Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

kaempferol on ehdotettu mahdollisena lääkkeenä syövän kemopreventiossa ja hoitoa, koska se on luonnollinen polyphenol sisältämän kasvipohjaisia ​​elintarvikkeita. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että kaempferol suojaa sydän- ja verisuonitautien ja syövän. Tähän havaintoon perustuen olemme tutkineet mekanismeja, joilla kaempferol tuottaa antimetastaattisia vaikutus ihmisen kielen levyepiteelikarsinooma SCC4 soluja.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tässä tutkimuksessa tarjosimme molekyyli- todisteet liittyvät antimetastaattisia vaikutus kaempferol osoittamalla huomattavan tukahduttaminen SCC4 solumigraation ja invaasiota. Tämä vaikutus liittyy heikentynyt ilmauksia MMP-2 ja TIMP-2: n mRNA ja proteiini tasoilla. Analyysi kopioinnin säätely osoitti, että kaempferol esti MMP-2-transkription tukahduttamalla c-Jun aktiivisuutta. Kaempferol myös tuottanut estävä vaikutus fosforylaation ERK1 /2.

Johtopäätökset

Nämä havainnot tarjoavat uusia näkökulmia molekyylitason mekanismeja anti-metastaattisen vaikutusta kaempferol, ja ovat arvokkaita ehkäisyyn suun syövän etäpesäkkeiden.

Citation: Lin CW, Chen PN, Chen MK, Yang WE, Tang CH, Yang SF, et ai. (2013) kaempferol Vähentää matriksimetalloproteinaasi-2 Expression by alaspäin säätäminen ERK1 /2 ja Activator Protein-1 signaalireaktioteissä Oral Cancer Cells. PLoS ONE 8 (11): e80883. doi: 10,1371 /journal.pone.0080883

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 2. lokakuuta, 2013 Hyväksytty: 18 lokakuu 2013; Julkaistu: 20 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Lin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus sai taloudellista tukea avustuksilla National Science Council, Taiwan (NSC-100-2632-B-040-001-MY3). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Suun okasolusyöpää (OSCC) ovat kuudenneksi yleisin maligniteetti maailmanlaajuisesti ja neljänneksi yleisin syy syöpäkuolemista miehillä Taiwanissa [1]. Leikkaus ja sädehoito ovat kriittinen hoitomodaliteetti varhaisessa vaiheessa OSCC [2]. Huolimatta edistysaskeleet terapiassa OSCC leimaa edelleen toistuvaksi ja etäpesäkkeiden alueellisiin kaulan imusolmukkeet, joka tuottaa huono potilas ennusteet. 5 vuoden pysyvyys syöpäpotilaiden on alle 50%, mutta mahdollisuudet varhaisen diagnoosin ja ehkäisy tämän taudin todennäköisesti kasvaa, jos molekyylimekanismin tunnistetaan [3]. Vaikka syy OSCC on monitekijäinen, etäpesäke, joka on vastustuskykyinen perinteisiin hoitoihin, on todennäköisesti tärkein kuolinsyy [4].

hajoaminen tyvikalvoissa ja strooman soluväliaineen (ECM) komponenttien muodostaa ratkaisevaa prosessin aikana paikallista kudosinvaasio ja etäpesäkkeiden [5]. Erittämällä proteolyyttiset entsyymit, kasvaimen solut voivat luoda polun siirtyä sekä paikallisesti ja kaukaista. Matriksin metalloproteinaasien (MMP: t) kuuluvat perheeseen, sinkki-riippuvaisia ​​endopeptidaaseja, jotka hajottavat useita osia ECM: [6]. Rakennetta ja substraatti MMP-perheen avulla se voidaan jakaa alaryhmiin kollagenaasit, stromelysiinit, gelatinaasit, kalvo-tyypin MMP, ja muut MMP: [7]. Nämä ovat erittäin tärkeitä normaaleissa fysiologisissa prosesseissa, kuten sikiön kehitykseen, tulehdus, angiogeneesi, ja haavan paranemista. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että korkeat MMP usein korreloivat ihmisen syöpien, kuten keuhko- [8], rintojen [9], maksa [10], ja suusyöpä [11]. Toiminta MMP säätelevät fysiologisia estäjät, kudos metalloproteinaasien estäjiä (TIMP: t) [12]. Epätasapaino aktiivisen MMP ja TIMP on ratkaiseva tekijä osallistuu remontin ECM esillä useita tautitiloja [13]. Gohji et ai. ehdotti, että seerumin MMP-2: TIMP-2-suhde on riippumaton prognostinen indikaattori urothelial syövän uusiutumiseen [14].

Flavonoidit ovat polyfenoliyhdisteiden, joita löytyy hedelmiä ja vihanneksia [15]. Flavonoidit käytetään yleisesti sydän- ja verisuonisairauksien ennaltaehkäisyä [16], [17]. Lisäksi, aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ruokavalion flavonoidit estävät kehityksen eri ihmisen syöpien, kuten rintasyövän [18], eturauhassyöpä [19] ja peräsuolen syövän [20]. Kaempferol, luonnollinen polyphenol kuuluva flavonoidi ryhmään, on läsnä suurina määrinä teetä, viinirypäleitä, parsakaali, ja marjat [21], [22]. Useat aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että kaempferol esittelee antioksidantti [23], anti-tulehdus [24] ja kasvaimen ominaisuuksia [25]. On olemassa ainakin kuusi erilaista flavonoideja. Kaempferol kuuluu flavonolia ja on samanlainen rakenne kuin quercein ja myrisetiini, joka on myös syövän vaikutukset [26]. Kaempferol havaittiin estävän angiogeneesiä ja VEGF ilmentymistä ihmisen munasarjasyövän soluja, ja polkuja mukana sääntelyn HIF-1α [27]. Kaempferol myös tuottanut apoptoosin vaikutuksen kautta AKT ilmentymistä ihmisen gliooma soluissa [28] ja leukemiasolujen [29]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että kaempferol indusoi G2 /M solusyklin pysähtymiseen ja autophagic solukuoleman ihmisen maksasyöpäsolut [30]. Lisäksi, Kang et ai., On raportoitu, että kaempferol ja kversetiini indusoiman kaspaasi-3-riippuvaista apoptoosia suuontelon syöpä soluihin [31]. Kuitenkin vaikutus kaempferol on syövän etäpesäke OSCC, ja taustalla olevien mekanismien tätä vaikutusta, ei ole vielä tutkittu. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että tukahduttamista metastaattisen kyvyn mukaan kaempferol tuotetaan alas-MMP-2: n ilmentymisen, ja toivomme tarjota pohjan lisätutkimusta.

Materiaalit ja menetelmät

Cell ja soluviljelmä

SCC-4, ihmisen kielen levyepiteelikarsinooma solulinja saatiin ATCC: stä (Manassas, VA, USA) viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-väliaineessa, jota oli täydennetty sama tilavuus ravintoaineen seosta, F-12 Ham väliaineessa (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA), 2 mM glutamiinia, 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä , ja 400 ng /ml hydrokortisonia. Kaikki soluviljelmät pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2.

Solujen elävyys määritys (MTT-määritys) B

SCC4-soluja siirrostettiin 24-kuoppalevyille tiheydellä 5 x 10

4 solua /kuoppa ja käsiteltiin kaempferol pitoisuutena 0-100 uM 37 ° C: ssa 24 tuntia. Valotuksen jälkeen ajan, väliaine poistettiin, ja solut pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja inkuboitiin sitten 20 ui MTT: tä (5 mg /ml) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 4 h. Elävien solujen määrä maljaa kohti on suoraan verrannollinen tuotannon formatsaanisakka, dehydrogenaasien mitokondrioissa sisällä eläviä soluja, joka voidaan mitata spektrofotometrisesti 563 nm seuraavat liuottamalla isopropanolilla.

Solun maahanmuutto- ja invaasion määritykset

Kun hoidon kaempferol (0, 20, 40, 60, 80 ja 100 uM) 24 tunnin, elossa solut kerättiin ja kylvetään Boyden kammioon (Neuro Probe, Cabin John, MD, USA) 10

4 solua /kuoppa seerumittomassa väliaineessa ja sen jälkeen inkuboitiin 24 tuntia tai 48 tuntia 37 ° C: ssa migraatiokokeessa tai invaasiomääritys, vastaavasti. Sillä invaasiomääritys, 10 ui Matrigel (25 mg /50 ml, BD Biosciences, MA, USA) pantiin 8 um huokoskoon polykarbonaattikalvosuodattimia ja alaosaan sisälsi standardin väliaineessa. Tunkeutuneet solut kiinnitettiin 100% metanolia ja värjättiin 5% Giemsa. Solujen lukumäärät laskettiin valomikroskoopilla. Migraatiokokeessa suoritettiin kuvatulla tavalla invaasiomääritys ilman pinnoite matrigeelin.

liivate alustan geelitsymografiaa

toiminta MMP-2 ehdollisen väliaineessa mitattiin gelatiinitsymografialla proteaasin määritykset . Lyhyesti, kerätyt media sopivan määrän (oikaistuna elintärkeää solujen määrä) valmistettiin SDS-näytepuskurissa ilman kuumennusta tai vähentäminen ja alistettiin 0,1% gelatiinia-8% SDS-PAGE-elektroforeesilla. Elektroforeesin jälkeen geelit pestiin 2,5% Triton X-100, ja sitten inkuboitiin reaktiopuskuria (40 mM Tris-HCl, pH 8,0; 10 mM CaCl

2 ja 0,01% NaN

3) 12 tunnin ajan 37 ° C. Sitten geeli värjättiin Coomassie brilliant blue R-250. Vastaavat vyöhykkeet MMP-2-aktiivisuus visualisoitiin negatiivisesti värjätty käyttämällä 0,3% Coomassie blue 50% metanolia ja 10% etikkahappoa.

Western blot-analyysi

Solulysaatit valmistettiin suspendoimalla 2 × 10

6/10 cm malja 200 ui RIPA puskuria, joka sisälsi proteaasin estäjiä cocktail. Solulysaatit altistettiin sentrifugoimalla 10000 rpm: ssä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja liukenematon pelletti heitettiin pois. Proteiinipitoisuus kokosolulysaateille määritettiin Bradford-määrityksellä. 20 ug näytteet kokosoluliuotteista tai ydin- jakeet erotettiin SDS-PAGE: lla 10% polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle käyttäen Mini-Protean Tetra Elektroforeesi System kuten aiemmin on kuvattu [32]. Blottia jälkeen sitä inkuboitiin 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (20 mM Tris, 137 mM NaCl, pH 7,6) 1 h estää ei-spesifinen sitoutuminen, ja sitten yön polyklonaalisilla vasta-aineilla MMP-2, TIMP -2 tai kolme MAPK (ERK 1/2, JNK 1/2 ja p38) erityisten vasta-aineiden fosforyloitumaton tai fosforyloidun muotoja vastaavan ERK 1/2, JNK 1/2 ja p38. Blotteja inkuboitiin sitten piparjuuriperoksidaasi vuohen anti-kani tai anti-hiiri-IgG: ssa 1 tunti. Jälkeenpäin signaali havaittiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin (ECL) kaupallinen (Amersham Biosciences) ja suhteellinen valokuvaus- tiheys kvantitoitiin skannaamalla negatiivit geelillä asiakirjat ja analysointijärjestelmä (AlphaImager HP System, Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA, USA).

RNA: n eristämistä, semikvantitatiivinen RT-PCR ja TaqMan kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR

Kokonais-RNA eristettiin 1 x 10

6 SCC4 soluihin käyttämällä Trizol (Life Technologies , Grand Island, NY), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kokonais-RNA (2 ug), tehtiin käänteistranskriptio cDNA: ksi, jonka SuperScript III First-Strand Synthesis Supermix (Invitrogen, Carlsbad, CA). PCR suoritettiin reaktioseoksessa, joka sisälsi 2 ui cDNA, 0,2 mM dNTP: tä seokseen, 2 uM kutakin alukkeita, 1 U Taq DNA-polymeraasia, ja 1-kertainen konsentraatio Thermal Pol Buffer (New England BioLabs, MA, USA) denaturointi 95 ° C: ssa 5 min, jota seurasi monistus osoitti sykliä 95 ° C 30 sekuntia, 62 ° C 30 sekuntia ja 72 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Erityiset alukesekvenssit nämä geenit ovat seuraavat: MMP-2: 5′-GGCCCTGTCACTCCTGAGAT-3 ’(eteenpäin), 5′-GGCATCCAGGTTATCGGGG A-3′ (taaksepäin), ja TIMP-2: 5’-GGCGTTTTGCAATGCAGATGTAG-3 ’ (eteenpäin), 5’-CACAGGAGCCGTCACTTCTCTTG-3 ’(reverse). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR-analyysi suoritettiin käyttäen Taqman yksivaiheista PCR Master Mix (Applied Biosystems). 100 ng kokonais-cDNA lisättiin per 25 ui reaktiossa MMP-2 tai GAPDH-alukkeita ja Taqman. MMP-2 ja GAPDH-alukkeita ja koettimet suunniteltiin käyttäen kaupallista ohjelmistoa (ABI PRISM Sequence Detection System; Applied Biosystems). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR-määrityksissä suoritettiin kolmena rinnakkaisena on StepOnePlus sekvenssin tunnistusjärjestelmä. Se oli vahvistettu yläpuolella ei-mallin ohjaus tausta ja lineaarisella vaiheessa kohdegeenin vahvistus laskea syklin, jossa kopio todettiin.

Luciferase reportterigeenimäärityksessä

SCC4 soluja ympättiin pitoisuutena 5 x 10

4 solua per kuoppa 6-kuoppaisille soluviljelylevyille. Fragmentti MMP-2-promoottori insertoitiin pGL3-perusvektoriin tuottaa MMP-2-promoottorin plasmidista. 24 tunnin inkubaation, pGL3-basic (vektori) ja MMP-2-promoottorin plasmidi kotransfektoitiin kanssa β- galaktosidaasin ekspressiovektorilla (pCH110) soluihin käyttäen Turbofect (Fermentas, Carlsbad, CA). 12 tunnin kuluttua transfektion jälkeen solut käsiteltiin ajoneuvon tai kaempferol (0, 20, 40, 60, 80 ja 100 uM) 24 tuntia. Lusiferaasi ja β-galaktosidaasi toimintaa analysoitiin mukaan valmistajan protokollan (Promega). Luminesenssi mitattiin käyttäen Tropix TR717 Microplate Luminometer (Applied Biosystems). Arvo lusiferaasiaktiivisuuden normalisoitiin transfektion tehokkuuden ja seurataan β-galaktosidaasin ilmentymistä.

Elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä

AP-1 sitoutumismääritykset ydin- uutteet tehtiin biotiinileimatulla double -stranded c-Jun oligonukleotidit (5′-CGCTTGATGAGTCAGCCGGAA-3 ’), ja elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä suoritettiin käyttäen Lightshift kittiä (Promega). Lyhyesti, sitovat reaktiot sisälsivät 10 ug tumaproteiini, 10 mM Tris, 50 mM KCI, 1 mM ditiotreitolia, 5 mM MgCl

2, 2 ug poly (dI dC) ja 2 pmoolia oligonukleotidikoettimen inkuboitiin 20 min huoneen lämpötilassa. Proteiini-DNA-kompleksit erotettiin elektroforeesilla 6% ei-denaturoivalla akryyliamidigeelillä, siirrettiin positiivisesti varautuneet nailonkalvoille ja sitten silloitetun on Stratagene ristisitojaa. Geeli siirtymät visualisoitiin streptavidiini-piparjuuriperoksidaasi seuraa kemiluminesenssiosoitusta. Merkitsemätön oligot AP-1 200 × lisättiin kilpailemaan nimenomaan leimatun oligo sitovia kilpailutilanteessa EMSA.

Kromatiini immunosaostusanalyysille (chip)

Kromatiini immunosaostusanalyysille suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [33]. Lyhyesti, kromatiinin ja proteiinien suunnilleen 2 x 10

6 solua silloitettu 1% formaldehydiä 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Nämä solut kerättiin talteen, hajotettiin, ja sonikoitiin jäällä leikkaamiseksi kromatiinin DNA pituus välillä 200 – 1000 emäsparin käyttäen Sonicator 3000 (Misonix, NY, USA). Sonikoitu kromatiinin lysaattia immunosaostettiin anti-c-Jun-vasta-ainetta, ja kerätään Protein A /G-agaroosi-helmiä (Pierce, IL, USA). Proteiini /DNA-siltoja immunosaostetun komplekseja palautettiin inkuboimalla 0,2 M NaCl 65 ° C: ssa 4 h, ja sitten DNA puhdistettiin ja soveltaa PCR edellä kuvatulla tavalla määrittää sitova kyky c-Jun MMP- 2 promoottori. Sekvenssit alukkeiden 5′-CTCTTTAGCTCTTCAGGTCTCAGC-3 ’(eteenpäin) ja 5′-TGTTGGGAACGCCTGACT-3’ (taaksepäin).

Tilastollinen analyysi

kaikki mittaukset, analyysi varianssianalyysi seurasi Scheffe jälkikäteen verrattuna käytettiin arvioimaan eroja valvontaa ja solujen käsiteltiin erilaisilla pitoisuus kaempferol. Ero at p 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä ja kokeet toistettiin kolmesti.

Tulokset

vaikutus kaempferol elinkelpoisuudesta SCC4 solujen

Analysoimme sytotoksiset vaikutukset kaempferol eri pitoisuuksina (0-100 uM) on SCC4 soluihin käyttämällä MTT-määritystä. Kuten kuviossa 1 on esitetty, käyttäen kaempferol kohtelu SCC4 solut tuottivat ei ole sytotoksista vaikutusta solujen elinkelpoisuuteen. Näin ollen, tämä konsentraatioalue kaempferol käytettiin seuraavissa kokeissa.

SCC4 soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla (0, 20, 40, 60, 80, ja 100 uM) kaempferol 24 tuntia. Solujen elinkyky määritettiin käyttämällä MTT-määritystä. Arvot edusti keskiarvoja ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen.

kaempferol estää SCC4 solumigraatioon ja invaasiota

tutkia solumigraatioon ja invaasiota hiljennettiin kaempferol, me ympättiin SCC4 solut Boyden kammion ja laskettu määrä invasiivisia solujen läsnä ollessa kaempferol. Havaitsimme, että kaempferol merkittävästi esti migraation ja invaasion SCC4 solujen annosriippuvaisesti, jossa vain 58% ja 56% jäljellä käsittelyn jälkeen 100 uM kaempferol 24 tunnin ja 48 tunnin kuluttua vastaavasti (kuviot 2A ja 2B) .

Kun hoidetaan kaempferol pitoisuutena 0, 20, 40, 60, 80, ja 100 uM, (A) solumigraation ja (B) soluinvaasion mitattiin käyttämällä Boyden kammion 24 ja 48 tuntia, vastaavasti. Edustamat arvot keskiarvoina ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. * P 0,05 verrattuna kontrolliin.

kaempferol vähentää MMP ja TIMP

Osoittaakseen, onko tukahduttaminen SCC4 muuttoliikkeen välittämä säätelemällä MMP-2: n ilmentymisen , joka on gelatiinitsymografialla määritys suoritettiin. Liivate tsymografialla Tulokset osoittivat, että MMP-2 entsyymin aktiivisuus estyi 53% on korkein pitoisuus kaempferol (100 uM) (kuvio 3A). Kuvio 3B esittää Western blotting-analyysi MMP-2 ja TIMP-2-proteiinin tasot. Proteiini tasot molempien MMP-2 ja TIMP-2 väheni merkittävästi. MRNA ilmaisu osoitti myös samat tulokset (kuvio 3C). Käytimme myös kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR-määrityksen vahvistaa MMP-2 mRNA: n ekspressio (kuvio 3D). Näin ollen, kaempferol merkittävästi inhiboi MMP-2 mRNA: n ekspression pitoisuudesta riippuvalla tavalla.

SCC4 soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla (0, 20, 40, 60, 80, ja 100 uM) kaempferol 24 tuntia . Esikäsitelty väliaine kerättiin ja MMP-2: havaittu (A), tai Western blot anti-MMP-2 ja anti-TIMP-2-vasta-aineita suoritettiin (B). (C) semikvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin vertaamaan MMP-2 ja TIMP-2-mRNA-tasoja. (D) mRNA-MMP-2: n määrät määritettiin käyttäen reaaliaikaista PCR. Edustamat arvot keskiarvoina ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. * P 0,05 verrattuna kontrolliin.

kaempferol estää transkription aktiivisuutta MMP-2

edelleen tutkimaan, ovatko kaempferol säännelty promoottorin MMP-2, me suoritetaan lusiferaasireport- määritys, ja reportterigeeni, joka sisälsi MMP-2-promoottorialueen transfektoitiin SCC4 soluihin. Kuten kuviossa 4A on esitetty, MMP-2-promoottorin aktiivisuus väheni annoksesta riippuvaisella tavalla, mikä osoittaa, että kaempferol estää MMP-2: n ilmentymisen transkriptionaalisella tasolla.

(A) SCC4 solut transfektoitiin pGL3 perus tai MMP-2-promoottori /reportteri-plasmidi, käsiteltiin sitten eri pitoisuuksilla (0, 20, 40, 60, 80, ja 100 uM) kaempferol. Sen jälkeen, kun 24-tunnin inkubaation Lusiferaasiaktiivisuudet määritettiin ja normalisoitiin P-galaktosidaasin aktiivisuuden. (B) Nuclear valmistettu uute SCC4 solujen eri pitoisuuksilla (0, 20, 40, 60, 80, ja 100 uM) kaempferol inkuboitiin biotiini-leimattu AP-1-spesifisiä oligonukleotideja, joissa konsensussekvenssin AP-1: een sitoutuvien. Bound kompleksit analysoitiin elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä. (C) sitoutuminen c-Jun on MMP-2-promoottorin mitattiin käyttämällä ChIP määritystä. (D) edustavat tulokset c-Jun: sta ja c-Fos-proteiinin tasot Western blot -analyysiä käyttämällä. Edustamat arvot keskiarvoina ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. * P 0,05 verrattuna kontrolliin.

kaempferol pienenee c-Jun /AP-1 aktivaatio in SCC4 soluissa

Koska edellinen data paljasti, että AP-1 oli keskeinen transkription säädin MMP-2 edistäminen [33], EMSA ja ChIP määritykset suoritettiin sitten tutkia vaikutusta kaempferol AP-1 DNA: ta sitova aktiivisuus. Kuten kuviossa 4B sitovaa aktiivisuutta AP-1 on MMP-2-promoottorin väheni merkittävästi SCC4 soluissa sen jälkeen, kun on käsitelty kaempferol pitoisuudesta riippuvalla tavalla. Erityisesti, sitomiskyky AP-1 promoottorin MMP-2-geenin tukahdutettu SCC4 soluissa sen jälkeen, kun on käsitelty 60 uM kaempferol (kuvio 4C) .Voit määrittää transkriptiotekijät, käytimme Western blot -määritys tunnistaa tumaansiirtymiseen c-Jun ja c-Fos. Hoitoon SCC4 solut kaempferol vähensi tumaansiirtymiseen c-Jun, mutta ei tuottanut vaikutuksia tasoon c-Fos (kuvio 4D).

kaempferol estää fosforylaatiota ERK1 /2

tietojen mukaan keräsimme, kaempferol esti SCC4 migraatiota vähentämällä MMP-2: n ilmentymisen. Jotta voitaisiin edelleen tutkia oleva mekanismi anti-metastaattinen kyky kaempferol in SCC4 soluissa, käytimme Western blot -määritys tunnistaa ilmentymisen MAPK reittejä. Kuvio 5A esittää, että fosforylaatio ERK tukahdutettiin sen jälkeen käsittelemällä SCC4 soluja kaempferol. Kuitenkin, fosforylaatio JNK1 /2 ja p38 säilyi ennallaan (kuviot 5B-5C).

SCC4-soluja käsiteltiin eri annoksilla kaempferol (0, 20, 40, 60, 80, ja 100 uM ) 24 tuntia ja kokosolulysaateista valmistetaan näitä soluja käytettiin western blot-analyysi, jossa (A) anti-ERK1 /2, (B) anti-JNK1 /2 ja (C) ja anti-p38 (yhteensä ja fosforyloituu) vasta-aineiden kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Edustamat arvot keskiarvoina ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. * P 0,05 verrattuna kontrolliin.

vaikutus kaempferol on MMP-2 ilmentymä SCC4 käsiteltyjen solujen U0126

Osoittaakseen, onko tukahduttaminen MMP-2 ekspression kaempferol tapahtui pääasiassa estämällä ERK1 /2 signalointireitin, SCC4 soluja käsiteltiin U0126, MEK: iä estäjä. Liivate zymografian tiedot osoittivat, että MMP-2-entsyymin aktiivisuus estyi, kun käsitellään ainoastaan ​​kaempferol tai U0126 47% ja 42%. Kuitenkin yhdistelmä hoito inhibiittorin kanssa kaempferol intensiivisesti vähensi MMP-2 entsyymiaktiivisuutta 78% (kuvio 6A). Lisäksi samanlaisia ​​tuloksia saatiin Boyden kammion määrityksessä solujen invaasion. Kuvio 6B esittää, että sekä kaempferol ja U0126 estävät solujen invaasiota, ja hoitoja yhdistämällä nämä kaksi kemiallisia yhdisteitä parantaa anti-invaasio aktiivisuutta. Tämän vuoksi inhibitio ERK1 /2 signalointireittien voi johtaa vähentyneeseen MMP-2, ja vähensi kasvainten solujen vaeltamiseen.

SCC4 soluja esikäsiteltiin U0126 (10 tai 20 uM) 1 tunti, ja sitten inkuboitiin läsnä ollessa tai puuttuessa kaempferol (60 uM) 24 tunnin ajan. (A) elatusaineet käytettiin aiheita analyysi MMP-2: n aktiivisuuden, ja soluja käytettiin invaasiomääritys (B), kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Edustamat arvot keskiarvoina ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. * P 0,05 verrattuna kontrolliin.

Keskustelu

kulutus hedelmiä ja vihanneksia sisältävän flavonoideja tuottaa elintärkeitä terveyshyötyjä. Kaempferol, flavonoidi, osoittaa erilaisten biologisten ja farmakologisten vaikutusten, kuten antioksidantti ja anti-syöpään liittyvien ominaisuuksien [23], [31], [34]. Tutkimuksemme käytetään SCC4 suun okasolusyöpä soluja, ja tuloksemme osoittavat, että kaempferol (1) estää migraation ja invaasion SCC4 solujen (2) vähentää geenin ilmentymisen ja entsyymin aktiivisuutta MMP-2; (3) vähentää tumaansiirtymiseen AP-1 MMP-2-promoottori; ja (4) estää fosforylaation ERK1 /2.

Useat aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että useat fytokemikaaleja käyttää anti-etäpesäkkeiden kyvyt estämällä entsyymiaktiivisuutta tai geeni MMP-2 [35], [36] . Kofeiinihappoa fenetyyliesteri estää suun syöpäsolumetastaasi säätelemällä MMP-2 ja MAPK polkuja [11]. Silibinin estää ihmisen osteosarkooma MG-63 soluinvaasion estämällä ERK-riippuvainen induktio MMP-2 [37]. Wang et ai havaittu, että PAK5-Egr1-MMP-2 signalointi säätelee muuttoliike ja invaasion rintasyöpäsoluissa [38]. Vaikka TIMP-2 oli fysiologinen inhibiittori MMP-2, meidän tiedot osoittavat, että kaempferol vähentää MMP-2 ja TIMP-2: n mRNA, ja proteiinin ilmentyminen. Aiemmissa tutkimuksissa, TIMP-2 yli-ilmentymisen vähensi invaasio ja angiogeneesi, ja suojattu melanooma soluja apoptoosin [39]. Bourboulia et ai. paljasti, että TIMP-2 edistetään kasvaimia torjuvaa transkription profiilin jopa säätelevä E-kadheriinin keuhkojen syöpäsoluja [40]. Kuitenkin de Vicente et al. osoittivat, että ilmentyminen TIMP-2 suun okasolusyöpä korreloi TNM pysähdyspaikan, paikallisen uusiutumisen, ja epäedullisempia eloonjäämisluvut [41]. Samat havainnot sisällytettiin tekemää tutkimusta Baker et al. joka löysi korkeammat keskimääräiset tasot TIMP-2 kasvainkudoksessa kuin normaalissa kudoksessa [42].

Aikaisemmat tutkimukset ovat kattavasti osoittaneet roolin MAPK-reitin säätelyssä MMP ilmaisun [37], [43], [ ,,,0],44]. Shan et ai. osoittivat, että estrogeeni voi lisätä VEGF: n ilmentymistä, ja aktivoi ERK1 /2-reitin aiheuttaa MMP-2: n ilmentymisen [45]. Silibinin estää hyökkäyksen suun syöpäsolujen tukahduttamalla aktivoituminen ERK1 /2 ja MMP-2: n ilmentymisen [46]. Selaginella tamariscina (Beauv.), Perinteinen lääkekasvi, hänellä haarapesäkkeiden vaikutuksia ihmisten luusarkoomasolujen vähentämällä MMP-2 ja MMP-9 eritteiden kautta p38 ja Akt signalointireitteihin [47]. Kuitenkin meidän tutkimus tulokset osoittivat, että kaempferol vain estää ERK-fosforylaation ja merkittäviä vaikutuksia näkyivät on JNK ja p38 signalointi polkuja. Itse asiassa, kuten on esitetty kuvioissa 5-6, kaempferol inhiboi fosforylaatiota ERK1 /2, ja osallistuminen MAPK-reitin oli hyvin osoitettu käyttämällä MEK-estäjää SCC4 soluissa, mikä osoittaa, että hoito käyttäen U0126 voi johtaa MMP-2: n eritystä ja SCC4 solujen invaasiota.

ilmentymisen MMP-2-geenin säätelee transkription tasolla vuorovaikutus AP-1 sitovia sekvenssejä MMP-2-geenin promoottori [33], [48]. AP-1 ei ole yksittäinen transkriptiotekijän, mutta heterodimeeri, joka koostuu c-Fos ja c-Jun perheitä. Useat raportit ovat osoittaneet, että useat lääkkeet inhiboivat syövän etäpesäkkeiden moduloimalla DNA: ta sitova toiminta AP-1. Hong et ai. osoittivat, että ascochlorin inhiboi MMP-9 ilmentymisen estämällä AP-1-aktiivisuutta [49]. Nobiletin, sitrushedelmien flavonoidi, heikennetty MMP-7 ilmentymistä vähentämällä AP-1 DNA: ta sitova aktiivisuus [50]. Nykyinen tietojen mukaan kaempferol alensi MMP-2 aktiivisuutta SCC4 solujen estämällä AP-1 aktivaatio. Tämä havainto tukee aiemmissa raporteissa, että ilmoitettu silibinin tukahdutti ihmisen osteosarkooma soluinvaasiota estämällä ERK-riippuvaisen AP-1 induktio MMP-2 [37]. Olemme kuitenkin havaittu, että kaempferol painaa vain c-Jun ilmentyminen tumassa vaikuttamatta c-Fos. Kaikki nämä tulokset viittaavat siihen, että kaempferol estää SCC4 solumigraation ja invaasiota vähentämällä MMP-2-geenin promoottori sitovaa aktiivisuutta AP-1 transkriptiotekijöiden, kuten c-kesäkuu

Yhteenvetona tuloksemme osoittavat, että kaempferol inhiboi AP-1-aktiivisuutta, vähentää MMP-2: n ilmentymisen, ja myöhemmin estää hyökkäyksen SCC4 soluja. Lisäksi osoitimme, että kaempferol estää ERK1 /2 fosforylaation, tehokkaasti johtaa MMP-2 säätely alaspäin. Nämä tulokset viittaavat siihen, että kaempferol voi olla tehokas ehdokas kehittämiseen aineita käytetään estämään syövän etäpesäke.