Krooninen sairaus

tiivistelmä

Hypoksia ja seerumin ehtyminen ovat tavanomaisia ​​kiinteitä kasvaimia, jotka esiintyä angiogeneesiä torjuvina, säteilytys ja kemoterapia poikki erilaisia ​​syöpäsairauksia. Tässä osoitamme, että kasvainsolut ilmentävät CD133, merkkiaine peräsuolen syövän aloittamaan tai kantasoluja, rikastetaan ja hengissä hypoksiaolosuhteissa ja seerumin ehtyminen olosuhteissa, kun taas CD133- solujen apoptoosin. CD133 + kasvainsolut lisätä syövän kantasoluja ja epiteelin-mesenkymaalitransitioon ominaisuuksia. Lisäksi kautta seulonta paneeli tyrosiini- ja seriini /treoniinikinaasi reitit tunnistimme Hsp27 konstitutiivisesti aktivoituu CD133 + soluissa sijaan CD133- solu hypoksiaolosuhteissa ja seerumin ehtyminen olosuhteissa. Kuitenkin, ei ollut eroa Hsp27 aktivaation välillä CD133 + ja CD133- solujen normaaleissa kasvun edellytys. Hsp27 aktivointi, joka oli välittämien p38MAPK-MAPKAPK2-Hsp27 reitti, tarvitaan CD133 + -solujen estää kaspaasi 9 ja 3 pilkkominen. Lisäksi esto Hsp27 signaloinnin herkistää CD133 + solujen hypoksia ja seerumin ehtyminen indusoiman apoptoosin. Lisäksi antiapoptoottisten reitti on myös aktivoitu pallomainen kulttuuri-rikastettu CD133 + syövän kantasolut eri kiinteän kasvaimen solujen, mukaan lukien keuhko-, aivo- ja suun syöpä, mikä viittaa siihen, että on yleinen reitti aktivoituu syövän kantasoluja useilta kasvaintyypeissä. Siten aktivointi PP2A tai inaktivoida p38MAPK-MAPKAPK2-Hsp27 reitti voi kehittää uusia strategioita syövän hoidossa jonka poistaminen niiden TIC väestöstä.

Citation: Lin SP, Lee YT, Wang JY, Miller SA, Chiou SH, Hung MC, et al. (2012) Survival of Cancer Stem Cells alle Hypoksia ja Serum väheneminen kautta väheneminen PP2A Toiminta ja aktivointi p38-MAPKAPK2-Hsp27. PLoS ONE 7 (11): e49605. doi: 10,1371 /journal.pone.0049605

Editor: Marianne Koritzinsky, University Health Network, Kanada

vastaanotettu: 29 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 11 lokakuu 2012; Julkaistu: 20 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Lin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain National Science neuvosto (97-3111-B-010-001, ja 99-3111-B-010-005-), Taipei Veterans General Hospital (V98E1-002), MD Anderson Cancer Center /Kiina Medical University ja sairaala sisar Institution Fund, ja National Yang-Ming University, opetusministeriö. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tätä tutkimusta varten. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

heterogeeninen fenotyyppiset ja molekyylitason piirteitä ihmisen syövistä ovat funktio niiden kasvain aloittamisesta tai syövän kantasolujen (-lämpökameroissa) pitoisuus [1]. CD133 + solupopulaation osuus on noin 2,5% paksusuolen syövän kasvainten solujen [2], ja aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että tämä solupopulaatio sisältää useita erilaistumattoman kasvaimia aiheuttavasta -lämpökameroissa [2], [3]. He osoittivat, että ihon alle annetun CD133 + peräsuolen syövän soluja, mutta ei CD133- solut pystyivät helposti jäljentää alkuperäisen kasvaimen immuunipuutteisilla hiirillä. Vapauttaminen TIC itseuudistuminen on todennäköistä vaatimus syövän kehittymiseen [4], [5], [6], ja selviytymistä -lämpökameroissa voi olla vastuussa vastus syövän hoitojen ja tuumorien uusiutumista, [7]. Taustalla olevien mekanismien -lämpökameroissa selviytymisen antituumorivaikutuksen hoitomuodot ovat suurelta osin tuntemattomia. Kuitenkin kasvu ABC kuljettajat [8], aktiivisia DNA-korjaus kapasiteetti [7], ja kestävyys apoptoosin sytokiinien tai aktivoimalla tiettyjä reittejä on raportoitu. Siten tunnistaa signalointireitit selviytymisen ja itseuudistumisen ominaisuudet -lämpökameroissa on viime aikoina saanut paljon huomiota, koska lupaus uusi solukohteeseen hoitoon syöpien.

Lämpöshokkiproteiinit ( HSP: t) on keskeinen rooli molekyyli saattajia avustamalla oikea taitto stressiä kertynyt väärin laskostuneet proteiinit, ja suoraan vuorovaikutuksessa eri osien säädeltyä ohjelmoidun solukuoleman koneita. Niistä Hsp27 pohjapinta taso on yleensä korkea soluissa tai kudoksissa monenlaisia ​​kasvaimia [9]. Lisäksi on osoitettu, että Hsp27 parantaa vastustuskykyä kemoterapian kanssa sisplatiinia ja doksorubisiinin, ja lisää tumoriogenic mahdollisia rotan koolonkarsinoomasoluissa [10].

Hypoksia ja seerumin ehtyminen ovat tavanomaisia ​​kiinteitä kasvaimia, jotka esiintyä angiogeneesiä torjuvina, säteilytys ja kemoterapia poikki monenlaisia ​​maligniteetteja [11], [12]. Hypoksia ja anemia (joka edistää kasvaimen hypoksia) voi johtaa ionisoivan säteilyn ja kemoterapian resistenssin viemällä tuumorisoluja hapen välttämättömiä sytotoksista aktiivisuutta näiden aineiden [13], [14]. Hypoksia saattaa myös vähentää kasvaimen herkkyyttä sädehoitoa ja kemoterapiaa yhden tai useamman epäsuoran mekanismeja, jotka sisältävät proteomic ja genomin muutokset. Nämä vaikutukset puolestaan ​​voi johtaa lisääntyneeseen invasiivisuus ja metastaattisen potentiaalin, menetys apoptoosin, ja kaoottinen angiogeneesiä, mikä lisää entisestään hoidon vastus. Kuitenkin vaste kasvainsolujen hypoksia ja seerumin ehtymisen ja taustalla olevaa mekanismia välittää tämä vastaus on selvennettävä. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että useimmat koolonkarsinoomasoluissa apoptoosia altistuksen jälkeen seerumin ehtyminen ja hypoksia, ja CD133 + populaatio koolonkarsinoomasoluissa kestää paremmin apoptoosia konstitutiivisen aktivaation anti-apoptoottisen signalointireitin johon Hsp27. Lisäksi osoitamme, että -lämpökameroissa voidaan herkistynyt apoptoosin ja solukuoleman kautta inaktivaatiota Hsp27 reitin.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja Hypoxic ehdot

ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän solulinja HT-29 saatiin American Type Culture Collection (ATCC). CCS ja HCW primääriviljelmässä solut lahjakas tohtori Wen K. Yang (laboratorio Cell /Gene Therapy, Kiina Medical University Hospital, Taichung, Taiwan). CCS Solut eristettiin primäärikasvain naispuolisen Duke C

3 paksusuolen adenokarsinooma. HCW solut eristettiin maksasta etäpesäke näyte uros paksusuolen adenokarsinooma. Kaikki solut kasvatettiin DMEM: ssä (Gibco, Grand Island, NY,), joka sisälsi 10 yksikköä /ml penisilliiniä, 10 ug /ml streptomysiiniä, 2 mmol /L glutamiinia, 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Gibco), 37 ° C kostutetussa ilmakehässä 5% CO

2. Sillä hypoksinen olosuhteet, soluja viljeltiin kaasuseoksessa, joka koostuu 94% N

2, 5% CO

2, ja 1% O

2, jota pidettiin käyttäen inkubaattorissa kaksi ilma anturit, yksi CO

2 ja toinen O

2; O

2-pitoisuus saavutettiin ja ylläpitää käyttämällä toimittamisesta typpikaasua (N

2). Jos O

2 prosenttiyksikköä nousee yli halutun tason, N

2 kaasua automaattisesti järjestelmään syötetään syrjäyttää liikaa O

2. Sillä sferoidi viljelyn jälkeen solut suspendoitiin uudelleen seerumittomaan DMEM /F12-väliaineessa, johon on lisätty N2 täydennys, ihmisen rekombinantti-EGF: ää (20 ng /ml; PeproTech), ja FGF (10 ng /ml; PeproTech), ja maljattiin tiheydellä 10

4 solua /kuoppa 6-kuoppaisille Ultra-Low Attachment Microplate (Corning, Lowell, MA).

Analyysit Apoptosis

Apoptoosi määritettiin matkapuhelinverkon väriaine, joka havaitsee kalvo muutokset (fosfatidyyliseriini flip) ja tahrat apoptoottisten solujen (APOPercentage; Accurate Chemical Scientific Corporation, New York, NY). Värjätään solut määritettiin käyttämällä Spectramax 250 mikrolevynlukijaa (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Vaihtoehtoisesti, solut kerättiin trypsiinikäsittelyllä, värjättiin TUNEL-määritys (in situ Cell Death Detection Kit, Roche), ja visualisoitiin käyttämällä fluoresenssimikroskooppia. Havaitsemiseksi katkaistun muotojen kaspaasi 3 ja 9, proteiini lysaatit valmistettiin ja western blot suoritettiin ensisijaisen vasta ostettu Cell Signaling Technologies (Beverly, MA).

Cell Migration ja invaasiomääritys

migraatiokokeessa, 4 x 10

4 solut, suspendoitiin 200 ul: aan DMEM täydennettynä 0,5% FBS, ympättiin ylemmässä kuopassa 24 kuopan siirtokuoppaan joka sisälsi suodatin 8 um huokosia ( Corning, Costar, USA). Alemmassa hyvin, 600 ui DMEM täydennetty 15% FBS lisättiin. -Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tuntia. Solut, jotka säilyvät ylemmän hyvin poistettiin vanupuikolla ja näiden siirtynyt vastakkaiselle puolelle suodattimen värjättiin DAPI ja laskettiin fluoresenssimikroskoopissa 200-kertaisella suurennuksella. Invasiivista kyky solujen määritettiin matrigeelin (Becton Dickinson) -päällystettyihin polykarbonaattisuodattimille 8 um huokoset 24 kuopan transwell. Cell istutustiheyteen, viljelynestettä kulttuuri ajan, ja arviointimenetelmä oli sama migraatiokokeessa.

Reaaliaikainen RT-PCR

menetelmä reaaliaikaisen RT-PCR suoritettiin kuten on kuvattu [15]. Lyhyesti, kokonais-RNA (1 ug) kunkin näytteen käänteisesti transkriptoitiin 20 ui käyttäen 0,5 ug oligo-dT: n ja 200 U Superscript III RT (Invitrogen, Carlsbad, CA). Monistus suoritettiin kokonaistilavuudessa 20 ui, joka sisälsi 0,5 uM kutakin aluketta, 4 mM MgCI

2, 2 ui LightCycler ™ -FastStart DNA Master SYBR vihreä I (Roche Molecular Systems, Alameda, CA) ja 2 ui 110 laimennettua cDNA: ta. PCR-reaktiot valmistettiin kahtena kappaleena, ja kuumennettiin 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 40 sykliä denaturointi 95 ° C 15 sekuntia, pariutuminen 60 ° C: ssa 1 min ja pidentäminen 72 ° C: ssa 20 sekunnin ajan. Standard käyrät (sykli kynnysarvojen vastaan ​​templaattikonsentraation) valmistettiin kunkin kohdegeenin ja endogeenisen viite (GAPDH) kussakin näytteessä. Kvantifiointi Tuntemattomien näytteiden suoritti LightCycler suhteellinen kvantifiointitietokoneohjelmaa versio 3.3 (Roche).

virtaussytometrianalyysissä, lajittelu ja MACS-erottelu

Jousitus syöpäsolujen nostetaan EDTA pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa FITC- tai PE-konjugoituja monoklonaalisia vasta-aineita ihmisen CD merkkiaineiden 50 ui pesupuskuria (PBS, 2% FBS: ää). Inkuboinnin jälkeen, solut sitoutuneiden vasta-aineiden pestiin kahdesti pesupuskurilla ja kiinnitetään 1% paraformaldehydiä (PBS: ssä). Hiiren isotyypin vasta toimi verrokkeihin nähden. Solut analysoitiin FACScan-virtaussytometrillä käynnissä CellQuest-ohjelmaa (Becton Dickinson, San Jose, CA). Solut, joita käytetään lajittelua varten valmistettiin menetelmän virtaussytometrialla kaikki reagenssit aseptisen ja ilman kiinnitystä. Magneettinen solujen erottaminen (MACS) on CD133 + -solujen suoritettiin valmistajan ohjeiden (https://www.miltenyibiotec.com/en/NN_21_MACS_Cell_Separation.aspx). Inkubaation jälkeen immunomagneettisia CD133-mikrohelmien (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Saksa) 30 minuuttia 4 ° C: ssa, solut pestiin PBS + 0,5% BSA plus 2 mM EDTA, suodatetaan 40 um solun siivilä, ja ajaa yli magneettinen solun erotuslaite (Auto-Macien; Miltenyi Biotec) positiivisen valinnan CD133 + solujen.

Western Blot analyysi

solun uutteet valmistettiin M-PER (Pierce, Rockford, IL ) plus proteaasiestäjäseostabletit (Halt ™, Pierce) ja proteiinin konsentraatiot määritettiin käyttäen BCA-määritystä (Pierce). Alikvootit proteiinin lysaatit erotettiin SDS-10% polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin PVDF-membraanille suodattimia, jotka estettiin 5% blotting luokka maitoa (Bio-Rad, Hercules, CA) TBST (20 mM Tris-HCI [pH 7,6] , 137 mM NaCI, 1% Tween 20). Sitten kalvot koettimena ilmoitettu primaaristen vasta-aineiden, saatetaan reagoimaan vastaavan sekundaarisia vasta-aineita, ja havaitaan käyttäen kemiluminesenssi määritystä (Millipore, Billerica, MA). Kalvot altistettiin röntgenfilmille visualisoida nauhojen (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Vasta-aineita pPP2A (# 12615; Santa Cruz), pP38 (# 9216; Cell Signaling), pMAPKAPK2 (# 3007; Cell Signaling), pHsp27 (AF2314, R Cell Signaling), N-kadheriinin (# 4061; Cell Signaling), vimentiinistä (MAB3400, Millipore), fibronektiinin (sc-8422; Santa Cruz), pJak2 (# 3771; Cell Signaling) ja PC- src at Tyr416 (# 2101; Cell Signaling) käytettiin. PP2 ja PP3 ostettiin Calbiochem.

Immunofluoresenssi- ja immunohistokemiallinen värjäys

immunofluoresenssilla, palloja käsiteltiin estopuskurilla inkuboitiin hiiren tai kanin vasta-aineita ihmisen CD 133 (AC133 hiiri IgG, Miltenyi) CK 20 (Ks20.8 hiiren IgG2a, GeneTex, San Antonio, TX), CDX2 (Chemicon, Temecula, CA), ja β-kateniinin (H-102, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), sopivina laimennoksina yön yli 4 ° C: ssa, pestiin perusteellisesti PBS: llä, ja saatetaan reagoimaan vastaavan fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) konjugoitua sekundäärisiä vasta-aineita. Immunofluoresenssikoe havaittiin fluoresenssimikroskoopilla. Immunohistokemiallista värjäystä parafinoidut tuumorisektioiden poistettiin parafiini, vedettömät ja antigeeni noutaa asettamalla osiot Declere työliuoksessa (Cell Marque, Austin, TX) mikroaaltouunissa 20 minuutin ajan. Endogeeninen peroksidaasi aktiivisuus estettiin 3% vetyperoksidia. Jäljellä oleva entsymaattinen aktiivisuus poistettiin PBS-pesun, ja epäspesifistä värjäytymistä blokattiin Ultra V Block 5 min (Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA). Sitten leikkeet saatettiin reagoimaan ensin vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa, pestiin perusteellisesti PBS: llä, ja saatetaan reagoimaan vastaavan biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineita (Vector Laboratories, Burlingame, CA) 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja käsiteltiin streptavidiini-peroksidaasilla (LSAB Kit; Dako, Carpinteria, CA), jonka jälkeen diaminobentsidiinin värjäys. Counterstaining suoritettiin Mayerin hematoksyliinillä.

seulonta havaitseminen fosforylaatio RTK: iden ja perhe-MAPK

Membraanit Human Phospho-reseptorityrosiinikinaasia Array Kit (luettelonumero ARY001; R R Invitrogen, Carlsbad, CA). Supernatantit kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen ja sitten suodatettiin. Subkonfluentit solut infektoitiin lentiviruksen, kun läsnä on 8 ug /ml polybreeniä (Sigma-Aldrich). 24 h infektion jälkeen poistimme keskipitkän ja korvattiin tuoreella sisältävään kasvualustaan ​​puromysiiniä (4 ug /ml), ja valitaan infektoitujen solujen 48 tuntia.

PP2A fosfataasin aktiivisuusmääritys

PP2A aktiivisuus määritettiin käyttämällä fosfataasi kit V2460 (Promega, Madison, WI). Lyhyesti, solut erotettiin MACS tai rikastettu -lämpökameroissa lysoitiin fosfataasi varastoinnin puskuriin, minkä jälkeen poistetaan endogeenisen fosfaatti käyttämällä spin sarakkeita, jonka seriini /treoniini-fosfataasi koejärjestelmässä. 1 ug proteiinia näytteet kolmena rinnakkaisena inkuboitiin fosfopeptidi on PP2A reaktiopuskuria 2 h huoneen lämpötilassa. Pesun jälkeen näytteet colorized väriaineen seosta 15 minuutin ajan ja sen jälkeen pysäyttämällä reaktio, ja OD-arvot aallonpituudella 600 nm mitattiin. Aineisto normalisoitiin ohjaus- solujen 100%.

Tilastollinen analyysi

Kaikki arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Vertailut kahden ryhmän välillä analysoitiin Studentin t-testi. Arvoa p 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Hypoksia ja Serum väheneminen Kasvata väestö CD133 + solujen

Altistuminen koolonkarsinoomasoluissa sekä hypoksia ja seerumin väliaineessa johti useita solukuoleman, mikä viittaa suurin osa kasvainsolujen eivät selvinneet näissä olosuhteissa. Kuitenkin olemme huomanneet, että prosenttiosuus CD133 + soluja HT-29 koolonin syövän solujen lisääntynyt muutaman kertaiseksi hypoksisissa olosuhteissa, ja myös seerumittomalla väliaineella, verrattuna happiolosuhteissa. Kuitenkin alle sekä hypoksia ja seerumivapaassa olosuhteissa CD133 + väestön nostettiin lähes 30-kertaisesti (kuvio 1A). Kasvu prosenttiosuus CD133 + -solujen havaittiin 2 päivän kuluttua ja vielä dramaattisesti päivänä 4 tai 6. Tämä lisäys CD133 + -solujen nähtiin myös CCS ja HCW primaariviljelmän koolonsyöpäsoluja (Fig. 1 B). Kasvu prosenttia CD133 + solujen kuitenkaan ei johtunut kasvusta kokonaismäärän CD133 + solujen, kuten todellinen määrä CD133 + solujen laski hieman yhdessä kasvua kulttuurin hypoksiaolosuhteissa ja seerumivapaassa väliaineessa olosuhteissa (kuvio 1 C) tai verrattuna määrä CD133 + -solujen seerumista sisälsi keski- ja /tai normoksia olosuhteissa (kuvio 1 D). Koska CD44 + ja CD166 + soluja pidetään myös tics kolorektaalisyövässä [16], me kysyi myös näitä markkereita liittyi CD133 ja vaikuttavat hypoksia ja seerumin ehtyminen. Suurin osa CD133 + solujen havaittiin olevan negatiivisia sekä CD44 ja CD166, kuitenkin siten, hypoksia ja seerumin ehtyminen havaitsimme kasvu CD166 + -solujen, mutta ei CD44 + ja väestön CD166 + oli paljon pienempi kuin CD133 + (kuvio 1 E) , mikä viittaa siihen, että suurin osa CD133 + väestöstä on erillään CD166 + /CD44 + solut. Kuten odotettua, CD133 + solujen värjättiin negatiivisesti CD29, CD90 ja CD105, markkereita mesenkymaaliset kantasolut ja CD45 markkeri hematopoeettisten solujen (kuvio 1 F). Ei solut värjättiin positiivisia CD105 ja CD45, ja mikään näistä merkeistä lisättiin alle seerumin heikkenemistä ja hypoksian olosuhteissa (kuvio 1 F).

(A) HT-29, (B), CCS ja HCW solut ympättiin normaali kasvualustaan ​​(FBS) alle normoksia (Nor). Solut altistettiin seerumin ehtyminen (SF), hypoksia (Hyp), hypoksia ja seerumin ehtyminen, tai verrokkina, samoissa olosuhteissa, ja 2, 4 tai 6 päivää myöhemmin solut kerättiin analysoimiseksi CD133 prosenttiosuus flow cytometry. (C vasen paneeli) Yhteensä solujen määrä kunkin kunto ja (C oikea paneeli) solujen määrä CD133- ja CD133 + HT-29-solujen ilmaistu jakso hypoksiaolosuhteissa ja seerumin ehtyminen mitattiin. (D vasen paneeli) kokonaismäärä solujen määrä ja (D oikea paneeli) lukumäärät CD133 + ja CD133- solujen CCS ja HCW solujen 4 vuorokautta kunkin kunnossa. (E ja F) Virtaussytometria pinta proteiiniprofiileja viljeltyjen solujen hallinnassa, tai hypoksiaolosuhteissa ja seerumin ehtyminen 4 päivää.

CD133 + soluilla ominaisuudet peräsuolen -lämpökameroissa

edelleen käsitellä onko CD133 + väestöstä ovat todellisia peräsuolen -lämpökameroissa käytimme seuraavat ominaisuudet liittyvät peräsuolen -lämpökameroissa kirjallisuudessa luonnehtimaan CD133 + väestöstä. Koska yksi olennainen piirre kyky -lämpökameroissa on muodostaa eriytymättömiä palloja (palloset) [2], kysyimme, onko CD133 + solut eristettiin hypoksia ja seerumin ehtyminen päteviä. Olemme havainneet, että CD133 + solut pystyivät muodostamaan palloja helpommin kuin CD133- soluja viljeltiin seerumivapaassa väliaineessa, johon on lisätty EGF: n ja FGF2 (kuvio 2A). Kuten odotettua, solut aloilla olivat positiivisia CD133, mutta negatiivinen eriytetyn markkereita Kolorektaalituumorien eli ydinaseiden β-kateniinin (aktivoitu β-kateniinin), sytokeratiini 20 (CK20) ja pyrstö tyyppi homeobox transkriptiotekijä 2 (CDX2) (kuvio 2B ja 2C), mikä osoittaa näillä aloilla olivat erilaistumaton aloilla. Sen tutkimiseksi, mikäli rikastettu CD133 + väestön aloilla on kyky muodostaa eriytetyn markkereita Kolorektaalituumorien, CD133 + palloja ympättiin matrigeeliä ja altistettiin seerumia sisältävää alustaa. Kun on viljelty näissä olosuhteissa 2 viikon ajan, ne alkoi muodostua eriytetyn palloja, jotka olivat vähentyneet CD133 värjäystä, positiivinen ydinvoiman β-kateniinin, CK20 ja CDX2 (kuvio 2B ja 2C). Tärkeintä, CD133 + -solujen, injektio on alle 1,000 soluissa oli riittävä muodostaa kasvaimia, kun istutetaan immuunivajausta hiirillä, mutta jopa 100000 solua, CD133- eivät pysty muodostamaan kasvaimia (kuvio S1A). Voidaan olettaa, kasvaimia muodostettu CD133 + -solujen, samanlainen kasvaimia muodostettu bulk-solut, jotka värjäytyivät positiivisesti ja peräsuolen syövän merkkiaineet (kuvio S1B). Lisäksi ksenograftikasvaimissa muodostettu CD133 + sisälsi myös CD133 + ja CD133- soluja (kuvio S1B), ja CD133 + väestöstä eristettiin ksenograftikasvaimissa muodostivat solujen populaation sekoitettuna CD133 + ja CD133- solut

ex vivo

, kun taas CD133- väestöstä yhä syntyi CD133- soluihin (kuvio S1C). Nämä tiedot osoittivat CD133 + solut muodostivat ksenografti kasvain ja synnytti molemmat CD133 + ja CD133- soluja, mikä viittaa näiden CD133 + solut hallussaan ominaisuuksia -lämpökameroissa. Lisäksi, kvantitatiivinen RT-PCR osoitti, että CD133 + -solut oli kasvua ekspression useita kantasolujen liittyviä geenejä, mukaan lukien, Oct4, Nanog, nestiinin, Klf4, Notch1, Notch 2 ja Notch 3, c-myc, Gil1, Wnt5a ja VEGF (Kuva 2D ja kuvio S2). Oct4 ja Nanog yksinomaan ilmaistaan ​​alkion kantasoluja [17], nestiinin ilmaistaan ​​pluripotenttien hermo kantasoluja [18], kun taas Klf4, c-myc, ja geenit Notch, SHH, ja WNT reitit on ilmaistu -lämpökameroissa erilaisia syövistä [19], [20], [21]. VEGF on yksi oletetun tavoitteet hypoksian indusoima tekijä-1α (HIF-1α) [22]. HIF1-α on myös osoitettu indusoivan epiteelisolujen-mesenkymaalitransitioon (EMT) [23], joka on äskettäin osoitettu pystyä tuottamaan solujen kantasolujen ominaisuuksia rintasyövän [24]. Kiinnostavaa kyllä, Huomasimme myös, että CD133 + solut vähenivät E-kadheriinin ja kasvoi EMT markkereita, kuten N-kadheriinin, vimentiinistä ja fibronektiini kvantitatiivisella RT-PCR ja western blot-analyysi (kuvio 2E). Tärkeää on, että kasvu EMT merkkiaineiden CD133 + soluissa liittyi myös kasvuun kapasiteetin solujen maahanmuuton ja invaasiota, ominaisuudet solujen lisääntynyt EMT (kuvio 2F). Siten CD133 + soluilla EMT ominaisuuksia ja lisätä kantasolujen markkereita ja HIF kohdegeenin.

(A) Sphere muodostuminen kapasiteetti CD133 + ja CD133- soluja. CD133 + ja CD133- soluja, erotettiin MACS jälkeen 4 päivää viljelty hypoksia ja seerumin ehtyminen, jotka viljeltiin seerumittomassa olosuhteissa, kun läsnä oli EGF: ää (10 ng /ml) ja FGF2 (10 ng /ml). Sphere muodostus laskettiin 2 viikon ( 25 tai 25 ilmaisee solujen määrä kunkin pallosta.). Virhe palkit kuvaavat keskihajontaa. (* P 0,05 verrattuna CD133-soluja määritettynä Studentin t-testi.) (B) CD133 + solujen jälkeen MACS erottamisen päivänä 4 altistuksen hypoksia ja seerumin ehtyminen, viljellään seerumittomassa kunnossa läsnäollessa EGF (10 ng /ml) ja FGF2 (10 ng /ml), joka muodostuu pallosten 2 viikkoa. Immunofluoresenssikoe osoittaa, että nämä alat ovat eriytymättömiä aloilla (eriyttämätön), jotka ovat positiivisia CD133, ja negatiivinen ydinvoiman β-kateniinin, CDX2 ja CK20. Sitten nämä palloset ympättiin matrigeeliä ja altistettiin seerumia sisältävään edellytys toisen 2 viikkoa. Immunofluoresenssikoe osoittaa, että näillä aloilla on eriytetty (Differentiated), joka vähenee CD133 ilmentyminen, lisätä ilmaus ydin- β-kateniinin, CDX2 ja CK20. Mittakaava, 20 um (C) Prosenttiosuudet positiivisten solujen CD133, ydin- β-kateniinin, CDX2 ja CK20 laskettiin. (D) ja (E ylemmät kaksi paneelia) Kvantitatiivinen RT-PCR mRNA-tasot, (E alempi paneeli) immunoblot-analyysillä. (F) solumigraation ja invaasiomääritys varten CD133 + ja CD133- solujen jälkeen MACS erottamisen päivänä 4 altistuksen hypoksia ja seerumin ehtyminen. Data HT-29-solut näkyvät edustavia tuloksia.

CD133 + solut ovat vastustuskykyisiä Hypoksia ja Serum väheneminen aiheuttaman apoptoosin

olivatko CD133 + solut saattavat olla vastustuskykyisiä hypoksia ja seerumin ehtyminen aiheuttamaa apoptoosia. Todellakin, CD133 + -soluja havaittiin olevan resistenttejä apoptoosin mitattuna TUNEL määrityksessä, kun taas CD133- solut olivat positiivisia TUNEL värjäytymistä (kuvio 3A). Tämä käsite on edelleen tukenut kun HT-29-solut kerättiin kolmen päivän hypoksia ja seerumin vajeeseen ja sitten CD133 + ja CD133- solupopulaatioiden olivat vastaavasti reseeded lisää 16 tuntia samoissa olosuhteissa ja analysoitiin käyttämällä APOPercentage määritystä. Täällä huomasimme, että CD133- väestöstä oli huomattavasti enemmän apoptoosin kuin CD133 + soluja (kuvio 3B). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että CD133 + -solut ovat resistenttejä hypoksia ja seerumin ehtyminen solukuolema. Selvittämiseksi mekanismi CD133 + solujen resistenssin apoptoosia, ensin kysytään tämän resistenssin tapahtunut kautta caspases riippuvan apoptoottisen reitin. Huomasimme, että ilmentyminen kaspaasi geenejä, kuten kaspaasi 9 ja 3 pienennettiin CD133 + soluissa verrattuna CD133- solujen sekä mRNA ja proteiini tasolle käyttäen kvantitatiivista RT-PCR (kuvio 3C) ja western blot-analyysi (kuvio 3D), tässä järjestyksessä. Lisäksi CD133 + -solujen osoitti myös pienemmän määrän aktiivista pilkkoa muotoja kaspaasi 9 ja kaspaasi 3 (kuvio 3D). Kuitenkin, emme löytäneet mitään ilmeisiä eroa CD133 + ja CD133- solujen proteiinin tasot fosfori-IKKα, ydin- NF-KB ja sen loppupään tavoitteita, kuten Bcl-2 ja surviviiniperäisten proteiineja (kuva S3). Nämä tulokset viittaavat siihen, että eloonjäämisen CD133 + solujen hypoksia ja seerumin ehtyminen on pääasiassa välittävät puute puute kaspaasi 9 ja kaspaasi 3 aktivaation, mutta riippumaton NF KB: n, BCL-2 ja surviviini.

(A ) TUNEL värjäys apoptoosia suoritettiin jälkeen MACS erottamisen CD133- ja CD133 + solujen hypoksiaolosuhteissa ja seerumi ehtyminen 4 päivää. (B) CD133- ja CD133 + solujen hypoksiaolosuhteissa ja seerumi ehtyminen 3 päivää kerättiin MACS erottaminen, reseeded hypoksiaolosuhteissa ja seerumin vajeeseen ja APOPercentage analyysi suoritettiin 16 tuntia myöhemmin. (C) Kvantitatiivinen RT-PCR mRNA-tasoja. (DF) Cell lysaatit CD133 + ja CD133- soluissa, sen jälkeen MACS erottamisen päivänä 4 altistuksen hypoksia ja seerumin ehtyminen valmistettiin ja käytettiin (D, F) immunoblot-analyysi proteiinin tasot, ja (E) MAPK fosfo-vasta-aineen matriisia analysoidaan tasot ilmoitetaan signalointireittien. Käyrät osoittavat kukin signalointi jälkeen normalisoitu ohjaus. CD133 + solujen vähentynyt ilmentyminen ja kaspaasi 9 ja 3 sekä lisääntynyt ilmentyminen fosfo-Hsp27. Virhe palkit kuvaavat standardipoikkeamat. (* P 0,05 ** p 0,01 määritettynä Studentin t-testi.) Tiedot HT-29-solut näkyvät edustavia tuloksia.

Hsp27 tarvitaan Survival of -lämpökameroissa alle hypoksia ja Seerumin väheneminen

Koska huomasimme, että siellä oli vähemmän aktiivinen muoto kaspaasi 9 ja 3 (kuvio 3D), tutkimme seuraavaksi molekyylitason mekanismeja vastuussa puutteesta kaspaasi 9 ja 3 CD133 + solut. Tätä varten käytimme nopea ja herkkä Phospho-RTK (fosfo-tyr) ja Phospho-MAPK Arrays (fosfo-ser /thr), ja verrataan fosforylaatiota proteiinien useita eri reittejä CD133 + -solujen CD133- soluja, mukaan ehdot hypoksia ja seerumin ehtyminen. Yleensä ei ollut merkitsevää eroa tyrosiinifosforylaatiossa välillä CD133 + ja CD133- soluja (kuvio S4). Toisaalta, oli useita Ser /Thr-kinaasi fosforylaatiot, että korotettiin CD133 + -soluja, ilmeisin on Hsp27 (8,6-kertainen) verrattuna CD133- soluihin (kuvio 3E). Näin ollen, olemme edelleen arvioitiin osallistumista Hsp27 on CD133 + -solujen resistenssin apoptoosia. Luotettavuutta Phospho-MAPK Arrays vahvistettiin Western blot -analyysillä ja CD133 + todellakin kasvanut Hsp27 aktivointi, kun taas fosforylaation tasoja ERK ja Akt eivät muuttuneet (kuvio 3F). Siksi nämä tiedot viittaavat vastus CD133 + solujen apoptoosiin liittyy aktivointi Hsp27.

Hsp27 tarvitaan Survival of -lämpökameroissa alle Hypoksia ja Serum väheneminen

Sen tutkimiseksi, Hsp27 toiminta on todellakin tärkeää suojella CD133 + väestöä apoptoosin, ensin käytetään kaksi Hsp27-shRNAs ja osoitti, että tukahduttaminen Hsp27 (kuva 4A) todellakin herkistyneet apoptoosin CD133 + väestö vastattaessa hypoksia ja seerumin ehtyminen. Lisäksi Hsp27-specific shRNA indusoi lasku kasvoi CD133 + prosenttiosuus alle hypoksia ja seerumivapaassa väliaineessa olosuhteissa, verrattuna salattu shRNA (kuvio 4B). Apoptoosin lisääntyminen havaittiin myös kaksi Hsp27-spesifinen shRNAs in CD133 + soluja HT-29 (kuvio 4C). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös primääriviljelmässä CCS (kuvio S5a). Western blot -analyysi paljasti myös lisääntyminen lohkaisu kaspaasi 9 ja 3 Hsp27-spesifinen shRNAs (kuvio 4A). Lisäksi kaksi rakenteellisesti erillistä Hsp27-inhibiittorit, Kversetiini ja KRIBB3 (spesifinen Hsp27 fosforylaatio) [25], myös lisääntynyt lohkaisu kaspaasien 9 ja 3 HT-29-soluja (kuvio 4D) ja CCS-soluja (kuvio S5B) ja indusoi vähenevän lisääntynyt prosenttiosuuden CD133 + solujen hypoksiaolosuhteissa ja seerumin ehtymisen (kuvio 4E) ja aiheutti apoptoosin CD133 + soluissa (kuvio 4F), Kuten odotettua, PI3K-Akt estäjä, LY294002 ja ERK estäjä, U0126 ei aiheuttanut näitä vaikutuksia ( Kuva S5c ja S5d). On syytä mainita, että Kversetiini tiedetään estävän Hsp27, Hsp70 ja Hsp90. Siten tutkimme myös aktivoinnin Hsp90 ja Hsp70 että CD133 + ja CD133- populaatioiden (kuvio 3F). Tulokset osoittavat, että ei ole mitään eroa pHsp70 ja pHsp90 kahden solujen populaatiot. Täten joukossa kolme Hsp-proteiineja, Hsp27 näyttää olevan ainoa, joka on aktivoitu CD133 + -solujen, jolloin Kversetiini vaikutus johtuu todennäköisesti estämällä Hsp27. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että Hsp27 tarvitaan selviytymisen -lämpökameroissa hypoksiaolosuhteissa ja seerumin ehtyminen.

Solut lentivirally transfektoitu Hsp27 shRNA (shR1 ja shR2) tai salattu shRNA, altistetaan sitten hypoksia ja seerumin ehtyminen . CD133 + ja CD133–solut eristettiin käyttäen MACS erottaminen 4 päivää myöhemmin. (A) immunoblottianalyysi HT-29-proteiinin tasot CD133 + ja CD133- solujen jälkeen MACS erottamisen. Virhe palkit kuvaavat standardipoikkeamat. Virhe palkit kuvaavat standardipoikkeamat.