa kliinisissä alatyyppejä, kuten serous ja selkeä solujen adenokarsinooman. Jotkut näistä solulinjoista muodostavat kompaktin sferoideja (OVCA429 ja ES-2), kun taas toiset muodostavat väljempi kennorakenteiden (SKOV3) (kuvio S1 ja [4]). Kaikki solutyypit ilmaistuna mDia1 ja mDia2 riippumatta pallomaisten muodostavien kyky (kuvio 1A).

. mDia1 ja mDia2 arvioitiin immunosaostuksella ja /tai Western blotting paneelissa ihmisen OvCa soluja. Tubuliinia blotattiin latauskontrollina. B. Solujen adheesio BSA- tai Kollageeni-I-päällystettyihin kuoppiin. Koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja koe toistettiin kolme kertaa. p-arvot ovat BSA vs. kollageeni-I kunkin solulinjan. C. Transwell muuttoliike määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja koe toistettiin kolme kertaa 5 h kohti SFM tai 20% FBS: ää. MDA-MB-231 ihmisen rintasyöpä-solut ovat positiivisia maahanmuuton valvonnan. p-arvot ovat SFM vs. 20% FBS kunkin solulinjan. D. Transwell invaasio määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja koe toistettiin kolme kertaa 24 tuntia kautta 2 mg /ml kollageeni-I geelit kohti joko SFM tai 20% FBS: ää. MDA-MB-231-solut ovat positiivisia hyökkäyksen valvontaa. p-arvot ovat SFM vs. 20% FBS kunkin solulinjan. E. OVCA429 solut siirtyneet tekemään 20% FBS 5 tunnin ajan Dunn kammiossa. mDia1, mDia2 ja F-aktiini arkkitehtuuri visualisoitiin IF. Nuoli osoittaa gradientin suunnassa. N. S. = Ei merkitsevä. Kaikki virhepalkkien vastaavat SDS Näkyy ovat edustavia kokeita Kaikkien määritysten.

OVCA paneeli seulottiin liiman, muuttavien ja invasiivisia ominaisuudet (kuvio 1, B-D, vastaavasti) tunnistaa erittäin invasiivisia , pallojakaantuminen muodostava solulinjassa. SKOV3, OVCA429 ja ES-2-solut olivat yhtä liima kollageeni 2D alustoille. Kuitenkin OVCA429 ja ES-2-solut olivat vaeltavia ja invasiivisia kuin SKOV-3 linjan vastauksena FBS kaltevuudet. Siksi meidän jäljellä tutkimusta tehtiin joko OVCA429 tai ES-2-soluissa.

spatiaalinen lokalisointi endogeenisten mDia proteiinien arvioitiin siirryttäessä OVCA429 soluissa käyttäen Dunn kammion vakaa FBS kaltevuus. Immunofluoresenssi (IF) suoritettiin kuluttua 5 h muuttoliike (kuvio 1 E). Sekä mDia1 ja mDia2 näytteillä polarisoitunut jakelu suuntautunutta FBS kaltevuus kuluessa vaeltavien OVCA429 soluissa (nuoli osoittaa gradientti sijainti). mDia1 ja mDia2 lokalisoitu pääasiassa lamellien, toisin kuin F-aktiini rikas lamellapodia, kuten aiemmin on nähty siirryttäessä epiteelisoluissa [46]. Nämä tulokset viittaavat mahdollista roolia mDia1 ja /tai mDia2 vakauttamaan aivokuoren aktiini allasta aikana OvCa kemotaksista.

Vaatimus mDia2 vuonna kemotaktinen maahanmuuton OVCA429 soluissa

Seuraava kysytään mDia proteiinin aktiivisuutta ja /tai ilmentyminen olivat tarpeen kemotaktinen muuttoliikettä. Etäisyyden muuttivat transfektoitujen OVCA429 solujen Dunn kammiossa kvantifioitiin elävien solujen seuranta. Solut muokattu ilmentämään joko mDia-YFP-fuusioproteiineja yksin tai erilaisia ​​yhdistelmiä ohjaus YFP vektorin ja FLAG-merkittyjen proteiinien. mDia yliekspressio validoitiin Western blottauksella (kuvio 2A). Solut, jotka ilmentävät vallitsevasti negatiivinen YFP-mDia-FH2ΔN, joka häiritsee sekä mDia1 ja mDia2-ajettu F-aktiini kokoonpano, [34], [47], [48] siirtynyt huonosti suhteessa YFP valvontaa. Toisaalta, solut, jotka ilmentävät konstitutiivisesti aktivoitu mDia2 M1041A [49], jossa autoinhibited tila on helpottunut, esillä lisääntynyt liikkuvuus suhteessa YFP + 3XFLAG tyhjän vektorin valvontaa. mDia1 yliekspressio ei muuttanut solumigraation suhteessa tyhjän vektorin valvontaa. Nämä tiedot viittaavat siihen, että mDia2 autoinhibition on vapautettava, jotta tehokkaasti solujen siirtymistä tapahtuu. Seuraavassa joukko tutkimuksia, rooli mDia2 vuonna kemotaktinen muuttoliikettä arvioitiin kylvämällä mDia2 vaje OVCA429 solujen siirtoaltaat. Vaikka lipidejä ja ohjaus siRNA-käsitellyissä soluissa voimakkaasti siirtynyt kohti FBS (suhteessa seerumittomassa kontrollikuoppiin), Migraatio vähenee merkittävästi mDia2-köyhdytettyä soluja (kuvio 2C). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että mDia2 ilmaisun ja /tai aktiivisuutta tarvitaan optimaalista kemotaktinen migraation OVCA429 soluja.

. Transfektoituja OVCA429 muuttivat 5% FBS. Elävät yksisoluiset seuranta transfektoitujen solujen tehtiin, ja kokonaismatka siirtynyt laskettu. Ainakin 10 solua seurataan kohti kunnossa. p-arvot on lueteltu lasketaan suhteessa vastaavaan tyhjän vektorin valvontaa. B. OVCA429 solut transfektoitiin lipidin vain, ohjaus siRNA tai vastaan ​​suunnattu siRNA mDia2 on kasvavia konsentraatioita (25, 50, 100 nM, on merkitty kiiloja) joko 72 tai 96 tuntia. mDia2 ehtyminen varmistettiin Western blot. C. OVCA429 solut transfektoitiin 100 nM siRNA: ssa 72 tuntia, ja transwell muuttoliike, jotka suoritettiin 5 tuntia kohti SFM tai 10% FBS: ää. Määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja koe toistettiin kolme kertaa. Edustava koe on esitetty. p-arvo on esitetty ovat 10% FBS käsitelty kontrolli vs. mDia2-köyhdytettyä soluissa. Kaikki virhepalkkien vastaavat SDS että edustava koe.

Euroopan RhoA /mDia2 signalointi akselin muodostumiseen kompakti OvCa pallosia

Rho reagoivaa mDia proteiinit voivat säädellä solu-solu kontakteja ja edistää yhden solun liikkuvuus [18], [26] – [28], [49]. Me seuraavaksi selvitettävä, RhoA /mDia2 signalointi akseli oli mukana OvCa pallomainen muodostumiseen. ES-2-solut nopeasti muodostunut erittäin tiiviitä pallosia (kuvio S1) ja käytettiin jäljellä olevissa tarkasteluissa. Vaatimus Rho GTPaasi-aktiivisuus on pallomainen muodostuminen testattiin altistamalla ES-2 soluja kasvavien pitoisuuksien (0,5-2,0 ug /ml), C3 transferaasin inhibiittori; RhoA-C. Kuten kuviossa S2A, C3-käsiteltyjen pallosia oli väljemmin järjestetty ja vähemmän tiivistetty suhteessa ajoneuvon hoidettuihin kontrolleihin. Koska edellinen työ on osoittanut, että yhteensä tasot RhoA lisääntyvät pallosia peräisin maksasyöpä [50], seuraavan kerran kysytään muutoksia RhoA aktiivisuuden esiintyä yhdessä muodostumiseen ES-2 pallosia. Sferoidit muodostettiin 500 solua 24 h (kuvio 3A). RhoA ja ilmentyminen sen loppupään efektoreja, mDia1 ja mDia2 arvioitiin sitten lysaateista yksisolukerroksista ja yhdistetty palloset korjataan 24-120 h. Kaiken mDia2 tasot laski pallosia suhteessa yksisolukerroksiin. Sisällä sferoidi populaatiot, ajasta riippuvaisia ​​eroja mDia2 ilmaisun havaittiin, hieman alhaisempi totesi 72 ja 96 h pallosia, suhteessa 24, 48 ja 120 h pallosia (kuviot 3B ja S3A). Toisin mDia2 tasot mDia1 korotettiin pallosia suhteessa yksisolukerroksiin. Vuonna pallojen mDia1 laski hieman 24 tuntia kautta 120 h (kuviot 3B ja S3B). Yhteensä RhoA tasot myös laski palloset, suhteessa yksisolukerroksiin. Silti RhoA tasot dramaattisesti talteen 120 h sferoidiviljelmiä muodostumista (kuvio 3B ja S3C). Koska vuorovaikutus RhoA sen loppupään efektoreja (kuten mDia tai ROCK) riippuu aktivaation GTP-sitovaa, me seuraavaksi määrällisesti tasoja aktiivisen GTP-sidottu RhoA in pallosia G-LISA. Määrä RhoA-GTP lisääntyi merkitsevästi pallosia muodostettu 48-120 tuntia verrattuna stimuloimattoman ES-2 yksisoluiset kerrokset, lähestyy että havaitut yksikerrosviljelmiin käsitelty tunnetulla RhoA aktivaattori, lysofosfatidihappo (LPA) (kuvio 3C). Siksi yleinen taso RhoA aktivoinnin tehostuvat, kun sferoidiviljelmiä kypsymistä.

. ES-2 pallosia kuvausaikaisilla brightfield mikroskoopilla. Asteikko bar = 250 um. (Huom: epätarkka levy-pinnoite kuvantaminen artefakti ja /tai kondensaatio sisällä epäsäännöllinen Muovilaattojen nähty täällä on yhteinen BF kuvantaminen). B. Lysaatit ES-2 monolayers tai sferoideina olivat Länsi-pyyhittäisiin jälkeen nimetty kertaa. C. RhoA G-Lisas tehtiin kun käsittelemättömän tai LPA käsiteltyä ES-2 monolayers tai pallosia. p-arvot ovat suhteessa käsittelemättömiin yksikerroksista. Koe suoritettiin neljänä rinnakkaisena kuoppiin ja koe toistettiin sitten kolmesti. Yhdistetyt tiedot 3 kokeiluja on esitetty. p-arvot näkyvät yllä baareja ja ovat suhteessa käsittelemättömiin yksikerroksista valvontaa. D. Pallot muodostivat 72 tuntia oli upotettu, kiinteät ja mDia2 visualisoidaan konfokaalimikroskopialla. Kuvat saatiin käyttäen 20 × tavoite 3D-mallinnus sarja viipaleiksi. Bar = 25 pm. Avoimet nuolet osoittavat päällekkäisyyksiä, kun taas suljettu nuolet osoittavat rinnakkain F-aktiini ja mDia2. Kaikki virhepalkkien vastaavat SDS että edustava koe, ellei toisin mainita.

Ensimmäinen askel kohti määritetään, onko RhoA riippuvaisen aktivaation mDia2 saattavat vaikuttaa muodostumiseen solu-solu liittymissä, me seuraavaksi kysytään mDia2 ja F-aktiini ovat yhteistyössä lokalisoitu pallosia solussa-soluliitos (kuvio 3D). Sferoidia muodostivat 72 h paljasti erillisiä F-aktiini-rikastettu solu-solu liittymissä, jossa pistemäinen mDia2 taustalla /proksimaalisesti nämä liittymissä (täytetty nuolenkärki). Joissakin liittymissä, mDia2 näytti kolokalisoituvat F-aktiini (täyttämätön nuolenkärki). Tämä viittaa mahdollinen rooli mDia2 säätelyssä F-aktiini dynamiikka välttämätöntä kehittämistä tai ylläpitoa varten solu-solu liittymissä.

mDia2 ehtyminen johtaa muodostumista pienempien, sekavaa pallosia

edelleen arvioimista roolia mDia proteiinien munasarjojen sferoidiviljelmiä muodostumiseen /eheys, käytimme RNA interferenssin strategiaa. Tukeva siRNA-välitteisen knockdovvn joko mDia2 tai mDia1 oli validoitu 120 h yksikerrosviljelmissä, jossa lievää elpymistä 144 h (kuvio 4A ja S4). Sferoidit muodostettiin yksikerrossoluissa 72 h jälkeinen siRNA hoitoa. Sferoidiviljelmiä halkaisijat mitattiin sitten 24-48 tuntia myöhemmin (96-120 h yhteensä siRNA hoito). mDia2 ehtyminen 48 h johti vaatimaton, mutta tilastollisesti merkitsevä väheneminen (10-20%) vuonna sferoidiviljelmiä halkaisija suhteessa kontrolliin siRNA hoitoon. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun mDia2 oli köyhdytettyä siRNA altaat tai yksittäisiä vastaan ​​suunnattu siRNA mDia2 (kuva S4), vaikka tukahduttaminen mDia2 ilmaisun kanssa yhdistettyjen siRNA oli johdonmukainen ja kestävä. Siksi kaikki myöhemmät tutkimukset suoritettiin käyttäen yhdistettyä siRNA. Sen lisäksi, että vähäinen lasku pallomainen halkaisija, mDia2-köyhdytettyä ES-2 palloset olivat selvästi heikommin organisoitu repaleinen reunat ja jotkut yksittäiset solut löysästi kiinni reunoihin. Samanlainen sekavaa pallonen fenotyyppi johtui lisäämällä mDia1 /mDia2 FH2 estäjä, SMIFH2 (kuva S5) [51]. Siellä tulokset johtuivat mDia2 ehtymisestä, koska mDia1 ehtyminen olisi ollut mitään vaikutusta sferoidiviljelmiä koko (kuvio 4B, C).

. siRNA-välitteinen mDia1 (ylempi) tai mDia2 (alempi) knockdowns suoritettiin upon ES-2 monolayers (Huom: epätarkka levy-pinnoite kuvantamisen artefakti /tiivistymistä sisällä epäsäännöllinen Muovilaattojen nähty täällä on yhteinen BF kuvantaminen). B-C. 72 tunnin jälkeinen siRNA tai kontrollikäsittely, sferoidit muodostettiin ja halkaisijat mitataan brightfield mikroskoopilla 48 tuntia myöhemmin (120 h jälkeinen siRNA hoito). Bar = 100 pm. Ainakin 30 pallosia mitattiin kunkin kunnossa. p-arvot on lueteltu edellä palkit ja ovat suhteessa kontrolliin siRNA pallosia. D-E. ES-2 monolayers olivat käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin nimetyn siRNA: t 48 tuntia, sferoidit on muodostettu vielä 48 tuntia, ja Western-blotit tai RhoA G-Lisasin kohdistetaan lysaatit. LPA on positiivisena kontrollina RhoA aktivointia. G-LISA koe suoritettiin kahdesti, neljänä ja yhdistetyt tiedot on esitetty p luetellut arvot puolelle baareja. P-arvot ovat suhteessa joko käsittelemättömään tai kontrolli-siRNA-käsitelty sferoideja, kuten edellä. F. Käsittelemätön (UT), lipidejä ainoastaan ​​tai siRNA-välitteisen ohjaus ja mDia2 knockdowns tehtiin upon ES-2 monolayers 72 h ja pMLC2 tasot arvioitiin Western-blottauksella. G. Ohjaus ja mDia2 knockdowns tehtiin 72 tuntia, ja pallosia muodostunut. Sferoidit olivat eriteltyjä osoitetussa aikoina muodostamisen jälkeen ja solut laskettiin. Koe toistettiin 5 kertaa. Edustava koe on esitetty. Virhepalkkien vastaavat SDS edustavasta kokeesta.

Mahdollisia selityksiä hieman pienempiä ES-2 palloset voivat sisältää vähentynyt solujen lisääntymistä, laski keskimääräinen solukoko, solun irtoaminen tai suurempi sferoidiviljelmiä tiivistymisen kautta lisääntynyt RhoA-suunnattu pMLC2 aktiivisuutta. Siksi määrittää, jos RhoA-GTP tasot muuttunut mDia2-köyhdytettyä pallosia. mDia2 ehtyminen validoitiin pallosia muodostivat 24-48 h (siRNA hoito 72-96 h) (kuvio 4D). Klo 96 tuntia post-siRNA hoito, RhoA-GTP aktiivisuus ei muuttunut ohjaus ja mDia2-köyhdytettyä pallosia (kuvio 4E). Tämän mukaisesti havainnon, pMLC2 pysyivät ennallaan yksisoluiset kerrokset (kuvio 4F). Lisäksi mDia2 ehtyminen ei muuttanut solujen numeroita eriteltyjä pallosia (Kuva 4G). Tämä osoittaa, ettei solujen lisääntymistä eikä menetys de-tarttunut soluissa oli yksin vastuussa pienempi pallomainen kokoa. Se ehdottaa myös, että vaikka siRNA-välitteinen ehtyminen mDia2 aiheuttaa enemmän sekavaa ja epäsäännöllinen sferoidi kokoonpano, loput mDia2 proteiini todennäköisesti riittää ylläpitämään sekä RhoA välittämää supistumiskyvyssä soluproliferaatiota. Viimeksi mainittu käsite on sopusoinnussa aiemman tutkimuksen mDia1 T-solujen aktivaation, jossa alhainen mDia proteiinien näytti olevan riittävä ylläpitämään joitakin solun prosesseja (

esim

., F-aktiini kertymistä vs. mikrotubulusdynamiikan) , kun taas samanaikaisesti heikentämättä muita toimintoja [52].

mDia2 ehtyminen edistää ES-2 sferoidiviljelmiä invasion kautta amoeboid siirtyminen

Sen arvioimiseksi, onko RhoA /mDia2 akseli toimii pallomainen invaasio, ES-2 sferoidit upotettiin kollageenin (T0) ja annettiin tunkeutua läpi 168 h (kuvio 5A). Nopeasti etenevä edessä invasiivisen solut näyttivät 24 h, ja geeli supistuminen oli riittävän laaja repiä geelien 72 tuntia. Sferoidiviljelmiä invaasio mitattiin piirtämällä alueen kohteisiin ympäri kehä leviämisrintamassa, johon kuului vähintään 95% invasiivisia soluja (määritettynä fluoresenssin merkinnät). Invasion riippui Rho-GTPaasit, kuten invasiivista edessä on huomattavasti pienempi ES-2 pallosia, jotka kasvatettiin ja upotettu läsnä C3 transferaasin, suhteessa ajoneuvon ohjaus-käsiteltyjen pallosia (kuvio S2, B ja C). Koska Rho-suunnattu mDia proteiinien ajaa hyökkäyksen eri epiteelin johdettujen syöpäsoluja [26], [29], [30], me visualisoitu spatiaalinen paikallistaminen mDia proteiinien kiinteän invasiivisia ES-2 pallosia. mDia2 jaettiin polaroituun kuvio, jossa rikastus on pallomainen reunoista, jossa invasiivisia soluja säteili osaksi kollageenia (kuvio 5B). Suurempi suurennus invasiivisen edessä, mDia2 dramaattisesti lokalisoitu pitkänomaisia ​​rakenteita muistuttavia tubulated endosomeihin [53], joka ulottui koko pitkän ulkonemat mesenkyymisolujen. Mielenkiintoista, mDia1 oli lähinnä ydinvoiman tunkeutuvat soluihin, yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien ydin- aktivoitu mDia1 ohjaamalla SRF välittämää F-aktiini dynamiikkaa tumassa [54]. Havaitsimme useita solun morfologioita invasiivisten solujen kollageenin, kuten pallomaisia ​​amoeboid soluja (-40% tunkeutuvat solut), ja pitkänomainen, polarisoituneet mesenkymaaliset solut (-60% tunkeutuvat solut) vaeltavat osa (tuloksia ei ole esitetty). Mielenkiintoista on, että invasiiviset sferoidit toistettavasti (käyttämällä useita primaaristen vasta-aineiden eri isäntä ja kaupallisen johdannaisia) osoitti erillisiä, pistemäinen mDia2 värjäys matriisin sisällä (kuvio 5C, ja dataa ei näytetty). Aiemmin mDia proteiinit havaittiin pro-muuttavien OvCa johdettu mikropartikkelit [55] ja mDia2 suunnattu pro-muuttavien oncosome muodostuminen eturauhasen syöpäsolujen [29]. Biokemialliset tutkimukset ovat parhaillaan luonnehtia mDia2 rikastettu solunulkoisen hiukkasia läsnä tunkeutuvat OvCa pallosia.

. Sferoidit muodostettiin ensin 48-I geelit, ja kuvantaa brightfield mikroskopialla jälkeen nimetty kertaa. Bar = 150 pm. B. Pallot muodostettiin 72 h, upotettu kollageeni I geelit ja annettiin tunkeutua 24 tuntia. Sferoidit kiinnitettiin ja IF suoritetaan mDia1, mDia2 ja F-aktiini. Bar = 100 pm. C. Korkeampi suurennos kuva (63 x) hyökkäävän soluja nimetyn ROI B. mDia1, mDia2, ja F-aktiini visualisoitiin konfokaalimikroskopialla. Bar = 25 pm. D. Kun 56 tunnin jälkeinen siRNA hoito, sferoidit muodostettiin ja upotettu kollageenin 104 h jälkeistä siRNA hoitoa. Alueella on ROI piirretty vastaten 95% invasiivisen soluista laskettiin 0 ja 18 tunnin kuluttua invaasiota (122 h jälkeinen siRNA hoito). Edustavia pallosia 4X näkyvät värjätään phalloidin ja kuvien varjoainetta. Bar = 100 pm. Ainakin 30 pallosia mitattiin kunkin kunnossa. p-arvot ovat yllä histogrammin ja ovat suhteessa invaasiota 18 h joko lipidin tai ohjaus käsitelty sferoideina. E. Pidennys indeksit laskettiin invasiivisia soluja D. Vähintään 30 invasiivisia solua mitattiin kohti kunnossa. Edustavia phalloidin värjäys näkyy. Bar = 25 pm. EI 2 (katkoviiva) pidetään mesenkyymisolun tyyppi. p-arvot näkyvät yläpuolella juoni ja ovat suhteessa invaasiota 18 h joko lipidin tai ohjaus käsitelty sferoideina. Kaikki virhepalkkien vastaavat SDS edustavasta kokeesta.

arvioimiseksi roolin mDia yhden solun invaasiota, mittasimme invasiivisia alalla sulautettujen mDia1 tai mDia2-köyhdytettyä ES2 pallosia kuluttua 0 t (104 h jälkeinen knockdown) ja 18 h (122 h jälkeinen knockdown). Käsittelemättömät ja ohjaus siRNA-käsiteltyjen pallosia voimakkaasti hyökkäsi kollageenimatriksin 20 tuntia. Kuitenkin mDia2-köyhdytettyä pallosia paljasti merkittävästi parannettu invaasio suhteessa kontrolleihin (Kuva 5D ja kuviossa S4C), vaikka niiden vaatimattomasti pienempiä päälle upottamisen (kuvio 4C). Toisaalta mDia1-köyhdytettyä pallosia hyökkäsi samassa määrin kuin ohjaus pallosia (kuva S6), mikä osoittaa, että mDia1 ei merkittävä rooli OvCa pallomainen hyökkäystä. Koska muutokset mDia2 ilmentyminen ja /tai toiminto liittyy amoeboid siirtymiä [27] – [29], laskimme venymä indeksit (EI) invasiivisessa soluissa, jotka ovat peräisin palloset jakamalla pitkä akseli solun lyhyellä akselilla; EI 2 tai enemmän osoittaa, pitkänomainen mesenkymaaliset muoto, kun taas EI alle 2 osoittaa merkittävämpi pyöristetty, amoeboid fenotyyppi. Tulokset osoittavat, että pallojen jossa mDia2 ehtyminen parannettu invaasio, invasiivista solut olivat pääasiassa amoeboid muodoltaan suhteessa käsittelemättömän ja hallita siRNA-käsiteltyjen pallosia (kuvio 5E).

ROCK tukee sekä mesenkymaalisten ja amoeboid 3D liikkuvuus ohjelmia in invasiivisia ES-2 pallosia

Amoeboid siirtymät voivat liittyä Rho-suunnattu ROCK signalointi suoraan contractility [56], [57]. ROCK myös antagonisoi mDia proteiineja suhteen ylläpitämiseen solu-liittymissä 2D monolayers [18]. Kuitenkin vuorovaikutus ROCK ja mDia proteiineja ylläpitämiseksi solu-liittymissä 3D rakenteita kuten OvCa pallosia on epäselvä. Siksi arvioitiin roolia ROCK toiminnan pallomainen muodostumiseen. Me estetty ROCK toimintaa käsittelemällä sferoidit erityisiä estäjä, Y27632. Sferoidiviljelmiä koko pieneni hieman läpi 48 h hoidon (kuvio 6A), mikä viittaa siihen, että ROCK /myosiiniin välittämää silloittumisen mDia-säänneltyjen F-aktiini voi olla rooli sferoidin muodostumiseen. Esto ROCK dramaattisesti tukahdutetaan sferoidiviljelmiä invaasio suhteessa kontrolleihin (kuvio 6B) Kuten aiemmissa tutkimuksissa syytetään ROCK in kupliminen peräsuolen [58] ja Caov3 munasarjasyövän yksikerrossoluissa [59]. Silmiinpistävän liioiteltu mesenkymaalitransitioon dominoivat muutamat solut asuttavat vaatimaton leviämisrintamassa soluissa käsitelty ROCK estäjän (kuvio 6C), mikä osoittaa vaatimus ROCK tehokkaasti suoraan solujen contractility sekä amoeboid ja mesenkymaalisten invaasio ohjelmia.

. Sferoidit muodostettiin läsnäollessa ajoneuvon tai 90 uM Y27632 varten ilmoitettu kertaa. Sferoidiviljelmiä halkaisijat mitattiin sitten vähintään 30 pallosia 10 ×. Bar = 100 pm. p-arvot näkyvät yläpuolella juoni ja ovat valvonta H

20-käsitelty pallosia. B. Pallot muodostettiin 48 h, kun läsnä on Y27632, ja sitten upotetaan kollageeni-I: 0-48 h, kun läsnä on ajoneuvon tai Y27632. Invasiivisia rintamalla mitattiin kunakin ajankohtana vähintään 30 pallosia per kunnossa. Bar = 400 um. Edustavia sferoidia 4 × näkyvät värjätään phalloidin ja kuvien varjoainetta. P-arvot on listattu kaavion yläpuolella ja ovat suhteessa valvoa H

20-käsitelty pallosia. C. Pidennys indeksit laskettiin invasiivisia solujen kollageenigeeleissä esitetyn B. EI 2 (katkoviiva) katsottiin mesenkyymisolun tyyppi. Ainakin 30 solua mitattiin kohti kunnossa.