Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Okasolusyöpä pään ja kaulan (SCCHN) induktiohoitoon on seitsemänneksi yleisin syöpä maailmassa. Valitettavasti selviytymisen sairastavien potilaiden SCCHN ei ole parantunut viimeisten 40 vuoden aikana, ja näin uudet tavoitteet hoitoa tarvitaan. Äskettäin seerumin taso interleukiini 6 (IL-6) ja ilmentyminen Twist Tuumorinäytteissä todettiin olevan yhteydessä huonoon kliiniseen tulokseen useita syöpätyyppejä, mukaan lukien SCCHN. Vaikka Twist on ehdotettu mestari säätelijänä epiteelin-mesenkymaalitransitioon ja etäpesäkkeiden syöpien, mekanismeja, joilla Twist tasot ovat säänneltyjä posttranslationaalisesti ei täysin ymmärretä. Kasvaimen etenemistä on ominaista osallistuminen sytokiinien ja kasvutekijöiden ja Twist induktio on kytketty useita näistä signalointireittien, mukaan lukien IL-6. Koska monet vaikutukset IL-6 välittyvät aktivoitumisen proteiinifosforylaation cascades, tämä merkitsee sitä, että Twist ilme on alle tiukka valvonta posttranslationaalinen tasolla, jotta voidaan vastata ajoissa ulkoisiin ärsykkeisiin.

Menetelmät /Principal havainnot

Tuloksemme osoittavat, että IL-6 kasvaa Twist ilmaisun kautta transkriptio-riippumaton mekanismi monissa SCCHN solulinjoissa. Edelleen tutkimus osoitti, että IL-6 stabiloi Twist in SCCHN solulinjoissa kautta kaseiinikinaasin 2 (CK2) fosforylaatio Twist jäämien S18 ja S20, ja että tämä fosforylaatio estää hajoamista Twist. Twist fosforylaatio ei vain lisää sen vakautta vaan myös parantaa solun liikkuvuus. Siten Translaationjälkeiset modulaatio Twist edistää sen kasvain edistäviä ominaisuuksia.

Johtopäätökset /merkitys

Tutkimuksemme osoittaa Twist ilmaisua voidaan säädellä posttranslationaalinen tasolla fosforylaation CK2, joka lisää Twist vakautta vastauksena IL-6 stimulaatiota. Meidän havainnot eivät ainoastaan ​​tarjoa uusia mekanistinen oivalluksia translaation jälkeisen sääntelyn Twist vaan myös siihen, että CK2 voi olla kannattava terapeuttinen tavoite SCCHN.

Citation: Su YW, Xie TX, Sano D, Myers JN (2011 ) IL-6 Stabiloi Twist ja parantaa kasvain solun liikkuvuus pään ja kaulan Syöpäsolut kautta aktivointi Kaseiinikinaasi 2. PLoS ONE 6 (4): e19412. doi: 10,1371 /journal.pone.0019412

Editor: Torbjörn Ramqvist, Karolinska Institutet, Ruotsi

vastaanotettu: 22 joulukuu 2010; Hyväksytty: 31 maaliskuu 2011; Julkaistu: 29 huhtikuu 2011

Copyright: © 2011 Su et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Teksasin yliopiston MD Anderson Cancer Center SPORE pään ja kaulan syöpä avustuksen P50 CA097007, National Institutes of Health Cancer Centerin Support apurahan CA016672, ja Pantheon ja The Broudy ”Sitoutuminen Cure” perustukset. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Okasolusyöpä pään ja kaulan (SCCHN) induktiohoitoon on seitsemänneksi yleisin syöpä maailmassa [1]. Huolimatta parannuksista kirurgisen ja sädehoidon tekniikoita, 5 vuoden pysyvyys ei ole parantunut merkittävästi viime vuosikymmenten ja edelleen 50-55%. Vaikka paikallisen uusiutumisen ja kaulan imusolmukemetastaaseja muodostavat suurimman osan kuolemista tähän sairauteen, vain 10-20% potilaista hyötyy integraation systeemisen kemoterapeuttisen hoidon, niukasti parantunut selviytymistä ja merkittäviä myrkyllisiä vaikutuksia [2], [3]. Siksi uudet tavoitteet hoitoa tarvitaan.

Äskettäin yliekspressio Twist kliinisissä Tuumorinäytteet havaittiin korreloivan metastaasin ja heikkoon ennusteeseen potilailla, joilla on SCCHN sekä muissa syövissä [4] – [7] . Twist on erittäin konservoitunut perus-helix-loop-helix transkriptiotekijä, jolla on tärkeä rooli helpottaa solun liikkeen kehittämisessä alkioita. Syöpäsoluissa, Twist pidetään onkogeenin, koska sen kohonnut ilmentyminen edistää taudin etenemistä ja etäpesäkkeiden indusoimalla epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) [8].

Huolimatta sen merkitys syövän etenemiseen, transkription jälkeisiin sääntely Twist ei ymmärretä hyvin

vertaileva analyysi Twist mRNA ja Twist proteiinin ilmentyminen hiiren alkioiden osoitti runsas Twist RNA ilmentymistä presomitic Mesodermi, epiteelin somiitit, ja aikaisemmat mesodermi, mutta ei Twist proteiini voisi löytyä kyseisten kudosten [9]. Ero oli myös huomattava aikana hiiren alkion kehitystä, kuten Twist RNA suurimmalla voimakkuudella 7,0 vuorokautta yhdynnänjälkeisen vaikka ei Twist proteiini löytynyt ennen 8,25 vuorokautta yhdynnänjälkeisen. Puute välistä yhdenmukaisuutta Twist mRNA ilmaisun ja Twist proteiinin ilmentyminen osoittaa, että kierre ilmaisu kontrolloidaan transkription jälkeisellä tasolla [9]. Transkription jälkeinen modifikaatio transkription tekijöitä, kuten fosforylaation ja ubikitinaatio, on osoitettu olevan tärkeä niiden toiminnan, koska se antaa käyttöön mekanismin, jolla solu voi nopeasti aloittaa transkription ohjelmia vasteena ulkoisille ärsykkeille. Esimerkiksi on raportoitu, että kierre voi hajota läpi ubikitiini /proteasomin hajoamisreitit, koska hoito proteasomi-inhibiittori inhiboi hajoamista Twist [10]. On myös todisteita siitä, että funktio Twist voidaan moduloida fosforylaatio [11], [12]. Koska fosforylaatio on usein osallisena säätelyssä proteiinin n ubikitiini /proteasomin riippuvaa hajoamista [13], me arveltu, että fosforylaatio Twist kasvattaa vakautta lisäämällä sen suhteellinen ekspressiotaso.

SCCHN kasvaimen kehittymisen ja etenemisen tiedetään vaikuttaa useiden kasvutekijöiden ja sytokiinien merkinanto tekijöistä, mukaan lukien interleukiini 6 (IL-6) [14] – [17]. Vuonna SCCHN potilailla, seerumin IL-6 taso korreloi huonon säilymisen ja epäsuotuisa kliiniseen tulokseen [14], [15], [18]. IL-6, joka on tuotettu joko infiltroituvien immuunisolujen tai kasvainsoluja, ei vain selviytymisen signaaleja syöpäsoluja, vaan helpottaa myös motiliteettia syöpäsolujen kautta EMT [19], [20]. Perinteinen IL-6-signalointireitin kautta sitova sIL-6-reseptori (gp80), joka indusoi dimeroitumisesta gp130 ja myöhemmän aktivoinnin joko Janus-kinaasien (JAK) /STST3 on transkriptiosta riippuvan tavalla tai Ras-MAPK ja PI3K /Akt-reitin [21]. Lisäksi kanoninen polkuja, kaseiinikinaasin 2 (CK2) on myös äskettäin raportoitu alavirtaan IL-6 signalointi syövän [22].

CK2 on erittäin konservoitunut ja ekspressoituvat seriini /treoniini-kinaasi, joka koostuu kahden katalyyttinen (α tai α ’) ja kaksi β säätelyalayksiköt [23]. Tärkeys CK2 alayksiköiden voidaan osoittaa geneettinen tutkimukset osoittavat, että hiiret puuttuu CK2α tai CK2β ovat alkion tappava kun CK2 α ’hiirten oli puutteita vain spermatogeneesin [24] – [26]. CK2 on viime aikoina pidettävä ”master kinaasi”, koska se ohjaa toimintaa monien muiden kinaasien ja on mukana monissa tärkeissä solun prosesseja [27]. Esimerkiksi CK2 ohjaa vakautta IκBα ja PML tuumorisuppressoriproteiinia kautta fosforylaation ja muuttamista niiden ubikitiinipromoottori /proteasomin hajoaminen [28], [29]. CK2 on raportoitu olevan yli-ilmentyneen ja korreloivan huono säilyminen monissa kasvaintyypeissä, kuten SCCHN [30] – [32]. Perinteisesti, CK2 pidetään konstitutiivisesti aktiivisia proteiinikinaasi, mutta useat tutkimukset ovat osoittaneet, että CK2 voi vastata monia kasvutekijä ärsykkeisiin, mukaan lukien IL-6 [22], [33], vaikka mekanismeja sen aktivoitumisen pysyvät suurelta osin epäselviä [34 ].

on raportoitu, että STAT3, suuret alavirran signaalin IL-6-reitin, voi transkriptionaalisesti aktivoida ilmentymistä Twist [35], [36]. Alustavien tiedot osoittivat kuitenkin, että Twist-proteiinin ekspressio lisääntyi IL-6 ennen säätelyä Twist mRNA useita aggressiivinen SCCHN solulinjoissa, mikä viittaa transkription-riippumaton sääntely Twist IL-6. Koska monet vaikutukset IL-6 välittyvät aktivoitumisen proteiinifosforylaation laskeutuu [21], ja alustan fosforylaatio on usein osallisena säätelyyn proteiinin n ubikitiini /proteasomin riippuvaa hajoamista [37], me olettaisi, että Twist ilmentymistä säädellään IL-6-aktivoitua fosforylaation.

tässä tutkimuksessa osoitamme, että hoito SCCHN solulinjojen kanssa IL-6 johtaa vakauttamiseen Twist proteiinia. Lisätutkimukset osoittivat, että IL-6 stimuloi Twist fosforylaatiota aktivoimalla CK2 seriini /treoniini proteiinikinaasi. Meidän havainnot paitsi aikaansaada uusi mekanistinen näkemys, että Twist aktivoidaan kautta fosforylaation CK2 kinaasin vaan myös merkittäviä vaikutuksia ennustettavuutta sekä Pään ja kaulan alueen syöpä.

Tulokset

Twist ilme ylössäädellään pian sen jälkeen IL-6-hoidon

Useimmat SCCHN ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solulinjat erittävät IL-6 ja ilmaista reseptorit IL-6 (Taulukko S1 ja kuvio S1) [38]. Tutkia vaikutus IL-6 näillä solulinjoilla, Twist ilmentyminen tutkittiin pitkin aika hoitojakso. Western blotit edustavien solulinjoja on esitetty kuviossa 1A. Twist ilmentyminen indusoitiin näissä soluissa 15 minuutin kuluessa käsittelyn jälkeen IL-6. Sen sijaan Twist mRNA-tasot pysyivät muuttumattomina yli samanlainen hoitojakson aikana (kuvio 1 B). Nämä tiedot osoittavat, että Twist ilmentymistä säätelee IL-6 transkription jälkeisellä tasolla.

(A) Twist-proteiinin ilmentyminen indusoitiin pian sen jälkeen IL-6-hoidon SCCHN soluissa (OSC-19, HN31) ja keuhkosyöpä (A549). Jälkeen seerumistarvaatio yön yli, solut altistettiin IL-6 hoitoa (20 ng /ml 0-4 h), ja Twist ilmentyminen solulysaateista analysoitiin western-blotilla. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (B) Twist mRNA: n ilmentymisen kuin sen määrä reaaliaikaisella RT-PCR pysyivät pääosin ennallaan koko IL-6 hoito (0-6 tuntia). Arvot normalisoitiin ilmentymistasojen housekeeping-geenin

GAPDH

, ja ne ilmoitetaan keskiarvona kertainen muutos lähtötasosta ± s.e.m. Kunakin ajankohtana kahdesta neljä rinnakkaista tehtiin. Kaikki kokeet tehtiin kahtena kunkin solulinjan. Data edustavasta kokeesta OSC-19 SCCHN solut näkyvät. (C) Twist hajoaminen estyi joko MG132 tai IL-6. Jälkeen OSC-19 SCCHN soluja käsiteltiin CHX (100 uM), CHX plus proteasomin inhibiittoria MG132 (10 uM), tai CHX plus IL-6 (20 ng /ml) 0-4 tunnin ajan, Twist ilmentyminen määritettiin western blot. (D) pikseliä kullakin kaistalla (C) mitattiin Image J ja normalisoitu siten, että pikselien määrä hetkellä 0 oli 100%. Tiedot piirrettiin log

10 suhteellisen pikselimäärä (y-akseli) versus aika (min). Puoliintumisaika määritettiin log 50% suhteellisessa pikselimäärä. Puoliintumisaika Twist oli 1,2 tuntia, kun läsnä on CHX yksin ja 4 h, kun läsnä on CHX + IL-6.

Tämä havainto, että IL-6 ylössäätelee Twist ilmaisun jälkeinen kopiointia johti meidät tutkimaan, onko hajoaminen Twist oli puolestaan ​​moduloi IL-6 hoitoa. Heikentyä Twist in SCCHN soluissa tutkittiin käsittelemällä inhibiittorin sykloheksimidin (CHX) yksin, CHX plus proteasomin estäjä MG132 tai CHX plus IL-6. Proteiinin määrä kussakin aikapisteessä määritettiin western blot ja kvantitoitiin densitometrialla. Kuten kuvioissa 1C ja 1D, endogeenisen Twist oli 1,2-h puoliintumisaika, mutta kun joko IL-6 tai MG132 lisättiin, vähemmän Twist oli hajonnut ja se ei saavuttanut puoliintumisaika 4-h hoitojakso . Tiedot ovat yhdenmukaisia ​​aiemman tutkimus, jonka kierre proteiini hajoaa läpi proteasomista tuhoamisjärjestelmällä [10] ja osoittavat, että Twist proteiini stabiloidaan posttranslationaalisesti estämällä sen hajoamista IL-6.

Twist fosforyloidaan vasteena IL-6 hoitoa, ja CK2 löytyy reitin välillä IL-6 ja Twist

Koska IL-6 on osoitettu aktivoivan useita solun signalointireittien kautta proteiinikinaasi kaskadeja, me seuraava tutkittava, onko Twist fosforyloituu vasteena IL-6 hoitoa. Solut, jotka on transfektoitu plasmidilla, joka koodaa hemagglutiniini (HA) -Twist fuusioproteiinia käsiteltiin IL-6; myöhemmin immunosaostuksella HA vasta-aineen ja western-blottauksella käyttämällä epäspesifistä fosfoseriini vasta-aineen paljasti fosforylaatio lisääntyy seriini /treoniinitähteisiin Twist (kuvio 2A), joka vahvistaa, että Twist fosforyloituu vasteena IL-6 stimulaation.

(A ) Twist fosforyloitiin vastauksena IL-6 hoitoa. OSC-19 SCCHN-solut transfektoitiin joko HA-Twist plasmidi- tai kontrollivektori 48 h, sitten käsiteltiin IL-6 (20 ng /ml) 30 min; käsitellyn ja käsittelemättömän solulysaatit immunosaostettiin HA-vasta-aineella ja analysoitiin western blot käyttämällä epäspesifistä fosfoseriini vasta-aine. (B) estäjät tunnettujen alavirran polut IL-6 eivät kyenneet inhiboimaan Twist ilmentymisen lisääntyminen IL-6. OSC-19 SCCHN soluja esikäsiteltiin ilmoitettu estäjät tai dimetyylisulfoksidia (DMSO; kontrolli) 1 tunnin ajan, sitten käsiteltiin IL-6 (20 ng /ml) 30 minuutin ajan. Twist ilmentyminen määritettiin western blot. (C) CK2 fosforylaatiokohdan (SNSE) Twist, ennustaa käyttämällä https://scansite.mit.edu/motifscan_seq.phtml, on säilynyt eri lajeissa. (D) CK2 aktiivisuus lisääntyi IL-6 ja estävät CK2 estäjä DMAT sisään SCCHN soluissa. Jälkeen seerumistarvaatio yön yli, lysaatit HN31 soluja käsiteltiin PBS: llä (kontrolli), IL-6 (20 ng /ml, 30 min), tai IL-6 plus DMAT (10 uM) kerättiin. Endogeeninen CK2 aktiivisuus solulysaateista (5 ug) mitattiin käyttäen synteettistä peptidiä CK2 substraattia (RRRADDSDDDDD; 0,1 mM) ja γ-

32P-ATP fosfaatin luovuttaja, kuten aiemmin on kuvattu [49]. Y-akseli edustaa määrä per minuutti (CPM) radioaktiivisuudesta normalisoinnin jälkeen on ei-alustan ohjaus. *

P

0,05 Student

t

-testi. (E) IL-6-indusoidun Twist ilmentyminen estyi CK2 inhibiittorit. Twist ilmentyminen mitattiin käsittelyn jälkeen IL-6 (30 min) lysaateissa OSC-19 SCCHN tai A549 keuhkosyövän soluja aiemmin inkuboitiin CK2 estäjät DMAT tai TBB (1 h). Twist ekspressio inhiboitui alhaisilla annoksilla kuin 0,8 uM, ja ei rajoitu tiettyyn solulinjaan. (F) Knockdown katalyyttisen alayksikön CK2 (CK2α) by shRNA estivät Twist proteiinin ilmentymisen. Knockdovvn CK2α in OSC-19 SCCHN soluja 24 h vähensi Twist ilmaisun ja estänyt sen induktio IL-6 hoitoa (20 ng /ml, 30 min).

Tunnistaa kinaasi vastuussa IL-6-indusoitua fosforylaatiota Twist, käytimme kemiallisen inhibiittorin seulonta strategia määrittää, onko IL-6-välitteinen Twist säätelyä voidaan estää estäjät tiedetään olevan alavirtaan signalointireitin. Kierre on voimistunut IL-6, vaikka soveltamisen estäjien estää JAK (AG490), PI-3K (Wortmanniini), Erk (U0126), p38 MAPK (SB202130), tai kesäkuu

N

-terminaalisen kinaasin (SP600125) osoittaa, että Twist upregulation on riippumaton näistä reiteistä (kuvio 2B). Koska yksikään tunnetuista polkuja, jotka testasimme näytti välittämisessä osallisena IL-6-indusoidun Twist ilmaisun, seuraavan kerran skannattu aminohapposekvenssin laskennallinen proteiinin perheen ennustaminen palvelimelle https://scansite.mit.edu/motifscan_seq.phtml ja yksilöitiin CK2 alustan konsensus motiivi (SNSE) sisällä Twist tähteissä 18 kautta 21, joka on konservoitunut lajien välillä (kuvio 2C).

CK2 on seriini /treoniini-kinaasi; lisäämällä viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että se voi olla tärkeä rooli etenemistä SCCHN [32], [39]. Se oli aiemmin pidetty konstitutiivisesti aktiivinen solunsisäinen kinaasi, mutta useat viimeaikaiset havainnot ovat osoittaneet, että CK2 voidaan aktivoida vasteena ulkoisille ärsykkeille, kuten IL-6, vaikka taustalla olevien mekanismien tätä aktivointia edelleen epäselviä [22], [34]. Yhdenmukaisesti aiempien tutkimusten, CK2 aktiivisuus SCCHN solulysaateista on voimistunut IL-6 ja inhiboi CK2-spesifinen estäjä 2-dimetyyliamino-4, 5, 6, 7-tetrabromi-1 H-bentsimidatsoli (DMAT), joka määritetään CK2 kinaasiaktiivisuuden määritys, joka käyttää synteettistä CK2 substraattipeptidi ja γ-

32P-ATP fosfaatin luovuttajan (kuvio 2D).

osoittavat lisäksi, että CK2 on polku välillä IL-6 ja Twist, tutkimme seuraavaksi Twist ilmentymisen läsnä ollessa IL-6 ja CK2 inhibiittorit DMAT tai 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole (TBB). Kuten on esitetty kuviossa 2E, IL-6-indusoidun Twist ilmentyminen estyi joko CK2 estäjä, ja tämä inhibitio havaittiin eri solulinjoissa. Vaikutukset CK2 on IL-6-indusoidun Twist ilmentyminen varmistettiin edelleen pudotus katalyyttisen alayksikön CK2α in SCCHN solulinjoissa, jossa sekä pohjapinta tasot Twist ilmaisun ja ne, sen jälkeen IL-6-hoito pienensi (kuvio 2F). Yhdessä nämä tiedot vahvistavat edelleen, että on tärkeää CK2 IL-6 aiheuttama vakauttaminen Twist.

CK2 kumppaniaan, fosforyloi ja vakauttaa Twist

seuraava tutki CK2 ja Twist ovat liittyvät toisiinsa käyttämällä ko- immunosaostusilmentymät. Ensin käytetään lysaatit valmistettiin HEK 293T-solut, jotka oli transfektoitu sekä villityypin Myc-Twist ja CK2α. Kuten kuviossa 3A on esitetty, CK2α havaittiin Western blot immunopresipitaateista suoritettiin Myc-vasta-aineen ja Myc-Twist havaittiin Western-blotit immunopresipitaateista suoritetaan CK2α vasta-aineella. Ohjaus immunosaostaa käyttäen epäspesifisiä IgG ei saostunut myöskään proteiinia. Tiedot viittaavat siihen, että proteiinit voivat olla vuorovaikutuksessa toistensa kanssa. Tutkia edelleen vuorovaikutusta endogeenisen CK2α ja Twist proteiinia SCCHN solujen Fadu solulinja valittiin, koska se ilmaisee korkeaa pohjapinta taso CK2 proteiinia; HN31 SCCHN soluja, jotka stabiilisti ilmentävät Myc-merkittyjen Twist (HN31 Myc-Twist SCCHN solut) perustettiin Immuunisaostukseen varten heikon suorituskyvyn kaupallisesti saatavilla Twist vasta-aineita. Kuten kuviossa 3B on esitetty, endogeeninen Twist Fadu SCCHN soluissa oli mukana immunosaostettiin anti-CK2α vasta-aine. In HN31 Myc-Twist SCCHN soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti Myc-merkityn Twist, endogeeninen CK2α oli myös kerasaostuvat anti-Myc-immunosaostumissa. Nämä tulokset tukevat hypoteesia, että CK2 voi säädellä Twist osoittamalla, että nämä kaksi proteiinia fyysisesti liittää toisiinsa.

(A) (B) Kaksisuuntainen samanaikainen immunosaostus osoitti, että CK2α liittyy Twist. (A) Co-immunosaostus tehtiin lysaatit HEK 293T-solut, jotka oli transfektoitu sekä WT Myc-Twist ja CK2α. CK2α oli co-immunosaostettiin Myc-Twist ja päinvastoin. (B) Solulysaatit Fadu (vasen) tai HN31 soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti WT Myc-Twist (oikealla), immunosaostettiin CK2α (in Fadu solut) tai Myc-vasta-ainetta (in HN31 WT Myc-Twist-solut) ja alistettiin western blot-analyysi. Endogeeninen Twist on co-immunosaostettiin CK2α in Fadu solujen lysaatit, ja endogeenisen CK2α havaittiin Myc-immunosaostumissa HN31 Myc-WT Twist solulysaateista. (C) Co-immunosaostettiin CK2α on HN31 Myc-Twist immunosaostumissa kasvoi IL-6 (20 ng /ml, 20 min) ja estää esikäsittelemällä vasta-aine IL-6-reseptorin, tosilitsumabi (50 ng /ml, 45 min). (D) CK2 fosforyloitua Twist. Immunoyhdistelmän kinaasianalyysiä suoritettiin Myc-immunopresipitaateista HEK 293T solulysaateista ohimenevästi yli-ilmentävät WT Myc-Twist tai Myc -S18,20A Twist. Rekombinantti CK2 kinaasin ja γ-

32P-ATP lisättiin immunosaostumat 30 ° C: ssa 15 min, ja reaktio pysäytettiin lisäämällä SDS-näytepuskuria ja kuumentamalla 95 ° C: ssa 5-10 min. Sitten näytteet suoritettiin elektroforeesi ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi kalvon autoradiografialla tai Western blot -analyysillä. (E) stabiilisuutta Twist vaikuttivat sivuston CK2 fosforylaation. [HN31 SCCHN soluista jotka ilmentävät pysyvästi WT Myc-kierouden CK2 hypophosphomimetic mutantti Myc-S18,20A Twist, tai fosforylaatio jäljittelevää mutantti Myc-S18,20D Twist olivat käsitelty CHX (100 uM) varten osoitettu kertaa. Myc-Twist ilmentymistä solulysaateista määritettiin western blot. Tulokset edustavat yksi kolmesta itsenäisestä kokeesta. Laskettu puoliintumisaika (t1 /2) päässä rinnakkaisessa kokeessa ilmaistaan ​​keskiarvona ± s.e.m. *

P

0,05 Student

t

-testissä.

tutkia vuorovaikutusta Twist ja CK2α on IL-6 riippuvainen, yhteis- immunosaostus toistettiin Myc-Twist-vakaa solulinjasta HN31 lyhytaikaisessa hoidon IL-6 (20 min). Koska HN31 ilmentää suuria määriä endogeenista IL-6 (taulukko S1), joka on monoklonaalinen vasta-aine IL-6-reseptoria, tosilitsumabi, käytettiin tutkimaan niiden vuorovaikutusta mukaisesti esto IL-6-signalointia. Kuten kuviossa 3C, lisääntynyt CK2α oli yhteistyössä immunosaostettiin Myc-Twist jälkeen IL-6 hoitoa, mutta ei löytynyt Immunosaostumien soluista esikäsitelty tosilitsumabihoitoon 45 minuuttia.

Voit selvittää CK2 fosforyloi Twist at jäämät S18 /S20, oletetun fosforylaatiokohdan meidän laskennallinen ennuste, teimme immunoyhdistelmän -kinaasimäärityksessä HEK 293T-soluissa yli-ilmentävät joko villin tyypin (WT) Myc-Twist tai mutantti Myc-Twist jossa S18 ja S20 on korvattu alaniinilla ( S18,20A Twist). Puhdistettu CK2 kinaasi fosforyloituu WT Twist, mutta fosforylaatio lakkautettiin läsnä ollessa CK2 estäjän DMAT ja voimakkaasti vähennetty mutatoitunut S18,20A Twist (kuvio 3D).

Voit testata, onko vakaus Twist vaikuttaa sivusto fosforylaation, vakaa HN31 solut yli-ilmentävät WT Twist, S18,20A Twist tai fosforylaatio matkivat jossa S18 ja S20 mutatoidaan asparagiinihappoa (S18,20D Twist) perustettiin. Sen jälkeen käsittelemällä soluja CHX, lasketun puoliintumisajat S18,20D Twist, S18,20A Twist, ja WT Twist kolmen kokeissa oli 9,62 ± 0,99 h S18,20D Twist, 2,45 ± 0,59 h S18,20A Twist ja 4,69 ± 0,73 h WT Twist (kuvio 3E). Kaikki

P

arvot vertailuvälineet mistä tahansa kahden ryhmän Student

t

-testi oli alle 0,05. Tämä tukee oletusta, että fosforylaatiota Twist mukaan CK2 lisää Twist vakautta. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että CK2 assosioituu ja fosforyloi Twist, ja että fosforylaation S18 ja S20 vakauttaa Twist.

CK2 ja Twist osallistuvat IL-6-edistänyt soluliikkuvuus

seuraavaksi tutkinut, mitä vaikutuksia IL-6, CK2 esto, ja Twist knockdown on SCCHN solun liikkuvuus, mitattuna haavan paranemista ja Boyden-kammion muuttoliike määrityksissä. Kuten kuvioissa 4A ja 4B, migraation OSC-19 SCCHN soluja 12-h haavan paranemista scratch määritys edistettiin IL-6 ja tukahdutti CK2 estäjä DMAT, kun taas suhteellinen leviämisen määrä jokaisessa ryhmässä tehtiin no Merkittävin muutos (kuvio 4C). Knockdown Twist in OSC-19 solujen syvästi tukahdutetaan solun liikkuvuus, mikä osoittaa sen tärkeä rooli solujen vaeltamiseen (kuvio 5A, yläpaneeli). Käsittelyn jälkeen IL-6: ssa 24 tuntia, muuttoliike nostettiin, mutta tämä kasvu kääntyi vuonna Twist pudotus ryhmiin (kuvio 5A, keskimmäinen paneeli). IL-6-edistänyt solumigraatio estyi CK2 estäjä sekä knockdovvn Twist, mikä viittaa siihen, että molemmat CK2 ja Twist ovat sekaantuneet signaali muuttoliikkeelle. Me seuraavaksi verrataan motiliteettia solulinjojen stabiilisti ilmentävät WT tai mutantti Twist

in vitro

. Vaikka taustalla korkean endogeenisen IL-6 eritystä ja olemassaoloa endogeenisen Twist HN31 SCCHN soluissa, yli-ilmentyminen WT, mutta ei S18,20A, Twist edistää solumigraatiota suhteessa kontrolliin (kuvio 5B, ylempi paneeli;

P

0,05). Lisäksi yli-ilmentyminen S18,20D Twist entisestään soluliikkuvuus että verrattuna soluihin, jotka ilmentävät joko WT tai S18,20A Twist, mikä viittaa siihen, että tämä mutaatio johtaa tehostetun solun liikkuvuus.

(A) Kuvien SCCHN solujen vaeltamiseen by arpeutumisprosessit määrityksessä esitetään. OSC-19 SCCHN soluja käsiteltiin PBS: llä (kontrolli), IL-6 (20 ng /ml), DMAT (20 uM) tai sekä IL-6 ja DMAT 2% väliaineessa, kuten on ilmoitettu. Konfluenttien yksisoluiset kerrokset haavoittui raaputtamalla 200 ui pipetin kärki. Kuvia naarmuja hankittiin 0 ja 12 tuntia. (B) määrälliset mittaukset suhteellisen siirretyn etäisyyden analysoitiin Image J. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± s.e.m. suhteellisen siirretyn etäisyyden. *

P

0,05 Student

t

-testi. (C) Solulisääntyminen korko kunkin ehdon (A) mitattiin MTT: llä 12 tuntia. Erot ryhmien ei ole tilastollista merkitystä.

(A) knockdovvn Twist esti SCCHN soluvaelluksen Boydenin kammioon migraatiokokeessa. OSC-19 SCCHN solut transfektoitiin ensin kontrollivektorilla tai Twist shRNAs 24 tuntia väliaineessa tai ilman IL-6 (20 ng /ml). Sitten solut altistettiin trypsinoimalla, lasketaan, ja niistä määritettiin solun liikkuvuus käyttäen Boyd kammion migraatiokokeessa 20 h kuluttua. Ylä keskimmäinen paneeli: tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± s.e.m. solun laskee neljästä eri pienempi teho kenttä mikroskooppisen näkemyksiä. *

P

0,05 Student

t

-testi. Alempi paneeli: Twist lauseke vastaavan kokeita ylä- ja keskimmäinen paneeli havaittiin Western blot. p-aktiini käytettiin latauskontrollina. (B) mutaatio Twist muuttunut migraation SCCHN soluja. Motiliteettia HN31 SCCHN soluista jotka ilmentävät pysyvästi WT Myc-Twist tai osoitti mutantti Myc-Twist tutkittiin proteiinin kanssa Boyden kammion migraatiokokeessa kuluttua 20 h. Ylempi paneeli: tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± s.e.m. solun laskee neljästä eri pienempi teho kenttä mikroskooppisen näkemyksiä. *

P

0,05 Student

t

-testi. Middle paneeli: edustavat kuvat siirrettyjä soluja vastaavasta siirtokuoppaan kalvoja alhaisella teholla kentän suurennus. Alempi paneeli: western blotit vastaavan kokeita ylähavaksessa (B). p-aktiini käytettiin latauskontrollina. (C) Solujen lisääntyminen kunkin ehdon (B), kuten MTT-määrityksellä mitattuna 20 tuntia. Erot ryhmien ei ole tilastollista merkitystä.

Keskustelu

Tämä raportti osoittaa uusi translaation jälkeistä phosphoregulation Twist IL-6 aktivoimalla CK2 in SCCHN soluissa. Tämä translaation jälkeinen modifikaatio voi vakauttaa Twist, jolloin se voi säädellä solun liikkuvuus, todisteeksi uuden mekanismin Twist sääntelyä syöpäsoluissa.

Julkaistu raportit ovat sekaantuneet sekä Twist ja IL-6 kehittämisen /etenemistä syövän, koska niiden ilmaukset ovat havaittavissa monissa epiteelikasvaimissa tai potilaiden seerumista ja liittyy epäedullinen hoitotuloksia [4], [16], [18]. Vaikka se on raportoitu, että IL-6 ja sen loppupään signaali välittäjänä STAT3, voi lisätä Twist ilmaisun transkription rintasyövän solulinjoissa [20], [35], [36], tämä ei sulje pois mekanismia posttranslationaalisten muutos Twist ilmaisua. Kuten on esitetty kuviossa 2B, Twist-ilmennys indusoituu pian sen jälkeen IL-6-hoito huolimatta inhibitio fosfo-STAT3 kemiallisen inhibiittorin AG490 tai SB202130 suuremmilla annoksilla, mikä osoittaa, että Twist ylösajon on STAT3 riippumaton. Kuten on esitetty kuvioissa 1A ja 1B, Twist-proteiinin ekspressio lisääntyi merkittävästi ennen muutoksia Twist mRNA: n ekspression SCCHN solulinjoissa. Nämä havainnot eivät ole ristiriidassa kuin aiemman tutkimuksen Lo

et al

[36], jossa Twist proteiinia indusoitiin 1 h kuluttua aktivoinnin EGFR-fosfo-STAT3 koulutusjakson aikana Twist mRNA lisääntyi vasta 2 h hoito. Vaikka sitä ei ole käsitelty aiempaa työtä, ristiriita Twist mRNA ja proteiinin ilmentyminen meidän tutkimus osoittaa, että kyseessä on transkription jälkeinen sääntelymekanismiin eri solulinjoissa.

Tuloksemme osoittavat, että kierre proteiini voi olla fosforyloitua ja stabiloi IL-6 SCCHN solulinjoissa, tukee käsitettä, että phosphoregulation transkription tekijöitä käytetään usein useiden solun signalointireittien ajoissa vasteena ulkoisille ärsykkeille [37]. Vaikka Twist phosphoregulation on kuvattu tutkimuksissa Twist mutaatioita potilailla, joilla Sæthre-Chotzen syndrooma, autosomaalinen hallitseva häiriö craniosynostosis [11], rooli phosphoregulation Twist syöpäsoluissa, tietojemme mukaan on käsitelty vain muutamassa tutkimuksissa [12], [40]. CK2 fosforylaatiokohdan (S18 ja S20) tunnistettu tässä tutkimuksessa on sijaittava NSEEE aihe, yksi viidestä evoluutiossa konservoituneiden domeenien Twist aminohapposekvenssissä, jonka tehtävänä on epäselvä [41]. Meidän havainto saattaa auttaa ymmärtämään paremmin tämän verkkotunnuksen, koska CK2 on yhdistetty moniin kasvutekijän tai sytokiinin reittejä, kuten IL-6 ja epidermaalisen kasvutekijän (EGF), jossa Twist on mukana [20], [22], [ ,,,0],33], [36].

Mielenkiintoista, nämä tekijät ovat myös hyvin tunnettuja vaikuttaa tuumorigeneesiin ja etenemisen SCCHN [16]. Analysoimme transkription jälkeisen sääntelyn Twist vastauksena muihin SCCHN-asiaan sytokiinien /kasvutekijöitä ja totesi, että toiminta vakauttaa Twist ei rajoitu IL-6. Muita tärkeitä kasvutekijöitä SCCHN, kuten EGF ja endoteelikasvutekijä C, myös vakauttaa Twist tasoilla [Kuva S2]. Tämä viittaa siihen, että yhteinen mekanismi voi osallistua sääntelyn Twist in SCCHN, ja että se voi olla mielenkiintoista tietää roolia CK2 näissä signalointireittejä.

mekanismi, jonka avulla CK2 aktivoituu edelleen epäselvä [34] . Vaikka on osoitettu, että CK2 aktivaatio on Erk-riippuvainen neuroblastoomasoluja [33], farmakologinen esto Erk kanssa U0126 meidän tutkimuksessa ei estä IL-6-välitteinen kasvu Twist ilmentyminen (kuvio 2B). Tämä viittaa siihen, että voi olla solu välittäjiä muu kuin Erk, jotka voivat aktivoida CK2. Onko tämä solutyyppi erityistarpeita on tutkittava lisää.

Etäpesäke on merkittävä uhka terveydelle ja selviytymistä syöpäpotilaiden ja sen johdon haastava terveydenhuollon ammattilaisille. Koska Twist pidetään mestari säätelijänä EMT ja etäpesäkkeiden syöpien [8], downregulation Twist syöpäsoluissa on ehdotettu lupaava terapeuttinen lähestymistapa, koska se ei ainoastaan ​​herkistää soluja kemoterapiaa ja edistää solujen apoptoosin, mutta myös estää solujen ”vaeltavat ja invasiivisia kyvyt [33], [42].