Krooninen sairaus

tiivistelmä

CDK /Rb /E2F reitin yleisesti rikkoudu keuhkosyöpää, ja siten, on ennustettu, että estämällä E2F polku olisi terapeuttista potentiaalia. Tämän hypoteesin testaamiseksi, olemme tutkineet toiminnan HLM006474 (pieni molekyyli yleiseurooppalainen E2F estäjä) keuhkosyövän solulinjoja yksittäisenä aineena että yhdistelmänä muiden yhdisteiden kanssa. HLM006474 alentaa kannattavuutta sekä SCLC ja NSCLC linjat biologisen IC

50, joka vaihtelee 15 ja 75 uM, mutta ilman merkittävää eroa ryhmien välillä. Yhdistelmä HLM006474 sisplatiinin ja gemsitabiinin osoittaa vähän synergiaa; kuitenkin, HLM006474 synergizes paklitakselin. Yllättäen huomasimme, että lyhyt solujen käsittely HLM006474 johti kasvua E2F3 proteiinin tasot (johtuen derepression näistä promoottorikohtien). Koska paklitakseli herkkyys on osoitettu korreloivan E2F3 tasoilla, me arveltu, että HLM006474 synergiaa paklitakseli saattaa välittää ohimenevä induktion E2F3. Tämän testaamiseksi H1299 solut köyhdytetty E2F3a ja E2F3b siRNA ja hoidettiin paklitakselilla. Analyysit leviämisen osoitti, että sekä siRNA vähentää merkittävästi paklitakselin herkkyys, odotetusti. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että HLM006474 voi olla tehoa keuhkosyöpä ja ne voivat olla käyttökelpoisia yhdessä taksaanien.

Citation: Kurtyka CA, Chen L, Cress WD (2014) E2F esto synergoi Paklitakselin Lung Cancer Solulinjat. PLoS ONE 9 (5): e96357. doi: 10,1371 /journal.pone.0096357

Editor: John D. Minna, Univesity Texas Southwestern Medical Center at Dallas, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 joulukuu 2013; Hyväksytty: 04 huhtikuu 2014; Julkaistu: May 15, 2014

Copyright: © 2014 Kurtyka et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Cancer Institute (CA119997), The Bankhead Coley Cancer Research Program of Florida Department of Health (FDH 08BB-05) ja Moffitt Cancer Center. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: WDC on keksijän US-patentti 8202886 B2 hallussa University of South Florida. Muuten kirjoittajat ole eturistiriitaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

retinoblastoomaproteiiniin (yleisesti kutsutaan Rb) on yleisesti tunnustettu yhdeksi tärkeimmistä tuumorisuppressoreilla ihmisissä. Yhdessä samanlainen ”tasku” proteiinit p107 ja p130, se on vastuussa sääntelystä solusyklin etenemistä [1]. Rb perhe säätelee solusyklin sitoutumisen kautta ja estämällä transkriptionaalista aktiivisuutta varhaisen 2 tekijöiden (E2Fs) ja sen tuumorisuppressoriproteiinia toiminta on tiukasti liittyy tämän toiminnon [2]. Kun fosforyloituu (tyypillisesti CDK 2, 4 ja 6 G1), Rb inaktivoituu, mikä vapauttaisi E2Fs ja mahdollistaa solusyklin etenemisen [3]. Välttääkseen poikkeavasta solusyklin alkamista, CDK-inhibiittorit kuten CDKN2A (yleisesti tunnettu p16) estävät CDK peräisin fosforyloivaan Rb ja voima solujen jäädä G1 [4].

Riippuen yhteydessä, E2F perheenjäsenet voivat toimivat transkription aktivaattoreita, jotka ohjaavat solusyklin etenemistä tai transkriptiorepresso- jotka rajoittavat solusyklin etenemistä [5]. Aktivaattoreina, E2Fs tunnustetaan olevan tärkeä leviämisen kautta transkription aktivaation S-vaiheen geenejä. E2Fs transkription aktivoimiseksi kautta yhdessä histoni liasetyylitransferaasi (HAT) aktiivisuus [6], [7]. Repressoreina, E2Fs estävät geenien transkriptio hyödyntää S-vaiheessa pääsyn sitoutumalla niiden promoottorien ja tukahduttaa transkriptio kautta niiden kyky sitoutua Rb ja muut tasku proteiineja, jotka puolestaan ​​rekrytoivat chromatin määritteet kuten histonideasetylaasit (HDAC: t) [6] – [8]. Kaikkien E2F perheenjäsenten, E2F3 on vain yksi erikseen vaaditaan solujen lisääntymistä tapahtuu [9] – [13]. E2F3 on tärkeä transkription eri geenien S-vaiheen pääsyn ja sen on todettu olevan rooleja kirjoittamisessa geenejä tarvitaan G2 /M-vaiheisiin (kuten Aurora-kinaasin [14], cdc2 [15], ja sykliini B1 [15], [16]). On olemassa kaksi E2F3 isoformeja, E2F3a ja E2F3b, kukin johtuvat transkription kahdessa eri promoottoreita. E2F3b tasot pysyvät vakiona koko solusyklin, kun taas E2F3a tasot vaihtelevat ja saavuttaa huippunsa ekspressiotasot ympäri G1 /S siirtyminen [17] – [19]. Hiiri knockout tutkimusten mukaan E2F3a ja E2F3b yleensä korvaavaan toisillaan [20], [21], mutta poistetaan molemmat isomuodot on tappava [9], [20]. Lopuksi E2F3 on korkeammin ilmaistaan ​​useita syövissä (katso [5] tarkistamista), mukaan lukien keuhko [22] ja sen toiminta on korreloinut herkempi taksaania hoitoa munasarjasyöpiä [23] ja ER-negatiivisen rintasyövän [ ,,,0],24].

CDK /Rb /E2F reitin häiriintyy lähes kaikissa tapauksissa ihmisen keuhkosyöpä, johtava syy syövän liittyvän kuoleman maailmanlaajuisesti [25]. Vuonna pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC), jonka osuus on noin 15% keuhkosyövässä, yleisin mekanismi Rb-reitti häiriöitä on mutaatio Rb proteiinia itseään. Itse asiassa noin 90% pienisoluiset keuhkosyövät puuttuu funktionaalinen RB-proteiini [26], [27]. Sen sijaan ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), Rb mutaatio osuus 15-30% näistä syövistä [26], [28], ja sääntelyn purkaminen CDK /Rb /E2F-reitin yleisemmin tapahtuu kautta hiljentäminen CDK-inhibiittori p16 [29] – [32]. Useimmissa tapauksissa ei-pienisoluisen keuhkosyövän, joissa

RB1 ​​

geeni on ehjä, CDK4: n ja 6 merkitsisi mahdollinen tapa kohdistaa tämän reitin kautta. Tämä hypoteesi on tutkittu useissa kliinisissä tutkimuksissa ja alustavat tulokset rintasyövän ovat erittäin lupaavia [33] – [35], mikä viittaa siihen, että CDK /Rb /E2F-reitin inhibiittorit voi olla tärkeä rooli hoidettaessa erilaisia ​​syöpiä.

hyöty CDK-inhibiittorit voidaan rajoittaa kasvaimia, joissa Rb proteiini pysyy WT ja toimiva, ja siten, reagenssit, jotka voivat kohdistaa tämän reitin alavirtaan Rb voivat olla hyödyllisiä syöpien jossa Rb on yleisesti mutatoitunut (kuten keuhkosyöpä). Tämän hypoteesin testaamiseksi olemme tutkineet aktiivisuus HLM006474 vastaan ​​paneelin keuhkosyövän solulinjat. HLM006474 (myös käsitellä tässä, sillä 6474) on pienimolekyylinen yleiseurooppalainen estäjä E2F-DNA: ta sitovan [36]. Vaikka IC

50 HLM006474 on suhteellisen korkea (30 uM), se on löytänyt käyttöä työkaluna yhdiste [37] – [40].

In vivo

tutkimukset osoittavat, että vaikutukset 6474 hoidon eri solulinjoilla sisältyvät väheneminen solujen lisääntymisen ja apoptoosin lisääntyminen ja vähentää hyökkäys on kolmiulotteinen kudosviljelmässä malli järjestelmä [36]. HLM006474 voivat olla käyttökelpoisia syövän ehkäisyyn johtamalla apoptoosin lisääntyminen ja lasku proliferaation kasvaimia aiheuttavasta ihmisalkion kantasoluja [39] sekä johtaa vähenemiseen kasvainten muodostumista hiiren alkioiden altis retinoblastoomaa [40]. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että häiriö E2F aktiivisuus käyttämällä pieniä molekyylejä voi olla kliinistä soveltamista syövän hoidossa. Kun nykyinen työ, tarjoamme tarkempi karakterisointi 6474 yhteydessä keuhkosyöpään. HLM006474 vähentää elinkelpoisuus laajan valikoiman solulinjojen biologisen IC

50, joka vaihtelee 15 ja 75 uM. Yhdistelmä HLM006474 yhteisiä kemoterapia-aineiden sisplatiinia ja gemsitabiinia osoittaa vähän synergiaa; kuitenkin, HLM006474 synergizes paklitakselin. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että HLM006474 voi olla tehoa syöpiä vastaan, joissa E2F on purettu ja se voi olla käyttökelpoinen yhdessä muiden lääkkeiden kanssa, jotka kohdistuvat solu- syklin osia.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja kemialliset yhdisteet

Keuhkosyöpä solulinjat saatiin ATCC tai alullepanijat ja toimittivat Moffitt SPORE Lung Cancer Cell Core laitokseen. Kaikki linjat todennetaan genotyypin ja ylläpidetään vapaa

Mycoplasma

. SCLC solulinjoja kasvatettiin RPMI 1640 10% FBS ja 1% pen /strep. NSCLC solulinjoja viljeltiin RPMI 1640 10% FBS ilman antibiootteja. HLM006474 syntetisoitiin ja validoi Moffitt kemian Core kuten aikaisemmin on kuvattu [36]. Gemsitabiini (Gemzar, Eli Lilly) ostettiin läpi Moffitt apteekki ja liuotetaan veteen. Sisplatiinin ja paklitakselin hankittiin Sigmalta ja konsentroituja kantaliuoksia valmistettiin dimetyylisulfoksidiin.

siRNA pudotus

Solut maljattiin ~ 50% konfluenssiin 6-kuoppalevyillä transfektoitiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Life Technologies) mukaan myyjän ohjeiden 200 pmol joko siGENOME kuin kohdistaminen siRNA # 2 (Dharmacon) tai siRNA kohdistaminen E2F3a tai E2F3b kuvatulla paperissa Hurst

et al

[41]. Solut kerättiin neljä tuntia transfektion jälkeen solujen elinkelpoisuuden määrityksessä (kuten kuvataan alla). Jäljelle jääneet solut uudelleen pinnoitettu ja korjattu Western blot-analyysi 24 tunnin kuluttua transfektion.

Elinkykymääritykset

antiproliferatiivinen yhdisteiden ja niiden yhdistelmät arvioitiin käyttäen suuren läpimenon CellTiter-Blue solunelinkykyisyysmääritys (Promega), kuten aiemmin on kuvattu [42]. Jotta määritykset, 1000 solua 24 ui maljattiin 384-kuoppalevyille ja inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Seuraavana päivänä, lääkkeet laimennettiin media- ja 6 ui näitä laimennoksia lisättiin sopiviin kuoppiin käyttämällä pipettiautomaatit asema. Neljä rinnakkaista kaivoja käytettiin kunkin lääkkeen pitoisuus. Soluja inkuboitiin lääkkeen kanssa 120 tunnin ajan, jona aikana, 5 ui CellTiter-Blue-reagenssia (Promega Corp., Madison, WI) lisättiin. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin kyky jäljellä käsiteltyjen solujen bioreduce resatsuriinia ja resorufiinin (579 nm Ex /584 nm Em). Fluoresenssi luettiin Synergy HT mikrolevylukijalla (Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT). IC

50s määritettiin käyttäen sigmoidal tasapainon mallia regressiolla käyttämällä XLfit versio 4.3.2 (ID Business Solutions Oy) ja määritellään lääkkeen pitoisuutena vaaditaan 50%: n vähennys kasvun /elinkelpoisuuden. 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -5- (3-karboksimetoksifenyyli) -2- (4-sulfofenyyli) -2H-tetratsolium (MTS) solujen elinkelpoisuuden määritykset, CellTiter 96 vesikerros Solution Promega, lisättiin mukaan myyjän ohjeita soluja 2 tuntia hoidon jälkeen lääkeaineen huomattava annos 72 tuntia. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja toistettiin ainakin kolme kertaa.

Yhdistelmä indeksit

IC

50-arvoja yhdessä lääkeaineen solujen elinkelpoisuuden määritykset käytettiin suunnittelemaan yhdistelmä kokeita. Sillä 6474 yhdistelmien sisplatiinin, gemsitabiinin ja paklitakselin nämä suhteet olivat 1:01, 500:1 ja 4000:1, vastaavasti. Huumeiden yhdistelmä kokeita, solujen elinkelpoisuuden määritykset suoritettiin, ja tulokset analysoitiin synergistinen, lisäaineen tai antagonistisia vaikutuksia käyttämällä yhdistelmä-indeksi (CI) kehittämä menetelmä Chou ja Talalay [43]. Yhdistelmä indeksit CI 1, CI = 1, ja CI 1 osoittavat synergismiksi additiivisia vaikutuksia, ja antagonismi, vastaavasti.

Vasta-aineet ja Western blotting

Western blotit suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [36 ], [44], [45]. Lyhyesti, kokosolulysaateille altistettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-kalvolle. Havaitseminen proteiinien suoritettiin käyttäen piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-aineita ja tehostetun kemiluminesenssin (ECL) hankittiin Amersham tai Thermo Scientific. Erilaisia ​​vasta-aineita käytetään mukana E2F1 (C-20, sc-193, Santa Cruz), E2F3 (C-18, sc-878, Santa Cruz), PARP (# 9542L, Cell Signaling Technology), ja monoklonaalisia β-aktiinin (klooni AC -15, kissa ei: A5441, Sigma). Adobe Photoshop CS käytettiin määrittämään Western blot bändi intensiteetti lukemia suoraan alttiina elokuvista käyttäen Suorakulmavalitsintyökalulla /histogrammin ja käänteinen skannatun elokuvan kuva. Tämä sama neliön käytettiin kaikkiin edelleen kaistan lukemat varmistaakseen, että samalla alueella analysoitiin jokaiselle kaistalle. Lukemat olivat säädettiin sitten osuus aktiinin ja taustan ja mielivaltaisesti normalisoitu solulinjaa H23 (saa arvon 1).

Reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio

RNA kerättiin soluista käyttäen RNeasy mini Kitin Qiagen. RT-PCR (PCR) suoritettiin sitten käyttäen iScript cDNA-synteesin kit (Bio-Rad). Tämä cDNA hyödynnetään sitten reaaliaikainen PCR käyttämällä joko iQ SYBR Green Supermixiä (Bio-Rad) tai PERFECTA SYBR Green SuperMix- (Quanta Biosciences, VWR). E2F1, E2F3, E2F4, tubuliinin, MCM2, MCM10, CCNE2, ja GAPDH alukkeet tilattiin Integrated DNA Technologies. Alukesekvenssit ovat seuraavat: E2F1 F (5′-GCTGGACCACCTGATGAATATC-3 ’), E2F1 R (5′-TCTGCAATGCTACGAAGGTCCTG-3′), E2F3a /b F (5’-CGTCTCTTGGTCTGCTCAC-3 ’), E2F3a /b R (5 ”-CACTTCTGCTGCCTTGTTC-3 ’), E2F4 F (5′-CTGAAGAGTGTGAGTGGTC -3′), E2F4 R (5’-GCAGAGGTGGAGGTGTAG -3 ’), tubuliinin F (5′-GGGGCTGGGTAAATGGCAAA-3′), tubuliinin R (5’- TGGCACTGGCTCTGGGTTCG-3 ’), MCM2 F (5′-CTGTGTGTGGTGAGGGACAC-3′), MCM2 R (5’-CTTGTCCTGGTCCATCTGGT-3 ’), MCM10 F (5′-CGTCAGTGAGCAGCATGAAT-3′), MCM10 R (5’-TCCCGTTCCCATTTGTAGAG- 3 ’), CCNE2 F (5′-CAGGTTTGGAGTGGGACAGT-3′), CCNE2 R (5’-ACTTCCTCCAGCATAGCCAA-3 ’), GAPDH F (5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′), ja GAPDH R (5’-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3 ”).

tilastollinen analyysi

reaaliaikainen PCR-analyysi ajankohtana kokeessa, ero ilmentymisen kunkin kokeellisen geenin (E2F1, E2F3, E2F4, CCNE2, MCM2, ja MCM10) ja ilmentymisen kontrolli-geenin (tubuliinin) laskettiin kustakin solulinjasta kussakin aikapisteessä. Ero kunkin ei-0 tunnin ajankohtina ja 0 tunnin kohdalla lukemat kullekin geenin kustakin solulinjasta laskettiin käyttäen T-Testit Welch korjaus. Paklitakseli IC

50s oli log-transformoitiin parantamiseksi normaaliuden. Korrelaatio E2F3 mRNA ja proteiini ilmaisutapoja log paklitakselin IC

50s laskettiin Pearsonin korrelaatiokerrointa. Wilcoxonin-summa testejä käytettiin tutkimaan ero solun elinkelpoisuuden ohjaus siRNA hoidossa joko E2F3a tai E2F3b siRNA hoitoon.

Tulokset

HLM006474 on laaja antiproliferatiivista aktiivisuutta

tutkia mahdollisuuksia 6474 hoidettaessa keuhkosyöpää, määritimme 6474 IC

50 seitsemäntoista keuhkosyövän solulinjoja (taulukko 1). Tämä analyysi sisältyi kahdeksan ei-pienisoluinen keuhkosyöpä riviä (NSCLC) ja yhdeksän pienisoluinen keuhkosyöpä riviä (SCLC). Tässä elinkelpoisuuden määrityksessä solut maljattiin alhaisella tiheydellä päivänä nolla ja kasvatettiin, kun läsnä on erilaisia ​​6474 pitoisuudet viisi päivää. Viiden päivän kuluttua suhteellinen Solujen elinkelpoisuus määritettiin värjäämällä CT-Blue (Promega). Tulokset osoittavat, että 6474 IC

50 vaihtelee -15 ja ~75 uM poikki seitsemäntoista solulinjat. Keskimääräinen biologinen IC

50 kaikkien solujen linjat oli 31,4 (6,1) uM, joka on pääosin sama kuin biokemialliset IC

50 29,8 (± 7,6 uM, aiemmin raportoitu [36]. Ei ollut tilastollisesti merkittävä ero SCLC ja NSCLC.

Lyhyet hoitoja HLM006474 johtaa lisääntyneeseen ekspressioon useista tunnetuista E2F geenien

Koska osa analyysimme HLM006474 selvitimme lauseke ja E2F perheenjäsenten hoidon jälkeen Western-blottauksella. NSCLC solulinjat H292 ja H1299 käsiteltiin 60 uM HLM006474 0, 3, 6, 9, 12, ja 24 tunnin kuluttua ja analysoitiin Western blotilla (kuvio 1 A). Yllättävää kyllä, proteiini tasot sekä E2F3a ja b isoformit kasvoi alussa ajankohtina (tyypillisesti noin 6-9 tuntia). tasot E2F1 proteiinin lisääntyminen vaatimattomammin hoidon jälkeen, korkeimmillaan välillä 6 ja 12 tuntia ja palaavat lähtötasolle 24 tunnin kuluttua. in reaali PCR-analyysi, jossa tubuliinin kontrollina, E2F3 mRNA lisääntyi merkittävästi 3 tunnin hoidon ja laski sitten jokaisena seuraavana ajankohtana (kuvio 1 B), kun taas E2F1 mRNA ilmaisun tasot olivat huomattavasti jälkeen lyhyen hoidon kertaa H292 yksinään (kuvio 1 C ) ja E2F4 pysyivät ennallaan tai laskenut kunakin ajankohtana (kuvio 1 D). Toisaalta todettiin, että jotkin geenit yleisesti säätelee E2Fs; MCM10 (kuvio 1 E), MCM2 (kuvio 1 F), ja CCNE2 (kuvio 1G); olivat korkeammin ilmaistaan ​​varhaisessa ajankohtina tavalla verrattavissa havaitut muutokset E2F3 mRNA ilmaisun. Tulokset on esitetty kuviossa 1 viittaavat siihen, että hoito estäjä E2F-DNA: n sitoutuminen voi johtaa aktivointi E2F-säännelty tavoitteet, kuten auto-säädellään E2F perheenjäseniä. E2F perhe tiedetään aktiivisesti tukahduttaa transkriptio [46] – [49], ja näin, ehdotamme, että hoito HLM006474 voivat syrjäyttää E2F-tukahduttavaa kompleksit ja siten aktivoimaan transkription E2F-säätelevät geenit, jotka pääasiallisesti tukahdutettu E2F komplekseja. Tutkia tätä mahdollisuutta, käytimme siRNA nimenomaan vastaan ​​E2F1, E2F3a, E2F3b, E2F4 ja Rb heikentävistä kaksi NSCLC solulinjojen eri E2F komplekseja. Microarray suoritettiin tutkimaan vaikutusta näiden siRNA: iden ilmentymistä koskevat E2F allekirjoituksen edellä on määritelty, joka perustuu E2F3 yliekspressio [50]. Tulokset, joka julkaistaan ​​muualla, osoittaa, että ehtyminen yksittäisten E2Fs tuloksia monissa E2F allekirjoitus geenit aktivoidaan, kuten voisi odottaa de-tukahduttaminen malli.

. NSCLC solulinjat H1299 ja H292 käsiteltiin 60 uM HLM006474 0, 3, 6, 9, 12, ja 24 tuntia, sitten talteen ja tarkasteltiin Länsi-blotit. Pientä nousua E2F1 ja dramaattinen nousu E2F3a ja b-proteiinin tasot, havaittiin varhaisessa ajankohtana molemmissa solulinjoissa.

B-D

. mRNA kerättiin soluista, joita oli käsitelty, kuten on kuvattu 1A, muunnetaan cDNA käyttäen RT-PCR: llä ja analysoitiin ekspressiotasot E3F3 (

B

), E2F1 (

C

), ja E2F4 (

D

) käyttäen reaaliaikaista PCR ja tubuliinin kontrollina. Lyhyt hoidot 6474 muuttunut mRNA: n ilmentymisen tasoa E2F3 ja E2F1, mutta ei E2F4.

E-G.

MRNA: n ilmentymisen hyvin tunnettuja geenejä yleisesti säätelee E2Fs analysoitiin tavalla, joka on samanlainen kuin edellinen kuvaus 1B-D. Ekspressiotasot MCM10 (

E

), MCM2 (

F

), ja CCNE2 (

G

) mRNA analysoitiin tubuliinin kontrollina ja olivat kaikki todettu olevan korkeammin ilmaistuna seuraava lyhyt hoitoja 6474. Huomautuksia: ns edustaa ole merkittävä, * edustaa p 0,05, ** edustaa p 0,01.

HLM006474 synergizes paklitakselilla

Todettuaan, että 6474 on antiproliferatiivisia vaikutuksia keuhkosyövän solulinjoja , mutta se voi vaikuttaa E2F-geenien monimutkaisella tavalla, pyrimme määrittämään, onko 6474 olisi synergisesti kemoterapeuttiset lääkkeet, joita käytetään yleisesti keuhkosyövän hoidossa. H1299-soluja käsiteltiin 6474 yksinään ja yhdistelmänä sisplatiinin, gemsitabiinin ja paklitakselin. Yhdistelmät valittiin perustuu IC

50 solujen yksittäisten yhdisteiden ja yhdistelmä indeksit laskettiin [43]. Kuvio 2 osoittaa, että on olemassa antagonismia 6474 ja sisplatiinin (paneeli 2A, CI keskiarvo 1,40) ja gemsitabiinia (paneeli 2B, CI keskiarvo 1,39). Sen sijaan 6474 heikosti synergizes paklitakselilla (paneeli 2C, CI keskiarvo 0,98). Tutkimaan edelleen luonnetta synergiaa 6474 ja paklitakselin, H1299-soluja käsiteltiin vaatimaton annoksia kunkin lääkkeen yksinään tai yhdistelmänä käyttää Western blot analyysissä. Ulkonäkö pilkkoa PARP käsitellyissä soluissa lääkeyhdistelmän vahvistaa, että yhdistelmä 6474 ja paklitakseli aiheuttaa enemmän apoptoosia kuin kumpikaan lääkeaine yksinään (kuvio 2D). Tutkia, onko tämä synergia olisi havaittu ylimääräisiä solulinjoissa, tutkimme myös NSCLC solulinjassa H292. Kuten tapauksessa H1299 soluja, 6474 synergized paklitakselin (paneeli 2G, CI keskiarvo 0,96), mutta ei osoittanut mitään synergiaa sisplatiinin (paneeli 2E, CI keskiarvo 1,51) tai gemsitabiinia (paneeli 2F, CI keskiarvo 1,46).

A-C.

H1299 solut altistettiin luelinkykymäärityksillä läsnäollessa 6474 (HLM) yhdistettynä sisplatiiniin (

, CisPt), gemsitabiini (

B

, Gem) ja paklitakselin (

C

, Pac), kuten (katso menetelmät). Tulokset paljastavat synergia paklitakselilla (CI keskiarvo 0,98) ja antagonismi sisplatiinin ja gemsitabiinin (CI keskimäärin 1,40 ja 1,39, tässä järjestyksessä).

D

. Western blotting osoittaa, että H1299-solut käsiteltiin 72 tunnin ajan 20 uM 6474 yksin, 5 nM paklitakseliin yksinään, tai näiden kahden yhdistelmä, 6474 ja paklitakselin synergisesti induktioon PARP pilkkominen.

E

–

G

. H292-soluja testattiin samalla elinkelpoisuuden Määrityksissä tehoa 6474 (HLM) yhdistettynä sisplatiinin (

E

, CisPt), gemsitabiini (

F

, Gem) ja paklitakselin (

G

, Pac). Kuten nähdään H1299 soluissa, 6474 synergizes paklitakselin (CI keskiarvo 0,96), mutta on antagonistinen sisplatiinin (CI keskiarvo 1,51) ja gemsitabiinia (CI keskiarvo 1,46).

E2F3 tasoilla vaikutus herkkyys paklitakseliin

havainnot että E2F estäjä voisi toimia synergisesti paklitakselin ja aiemmin keskusteltu kasvua E2F3 tasoille aikaisin ajankohta hoitoja HLM006474 ehdotti, että E2F3 toimintaa saattavat vaikuttaa paklitakselin herkkyyttä. Reaaliaikainen PCR käytettiin analysoimaan endogeenisen ilmentymisen E2F3 (jossa GAPDH palvelee sisäisenä kontrollina), ja sen jälkeen nämä arvot korreloivat paklitakseli logiikan

50 kunkin solulinjan (kuvio 3A). Lysaatit kymmenen NSCLC solulinjojen ajettiin Western blot (kuvio 3B) ja densitometrisesti analysoitiin β-aktiini kontrollina. Nämä E2F tasot piirrettiin sitten vastaaviin paklitakseli Logic

50-arvot (kuvio 3C). Sekä reaaliaikainen PCR ja Western blot -analyysit, vahva käänteinen korrelaatio E2F3 ja paklitakselin IC

50 todettiin. Enemmän muodollisesti testata tätä hypoteesia, käytimme siRNA tyhjentämiseksi H1299 soluihin E2F3a ja E2F3b ja sitten määritettiin niiden herkkyys paklitakseli mitattuna MTS määrityksissä. Western blotting paljastaa lähes täydellisen Knockdown kohdennettujen E2Fs että H1299-soluissa (kuvio 4A). Ohjaus siRNA ei vaikuttanut E2F ilmaisua. Kuten odotettua, kuva 4B paljastaa, että solut vähenivät E2F3 tasot olivat vähemmän herkkiä paklitakselille.

. cDNA kymmenen NSCLC solulinjoja käytettiin reaaliaikaista PCR havaita endogeenisen E2F3 ekspressiotasoja (verrattuna GAPDH kontrollina). Ilmaisu tasot verrattiin sitten paklitakseli logiikan

50 jokaisen rivin ja graafisesti esitetty.

B

. Lysaatit kymmenen NSCLC solulinjoista valmistettiin ja juoksi Western blot havaita endogeenisten E2F3 tasoilla.

C

. Densitometrisesti analysoi arvot proteiinin ekspressiotasoja (verrattuna p-aktiini kontrollina) Sitten graafisesti vastaan ​​paklitakseli Logic

50 jokaiselle riville, kuten on esitetty.

. H1299-soluja transfektoitiin ohimenevästi 200 pmol ohjaus, E2F3a tai E2F3b siRNA ja kerättiin 24 tunnin kuluttua. Western blotit näistä lysaateista osoittavat laajuus E2F knockdown.

B

. MTS määrityksiä käytettiin määrittämään herkkyyttä kustakin solulinjasta 50 nM paklitakselia. Solut, joissa heikentynyt E2F3 tasot olivat elinkelpoisia läsnä paklitakselin kuin kontrolli soluja. Huomautuksia: * edustaa p 0,05, ** edustaa p 0,01.

Johtopäätökset

CDK /Rb /E2F-reitin muodostaa hyvän kohde hoidettaessa erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia. Vaikka kehitys on ollut hidasta johtuen myrkyllisyydestä varhaisen yhdisteiden, CDK-inhibiittorit ovat alkaneet saada pitoa kliinisissä tutkimuksissa [33], [51], [52]. Ehdotamme, että kohdistettu CDK /Rb /E2F-reitin entisestään loppupään kello E2F tasolla, voi myös olla hyötyä. Niinpä olemme tutkineet mahdollisuuksia yleiseurooppalaisen E2F estäjä, HLM006474, hoidossa keuhkosyövän.

Ehdotamme malli kuvassa 5 selittää tuloksemme. Ensinnäkin, havaitsemme, että hoito 6474 johtaa ohimenevää paitsi E2F3 proteiinia ja mRNA: n ilmentymisen tasoa, mutta myös kasvua monissa muissa E2F-säännelty selostukset. Nämä takaperoiselta havainnot kohtuullisia sen pitkään tunnettu havainto, että E2Fs ovat aktiivisia repressors transkription [46] – [49]; ne kuitenkin herättävät huolta, että yleiseurooppalainen E2F kompleksin esto voi olla ei-toivottuja seurauksia. Siten tuleva E2F kohdistetut yhdisteiden tulisi selektiivisesti estää transkription aktivoivaa E2F-kompleksit ja vapaa-transkription tukahduttaa E2F komplekseja. Toiseksi uskomme kohonneeseen E2F3 (ja todennäköisesti muut E2F geenien) lisätä herkkyyttä solujen paklitakseliin. Perustamme tähän tulokseen korrelaatio havaittu normaalin E2F3 tasojen ja paklitakseli herkkyys sekä tulosten E2F3 siRNA kokeiluja. Tämä dokumentoi ensimmäisen linkin tasojen välillä E2F3 ja paklitakselin NSCLC, vaikka suhde korkea E2F3 aktiivisuus ja lisääntynyt herkkyys paklitakseli on aiemmin havaittu munasarjojen [23], ja ER-negatiivinen rintasyöpä [24]. Mekanismi, jolla E2F3 tuottaa herkkyys paklitakseli on tuntematon. Yksi mahdollisuus on, että se liittyy suoraan E2F3 roolia solusyklin. Esimerkiksi soluissa korkean E2F3 tasolla, voisi olettaa, että solut lisääntyvät enemmän, mikä antaa solujen suuremman mahdollisuuden tulla M vaiheeseen (jossa paklitakseli olisi tehokkain). Tämä selitys yksinään viittaisi siihen, että nämä solut pitäisi olla herkempiä gemsitabiinin sekä johtuen tulevien S-vaiheeseen useammin. Voisi olla todennäköisempää, että herkemmäksi paklitakseli johtuu apoptoosin säätelevä geenit tulossa erittäin ilmaisi johtuen kasvusta E2F3. Lisäksi se on ollut aiemmin todettiin, että yli-ilmentyminen E2F3 johtaa rikastuminen geenejä, jotka ovat mikrotubuluksiin liittyvä [23], joten tämä voi ehkä selittää korrelaation näemme välillä E2F3 tasoja ja paklitakselin herkkyys. Samoin kuten edellä mainittiin, E2F3 on todettu olevan rooli on G2 /M tarkastuspiste kautta sääntelyn ilmentymisen Aurorakinaasi [14], cdc2 [15], ja sykliini B1 [15], [16], joka voi myös viitata suurempia E2F3 johtaa lisääntymiseen soluissa syöttämällä että vaihe solusyklin ja ehkä sitten lisäämällä paklitakseli herkkyyttä.

käsittelemättömät solut, E2F /dimerointi kumppani (DP) /Rb kompleksit ovat enemmistönä, ja siten, E2F3 tasot ovat suhteellisen heikosti (samoin kuin monet muut E2F geenien). Hoito HLM006474 häiritsee E2F /DP /Rb tukahduttavaa kompleksit sitoutumasta DNA, mikä lisää transkription E2F3 (samoin kuin monet muut E2F geenien). Tässä mallissa, kohonneet tasot E2F3 herkistää soluja taksaanin hoitoon, kuten aiemmin on osoitettu, kautta tuntematon mekanismi.

Olemme osoittaneet, että HLM006474 on tehokas keuhkosyöpää solulinjoissa. Lisäksi olemme osoittaneet, että 6474 synergizes hyvin paklitakselilla, mahdollisesti johtuen 6474 vaikutuksista E2F3 tasoilla. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että tehokas, spesifinen aktivaattori E2F esto voi olla käyttökelpoinen hoidettaessa NSCLC tulevaisuudessa (etenkin yhdessä muiden aineiden) ja että E2F3 tasoja voi olla hyvä ennustaja paklitakselin herkkyyden NSCLC.

Kiitokset

monet antelias lahjoja reagenssien tunnustetaan Materiaalit ja menetelmät.

tri. Fumi Kinose of Moffitt n SPORE Lung Cancer Cell Core toimittamaa validoitu solulinjoja, mukaan lukien ystävällisesti lahjoittanut lab John D. Minna University of Texas Southwestern Dallasissa. Dr. Dung-tsa Chen ja Jimmy Fulp of Moffitt n Biostatistics Core suoritettu tilastollinen analyysi. Drs. Christopher L. Cubitt ja Shumin Zhang Moffitt n Experimental Therapeutics Core suoritettu luelinkykymäärityksillä ja tietojen analysointi.