Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

vapautuminen kanoninen Wnt /CTNNB1 (beeta-kateniinin ) reitti on yksi varhaisimmista tapahtumien synnyssä paksusuolen syöpä. Mutaatiot

APC

tai

CTNNB1

ovat erittäin yleisiä paksusuolensyöpä ja aiheuttaa poikkeavaa vakauttaminen CTNNB1, joka aktivoi transkriptiota Wnt kohdegeenien sitoutumalla chromatin kautta TCF /LEF transkriptiotekijöitä. Kirjoittajat raportoivat integroiva analyysi genominlaajuisten chromatin täyttöaste CTNNB1 mukaan kromatiinin immunosaostuksella yhdistettynä suurikapasiteettisten sekvensointi (chip kohdat) ja geeniekspressioprofilointi by mikrosiruanalyysillä upon RNAi-välitteinen knockdovvn CTNNB1 paksusuolen syöpäsoluissa.

tulokset

Havaitsimme 3629 CTNNB1 sitova huiput koko genomin ja merkittävä korrelaatio CTNNB1 sitova ja pudotus aiheuttama geenien ilmentymisen muutoksia. Meidän integroiva analyysi johti löytämisen suoran Wnt tavoite allekirjoitus koostuu 162 geenejä. Gene ontologia analyysi tämän allekirjoituksen paljasti merkittävän rikastamisen Wnt reitin geenit viittaa useita palaute asetusten kautta. Tulosten mukaan tämä geeni allekirjoitus osittain päällekkäinen Lgr5

+ suoliston kantasolujen allekirjoitus, ja on merkittävästi rikastettu suoliston normaalin kantasoluja sekä kliinisissä kolorektaalisyövässä näytteitä. Mielenkiintoista, kun taas ilmaus CTNNB1 kohdegeenin sarja ei korreloi selviytymisen, kohonnut ilmentyminen negatiivista palautetta säätelyjärjestelmiä allekirjoitus ennustaa paremmin ennustetta.

Johtopäätös

Tuloksemme tarjoavat genominlaajuisten näkymä chromatin käyttöasteen ja geenin Wnt /CTNNB1 signalointia koolonkarsinoomasoluissa.

Citation: Watanabe K, Biesinger J, Salmans ML, Roberts BS, Arthur WT, Cleary M, et al. (2014) Integrative chip seuraavissa /Microarray Analysis Tarkoittaa CTNNB1 Target Signature Rikastettu Suoliston Kantasolut ja paksusuolen syövän. PLoS ONE 9 (3): e92317. doi: 10,1371 /journal.pone.0092317

Toimittaja: Ted S. Acott, Casey Eye Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 lokakuu 2013; Hyväksytty: 20 helmikuu 2014; Julkaistu: 20 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Watanabe et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: rahoitus Susan G. Komen myöntää KG110897 (XD), joka on Yhdysvaltain puolustusministeriön BCRP Postdoctoral Fellowship (KW W81XWH-10-1-0383), ja National Institutes of Health myöntää R01HG006870 (XX). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Brian S. Roberts ja William T. Arthur ovat entisiä työntekijöitä Rosetta Inpharmatics, LLC Merck Co Inc Michele Cleary on tällä hetkellä työntekijä Merck Co., Inc. Ei ole patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Background

Wnt /CTNNB1 signalointi on konservoitunut polku joka pelaa perustavanlaatuinen rooli alkion kehityksen, kudosten homeostaasin ja ylläpito kantasolujen. Normaalissa suolessa, tämä reitti on välttämätöntä kehittämiseen ja ylläpitoon suoliston kantasolujen [1], [2]. Aktivointi kanoninen Wnt signalointia liittyy vakauttaminen sytoplasman CTNNB1, joka on muutoin hajottaa proteasomista läpi hajoamisen monimutkainen koostuu tuumorisuppressoriproteiinia APC, seriini /treoniini-kinaasi GSK-3, ja ak- siini. Stabiloidut CTNNB1 translokoituu tumaan, jossa se sitoutuu TCF /LEF transkriptiotekijöiden ja aktivoi kohdegeenin ilmentyminen [2]. Keskeinen aloittamisesta tapahtuma paksusuolen syöpää (CRC) on CTNNB1 vakauttamista menetyksen

APC

geeni tai aktivoimalla mutaatioita

CTNNB1

geeni [3]. Tämä geneettinen tapahtuma esiintyy pääasiassa suoliston kantasolujen populaation [4] – [6] ja johtaa epänormaaliin proliferaatioon mutatoitujen solujen aktivaation kautta kohdegeenien, kuten

MYC

ja

CCND1

[7 ]. Kun kuitenkin otetaan huomioon erilaiset solun roolit Wnt /CTNNB1 signalointi, muut kohdegeenien voi myös myötävaikuttaa patogeneesiin CRC.

Näin tunnistamiseen ja CTNNB1 kohdegeenien genominlaajuisten ovat olleet tärkeä pyrkimys CRC opinnot. Transkription profilointia käytettiin tunnistamaan Wnt /CTNNB1 kohdegeenien koolonkarsinoomasoluissa [8]. Kuitenkin analyysi geenien ilmentyminen yksin on rajallinen, koska kyvyttömyydestä erottaa ensisijaisen ja toissijaisen vaikutukset Wnt-reitin aktivoinnin. Viime aikoina kromatiinin immunosaostus (chip) seurasi laajamittainen DNA-analyysi kuten DNA-sirun (chip chip) tai suurikapasiteettisten sekvensointi (chip kohdat) [9], [10] käytettiin tunnistamaan genomiseen loci joka CTNNB1 tai TCF tekijät sitoutuvat suoraan [11] – [14]. Kuitenkin sirupohjaista tutkimuksia erilaisten transkriptiotekijöiden viittaavat siihen, ettei kaikkia sitovia yksilöidyt korreloi transkriptionaalisen sääntelyä toiminnallisella tasolla [15]. Siksi on tärkeää tehdä integroiva analyysi sisältää sekä genominlaajuisten chromatin käyttöasteen kartoitus ja geeniekspressioprofilointi samantyyppistä paksusuolen syöpä solujen tunnistamiseksi suoraan ja toiminnallinen Wnt /CTNNB1 kohdegeenien, jota ei ole vielä tehty kirjallisuudessa.

nykyisessä tutkimuksessa yhdistämme chip seuraavien kanssa mikrosiruanalyysi käyttäen SW480 ihmisen koolonisyöpäsolulinja, jossa vapautetuilla Wnt signalointia toiminta on hyvin dokumentoitu. Raportoimme merkittävä korrelaatio CTNNB1 sitova ja ilmaisun sääntely, ja tunnistaminen ydinjoukko 162 geenien ”Wnt suoraan kohdegeenien”, joita sitoo ja aktivoi CTNNB1. Wnt kohdegeenin allekirjoitus rikastui suoliston normaalin kantasoluja ja CRC mutta ei ennustaa ennusteen CRC potilaista. Tutkimuksemme on tärkeä resurssi ymmärtämiseksi biologian Wnt signalointia.

Tulokset

chip seuraavissa analyysi CTNNB1 kromatiinin käyttöaste SW480-soluissa

SW480 solut sisältävät inaktivoiva mutaatio

APC

geeni, joka aiheuttaa korkeaa konstitutiivisesti vakiintui CTNNB1 proteiinia ytimet [16], [17]. Kaapata oletettavasti dynaamista vuorovaikutusta CTNNB1 kromatiinin kanssa [18], [19], me optimoitu siru protokollan amiini-erityinen proteiini-proteiini ristisitojia ennen formaldehydi ristisilloitukseen yhdistettynä ydin- louhinta [20] (Katso menetelmät) . Spesifinen sitoutuminen CTNNB1 ensin validoitu Chip-PCR tunnettuja maaleja myös

MYC

ja

LEF1

(kuvio 1A). DNA: t useista ChIP kokeissa käyttäen anti-CTNNB1 vasta-aine tai isotyyppikontrolli IgG ohjaus yhdistettiin for Solexa /Illumina sekvensoinnin, joka tuotti noin 26 miljoonaa henkilöä 36-nukleotidisekvenssin lukee kussakin aikavälillä. Vain lukee ainutlaatuisesti kartoitettu ihmisen genomin (15776628 ja kontrolli-IgG ja 17112552 anti-CTNNB1) käytettiin myöhempää analyysiä (taulukko 1). Model-Based Analysis chip-Seq (MACS) [21] tunnistettiin 3629 CTNNB1 sitova huippu alueilla (

p

arvo ≤ 1E-5, FDR ≤ 5%) koko genomin (taulukko 1). Noin 60% piikkien sijaitsevat lähellä geenin koodaavan alueen, mukaan lukien promoottori (2-kb 5 ’reunustavan alueen, 21,5%), 5′-UTR (6,9%), eksonin (5,5%), introni (21,6 %), 3’-UTR (3,2%) ja loppupään (2-kb 3 ’reunustavan alueen, 0,5%) alueet (kuvio 1 B). Rikastaminen CTNNB1 sitova, promoottorit (21,5%) oli tilastollisesti merkitsevä (

p

0,001) verrattuna jakautumista satunnaisesti huiput samankokoiset (3,5 ± 0,2%). Yhdenmukainen aiemman raportin [12], huippu jakelu korreloi merkittävästi läheisyys transkription aloituspaikat (TSS) (kuvio 1 C). Koska CTNNB1 /TCF-sidottu tehostaja voi toimia etäällä TSS [18], me haetaan TSSs, jotka sijaitsevat 20 kb havaittu piikkejä, ja tunnistettiin 2794-geenit, joita käytettiin myöhemmin analyysi tunnistaa suoraan kohdegeenejä .

a.

ChIP optimointi. ChIP-PCR suoritettiin tunnettujen CTNNB1 sitovia elementtejä MYC ja LEF1 geenin säätelyalueita. * Anti-PYGO2 vasta-ainetta käytettiin positiivisena kontrollina, sillä PYGO2 proteiini assosioituu CTNNB1-TCF /LEF proteiini-kompleksin [51].

B.

Jakautuminen CTNNB1 sitovien alueiden genomin suhteen RefSeq ihmisen geenejä. A ’promoottori ”määritellään 2-kb alue ylävirtaan TSS, kun taas loppupään alue määritellään 2-kb alavirtaan transkription terminaatiokohta. Geenien välinen alue viitataan kaikkiin muualla kuin ”promoottori”, 5′-UTR: n, ”eksoni”, ”introni”, ”3’-UTR”, tai ”alavirtaan”.

C.

Etäisyys keskustasta kunkin CTNNB1 sitoutumisen huipusta TSS lähimmän geenin. Punainen viiva edustaa satunnaisesti jakautunut kuvio syntyy ottamalla 1000 satunnainen permutaatio huippujen.

D.

MEME ohjelma tunnistaa konsensus TCF /LEF sitova motiivi sisällä siru-seq huiput.

Usean EM for Motif Elisitointi (MEME), de novo motiivi löytö ohjelman [22], olemme analysoineet ainutlaatuinen CTNNB1 piikkien läsnäolon mahdollisen konsensuksen motiivi. Laajennettu TCF /LEF konsensussekvenssi [12], [13] esiin kuin sijoilla motiivi (E-arvo = 7.9e-1135) (kuvio 1 D). Useat muut ehdokas sekvenssit tunnistettiin myös; kuitenkin, ne näyttivät ovat toistuvia sekvenssejä, jotka ovat yhteisiä esineitä tämän analyysin (tietoja ei esitetty). Nämä tiedot vahvistavat, että CTNNB1 sitoutuu kromatiinin ensisijaisesti TCF /LEF DNA: ta sitovien proteiinien [11]. Tämä sanoi, emme voi sulkea pois mahdollisia sitovia motiiveja, joita ei ole havainnut MEME, samoin kuin olemassa muita liittyvien motiivien ulottumattomissa siru huippu alueilla [12], [14]. Todellakin, k-Mer Hae [23] paljasti, että AP-1 konsensussekvenssi (TGAYTCA) on merkittävästi rikastettu samankokoiset satunnainen genomista fragmenttia (

p

= 1.78e-50), mikä on yhdenmukaista aikaisemman työn raportointi rikastamista AP-1 motiivien CTNNB1 sitovia elementtejä [12].

käyttäminen UCSC Genome selain (NCBI36 /hg18) [24], me visualisoida CTNNB1 sitoutuminen tunnettuihin Wnt /CTNNB1 kohdegeenien.

Axin2

on klassinen kohde ja sisältää useita TCF /LEF sitovat alueet sen promoottorin ja ensimmäisen intronin [25]. Meidän ChIP-seuraavissa analyysi todellakin tunnistettu useita huippuja

AXIN2

, niiden paikkoihin, jotka vastaavat hyvin raportoitu sitoutumiskohdista (kuvio 2A). Olemme myös havainneet piikit ilmoitetaan alueita muiden tunnettujen kohdegeenien, kuten

MYC

[12] ja

LEF1

[26] (kuvio 2B ja C).

Näkyy ovat tulokset CTNNB1 ja IgG jakaumat on Ref-seq gens. Punainen laatikot osoittavat kannat konsensus TCF /LEF-sitovat motiivit. H3K4me1 ja H3K4me3 verkkotunnuksia useista Encyclopedia of DNA Elements (KOODAAMISEEN) solulinjat esitetään viittaukset tehostajana /promoottori ja promoottorialueille vastaavasti.

Combinational analyysi chromatin sitovia ja geeniekspression data identifioi suora CTNNB1 kohdegeenin allekirjoitus, joka sisältää palautetta sääntelevät Wnt-signalointireitin

tunnistaa suora ja toiminnallisesti asiaankuuluvat CTNNB1 kohdegeenien, analysoimme siru-seq aineisto vastaan ​​transkription profilointiin tietojen valvonta- ja CTNNB1-köyhdytettyä SW480-solujen [27] . Kuten aiemmin on kuvattu [27], knockdovvn CTNNB1 suoritettiin käyttäen kahta eri CTNNB1 erityisiä siRNA: t, jotka, kun niitä testattiin toiminnallinen määritys käyttäen Beta-kateniinin-Activated Reporter (BAR) [28] pystyivät tukahduttaa BAR aktiivisuuden ~99 % ja ~97%, vastaavasti. Suoritimme Gene asetettu rikastus analyysi (GSEA) käyttäen muunneltua Kolmogorov-Smirnov (KS) testiä [29] arvioida CTNNB1 sidottu geenejä niiden jakeluun mikrosirulla aineisto, jossa geenit sijoitus järjestettyä niiden ero ilmentymisen välillä ohjaus ja CTNNB1 vaje soluja. KS paljasti erittäin merkittävää korrelaatiota (

p

= 0) välillä CTNNB1 sitova ja geenin ilmentymisen jälkeen muutoksia CTNNB1 pudotus, ja tämä oli totta sekä siRNA: ita (kuvio 3A ja tietoja ei ole esitetty). Suurin osa CTNNB1 sitoutuneen geenit korreloivat positiivisesti, kun taas pieni määrä geenejä korreloi negatiivisesti, jossa CTNNB1 ilmentyminen (kuvio 3B). Tämä on sopusoinnussa CTNNB1 pääasiassa toimii transkription aktivaattori, mutta myös kykenee tukahduttaa tiettyjen geenien ilmentyminen [30].

A-B

. KS tontteja osoittavat korrelaatiota CTNNB1 sitova ja ilme sääntelyä. 2794 CTNNB1 sidottu geenit verrattiin niiden vastaavuus ilme muuttuu kun siRNA knockdovvn CTNNB1. Geenien microarray oli paremmuusjärjestykseen

p

arvo (

,

p

= 4.4e-16) tai kertaiseksi (

B

,

p

= 0) kussakin GSEA.

Käyttämällä kombinatorisista kriteerit, eli alassäätöä in mikrosiruanalyysi kanssa

p

0,01 ja log suhde -0,2 käsittelyn jälkeen sekä siRNA: iden ja näyttämällä CTNNB1 sitova piikin ± 20 kb TSS tunnistimme 162 geenejä suorina ja toiminnallinen Wnt tavoitteet (taulukko S1). Mukana tässä tavoitteen allekirjoitus tunnetaan tavoitteita kuten

AXIN2, CDX2, ID2, LEF1, LGR6, MSX1, NKD1, NKD2, SP5, TDGF1,

ja

TNFRSF19

, joka ilmaisee voimassaolon allekirjoitus. Olemme myös näytteet 10 geenejä luettelosta, ja käytetty ChIP-PCR vahvista CTNNB1 sitova odotetun sivustoja (kuvio 4A). Käyttämällä shRNA vastaan ​​CTNNB1, joka on erilainen kuin kaksi siRNA: t, joita käytetään mikrosiruanalyysi, me validoitu, että pudotus on CTNNB1 johti merkittävään down-regulation useimpien testattujen geenejä, mukaan lukien

FASLG, IL10, LMO2, MPZL2, NOTUM , PPP1R2,

ja

TREM2

(kuva 4B).

. ChIP-PCR analyysi osoitti geenien käyttäen itsenäisesti valmistettu chromatin näyte.

LEF1

ja

GAPDH

toimivat positiiviset ja negatiiviset kontrollit, vastaavasti.

B

. Kvantitatiivinen RT-PCR: llä osoitti geenejä. Keskiarvo ± keskihajonta 4 itsenäisen kokeen on esitetty.

p

arvot lasketaan kaksisuuntaisella standardin

t-

testi. NS: ei merkittävää, *:

p

0,05, ja **:

p

0,01.

Gene ontologia (GO) termi väkevöimisen tietokanta Annotation, visualisointi, ja Integrated Discovery (DAVID) [31], että 162-kohde-allekirjoitus ehdotti tärkeä kehityshäiriöitä toimintoja Wnt-reitin, mukaan lukien alkion lisäke morphogenesis, sydämen tai lihasten kehittämiseen (taulukko S2). GO-analyysi paljasti myös geenejä mukana useissa signalointireittien, viittaavia mahdollisten rajat väliset neuvottelut Wnt signalointia ja näitä reittejä. Erityisesti merkittävästi havaittu polku GO termit sisältävät sytokiinisignaloinnin (

FasL, BMP7, CXCL4, CXCL6, CXCL14, Edar, IL10RA, IL10, TNFRSF1B, TNFRSF11B, TNFRSF19

), väyliä syövän (

FasL, Gli3 , AXIN2, FGF3, FGF9, FGF19, LEF1, WNT6, WNT11

), tai Hedgehog signalointireitin (

Gli3, BMP7, WNT6, WNT11

) (taulukko 2).

GO analyysi havaitsi geenit koodaavat Wnt signalointia komponenttien CTNNB1 tavoitteet ja me syntyy laajennetun listan mahdollisista palautteen sääntelyviranomaisten (taulukko 3).

AXIN2, LEF1, NKD1

ja

NKD2

on kuvattu negatiivinen tai positiivinen palaute sääntelevät koulutusjakson [25], [32], [33].

WNT6

ja

WNT11

koodaavat Wnt ligandeilla, joilla on potentiaalia kasvain edistäviä rooleja vaikka CRC kanssa

APC

mutaatioita [34] ja että on kyky signaloida strooman komponenttien moduloimaan tuumorin mikroympäristössä [35]. Muita mahdollisia palaute sääntelyviranomaisten sisältävät

APCDD1

,

NOTUM, PPP1R2

, ja

ZNRF3

.

APCDD1

on raportoitu säädellä negatiivisesti reitti on ligandi-vaiheen ja sen mutaatio on vastuussa autosomaalinen dominantti hiustenlähtö tauti, perinnöllinen hypotrichosis simplex [36].

NOTUM

koodaa eritettyä α /β-hydrolaasi, joka on tunnettu antagonisoida Wnts vapauttamalla glypicans solun pinnasta [37].

PPP1R2

geenituote estää Proteiinifosfataasiin 1 kompleksi, joka säätelee phospholyration tilan GSK3 [38] ja näin ollen CTNNB1 hajoaminen [39].

ZNRF3

koodaa E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla että nimenomaan edistää ubikinaation ja hajoaminen Frizzled reseptorien [40], [41]. Kuten edellä on esitetty, olemme vahvistaneet

NOTUM

ja

PPP1R2

olevan bona fide tavoitteita CTNNB1. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että Wnt signalointia sovelletaan monimutkaisia ​​palautetta määräyksiä.

Euroopan CTNNB1 tavoite allekirjoitus on rikastunut suoliston kantasoluja ja CRC, mutta ei korreloi selviytymisen CRC potilaiden

Lgr5

+ suoliston soluja aktiivisesti pyöräily kantasoluja ja Wnt /CTNNB1 signalointireitin on kriittinen rooli heidän itseuudistumisen [2]. Siksi vertasi CTNNB1 tavoite allekirjoituksen tunnistettu tässä tutkimuksessa äskettäin raportoitu geeni allekirjoitus (joukko 510 geenejä tunnistettiin microarray-pohjainen transkription profilointi ja massaspektrometrisiä proteiini profilointi), joka on rikastettu Lgr5

+ suoliston kantasolujen [42 ]. Tilastollisesti merkittävää päällekkäisyyttä (

p

8.9e-07, esitys tekijä 4,1; verrattaessa sattuman) todettiin: 17 geenejä (~ 10%) kun CTNNB1 kohdegeenin allekirjoitus oli myös osa Lgr5

+ suoliston kantasolujen allekirjoitus (kuvio 5A, taulukko 4). GSEA on microarray tietokokonaisuus peräisin EphB2 rikastettu suoliston kantasolujen populaation ihmisen paksusuolen epiteelisolujen (GSE31257) [43] paljasti myös rikastumista 162-kohde-allekirjoitus näissä soluissa [normalisoitu Enrichment Score (NES) = 1,81, FDR

q

-arvo = 0,0; Kuvio 5B]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että suora CTNNB1 kohdegeenien SW480-solut aktivoidaan myös normaaleissa suoliston kantasoluja.

. Päällekkäisyyden CTNNB1 kohdegeenin asettaa ja Lgr5

+ suoliston kantasolujen geeniperimä.

p

arvo ja edustus tekijä korosta tilastollista merkittävyyttä verrattuna sattuman. Laskelma perustuu oletukseen, että määrä koko geenejä on 20000.

B-C

. GSEA varten 162 geenien avulla vertailutietoa välillä EphB2

korkea ihmisen suoliston kantasolujen ja EphB2

alhainen nonstem solupopulaatioiden (

B

välillä) tai paksusuolen syövän ja normaali kudosnäytteistä (

C

).

koetin merkitystä 162-kohde-allekirjoitus kliinisistä näytteistä, suoritimme GSEA geenien ilmentymisen tiedot ihmisillä paksusuolensyöpä näytettä (GSE41328) [44] . Tämä analyysi paljasti silmiinpistävä rikastusta CTNNB1 tavoite allekirjoituksen paksusuolensyöpä näytteissä verrattuna normaaliin paksusuolen kudoksiin (NES = 2,01, FDR

q

-arvo = 0,0; kuvio 5C). Käytimme myös julkisesti saatavilla geenien ilmentyminen datasarja testata onko 162-kohde-allekirjoitus voi ennustaa paksusuolen syöpäpotilaiden [45]. Huolimatta rikastuminen allekirjoituksen paksusuolensyöpä näytteissä, emme noudata mitään merkittävää korrelaatiota ilmaisee yleisesti allekirjoituksen ja taudista vapaan leikkauksen jälkeisen selviytymisen paksusuolen syöpäpotilaiden (kuvio 6A). Tämä sanoi, ilmaus useiden negatiivisen palautteen sääntelyviranomaisten että olemme määritelleet tähän työhön korreloivat paremmin tautivapaan eloonjäämisaste. Esimerkiksi potilailla, joilla on korkea keskimääräinen ilmaus

AXIN2, APCDD1, NKD1, NKD2

, ja

NOTUM

osoitti merkittävästi pidempi tautivapaa elossaolo verrattuna matalan ilmentäjänä ryhmä (kuvio 6B). Yhdessä tuloksemme osoittavat rikastuminen suorien CTNNB1 kohdegeenien suolen kantasoluja ja kliinisistä CRC näytteitä. Kuitenkin merkittävä korrelaatio ennuste CRC potilaiden on rajoitettu valita osajoukko CTNNB1 kohdegeenien, eli negatiivinen palaute tekijöitä, eikä koko kohde allekirjoituksen.

yhteensä 232 potilasta luokitellaan korkea ( punainen) tai matala ekspressoivat (sininen), joka perustuu ilmaus 162 geenien (

) tai viisi negatiivista palautetta geenejä (

AXIN2, APCDD1, NKD1, NKD2, NOTUM) B (

B

).

p

arvot laskettiin log rank analyysi.

Keskustelu

puolueeton genomin mittakaavan seulontaa CTNNB1 kohdegeenien Yhdistämällä chip kohdat ja mikrosirujen analyysit tarjoaa tärkeä resurssi paksusuolensyöpä tutkimukseen. Huolimatta merkittävä korrelaatio chromatin sitovia ja geenien ilmentymisen sääntely, työmme paljastaa pieni määrä (162) geenien suorina, toiminnallinen CTNNB1 tavoitteet SW480 paksusuolen syöpäsoluissa. Tämä määrä on huomattavasti pienempi kuin CTNNB1 sidottu loci tai CTNNB1 reagoivien geenien, mikä viittaa siihen, että kaikki sitoutuneet lokuksen toiminnallisesti hyödynnetään SW480 solujen transkription säätelyyn, ja että suuri osa muutoksia geenien ilmentyminen tapahtuu välilliset seuraukset CTNNB1 ehtyminen. Olisimme jäänyt joitakin vaatimattomasti säännellään tavoitteita vaatimalla geenin ilmentymisen muutos tapahtuu käsittelemällä kahdella eri siRNA: t ja käyttämällä tiukkoja raja-arvoja. Osa CTNNB1 sitoutuneiden lokusten voidaan säännellä asiayhteyskohtaisia ​​tavalla; Esimerkiksi geenejä, jotka ovat monikerroksisesta sääntelystä kuten vaiennetaan DNA: n metylaatio tai pääasiallisesti hallintaan muilla transkription /translaation sääntelyviranomaisten SW480 soluja ei osoittavat merkittävää laskua transkriptio upon CTNNB1 ehtyminen. On edelleen mahdollista, että tällaiset loci säädellään CTNNB1 muissa solun yhteyksissä.

Vahvistustyökalu kokeet viittaavat 80% onnistumisaste tunnistamisessa bona fide CTNNB1 tavoitteet käyttäen genomisen lähestymistapaa. Ero Knockdown tehokkuuden joukossa si /shRNAs tai off-tavoite vaikutukset si /shRNAs voi selittää ”vääriä positiivisia”. CTNNB1 tavoite allekirjoitus 162 geenien esitellään joitakin mielenkiintoisia ominaisuuksia. Silmiinpistävin on läsnäolo palautteen sääntelevät reitin. Palaute sääntely Wnt /CTNNB1 reitin on vakiintunut perustuu tutkimuksiin yksittäisten geenien [25]. Käyttämällä sarja analyysi kromatiinin käyttöaste (SACO), CTNNB1 täyttöasteen komponenttien kanoninen Wnt-signalointireitin on havaittu [11]. Meidän havainto, että Wnt kanavan komponentit yliedustettuina CTNNB1 kohde allekirjoitus lisää uusia todisteita tukemaan tätä tärkeää säätötapa. Huomattavaa on, että tutkimuksemme ja SACO tutkimuksessa [11] paljastaa pitkälti selvä Wnt-reitin geenit CTNNB1 tavoitteet: ulos 15 geenejä, jotka tunnistettiin SACO tutkimuksessa, vain 2 geenit (

AXIN2

ja

WNT11

) löytyi listalta 10 Wnt-reitin geenit (taulukko 2). Lisäksi kun verrataan toiseen CTTNB1 siruun seuraavissa tutkimuksessa käytetty HCT116-solut [12], limityksellä 161 CTNNB1 sitoutuneen geenien välillä havaittiin 988 geenien tunnistettu, että tutkimuksessa ja 2794 geenit tunnistettu nykyisessä tutkimuksessa. Vaikka päällekkäisyys on tilastollisesti merkitsevä (

p

4.8e-07), huomattavan määrän kohdegeenien oli kunkin tutkimuksen. Tämä saattaa osittain johtua ero parametriasetuksen tai mahdollisia ääniä analyysissä, mutta voisi myös heijastaa todellista eroa CTNNB1 välistä toiminnallista CRC solulinjojen (HCT116 vs. SW480) käytetään kahdessa tutkimuksessa. Todellakin, ero DNA-metylaation Wnt kohdegeenien välillä HCT116 ja SW620, imusolmuke metastaattinen variantti SW480, on raportoitu [46]. Sinänsä työmme paljastaa uusia puolia palautteen Wnt /CTNNB1 signaloinnin. Hienosäätöä Wnt signalointia lähdön useiden palautetta mekanismit voivat olla tärkeä tarkka spatiotemporal sääntelyä sen toiminnan aikana kudosta kuviointi ja ylläpito kudosten homeostaasin. Lisäksi toimintahäiriö näistä mekanismeista voidaan edistää patologisia tiloja, kuten syöpä [47].

Jo suhteellisen pieni määrä geenien 162-kohde-allekirjoitusta, niihin liittyvät toiminnalliset ehdot näyttävät määrittelemättömiä ja monipuolinen. Tämä on sopusoinnussa erilaiset biologiset vaikutukset Wnt /CTNNB1 signalointi [2]. Allekirjoitus sisältää useita transkription säätölaitteet (taulukko S1), syytetään olemassaolo toissijaisen /epäsuora transkription tavoitteet. Tunnistaminen suora CTNNB1 /TCF tavoitteet toisten [11] – [14] ja tämä työ tarjoaa puitteet leikellä suhteellinen osuus suoran ja epäsuoran tavoitteen geenejä biologisia vaikutuksia reittiin.

On laajalti tunnustettu, että vapauttaminen Wnt /CTNNB1 reitti on keskeinen aloittamisesta vaiheen suoliston tumorigeneesin [48]. Tämä vapauttaminen on ajateltu esiintyvän suoliston kantasolupopulaatiosta ruokkiva kasvaimen kasvu [5], [6]. Yhdenmukainen käsitystä, löysimme CTNNB1 tavoite allekirjoitus on merkittävästi rikastettu eristetyissä suoliston kantasolujen sekä kliinisissä CRC näytteistä. Emme kuitenkaan ole havaita merkittävä korrelaatio ilmaisu kohde allekirjoituksen ja ennusteen CRC potilailla. Tämä on mielenkiintoista, ottaen huomioon, että kohonnut ilmentyminen suoliston kantasolujen allekirjoitus ennustaa huonoon ennusteeseen CRC potilaista [46], [49] ja että vapautuminen Wnt-reitin on tunnettu tunnusmerkki CRC [50]. Se, että CTNNB1 kohdistaa allekirjoituksen sisältää useita palautteen tekijät voivat vaikeuttaa skenaario. Esimerkiksi tukahduttaminen negatiivinen palaute sääntelyviranomaisten saattaa päälle onkogeenisel- Wnt signalointi aktiivisuutta syöpäsoluissa, mutta koska nämä palaute tekijät itse ovat Wnt tavoitteiden mukaan Wnt tavoite geeniekspressiomalli ehkä tunnu korreloivan ennusteeseen. Todellakin, hiljentäminen Wnt kohde- geenien promoottori metylaation on todettu CRC huonon ennusteen [46]. Tuloksemme osoittavat, että ilmentyminen valitse negatiivista palautetta tekijöitä meidän geenistä luettelosta todellakin korreloi positiivisesti selviytymisen CRC potilaista (kuvio 6B). Sellaisissa tapauksissa, joissa negatiivinen palaute säätelijöitä koulutusjakson vaiennetaan, keskimääräinen kohdegeenin ilmentyminen voi ei vastaa todellista signalointi aktiivisuutta reitin. Siten nykyinen tutkimus ja muut [46] viittaavat siihen, että huolellinen näkökohdat kompleksin asetusten ja asiayhteys riippuvuus taataan koskien kliinistä käyttökelpoisuutta eri Wnt kohdegeenin sarjaa, jotka ovat nousseet kirjallisuudessa. Tutkimuksemme lisää kattava näkemys Wnt signalointia sääntelyn CRC, jota on tutkittu jo vuosikymmeniä, mutta vielä täysin ymmärretty.

Johtopäätös

Tuloksemme tarjoavat genominlaajuisten näkymä geenin sääntelyä Wnt /CTNNB1 signalointia CRC. Kohdegeenin analyysi paljasti useita kerroksia palautteen sääntelyn Wnt /CTNNB1 reitin. CTNNB1 suora kohdegeenin allekirjoitusta erittäin ilmaistu suoliston kantasolukkoa ja syöpäsoluja, mutta eivät osoittaneet merkittävää korrelaatiota selviytymisen CRC potilaista. Tämä tutkimus on tärkeä resurssi ymmärtää monimutkaisia ​​ja erilaiset toiminnot Wnt /CTNNB1 reitin.

Methods

Soluviljely

SW480-solut hankittiin ATCC ja ylläpidetään Dulbeccon Modified eagle Medium täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia.

Kromatiini immunosaostuksella (chip) ja suuren suorituskyvyn sekvensointi

ChIP suoritettiin protokollan Milliporesta tietyin muutoksin. SW480-soluja silloitettu ensin cocktail proteiini-proteiini crosslinkers [0,67 mM disukkinimi- sulfaatti (DSS), 0,67 mM disukkinimi- glutarate (DSG), ja 0,67 mM eteeni glycolbis (succinimidylsuccinate) (EGS)] [20] 45 minuuttia huoneenlämpötilassa, ja sitten 0,75% formaldehydi 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Pesun jälkeen, kromatiinin leikattiin osaksi ~100-300-bp fragmentit käyttäen Bioruptor (Diagenode Inc.). Lysaatit esikirkastettiin Dynabeads-proteiini A: n (Invitrogen) yksi tunti 4 ° C: ssa, ja pieniä eriä talteen supernatantti alistettiin kääntää silloittumisen ja puhdistus DNA (syöttää näytteet). Input näytteitä käytettiin konsentraation mittaamiseksi kromatiinin DNA: ta ja immunosaostus suoritettiin 25 ug DNA: ta sisältävien chromatin 4 ° C: ssa yön yli kontrolli-IgG (Santa Cruz Biotechnology, sc-2027) tai anti-CTNNB1-vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, sc-7199). Immuno-kompleksit puhdistettiin sitten Dynabeadsilla proteiini A: n ja reverse silloitettu inkuboimalla 200 mM NaCI: a 65 ° C: ssa 5 tunnin ajan. Jälkeen proteinaasi K hoito 1 tunti, ChIP DNA otettiin talteen käyttäen QIAquick PCR-puhdistuskittiä (Qiagen, 28104). Kirjasto sukupolven suoritettiin käyttäen yhdistettyä ChIP DNA-näytteet neljä itsenäistä ChIP valmisteita käyttäen Illumina protokollaa. Lyhyesti, siru DNA fragmenttien päät korjattiin ja fosforyloidun käyttäen Klenow, T4 DNA-polymeraasilla ja T4-polynukleotidikinaasia (Illumina kit komponentit). Ligaation jälkeen Illumina sovittimia, DNA koko valitaan geelipuhdistuksella ja sitten monistetaan PCR: llä käyttäen Illumina alukkeita. Sekvensointi suoritettiin Ambry Genetics koskevasta Illumina Genome Analyzer IIx, yksi kaista näytettä kohti, 36-emäsparin yksittäiseksi sekvensointi.

validointimenettelyssä suoritettiin käyttämällä ChIP-PCR: llä alukkeilla taulukossa S3.

mikrosiruanalyysi

analyysi julkaistiin aiemmin [27], ja kokeelliset yksityiskohdat ovat seuraavat. Kaksivärinen microarray oli suoritettiin kahtena kappaleena SW480 transfektoitujen solujen ohjaus (siRNA vastaan ​​lusiferaasigeeniin) ja kaksi riippumatonta siRNA vastaan ​​CTNNB1 (CTNNB1 # 1 eteenpäin, CUAUCUGUCUGCUCUAGUATT, käänteinen; UACUAGAGCAGACAGAUAGTT, CTNNB1 # 2 eteenpäin; CUGUUGGAUUGAUUCGAAATT, käänteinen, UUUCGAAUCAAUCCAACAGTT), vastaavasti. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen RNA uutettiin soluista käyttäen RNeasy-kittiä (Qiagen, Valencia, CA). cDNA syntetisoitiin Cy3 (ohjaus) ja Cy5 (CTNNB1 siRNA) merkintöjä käyttäen mukautetun automatisoitu versio aminoallyl MessageAmp II Kit (Life Technologies). Leimatut näytteet hybridisoitiin Rosetta /Merck Human 44k 1.1 mikrosiru (GPL4372) inkuboimalla 40 ° C: ssa 48 tuntia pyörivässä karusellissa. Pesun jälkeen poistaa ei-spesifisen hybridisoitiin näytteitä, mikrosiruja kuivattiin otsonia typessä kammioon. Mikrosiruja skannattiin käyttäen Agilent LP2 laserskannerin. Skanneri lähtö on Tiff-tiedosto, joka sisältää määrällisiä hybridisaation dataa kunkin yksittäisen mikrosirun. TIFF-tiedostot sitten käsitellään käyttäen Rosetta mukautettu toiminto purkuohjelmissa, joka suorittaa virhe mallinnus. Sitten aineisto käsitellään käyttäen Rosettan Resolver® järjestelmä, joka suorittaa purista operaatio, jossa yhdistyvät rinnakkaisnäytteet samassa järjestyksessä array kun hakee painofunk-. Virhe painotus koostui säätämisen lisäaineen ja multiplicative melua.