Krooninen sairaus

tiivistelmä

Molecular biomarkkereiden tehokkuuden määrittämiseksi kohdennettujen hoitomuotojen syövän hoidossa on laajalti hyväksytty peräsuolen syöpä (CRC), mutta ne ennustaa kemoterapian herkkyys säilyvät heikosti määritelty. Testasimme hypoteesia, jonka KRAS-mutaatio voi olla ennustaja oksaliplatiinin herkkyyden CRC. KRAS oli tippuu alas in KRAS-mutantti CRC soluja (DLD-1

G13D ja SW480

G12V) pienet häiritsevät RNA: t (siRNA) ja yli-ilmentyy KRAS-villityypin CRC-solut (Colo320DM) by KRAS-mutantti vektorit generoimaan pariksi CRC-soluja. Nämä pariksi CRC solut testattiin oksaliplatiinia, irinotekaania ja 5FU muutoksen määrittämiseksi huumeiden herkkyyden MTT: llä ja virtaussytometria. Syyt herkkyys muutoksiin olivat edelleen määritettiin western blot ja reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR (qRT -PCR). In KRAS-villityypin CRC-solut (Colo320DM), KRAS yliekspressio mutantti vektoreiden aiheuttamat Leikkauskorjauksessa rajat komplementaatioryhmä 1 (ERCC1) downregulation proteiinia ja mRNA-tasojen, ja parannettu oksaliplatiini herkkyyttä. Sen sijaan KRAS-mutantti CRC soluja (DLD-1

G13D ja SW480

G12V), KRAS tippuu alas by KRAS-siRNA johti ERCC1 säätelyä ja lisätä oksaliplatiini vastus. Herkkyys irinotekaanin ja 5FU ei ollut muuttunut pariksi CRC soluja. Validoida ERCC1 ennustajana herkkyys oksaliplatiinin, ERCC1 lyötiin-alas siRNA KRAS-villityypin CRC soluja, mikä palautti oksaliplatiini herkkyyttä. Sen sijaan, ERCC1 oli yli-ilmentää ERCC1-ilmentävillä vektoreilla in KRAS-mutantti CRC-soluja, ja aiheutti oksaliplatiini vastus. Kaiken kaikkiaan meidän havainnot viittaavat siihen, että KRAS-mutaatio on ennustaja oksaliplatiinin herkkyyden koolonkarsinoomasoluissa, mekanismilla ERCC1 downregulation.

Citation: Lin YL, Liau JY, Yu SC, Ou DL, Lin LI, Tseng LH , et ai. (2012) KRAS Mutaatio on Predictor oksaliplatiiniannosten Herkkyys koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 7 (11): e50701. doi: 10,1371 /journal.pone.0050701

Editor: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 toukokuu 2012; Hyväksytty: 25 lokakuu 2012; Julkaistu: 28 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Lin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta Department of Health, Executive Yuan (DOH100-TD-C-111-001), Taipei, Taiwan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

biomarkkerit määrittämään hoidon tehoa on tutkittu perinteisen kemoterapian aikakauden, mutta vain rajoitettu määrä biomarkkereiden on löydetty toistaiseksi. Esimerkkejä ovat Leikkauskorjauksessa rajat komplementaatioryhmä 1 (ERCC1) lauseke ennustaa vastus oksaliplatiinin [1], ja tymidylaattisynteesin (TS) lauseke määrittää 5FU herkkyyden [2]. Tämä käsite on kehittynyt ja on tullut enemmän merkitystä, kun hoito on edennyt molekyylitason kohdennettuja aikakauden. Useimmat molekyyli kohdistetut aineilla on ennalta sovitut tavoitteet, jotka helpottavat ennustamiseksi hoidon tehokkuutta tai ennusteen sairauksia. Hyviä esimerkkejä ovat epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) mutaatio ennustaa tehokkuutta EGFR tyrosiinikinaasin estäjät (TKI) keuhkojen adenokarsinooma [3], sekä KRAS mutaatio ennustamiseksi reagoimattomuus EGFR monoklonaalinen vasta-aine ja peräsuolen syöpä (CRC) [ ,,,0],4]. Vaikka laajoja tutkimuksia on tehty tunnistamaan uusia ennustavia tunnetuista signalointireitteihin tai microarray perustuvat tutkimukset [5], [6], biomarkkerit ennustaa kemoterapian herkkyys edelleen heikosti määritelty.

(A) KRAS-tippuu alas DLD-1

G13D solut olivat resistenttejä oksaliplatiini, mutta on sama herkkyys irinotekaani, 5FU, ja doksorubisiinin kuin vanhempien DLD-1

G13D soluja, kuten on osoitettu MTT: llä. (B) proteiini taso ERCC1, mutta ei niille TOPO1 tai TS oli upregulated jälkeen DLD-1

G13D soluja tippuu alas by KRAS siRNA. (C) mRNA taso ERCC1, mutta ei niille TOPO1 tai TS oli upregulated jälkeen DLD-1

G13D soluja tippuu alas by KRAS siRNA. ***:

p

0,001.

Useat Jälkikäteisanalyysi viime satunnaistettu tutkimuksista CRC ehdotti, että KRAS geenimutaatio tila voisi ennustaa tehoa solunsalpaajahoito, erityisesti for oksaliplatiinipohjaisessa hoidossa. OPUS [7] ja PRIME [8] tutkimuksia, jotka molemmat on suunniteltu potilaat voivat saada ensilinjan oksaliplatiini /5FU /leukovoriiniin /ilman EGFR monoklonaalisia vasta-aineita, ovat hyviä esimerkkejä. Ensisijaisesti keskitytään kemoterapia-ainoa ryhmä näissä 2 tutkimukset osoittavat, että ensilinjan ilman taudin etenemistä (PFS) KRAS mutantti ryhmä kestänyt pidempään kuin villin tyypin ryhmä, jossa on 8,6 vs. 7,2 kuukautta vuonna OPUS tutkimuksessa ja 8,8 vs. 8,0 kuukautta vuonna PRIME tutkimuksessa. Sitä vastoin CRYSTAL tutkimuksessa [9], jonka tarkoituksena oli potilailla, jotka saivat ensilinjan irinotekaani /5FU /leukovoriiniin /ilman EGFR monoklonaalinen vasta-aine, samanlainen ilmiö ei havaittu. Mediaani ensilinjan PFS in KRAS-mutantti ja villityypin potilailla oli 7,7 ja 8,4 kuukautta.

Näiden havaintojen, me arveltu, että KRAS-mutaatio voi olla ennustaja oksaliplatiinin herkkyyden CRC. Ensin KRAS lyötiin alas in KRAS-mutantti CRC soluja ja yli-ilmentynyt KRAS-villityypin CRC soluissa. Nämä pariksi CRC solut testattiin oksaliplatiinia, irinotekaania ja 5FU arvioida muutoksen huumeiden herkkyys. Syyt herkkyys muutoksiin olivat edelleen määritettiin western blot ja reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR (qRT -PCR). Lopuksi, tavoite vastaava herkkyys muutos oli validoitu lyömällä alas ja yli-ilmentävät tavoitetta.

(A) KRAS-tippuu alas SW480

G12V solut olivat resistenttejä oksaliplatiini, mutta on sama herkkyys irinotekaanille, 5FU, ja doksorubisiinin kuin vanhempien SW480

G12V soluja, kuten on osoitettu MTT: llä. (B) proteiini taso ERCC1, mutta ei niille TOPO1 tai TS oli upregulated jälkeen SW480

G12V soluja tippuu alas by KRAS siRNA. (C) mRNA taso ERCC1, mutta ei niille TOPO1 tai TS oli upregulated jälkeen SW480

G12V soluja tippuu alas by KRAS siRNA. ***:

p

0,001.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

Ihmisen CRC solulinjat Colo320DM (KRAS -wild-tyyppi), DLD-1

G13D (KRAS G13D mutaatio), ja SW480

G12V (KRAS G12V mutaatio) olivat kaikki saatu American Type Culture Collection. Soluja kaikki ylläpidettiin RPMI-1640, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia, 2 mmol /l L-glutamiinia (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), ja PSA (10000 yksikköä /ml penisilliiniä, 10 mg /ml streptomysiiniä ja 25 ug /ml amfoterisiini B: tä, Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel), ja viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO2. Oksaliplatiini (Eloxatin® injektio 5 mg /ml) saatiin Sanofi-Aventis Co., Ltd (Taipei, Taiwan). Irinotekaani, 5FU, ja doksorubisiinin ostettiin kaikki yhtiöltä Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Rabbit vasta-western blot vastaan ​​ERCC1 ja KRAS ostettiin Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, USA). Hiiren vasta-aineita TS, topoisomeraasi I (TOPO I), ja β-aktiini saatiin Millipore (Bedford, MA, USA), BD Biosciences (San Jose, CA, USA) ja Cell Biolabs, Inc. (San Diego, CA, USA), vastaavasti.

(A) KRAS

G13D-DDK-myc-Colo320DM solut olivat herkempiä oksaliplatiini, mutta on sama herkkyys irinotekaani, 5FU, ja doksorubisiinin kuin vanhempien Colo320DM soluja, kuten osoittivat MTT: llä. (B) proteiini taso ERCC1, mutta eivät TOPO1 tai TS, säädeltiin vähentävästi jälkeen Colo320DM solut transfektoitiin KRAS

G13D mutantti vektori. (C) mRNA-taso ERCC1, mutta eivät TOPO1 tai TS, säädeltiin vähentävästi jälkeen Colo320DM solut transfektoitiin KRAS

G13D mutantti vektori. **:

p

0,01.

Nakuttava-alas KRAS ja ERCC1

kahdentyyppisiä sekä KRAS ja ERCC1 pieniä häiritseviä RNA: ita (siRNA) ja salattu epäspesifinen (negatiivinen kontrolli) siRNA hankittiin Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA, USA). KRAS-geenin Knockdown, DLD-1

G13D ja SW480

G12V soluja transfektoitiin ensin KRAS- tai salattu siRNA 1 päivän käyttäen Iipofectamine2000 transfektioreagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) mukaan valmistajan ohjeiden . Transfektoidut solut käsiteltiin sitten oksaliplatiinia, irinotekaania, 5FU: n ja doksorubisiinin kanssa eri pitoisuuksissa seuraavien 72 tunnin aikana. Proteiini lysaatti ja mRNA vanhempien ja KRAS knockdown DLD-1

G13D ja SW480

G12V solut kerättiin 24, 48, 72 ja 96 tuntia transfektion jälkeen arviointiin KRAS Knockdown suuruusluokkaa Western blot. Sillä ERCC1 geenin pudotus, Colo320DM solut transfektoitiin kaksi eri ERCC1- tai salattu siRNA: t käsiteltiin oksaliplatiinin kanssa 72 tuntia. Proteiini lysaatti ja mRNA vanhempien ja ERCC-tippuu alas Colo320DM solut kerättiin 24, 48, 72 ja 96 tuntia transfektion arvioimiseksi ERCC1 knockdown vaikutus Western blot ja qRT-PCR.

( A) KRAS

G12V-DDK-myc-Colo320DM solut olivat herkempiä oksaliplatiini, mutta on sama herkkyys irinotekaani, 5FU, ja doksorubisiinin kuin vanhempien Colo320DM soluja, kuten on osoitettu MTT: llä. (B) proteiini taso ERCC1, mutta eivät TOPO1 tai TS, säädeltiin vähentävästi jälkeen Colo320DM solut transfektoitiin KRAS

G12V mutantti vektori. (C) mRNA-taso ERCC1, mutta eivät TOPO1 tai TS, säädeltiin vähentävästi jälkeen Colo320DM solut transfektoitiin KRAS

G12V mutantti vektori. **:

p

0,01. (D) lisääminen apoptoosiprosentti, 22,5% ± 0,2%: sta 39,1% ± 0,2% apoptoosin (P 0,001), on osoitettu, kun KRAS

paino–DDK-myc-Colo320DM soluja, verrattiin KRAS

G12V-DDK-myc-Colo320DM soluissa, joissa molemmat käsiteltiin saman pitoisuuden oksaliplatiinin 5 uM. *:

p

0,001.

yli-ilmentyminen KRAS ja ERCC1

pCMV6-Myc-DDK-tagged-KRAS vektori hankittiin Origene Technologies ( Rockville, MD, USA). DNA-sekvenssin koodaavan KRAS G12V ja G13D mutaation tuotettiin kohdennetulla mutageneesillä ja kloonattiin pCMV6-Myc-DDK-merkitty-KRAS vektori. Sekvenssit KRAS G12V ja G13D-mutaatio, olivat seuraavat: 5′-GTTGTGGTAGTTGGAGCTGTTGGCGTAGGCAAGAATGCC-3 ’; reverse: 5’-GGCACTCTTGCCTACGCCAACAGCTCCAACTACCACAAG-3 ’ja eteenpäin: 5′-GGTAGTTGGAGCTGGTGACGTAGGCAAGAGTGCC-3′; reverse: 5’-GGCACTCTTGCCTACGTCACCAGCTCCAACTACC-3 ’, vastaavasti. KRAS yliekspressio, Colo320DM solut transfektoitiin lyhytaikaisesti kanssa pCMV6-Myc-DDK-tagged-KRAS, -KRAS

G12V, ja -KRAS

G13D vektoreita. Sen jälkeen, kun 24-tunnin transfektion jälkeen solut käsiteltiin oksaliplatiinia, irinotekaani, 5FU, ja doksorubisiinin kanssa eri pitoisuuksissa seuraavien 72 tunnin aikana. Proteiini lysaatti ja mRNA Colo320DM solujen transfektoitiin pCMV6-Myc-DDK-tagged-KRAS, -KRAS

G12V, ja -KRAS

G13D vektorit kerättiin 24, 48, 72, ja 96 tuntia arviointi of KRAS yliekspressio suuruusluokkaa western blot. Sillä ERCC1 yli-ilmentyminen, SW480

G12V-solut transfektoitiin pCMV6-ERCC1-GFP-vektorilla (Origene Technologies, Rockville, MD, USA) 24 tunnin ajan, ja käsiteltiin oksaliplatiinin 72 tuntia. Proteiini lysaatin SW480

G12V solut transfektoitiin ERCC1-GFP-vektorilla, kerättiin 24, 48, 72, ja 96 tunnin arviointiin ERCC1 yliekspressio suuruusluokkaa Western blot.

(A) ERCC1- tippuu alas Colo320DM solut olivat herkempiä oksaliplatiinille kuin vanhempien Colo320DM soluja, kuten on osoitettu MTT: llä. (B) proteiini ja mRNA tasot ERCC1 olivat vaimentua kun Colo320DM soluja tippuu alas by ERCC1 siRNA. *:

p

0,05 (C) ERCC1-GFP-SW480

G12V solut olivat resistenttejä oksaliplatiinille kuin vanhempien SW480

G12V soluja. (D) Ectopic ERCC1 on voimistunut, kun SW480

G12V-solut transfektoitiin ERCC1-GFP-ekspressiovektoriin.

elinkykyyn ja apoptoottinen analyysit

Solujen elinkelpoisuus arvioitiin käyttämällä 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT; Tokyo Chemical Industry Inc., Tokio, Japani) määritystä 6 rinnakkaista. Aluksi Colo320DM, SW480

G12V, ja DLD-1

G13D soluja ympättiin 3500, 4500, ja 3000 solua per kuoppa 96-kuoppaisille, tasapohjaisille levyille, vastaavasti. Sen jälkeen, kun 24-tunnin inkubaation SW480

G12V ja DLD-1

G13D solut transfektoitiin KRAS- ja salattu siRNA: t, ja Colo320DM solut transfektoitiin pCMV6-Myc-DDK-merkityn KRAS, -KRAS

G12V, ja -KRAS

G13D vektoreita, kuten on kuvattu. Jälkeen KRAS-siRNA: t transfektoitiin DLD-1

G13D /SW480

G12V solujen ja KRAS-mutantti vektoreita Colo320DM soluja 24 tunnin ajan, soluja käsiteltiin oksaliplatiinia, irinotekaani, 5FU, ja doksorubisiinin eri pitoisuuksilla 10 % FBS-täydennettyä RPMI-1640: ssa 72 tuntia. Ohjaus solut sekoitettiin DMSO: ssa pitoisuuksina, että lääkkeellä käsiteltyihin soluihin. Solujen elinkelpoisuus näiden käsiteltyjen solujen mitattiin lisäämällä 200 ui 0,5 mg /ml MTT: liuotetaan DMSO: hon kuhunkin kuoppaan, ja soluja inkuboitiin CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa 2 tuntia poistamisen jälkeen väliaineen. Absorbanssi määritettiin aallonpituudella 570 nm. Yhdisteiden konsentraatiot, jotka estivät elinkelpoisuutta 50% (IC

50) määritettiin käyttäen mediaani vaikutus menetelmää käyttämällä CalcuSyn-ohjelmisto (Biosoft, Ferguson, MO, USA).

(A) proteiini ilmentymistä ERCC1 DLD-1 (KRAS

G13D-mutaatio) soluja on säädelty jälkeen 5′-atsasitidiinin (de-metyloimisaine) hoitoa 96 tuntia, mikä merkitsi sitä, että downregulation ERCC1 in KRAS-mutantti CRC solut saattavat olla osittain ERCC1 hypermetylaation. (B) alassäätely ERCC1 vuonna Colo320DM (KRAS villityypin) solut transfektoitiin KRAS

G13D-mutantti-vektori 24 ja 96 tuntia ei vain voida palauttaa 5′-atsasitidiinin 10 uM, mutta aiheutti myös ylä- sääntely DNMT3B.

osa apoptoottisten solujen, kun KRAS yli-ilmennetään Colo320DM soluissa, ja käsiteltiin oksaliplatiini, arvioitiin virtaussytometrialla anneksiini V-FITC: llä. Colo320DM soluja ympättiin 2,5 x 10

5 solua /kuoppaa kohti salattu ja KRAS

G12V-mutantti-vektorin transfektiolla 6-kuoppaisille levyille. 6 tunnin kuluttua transfektion transfektion väliaine korvattiin säännöllisin väliaineen. Oksaliplatiinia pitoisuus 5 uM annettiin transfektoituja Colo320DM solujen seuraavana päivänä. Transfektoidut Colo320DM solut trypsinoitiin ja analysointia varten kerätään 48 tunnin kuluttua ja oksaliplatiinihoito. Soluja sentrifugoitiin 300 g: ssä 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, ja solususpensio värjättiin anneksiini V-FITC: tä (anneksiini V Assay Kit, BD Biosciences Pharmingen) ja propidiumjodidia huoneen lämpötilassa vähintään 15 minuutin ajan pimeässä. Sitten solut analysoitiin FACScan-virtaussytometrillä ja Cell Quest ohjelman. Osuus apoptoottiset solut oli solujen osuus värjättiin anneksiini V-FITC.

Western Blot analyysi

KRAS-yli-ilmennetään Colo320DM ja KRAS-tippuu alas SW480

G12V ja DLD- 1

G13D soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla oksaliplatiinia, irinotekaania, ja 5FU 72 tunnin ajan 6-cm: n maljoille (1 x 10

5 solua per malja), kerättiin ja lyysattiin RIPA lyysipuskuria [50 mmol /L Tris-HCI (pH 8,0), 150 mmol /l NaCI, 1% NP40, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS: ää] (Sigma Cat. nro R0278). Proteiinikonsentraatiot lysaattia määritettiin käyttäen Pierce BCA-proteiinin iinianalyysikitissä (Thermal Scientific, Odessa, Texas, USA). Yhtä suuret määrät proteiinia kustakin lysaatista alistettiin SDS-PAGE ja sen jälkeen siirrettiin nitroselluloosamembraaneille ja immunoblottauksella. Transblotatun kalvot pestiin kahdesti Tris-puskuroidulla suolaliuoksella (TBS), joka sisälsi 0,1% Tween 20: tä (TBST). Blokkaamisen jälkeen TBST: llä, joka sisälsi 5% rasvatonta maitoa 40 minuuttia, kalvoja inkuboitiin sopivan primaarisen vasta-aineen TBST, joka sisälsi 1% rasvatonta maitoa 4 ° C: ssa yön yli. Kaikki ensisijainen vasta-aineet laimennettiin sopivaan konsentraatioon 1% rasvatonta maitoa, joka sisälsi TBST. Käsittelyn jälkeen primaarisen vasta-aineen, membraanit pestiin kahdesti TBST: llä 20 minuutin ajan, jota seurasi vuohen anti-kani tai anti-hiiri-IgG-piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (laimennettu 1:3000) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja pestiin 3 kertaa TBST: llä 1 tunnin ajan. Membraanit kehitettiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssia piparjuuriperoksidaasi alustan (Millipore, Bedford, MA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Reaaliaikainen Kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR) B

KRAS-yliekspressoitu Colo320DM, KRAS-tippuu alas SW480

G12V ja DLD-1

G13D soluja käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla oksaliplatiinia, irinotekaania, ja 5FU 24, 48, ja 72 tuntia, vastaavasti, kerättiin ja hajotettiin Trizol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja säilytettiin -20 ° C: ssa. RNA Näiden solujen uutettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA syntetisoitiin kokonais-RNA (1 ug) käyttämällä Applied Biosystems High-Capacity cDNA Archive Kit mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. CDNA: t 50-ng kokonais-RNA kvantitoitiin käyttäen Taqman Universal tai SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ABI PRISM 7900 Sequence Detection System (Perkin-Elmer /Applied Biosystems). Alukesekvenssejä of ERCC1 (ABI Taqman määritys ID: Hs01012158_ml), TOPO I (ABI Taqman määritys ID: Hs00243257_ml), TS (ABI Taqman määritys ID: Hs00426586_ml), ja β-aktiini-geeni (ABI Taqman määritys ID: Hs99999903_ml) kuin endogeeninen kontrolli olivat kaikki hankittiin Applied Biosystems (Foster City, CA, USA). Olosuhteet PCR olivat 50 ° C: ssa 2 minuutin ajan, 95 ° C: ssa 10 minuuttia, ja 40 sykliä 95 ° C: ssa 15 sekuntia (denaturaatio) ja 60 ° C: ssa 1 minuutti (hehkutus /laajennus). Suhteellinen mRNA määrä kohdegeenin /endogeeninen kontrolli-geenin (β-aktiini) laskettiin käyttäen ACt (kynnys sykli) menetelmä, seuraavasti: suhteellinen ekspressio = 2-ACt, jossa ACt = Ct (kohdegeenin) – Ct (β aktiini-).

tilastollinen analyysi

solulinjan tutkimuksia, kaikki tiedot toistettiin vähintään 3 itsenäisen kokeen. Quantitative data esitetään keskiarvona ± SD. Vertailut tiedot samassa kokeissa analysoitiin käyttäen Studentin

t

testiä.

p

-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Nakuttava alas KRAS in KRAS-mutantti CRC Cells Parantaa Oksaliplatiini Resistance ja syyt ERCC1 Yliekspressio

Nakuttava alas KRAS DLD-1

G13D solut johti soluissa vastustuskykyisempiä oksaliplatiinia, mutta ei irinotekaani, ja 5FU, standardi kemoterapeuttisten aineiden CRC, eikä doksorubisiinille, laaja kirjo kemoterapeuttista ainetta varten muut suuret syöpiä. Kaksi eri KRAS-siRNA: t transfektoitiin DLD-1

G13D soluja. IC

50 ensimmäisen pariksi vanhempien DLD-1

G13D /KRAS-siRNA (1) -DLD-1

G13D soluja käsiteltiin oksaliplatiinin 72 tuntia oli 3,97 /33.07 uM. Toisen pariksi vanhempien DLD-1

G13D /KRAS-siRNA (2) -DLD-1

G13D solua oli 3,97 /13,49 uM. IC

50 pariksi vanhempien DLD-1

G13D /KRAS-siRNA-DLD-1

G13D soluja käsiteltiin irinotekaanin, 5FU ja doksorubisiini pysyi ennallaan (kuvio 1A). ERCC1, TOPO I ja TS, joka arveltiin olevan biomarkkereiden ennustamaan herkkyyden oksaliplatiinin [1], irinotekaani [10] ja 5FU [2], vastaavasti, olivat edelleen tarkastaa western blot ja qRT-PCR (kuviot 1 B, and1C ) tutkimaan mekanismeja havaintomme. Vain ERCC1 ilmentyminen säädeltiin jälkeen KRAS knockdown; Sen sijaan TOPO I ja TS pysynyt vakiona sekä proteiinia ja mRNA-tasojen. KRAS pudotus tehokkuutta arvioitiin western blot, joka osoitti vähentynyt of KRAS ilmaisun jälkeen 72 tunnin koputtaa alas KRAS-geenin (kuvio 1 B).

lujittaa entisestään havaintomme, käytimme toinen CRC solu, SW480 , joka kanna toinen KRAS mutantti alatyyppiä, G12V, toistaa samaa koe- menettelyjä. Yhteenvetona, vanhempien SW480

G12V soluja oli odotetusti herkempiä oksaliplatiinille kuin KRAS tippuu alas SW480

G12V soluja. IC

50 vanhempien SW480

G12V /KRAS-siRNA-SW480

G12V soluja käsiteltiin oksaliplatiinin 72 tuntia oli 2,08 /13,53 uM, mutta vanhempien SW480

G12V /KRAS-siRNA- SW480

G12V soluja käsiteltiin irinotekaanin, 5FU, ja doksorubisiini pysyi ennallaan (kuvio 2A). ERCC1, TOPO I ja TS olivat samanaikaisesti tarkastetaan western blot ja qRT-PCR (kuviot 2B ja 2C), ja jälleen vain ERCC1 oli voimistunut jälkeen KRAS Knockdown, jossa TOPO I ja TS tasot pysyvät ennallaan proteiinia ja mRNA-tasojen. Samoin KRAS knockdown tehokkuutta mitattiin western blot, joka osoitti laskua KRAS ilmaisun jälkeen 72 tunnin koputtaa alas KRAS-geenin (kuvio 2B).

yliekspressoivien KRAS in KRAS Villityypin CRC Cells johdot oksaliplatiinista Herkkyys ja ERCC1 alassäätely

yli-ilmentyminen KRAS in Colo320DM soluissa KRAS-mutantti vektorit johtivat solut herkemmiksi oksaliplatiinille. IC

50 vanhempien Colo320DM /KRAS

G13D-DDK-myc-Colo320DM solujen käsitelty oksaliplatiinin 72 tuntia oli 2,86 /0,26 uM, mutta vanhempien Colo320DM /KRAS

G13D-DDK-myc- Colo320DM solut käsiteltiin irinotekaanin, 5FU, ja doksorubisiini pysyi ennallaan (kuvio 3A). ERCC1, TOPO I ja TS tarkistettiin western blot ja qRT-PCR (kuviot 3B ja 3C), mikä osoitti, että vain ERCC1 säädeltiin vähentävästi ilman muutoksia proteiinien ja mRNA tasot TOPO I ja TS jälkeen KRAS yli-ilmentymisen. Ilmentymisen ektooppinen KRAS ja endogeenisen KRAS mitattiin western blot, joka osoitti vankan ilmentymisen ektooppinen KRAS, jossa on jatkuvasti endogeenisen KRAS jälkeen 24 tunnin yliekspressio KRAS-geenin (kuvio 3B).

samat tulokset havaittiin myös Colo320DM transfektoitu KRAS

G12V-mutantti vektori. IC

50 vanhempien Colo320DM /KRAS

G12V-DDK-myc-Colo320DM käsiteltyjä soluja oksaliplatiinin 72 tuntia oli 2,55 /0,25 uM, mutta vanhempien Colo320DM /KRAS

G12V-DDK-myc- Colo320DM solut käsiteltiin irinotekaanin, 5FU, ja doksorubisiini pysyi ennallaan (kuvio 4A). Jälleen, vain ERCC1 säädeltiin vähentävästi ilman muutosta TOPO I ja TS proteiinia (kuvio 4B) ja mRNA-tasot (kuvio 4C), kun KRAS yliekspressio. Ilmentymisen ektooppinen KRAS ja endogeenisen KRAS jälkeen 24 tunnin yliekspressio KRAS-geenin on esitetty kuviossa 4B. Edelleen vahvistaa havainto, että KRAS

G12V-DDK-myc-Colo320DM solut olivat herkempiä oksaliplatiinille kuin vanhempien Colo320DM solujen virtaussytometria jossa anneksiini V-FITC suoritettiin. Näin ollen, lisääntynyt apoptoosiprosentti, 22,5% ± 0,2%: sta 39,1% ± 0,2% apoptoosin (P 0,001), on havaittu, kun vanhempien Colo320DM solut, transfektoitiin KRAS

paino–DDK-myc-vektori, olivat verrattuna Colo320DM soluihin, transfektoitiin KRAS

G12V-DDK-myc-vektori, jossa molemmat käsiteltiin samassa pitoisuudessa oksaliplatiinille 5 uM (kuvio 4D).

validointi ERCC1 Expression kuin ennustaja oksaliplatiiniannosten herkkyys

Nakuttava alas ERCC1 in KRAS villityypin CRC solujen palauttaa oksaliplatiinille herkkyys.

varmistamiseksi edelleen suhdetta ERCC1 ilmaisun ja oksaliplatiini herkkyys, koputimme-alas ERCC1 geeni käyttäen 2 eri ERCC1-siRNA: t in KRAS-villityypin solujen (Colo320DM). Huomasimme, että IC

50 ensimmäisen pariksi vanhempien Colo320DM /ERCC1-siRNA (1) -COLO320DM käsiteltyjä soluja oksaliplatiinin 72 tuntia oli 2,75 /0,91 uM (kuvio 5A). Toiseksi pariksi vanhempien Colo320DM /ERCC1-siRNA (2) -COLO320DM solut oli 2,75 /0,83 uM (kuvio 5A). Proteiini- ja mRNA: n ilmentymisen tasot ERCC1 oli vaimentua jälkeen ERCC1 oli tippuu alas by ERCC1-siRNA Colo320DM soluissa (kuvio 5B).

yli-ilmentävät ERCC1 in KRAS-mutantti CRC-solujen aiheuttaa oksaliplatiini vastus.

yli-ilmentyminen ERCC1 vuonna SW480

G12V soluissa ERCC1-yliekspressoivassa vektori aiheutti SW480

G12V solujen tulla enemmän vastustuskykyisiä oksaliplatiinia. IC

50 vanhempien SW480

G12V /ERCC1-GFP-SW480

G12V soluja käsiteltiin oksaliplatiinin 72 tuntia oli 1,87 /11,03 uM (kuvio 5C). Western blot käytettiin määrittämään ERCC1-GFP yliekspressio tason transfektion jälkeen (kuvio 5D).

Keskustelu

Tutkimuksemme osoittaa, että KRAS-mutaatio on ennustaja oksaliplatiinin herkkyyden koolonkarsinoomasoluissa by ERCC1 downregulation. Tämä voi tarjota tärkeä askel henkilökohtaista kemoterapian paksusuolensyöpä.

edeltävässä täsmähoitoihin aikakauden, Tournigand et al [11] julkaisi keskeinen artikkeli osoittaa, että ensilinjan kemoterapiaa joko irinotekaania /5FU /lecovorin (FOLFIRI) tai oksaliplatiinin /5FU /leukovoriiniin (FOLFOX6) in ”ei-valittu” metastaattinen CRC potilaita, peräkkäin sen jälkeen toinen etenemisen jälkeen, ei vaikuttanut yleiseen eloonjäämiseen (OS). Artikkelissaan totesi myös, että molemmat hoito-ohjelmia voidaan suositella ensilinjan hoitoon pitkälle CRC. Vuonna nykyajan täsmähoitoihin, nykyinen hoito on edennyt yksilöllinen hoito jälkeen villin tyypin KRAS-geeni tunnistettiin ennustaja EGFR monoklonaalinen vasta-aine. KRAS asema on suositellaan rutiininomaisesti tarkastaa päivittäin onkologisia käytännössä. Tunnistaa paremmin ennustavia nykyisissä kemoterapiaa tai uudempi hoidon tavoitteita KRAS-mutantti CRC potilailla on perusteltua. Tutkimuksemme aloitettiin löytää parempia ennustavia nykyisissä kemoterapiaa, joille hypoteesi oli tuotettu alaryhmäanalyyseissa satunnaistetuista prospektiivisessa kliinisessä tutkimuksessa, PRIME [8] ja OPUS [7], versus CRYSTAL [9]. Tutkimuksemme, KRAS-mutantti CRC potilaat saattavat hyötyä enemmän saamasta ensilinjan oksaliplatiinipohjaisessa hoidossa kuin KRAS-villityypin potilailla. Tämä ilmiö takaa lisävahvistusta suuret prospektiivisessa kliinisessä tutkimuksessa.

Tuloksemme osoittivat, että KRAS mutaatio CRC soluissa aiheutti ERCC1 downregulation. Tämä merkittävä havainto saattaa merkitä sitä, että jotkut muut tuntemattomia druggable tavoitteet voivat silti olla vastuussa KRAS-mutantti CRC hoidon lisäksi perinteisen RAS /RAF /MEK /ERK-reitin. Tutkia näitä tuntemattomia tavoitteita, tutkimukset suunniteltu epigeneettisellä ja /tai geneettinen näkökulmista voi olla apua. Vuodesta epigeneettisellä näkökulmasta hypermetylaation aiheuttaa geenien on tunnettu [12], [13]. Tutkimuksessamme olemme havainneet, että proteiini ilmentymistä ERCC1 DLD-1 (KRAS

G13D mutaatio) solut on säädelty jälkeen 5′-atsasitidiinin (de-metylointiaineen) hoitoa 96 tuntia (kuvio 6A), mikä osoitti, että downregulation ERCC1 in KRAS-mutantti CRC solut saattavat olla osittain ERCC1 hypermetylaation. Olemme myös havainneet, että downregulation proteiinin ilmentymistä ERCC1 vuonna Colo320DM (KRAS villityypin) solut transfektoitiin KRAS-mutantti-vektori 24 ja 96 tuntia voidaan palauttaa 5′-atsasitidiinia (kuvio 6B). Tämä edelleen hiljaista, että downregulation ERCC1 ilmentymisen CRC-soluissa ei ole vain osittain hypermetylaation, mutta myös määrittää muutoksia KRAS ilmaisun CRC soluissa. Koska downregulation ERCC1 in Colo320DM soluissa, transfektoitiin KRAS

G13D-mutantti-vektori, voi johtua hypermetylaatiota ERCC1, olemme edelleen tarkastetaan DNMT3B (DNA metyylitransferaasi 3B), jonka tärkein tehtävä on edetä prosessin metylaation. Olemme havainneet, että DNMT3B on voimistunut, kun ERCC1 on dowenregulated vuonna Colo320DM soluissa, transfektoitiin KRAS

G13D-mutantti-vektoriin (kuvio 6B). DNMT3B voi jälleen tukahduttaa 5′-atsasitidiinia, joka kuvataan että DNMT3B on todennäköisesti vastuussa metylaation prosessia. Siksi meidän tiedot osoittivat, että ERCC1 downregulation in KRAS-mutantti CRC solujen ehkä kautta ERCC1 hypermetylaation. Olemme ehdottaneet, että KRAS-mutantti CRC soluissa saattaa olla korkeampi metylaatio korko CpG saarilla ERCC1 promoottorialueen kuin KRAS-mutanttisoluja transfektoidaan KRAS-siRNA. Tämä hypoteesi voidaan validoitu vertaamalla mahdollisia eroja hypermetylaation on ERCC1 promoottorialueen välillä KRAS-mutanttisoluista ja KRAS-mutanttisoluja transfektoidaan KRAS-siRNA metylointi PCR ja /tai natriumbisulfiitti Sekvensointianalyysin [14]. Koko konsepti on, että KRAS aktivoiva mutaatio saattaa aiheuttaa DNMT3B säätelyä. Sen jälkeen, DNMT3B voi sitoutua promoottorialueen ERCC1 johtaa hypermetylaatiota ERCC1 geenin. Lopuksi hypermetylaatiota ERCC1 geenin tuloksia downregulation of ERCC1 ilmaisua. Vaihtoehtoisesti, geneettisen näkökulmasta, koska KRAS mutaatio on aktivoiva mutaatio, joka on laajalti hyväksytty [15], [16], ehdotimme, että saattaa olla olemassa tuntematon tekijä, joka voidaan inhiboida aktivoitumisen KRAS-geenin tai sen loppupään signaaleja. Tämä seikka pitää myös olla aktivoiva tekijä aktivoida ERCC1 geeniä. Sitten kun KRAS-geeni on mutatoitunut (aktivoitu), tämä seikka saattaa estyä, ja määrä tämän tekijän voidaan vähentynyt. Sen jälkeen, ilmaus ERCC1 voidaan vaimentaa, koska ei ole tämän tekijän. Tehdään tällaisia ​​tutkimuksia, reportterigeenirakenteilla käyttäen ERCC1 promoottoria, lusiferaasiaktiivisuus määritys ja chromatin immunosaostus voidaan siten tarvita [17].

Vaikka yksityiskohtaisia ​​mekanismeja tuloksista on vaikeasti, ylikuulumisyhdistelmää välillä mutatoitunut KRAS-geeni ja DNA kuntoutuskoneet reittejä, mikä voi olla vastuussa vaikutuksesta oksaliplatiinipohjaisen hoitoa, on tutkittu [18], [19]. Lisäksi erilaisia ​​uusia sukupolvia microarray-pohjainen teknologia, vertaamalla saman annetaan solua /ilman KRAS mutaatio lyömällä alas ja yli-ilmentävät KRAS-geenin vastaavasti, voi olla yksi hyödyllinen tapa määrittää uusia tavoitteita KRAS-mutantti CRC käsittely [5], [6].

yli-ilmentyminen ERCC1 liittyy vastuksen platinapohjaisen kemoterapian [1], [20], [21], [22], [23], [24], joka on ollut osoitettu erilaisia ​​syöpiä, mukaan lukien ruokatorven syöpiä [25], ei-pienisoluisen keuhkosyövän, [26] ja virtsarakon syövät [27]. Nämä havainnot ovat myös yhteensopivia nykyisen tutkimuksen. Tutkimuksessamme olemme osoittaneet, että KRAS villityypin (Colo320DM) CRC-solut olivat resistenttejä oksaliplatiini kuin sama annetaan solut (Colo320DM) transfektoitiin KRAS-mutantti-vektorit.