Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ymmärtäminen molekyyli- esiliinan chemoresistance on tärkeää suunnitella hoitoja palauttamiseksi kemosensitiivisyys . Erityisesti, metadherin (MTDH) on osoitettu olevan ratkaiseva merkitys chemoresistance. Yli-ilmentyminen MTDH korreloi huonon kliinisen tuloksen rintasyövän, neuroblastooma, maksasolusyövän ja eturauhassyöpää. MTDH on myös erittäin ilmaistaan ​​kehittynyt kohdun limakalvon syöpiä, sairaus, jota varten uusia hoitoja tarvitaan kiireesti. Tässä Tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet terapeuttista hyötyä MTDH ehtyminen endometriumin syöpäsoluissa palauttaa herkkyyttä solukuolemaa. Soluja käsiteltiin yhdistelmällä tuumorinekroositekijä-α-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL), joka edistää syöttämällä pahanlaatuisia soluja ihmisen synnytyskanavan ja histonideasetylaasi (HDAC) estäjät, joiden on osoitettu lisäävän herkkyyttä syöpäsolujen TRAIL-indusoitua apoptoosia. Meidän tiedot osoittavat, että ehtyminen MTDH endometriumin syövän soluissa johti herkistää solut, jotka aikaisemmin olivat resistenttejä vasteena kombinatorista hoitoa TRAIL ja HDAC-inhibiittori LBH589. MTDH pudotus vähensi solujen osuus S ja lisääntynyt solujen pidätyksen G2 /M-soluissa on käsitelty LBH589 yksinään tai LBH589 yhdessä TRAIL, viittaa siihen, että MTDH toimintoja solusyklin Checkpoint toteuttaa vastus. Käyttäen sirutekniikalla tunnistimme 57 alavirran kohdegeenien MTDH, mukaan lukien calbindin 1 ja galektiini-1, joka voi myötävaikuttaa MTDH-välitteisen terapeuttinen vastus. Toisaalta, vuonna MTDH köyhdytetyn soluissa esto PDK1 ja AKT fosforylaatio sekä lisääntynyt Bim ilme ja XIAP hajoaminen korreloivat suurempi herkkyys solukuolemaa vastauksena TRAILin ja LBH589. Nämä havainnot osoittavat, että kohdentaminen tai heikentävien MTDH on mahdollisesti uusi avenue kääntämiseksi terapeuttista resistenssi potilailla, joilla on kohdun limakalvon syöpä.

Citation: Meng X, Brachova P, Yang S, Xiong Z, Zhang Y, Thiel KW, et al. (2011) knockdovvn MTDH herkistää limakalvon syöpäsolujen solukuoleman induktio Death reseptoriligandin TRAIL ja HDAC estäjä LBH589 Co-hoito. PLoS ONE 6 (6): e20920. doi: 10,1371 /journal.pone.0020920

Editor: Andrei L. Gartel, University of Illinois at Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 joulukuu 2010; Hyväksytty: 16 toukokuu 2011; Julkaistu: 08 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 Meng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health (NIH) Grant R01CA99908 ja KKL, ja osittain osasto Naistenklinikka Research Development Fund, Institutional Research Grant Number IRG-77-004-31 American Cancer Society XM, annettuna kautta Holden Kattava Cancer Center yliopiston Iowa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

yleinen ongelma syövän hoidossa on resistenssin kehittymistä, ja parannettu ymmärrystä taustalla reittejä mukana lääkeresistenssin voisi johtaa uusien strategioiden voittaa tämän resistenssin. Hiljattain löydetty geeni, metadherin (MTDH, joka tunnetaan myös nimellä AEG-1 tai LYRIC) on muodostunut mahdollisesti ratkaiseva välittäjäaine kasvaimen etenemisen, etäpesäkkeitä, ja kestävyys chemotherapies [1], [2], [3], [4] . MTDH ehdotetaan edistää kasvaimen etenemistä integroimalla useita signalointireittien, kuten ras, myc, Wnt, PI3K /AKT ja NF-KB: n eri tyyppisiä syöpäsoluja [4], [5], [6], [7] , mutta mekanismi, jolla MTDH ohjaa näitä signalointi tapahtumia on epäselvä. Tässä tutkimuksessa selvitimme roolia MTDH endometriumin syövän ja sen estäminen mekanismina voittamiseksi lääkeresistenssi.

Alkuperäinen kiinnostusta MTDH osatekijänä chemoresistance syntyi seurauksena NCI60 farmakogenomiset tietoja, joita löytyy että genominen kopiomäärä voitto 8q22 on ratkaiseva tapahtuma chemoresistance [8]. Aikaisempi tutkimus kertoo, että imusolmuke etäpesäke liittyy merkittävästi kopiomäärä lisäämisessä 8q22-q23 endometriumin syöpiä [9]. Toistaiseksi MTDH on ainoa tunnettu geenin 8q22, joka on osoitettu korreloivan huono kliinisiä tuloksia potilailla, joilla on kiinteitä kasvaimia [8].

In vitro

ja

in vivo

chemoresistance analyysit vahvistivat, että MTDH pudotus herkistää erilaisia ​​kasvaimia – mukaan lukien rintasyövän, maksasyövän, eturauhassyövän ja neuroblastoma- useita kemoterapia-aineisiin, kuten 5- fluorourasiilin (5-FU), sisplatiini, paklitakseli ja doksorubisiini [1], [10], [11]. Kuitenkin kyky MTDH Knockdown herkistää soluja kohdistettuja hoitomuotoja, jotka ovat tulleet symboloivan tulevaisuuden syövän hoitomuotoja, ei ole vielä tutkittu.

Tuumorinekroositekijä (TNF) -α-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) äskettäin noussut lupaavaksi kohdennettua terapeuttista strategiaa eri syöpien koska sen proapoptoottiseen ominaisuudet [12], [13]. Jäsenenä TNF-perheen, TRAIL nimenomaan aktivoi ulkoisia apoptoottisia reittejä syöpäsoluissa sitoutumalla kuolemareseptorien. Tärkeää on, TRAIL selektiivisesti edistää kasvainsolujen apoptoosin, mutta sillä ei ole vaikutusta normaalin ihmisen sukuelimiin solut mukaan lukien kohdun limakalvon, munasarjojen, kohdunkaulan, tai munanjohdin [13]. Jotkin syöpäsolut ovat vastustuskykyisiä TRAIL: n indusoiman apoptoosin [14], [15], [16], siis kombinatorinen annostelua on hyväksytty palauttamiseksi herkkyys [13], [17]. Useissa tutkimuksissa, histonideasetylaasi- (HDAC) estäjien on osoitettu lisätä herkkyyttä TRAIL-indusoitua apoptoottista solukuolemaa [18], [19], [20], [21]. Valitettavasti jotkut syöpäsolut jäädä vastustuskykyisiä yhdistettynä TRAIL ja HDAC estäjä hoito [22], ja uusia lähestymistapoja palauttaa herkkyys kohdennetut hoidot ovat tarpeen.

tutkittiin, mikä vaikutus heikentävien MTDH tasoilla palauttamaan herkkyys perävaunu perustuvia kohdennettuja hoitoja. Tiedot ilmoitetaan tässä osoittavat, että MTDH säätelee solusyklin ja solu- selviytymistä hoitovasteen HDAC-inhibiittorit ja TRAIL, viittaa siihen, että MTDH on lupaava terapeuttinen kohde tehokkuuden lisäämiseksi TRAILin ja HDAC estäjä kombinatorisista hoitoon.

Tulokset

MTDH ilmentyminen on kohonnut kohdun limakalvon syövän solulinjoissa ja kudoksissa

MTDH oli hyvin ilmaistiin proteiinin tasolla kaikissa kuudessa kohdun limakalvon syöpä testatuissa solulinjoissa (RL95, AN3CA, KLE, Ishikawa, Hec50co ja ECC1, kuvio 1A). Endometriumin syöpä potilaan kudoksissa, MTDH ilmentymistä kohonnut verrattuna normaaliin kohdun limakalvon (kuvio 1 B). Erityisesti ilmaus 80 kDa MTDH ja oletetun 50-55 kDa MTDH isoformit olivat merkittävästi korkeammat kohdun limakalvon syöpä näytettä, myös papillaarinen vakavien, sarkooma ja adenokarsinooma, kun taas MTDH ei ollut havaittavissa normaaleissa kohdun limakalvon kudoksissa (kuvio 1 B). Koska mitään MTDH havaittu normaalissa kohdun kudoksessa, me pyyhittäisiin varten tuumorisuppressori LKB1 kontrollina (kuvio 1 B). Lisääntynyt ilmentyminen sytoplasman MTDH endometriumin adenokarsinooma ja ydinvoiman MTDH joissakin metastaattisen kohdun limakalvon syöpä havaittiin myös kohdun limakalvon syövän kudoksissa, kuten on esitetty kuviossa 1C immuunihistokemiallisesti MTDH-spesifistä vasta-ainetta. XIAP ja FLIP kaksi pro-selviytymisen liittyvien proteiinien kuoleman reseptorin aiheuttamaa ulkoista apoptoottisen reitin [12]. Siksi tutkittiin, onko korrelaatio ilmaus pro-selviytymisen proteiinien XIAP ja FLIP kanssa MTDH ilme. Vaikka ilmaus MTDH ja XIAP eivät korreloineet, emme havaita korrelaatio FLIP ilme (kuvio 1 B). Lisääntynyt ilmentyminen MTDH kaikissa syöpäsoluissa ja tutkituissa kudoksissa viittaa siihen, että se voi olla tärkeä rooli kohdun limakalvon syövän synnyssä.

(A) ilmentyminen MTDH havaittiin kaikissa kuudessa testataan kohdun limakalvon syövän solulinjat: RL95, AN3CA, ECC1, Ishikawa H (Ishi), KLE ja Hec50 soluja. (B) ilmentyminen MTDH havaittiin kohdun limakalvon kudoksissa kaksi normaalia yksilöitä, neljä potilasta, joilla papillien vakavien, kolme potilasta, joilla adenokarsinooma, ja kaksi potilasta, joilla kohdun limakalvon sarkooma. Ilmentymisen tuumorisuppressorigeenin LKB1 ja kaksi anti-apoptoottiset geenit, XIAP ja FLIP, havaittiin myös Western-blottauksella samoissa näytteissä. (C) MTDH ilmentymistä havaittiin immunohistokemiallisesti värjäyksellä käyttämällä tautikirjo (kohdun limakalvon syövän eteneminen) kudoksen array yli 50 näytteitä kohdun limakalvon kudoksissa hyvänlaatuinen syöpään. (I) normaali kohdun limakalvon kudos, (ii) huono laatu kohdun limakalvon adenokarsinooma, (iii) korkean asteen kohdun limakalvon adenokarsinooma, ja (iv) kohdun limakalvon syöpä metastasoitunut ja vatsaonteloon. Alkuperäinen suurennos, × 400.

knockdovvn MTDH vähentää pesäkkeiden muodostumisen

Koska kohonnut ilmentyminen MTDH eri kohdun limakalvon syövän solulinjat ja ihmisen kohdun limakalvon syöpä näytteitä, tutkimme seuraavaksi kasvaimia potentiaalia MTDH Tyyppi II endometriumsyövän solulinja Hec50co käyttämällä lyhyen hiusneula-RNA (shRNA) spesifinen MTDH. 3,49-kertainen väheneminen MTDH geenin ilmentymistä havaittiin kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR: n (qRT-PCR) in MTDH shRNA-transfektoitujen Hec50co soluja verrattuna kontrolliin salattu shRNA-transfektoiduissa soluissa (taulukko S1). Ehtyminen MTDH väheni pesäkkeiden muodostumisen soluissa, jotka ilmentävät stabiilisti MTDH shRNA verrattuna kontrolliin shRNA (kuvio 2A, B). Nämä tulokset vahvistettiin käyttämällä kolmea shRNA konstrukteja kohdistaminen eri alueilla MTDH. Samanlainen fenotyyppi havaittiin myös, kun knockdovvn MTDH Ishikawa H tyypin I kohdun limakalvon syöpä soluja, mikä osoittaa, että kohonnut MTDH ilmentyminen on yleensä tarvitaan kohdun limakalvon syöpä pesäkkeiden muodostumista.

Hec50co solut transfektoitiin kontrolli tai MTDH shRNA ekspressiovektoreihin . (A) Pesäkkeet muodostettu ohjaus- tai MTDH shRNA transfektoidut Hec50co solut on esitetty sen jälkeen, kun transfektio shRNAs valintaa ja sen jälkeen 2 ug /ml puromysiiniä ja 3 viikkoa. (B) kvantifiointi suhteellinen pesäkkeenmuodostusta ohjaus versus MTDH pudotus Hec50co soluja.

tunnistaminen MTDH geenien in endometriumsyöpään solulinjoissa

tunnistamiseksi alavirran geenien välittäjänä kasvaimia vaikutukset MTDH endometriumin syövän solulinjoissa, joka on Affymetrix oligonukleotidi mikrosiru (Human gene array 1,0 ST) käytettiin havaitsemaan differentiaalisesti ilmentyvien geenien in Hec50co pysyvästi transfektoitujen solujen joko MTDH shRNA tai ohjaus shRNA (Data on talletettu GEO, GSE26134) . Ehtyminen MTDH mukaan Knockdown johti vähintään kaksinkertaiseksi geenin ilmentymisen muuttaminen 57 geenien (kuvio 3A). Useat näistä geeneistä valittiin satunnaisesti vahvistaa muutokset qRT-PCR (kuva 3B).

(A) Heat kartta kaksinkertaiseksi muutos geenien ilmentyminen (määritettynä Affymetrix array data) välillä ohjaus ja MTDH pudotus Hec50co soluja. (B) Geenien ilmentyminen muuttuu todensi qRT-PCR: llä osoitti geenien tunnistettu mikrosirulla (* p 0,05). (C) Expression ja /tai fosforylaatio ilmoitettu proteiinien tutkittiin Hec50co soluissa, jotka ekspressoivat stabiilisti joko ohjaus shRNA tai MTDH shRNA. Yhteensä PDK1 ja β-aktiini käytettiin lastaus valvontaa. (D, E) Expression of PIP3 havaittiin kontrolli (D) tai MTDH taintumisen (E) Hec50co soluissa PIP3 immuno-fluoresenssivärjäys.

Tiedot array osoitti, että MTDH säätelee geenien ilmentymistä mukana invaasio, tiukka liittymissä sekä chemoresistance (taulukko S1 ja S2). Esimerkiksi galektiini-1 (LGALS1) ja calbindin 1 (Calb1) olivat merkittävästi alas-säädellä mRNA: sta (kuvio 3B), ja proteiinin tasot (kuvio 3C) on MTDH shRNA-transfektoitujen Hec50co soluissa. Calb1 ja galektiini-1 on kahden mahdollisen MTDH loppupään geenejä, jotka voivat säädellä aineenvaihduntaa fosfatidyyli, joka on osa PI3K /AKT-signalointireitin yleisesti yläreguloituja kohdun limakalvon syöpä [23]. Tutkimme myös muutoksia geenien ilmentyminen in Ishikawa H endometriumsyöpään solujen vastauksena MTDH hiljentämisen ja havaittiin jonkin verran päällekkäisyyttä geeneillä, jotka muutettiin vuonna Hec50co soluissa (taulukko S3 ja S4).

vieressä pyrkineet ymmärtämään, miten MTDH säätelee PI3K /Akt-reitin. Expression of galektiini-1 on ylösajettu erilaisten kasvainten, ja on raportoitu välittävän kasvaimen invaasiota ja etäpesäkkeiden lisäämällä ilmentymistä matrix metalloproteinase MMP-9: n ja MMP-2 ja edistää uudelleenjärjestely aktiinisytoskeletonin [24]. Yhdenmukaisesti aikaisemman tutkimuksen, jossa yliekspressio MTDH edistää aktivaation PI3K /AKT-reitin neuroblastooma [7], havaitsimme inhibitiota komponenttien PI3K /AKT: n signalointireitin Hec50co soluissa köyhdytettyä MTDH kontrolliin verrattuna (kuvio 3C) . Erityisesti dramaattinen väheneminen PDK1 fosforylaation S241 ja AKT fosforylaatio sekä T308 ja S473 esiintyi MTDH pudotus soluissa, vaikka mitään merkittävää muutosta koko PDK1 proteiinin taso havaittiin (kuvio 3C). Lisäksi, kuten on esitetty kuviossa 3D, ja E, dramaattinen väheneminen tason PIP3 havaittiin Hec50co solujen MTDH shRNA verrattuna solujen valvonnan shRNA. Nämä havainnot osoittavat, että MTDH voi aktivoida pro-eloonjäämisreittejä PI3K /AKT kautta lisäävä säätely PIP3.

MTDH Knockdown herkistää soluja kohdennettuja syövän hoitomuotoja

vastustusta hoitoja, HDAC estäjät, kuten LBH589 on käytetty palauttamaan TRAIL-indusoitua apoptoosia eri syöpien [18], [19]. Hec50co solut on aiemmin osoitettu olevan resistenttejä TRAIL-välitteisen apoptoosin [13]. Näin ollen testata vaikutusta MTDH on herkkyys TRAIL näissä soluissa, käsittelimme Hec50co solujen kanssa tai ilman MTDH (kontrolli vastaan ​​MTDH pudotus), jossa yhdistetty TRAIL ja LBH589 hoidon kolmen päivän ajan, ja sitten tutkittiin solujen elinkykyä. Verrattuna salattu shRNA transfektoitujen Hec50co soluja, vakaa MTDH pudotus hieman lisääntynyt herkkyys Hec50co solujen Monoterapiassa (joko LBH589 tai TRAIL yksinään, kuvio 4A, B). Kuitenkin, kuten on esitetty kuviossa 4B, joka on dramaattisempi induktion herkkyyden tapahtui vakaa MTDH pudotus Hec50co solujen yhdistelmällä LBH589 ja TRAIL. Nämä tiedot viittaavat siihen, että MTDH ilmentyminen on tärkeä tekijä taustalla vastustuskyky yhdistetyn hoito-ohjelman.

(A) Cell kuoleman induktion LBH589 yhtenä ainetta tunnistettiin kontrolli tai MTDH pudotus Hec50co soluja. 3 päivän kuluttua solukuolema määritettiin WST-1-menetelmällä. (B) Cell aiheuttaman kuoleman eri pitoisuuksia TRAIL (5-50 ng /ml), yksin tai yhdessä 5 nM LBH589 analysoitiin ohjaus tai MTDH pudotus Hec50co soluja.

apoptoosin säätelijät osallistuvat MTDH-välitteisen solukuoleman

tutkimiseksi molekyylimekanismi solukuoleman MTDH pudotus soluissa, ekspressio liittyvien proteiinien apoptoosia (sekä pro- ja anti-apoptoottisia tekijöitä) testattiin MTDH ohjaus ja pudotus solujen kerta käsittely (LBH589 tai TRAIL) tai sen jälkeen yhdistelmähoito (LBH589 ja TRAIL). Yhdistelmähoito ei ilmentymisen tehostamiseksi TRAIL-reseptorien DR4 ja DR5. Lisäksi käytössä ei tapahtunut muutoksia ilmentymistä antiapoptoottisten geenien Bcl-xL, Mcl-1, tai FLIP in MTDH ohjaus ja pudotus Hec50co solujen jälkeen kombinatorisista hoidon (kuva 5).

Ohjaus tai MTDH pudotus Hec50co soluja käsiteltiin 24 tuntia ajoneuvon hallinnan, 20 nM LBH589, 25 ng /ml TRAILin tai LBH589 ja TRAIL pitoisuuksissa totesi. Lysaatit kerättiin. Expression of DR4, DR5 ja apoptoosiin liittyvien kaspaasi-3, kaspaasi-8, PARP-1, BID, FLIP, XIAP, Bim, MCL-1 ja BCL-XL analysoitiin Western-blottauksella.

Mielenkiintoista on, että pro-apoptoottinen BH3-vasta-proteiinin Bim oli säädelty hoitamattomien MTDH pudotus Hec50co soluja verrattuna kontrollisoluihin (kuvio 5), mikä osoittaa, että ehtyminen MTDH yksinään voi johtaa induktion pro-apoptoottisten tekijöistä. Kun ohjaus Hec50co soluja käsiteltiin LBH589 yksin tai yhdessä TRAIL, ilmaus Bim lisääntynyt. Sitä vastoin ilmaus Bim tehostui merkittävästi vuonna MTDH pudotus Hec50co soluja ilman hoitoa, kun taas käsittely joko LBH589 tai TRAIL entisestään ilmaus Bim. Kuitenkin Bim ilmentyminen laski hieman MTDH pudotus soluissa jälkeen yhteistyössä hoidon LBH589 ja TRAIL.

säätökennoja, translaation jälkeinen muutos XIAP tapahtui käsiteltäessä LBH589, mikä osoitetaan korkeamman vaeltaville eläimille, ja vähentäminen sekä täydellistä ja modifioitu XIAP vasta havaittiin LBH589 ja TRAIL yhdistelmähoitona (kuva 5). Tämä vaikutus korostuu, kun MTDH pudotettiin, niin että havaitsimme suuremman alentamisen XIAP translaation jälkeinen muokkaus MTDH pudotus Hec50co soluja verrattuna ohjata soluihin jälkeen LBH589 ja TRAIL hoitoa. Lisäksi merkittävä induktio pilkkomisen kaspaasin 8, kaspaasi-3 ja PARP-1 havaittiin, kun yksittäinen hoidon LBH589 tai TRAIL, tai yhdistelmä MTDH pudotus Hec50co soluja verrattuna kontrolli soluihin. Vähentäminen Bid havaittiin myös MTDH pudotus soluissa käsitelty yhdistelmällä LBH589 ja TRAIL. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että knockdovvn MTDH voi lisätä ulkoista indusoiman apoptoosin TRAIL ja LBH589, ja pääasiallinen mekanismi on kautta lisäävä säätely Bim. Down-regulation XIAP ja myöhemmin kaspaasi-8 ja kaspaasi-3 sekä alavirran substraattien, kuten PARP-1 esiintyy myös.

Cell cycle tarkistuspiste sääntelyä MTDH

Jotta määrittää tarkkaa mekanismia, jolla MTDH resistenssin TRAIL ja LBH589 hoito, tutkimme seuraavaksi roolia MTDH solusyklin kontrolli. Ohjaus ja MTDH pudotus Hec50co solut, jotka olivat käsittelemättömiä tai käsitelty TRAIL yksinään ei ollut samanlainen solusyklin profiileja (kuvio 6A). Sitä vastoin käsittely HDAC-inhibiittori LBH589 soluissa, joista puuttuu MTDH johti suurempi osuus solujen jatkuvasti, että G2 /M-vaiheessa. Kun Hec50co MTDH pudotus soluja käsiteltiin sekä LBH589 ja TRAIL, vähentynyt solujen osuus oli S-vaiheessa ja lisääntynyt solujen osuus pidätettiin G2 /M (Fig. 6A). Nämä tiedot osoittavat, että MTDH on merkittävä rooli säätelyssä solusyklin Checkpoint yhteydessä kombinatorisista TRAIL ja HDAC estäjä hoitoa.

(A) Cell cycle profiilit määritettiin kontrolli tai MTDH pudotus Hec50co solujen 24 tuntia hoidon jälkeen 20 nM LBH589, 25 ng /ml TRAIL, tai LBH589 ja TRAIL yhdistelmänä. Prosenttiosuus soluja G1, S ja G2 /M-vaihetta määritettiin. (B) muutos Aurora A, Aurora B, p21, histoni H3 asetylointi lysiinin 9, histoni H3 fosforylaatio seriinillä 10 ja yhteensä histoni H3 arvioitiin Western-blottauksella seuraavien 24 tunnin kuluessa hoidon kanssa ilmoitettu reagenssien. Yhteensä histoni H3 käytettiin latauskontrollina. (C) malli selvitetty mekanismi, jonka knockdovvn MTDH lisää solukuoleman TRAIL ja HDAC estäjä LBH589. MTDH pudotus pienenee fosforylaatiota PDK1 ja sen substraatin AKT, mikä johtaa lisääntyneeseen ilmentyminen proapoptoottiset proteiinin Bim. XIAP ilmentyminen säädeltiin vasteena yhdistetyn LBH589 ja TRAIL-käsittely, vapauttaen siten XIAP estoa kaspaasi-3 ja -8 aktivointi. Yhdessä sääntely näistä reiteistä edistää apoptoottista solukuolemaa.

tutkimiseksi mekanismi, jonka MTDH säätelee solusyklin, ilmaus solukierron sääntelyviranomaisten mitattiin. Lisäys Aurora A proteiini tasolla havaittiin MTDH pudotus soluissa verrattuna kontrollisoluihin (kuvio 6B). Kun ohjaus ja MTDH pudotus Hec50co solut altistettiin LBH589, oli kasvu Aurora A, Aurora B, asetylaatio histoni H3 lysiinin 9, fosforylaatio histoni H3 seriini 10 ja p53-riippumattoman up-regulation of p21 WAF1, estäjä sykliini-riippuvaisten kinaasien (kuvio 6B). Mielenkiintoista on, että TRAIL-hoito johti huomattavaan vähenemiseen histoni H3 fosforylaatio, joka vastasi vähenemistä prosentteina solujen G2 /M-vaiheen verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot sotkea uudenlainen rooli MTDH säätelyssä solusyklin tarkastuspisteitä.

Keskustelu

Vaikka MTDH on yhdistetty sekä etäpesäkkeiden ja kestävyys kemoterapiaa eri syöpien [1], [ ,,,0],25], mekanismi ja biologisen toiminnan MTDH ei juuri tunneta. Loppuminen MTDH voi voimistaa kemoterapeuttisten lääkkeiden, kuten doksorubisiini, paklitakseli ja 5-FU: [10], [11]. Kirjoittajat raportoivat, että ilmentyminen MTDH on erittäin kohonnut kohdun limakalvon syöpiä kudoksiin verrattuna normaaliin kohdun limakalvoon. Tuloksemme osoittavat, että ehtyminen MTDH tietyn shRNA voi myös lisätä solujen herkkyyttä kohdistettuja hoitomuotoja, kuten HDAC estäjä LBH589, TRAIL ja yhdistelmä annosteltavaan molemmat aineet. Kuten kuviossa 6C, olemme tunnistaneet mahdollisia mekanismi, jonka knockdovvn MTDH lisää solukuoleman hoitovastetta TRAILin kanssa ja HDAC estäjä LBH589. Tarkemmin sanottuna soluja, joista puuttuu MTDH ovat laskeneet fosforylaatioon PDK1 ja sen alustan AKT, mikä puolestaan ​​stimuloi ilmentyminen proapoptoottiset proteiinin Bim. Yhdistetty LBH589 ja TRAIL käsittely johtaa downregulation of XIAP, jolloin kaspaasi-3 ja -8. Nämä molekyylitason muutokset johtavat apoptoottisen solukuoleman soluissa, joista puuttuu MTDH. Tuloksemme viittaavat siihen, siksi että MTDH välittämää vastus tapahtuu aktivoitumisen kautta pro-selviytymisen signalointireitteihin ja mahdollisesti poikkeavan sääntelyn solusyklin tarkastuspisteitä.

Käyttämällä microarray lähestymistapa tunnistimme monet kandidaattigeenejä joita säädellään eri tavalla soluissa puuttuu (MTDH shRNA) tai ekspressoimiseksi (kontrolli shRNA) MTDH. Erityisen kiinnostavia olivat calbindin 1 (CALB1) ja galektiini-1, kaksi proteiineja, jotka on aiemmin yhdistetty pro-eloonjäämisen signalointireitteihin. CALB1 on kalsiumia sitova proteiini, jossa on neljä aktiivista kalsiumia sitovia verkkotunnuksia. CALB1 ilmoitettiin vuorovaikutuksessa Myo-inositolia monophosphatase (IMPA) käyttäen faagi display ja aiheuttaa IMPA toimintaa jopa 250-kertaisesti [26], [27]. IMPA on entsyymi, joka defosforyloi myo-inositoli monofosfaatti, myo-inositoli-1,3-difosfaatti, ja myo-inositoli-1,4-difosfaatista luoda vapaa myo-inositoli, joka näyttelee tärkeää roolia ohjelmoidun solukuoleman [28]. Galektiini-1, beeta-galaktosidaasi sitova proteiini, ilmentyy voimakkaasti erilaisissa ihmisen syövissä ja sen on osoitettu olevan rooli on PI3K signalointi ja Akt aktivointi [29]. Glioblastoomasoluissa, knockdovvn galektiini-1 heikentää kykyä insuliinin kaltaisen kasvutekijän (IGF1-) stimulaatio nostaa solun PIP3 tasoilla (Perry et al., 2010, AACR 101

st vuosikokouksessa abstrakti 301). Meidän tiedot osoittavat, että MTDH-välitteinen säätely ylöspäin galektiini-1 ja CALB1 voi olla mekanismi, jonka MTDH stimuloi kasvua PIP3 tasolla, siten aktivoimaan PI3K /AKT /mTOR kautta. Tämä reitti on tärkeä rooli limakalvon syövän synnyssä, joko mutaation PTEN tai muilla mekanismeilla, konstitutiivinen aktivaatio on sääntö. Meidän tunnistaminen yli-ilmentyminen MTDH mikä lisää PIP3 tasoa säädetään vielä toinen mahdollinen selitys korkean aktiivisuuden PI3K ja AKT löydetään usein kohdun limakalvon syöpä.

inhibitio MTDH havaittiin lisäävän indusoimaa solukuolemaa LBH589 ja TRAIL yhdistelmähoitona (kuva 4). TRAIL voi aiheuttaa ulkoisten apoptoosin kautta suoraan sitova kuolemareseptorien. Vaikka TRAIL voi selektiivisesti indusoida apoptoosia kohdun limakalvon syövän soluissa, se ei voi indusoida apoptoosia normaaleissa kohdun limakalvon kudoksissa samana pitoisuutena. Lisäksi pitoisuus TRAIL (200 ng /ml), joka tarvitaan indusoimaan apoptoosia kohdun limakalvon syövän soluissa on paljon korkeampi kuin aikaisemmin käytetty solut muista kiinteitä kasvaimia (esim 25-50 ng /ml haimasyövän) [13], [ ,,,0],30]. Tämä osoittaa potentiaali lähtötilanteessa resistenssi TRAIL kohdun limakalvon syöpä, joka voitaisiin yhdistää korkean MTDH ilme. Voittaa resistanssi, useita kemoterapeuttisia aineita tai kohdistettu inhibiittorit, jotka on raportoitu lisäävän herkkyyttä TRAIL: n indusoiman apoptoosin on käytetty kombinatorisista hoito [12]. Tässä osoitamme, että HDAC estäjä LBH589 voi lisätä TRAIL-välitteisen kaspaasi-8 aktivaatio ja myöhempi ulkoisia solukuoleman endometriumin syöpäsoluja. Knockdovvn MTDH voidaan edelleen edistää kaspaasi-8 pilkkoutumisen aiheuttama LBH589, TRAIL, tai näiden kahden yhdistelmä. Lisääntyminen XIAP jälkeisessä käännös muutos, vähennys yhteensä XIAP, ja induktio pro-apoptoosigeenin Bim havaittiin soluissa käsitelty LBH589 yksin. Menetys Bid havaittiin MTDH pudotus soluissa jälkeen LBH589 ja TRAIL yhdistelmähoito, joka johtuu todennäköisesti Bid aktivoitumisen kautta pilkkominen. Havainto on vähentynyt Bim kanssa saman kohtelun oli hieman odottamaton. Kuitenkin myös kuvion 3 mukaiset tiedot viittaavat siihen, että MTDH pudotus säätelee negatiivisesti Akt-reitin, joka voi aluksi johtaa kohonnut ilmentyminen Bim. Koska solut edetessä apoptoosin, epävakaampi proteiinit voidaan soveltaa hajoamiseen. Koska MTDH knockdown-soluja on kiihtynyt solukuolemaa vasteena yhdistelmähoidon (kuvio 4), on mahdollista, että lasku Bim on osoitus nopeasta proteiinin vaihtuvuus.

Vastauksena LBH589 hoito yksinään tai TRAIL kaksi pääasialliset vaikutukset MTDH pudotus solusyklin oli lasku solujen prosenttiosuus S ja samanaikainen kasvu prosenttia soluja G2 /M, jossa solut näyttävät olevan pidätetty. Solutasolla, kuitenkin, pudotus MTDH yksin ilman hoitoa ei vaikuttanut ekspressioon kanoninen solusykliä sääteleviä proteiineja. Esimerkiksi, LBH589 merkittävästi parannettu histoni H3 asetylointi lysiinin 9 (kuvio 6B), jotka mahdollistavat transkription aktivointi p21-geenin [31]. Kuitenkin H3 muutos ei vaikuttanut shRNA knockdovvn MTDH. Proteasomin välittämää hajoamista Aurora A, Aurora B ja C-FLIP ilmoitettiin olevan vastuussa kasvu herkkyys TRAIL HDAC estäjä hoitoa joissakin syöpäsoluissa [15], [32]. Kuitenkaan mitään merkittäviä muutoksia Aurora A ja B tai C-FLIP tasot havaittiin kohdun limakalvon syövän soluissa käsitelty LBH589 meidän tutkimuksissa.

Tämä on ensimmäinen raportti MTDH vaikutuksista resistenssin täsmähoitoihin varten kohdun limakalvon syöpä . Näitä tutkimuksia varten valitsimme yhdistelmä LBH589 ja TRAIL vaikutusten vuoksi näiden aineiden vaikutus proapoptoottiset polkuja. Osoitamme tässä, että pudotus on MTDH herkistää soluja ohjelmoitua solukuolemaa, vaikka mekanismi, joka liittyy inhibitio PDK1 ja Akt-fosforylaation, kasvu Bim, ja vähentäminen XIAP. Siksi voimme kohdistaa MTDH parantaa herkkyyttä paitsi kemoterapian lisäksi myös kohdennettuja aineita, jotka toimivat läpi ohjelmoidun solukuoleman. Nämä tiedot tarjoavat vakuuttavia todisteita siitä, että kun vähen- tämisessä MTDH endometriumin syöpä, voimme suurentaa proapoptoottiset väyliä ja hoitovaste.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Normaali kohdun limakalvon kudokset ja kohdun limakalvon kudokset kohdun limakalvon syöpiä kerättiin suostumuksella potilaita Iowan yliopistossa Institutional Review Boards hyväksytty protokolla. Saimme ilmoitti kirjallinen suostumus kaikki osallistujat mukana tässä tutkimuksessa.

Solulinjat ja Cell Culture

Ihmisen kohdun limakalvon syöpä solulinjat Hec50co, RL95, AN3CA, ECC1, Ishikawa H, ja KLE säilyivät kuten aiemmin on kuvattu [33]. Soluja viljeltiin DMEM-alustassa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini /streptomysiiniä (kaikki Gibco BRL, Carlsbad, CA) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 ja 95% ilmaa. Generoimaan MTDH pudotus malli, Hec50co solut transfektoitiin MTDH sh RNA: ta tai kontrollina ei-hiljentäminen shRNA rakentaa kohti valmistajan ohjeiden (Origene, Rockville, MD). Yksittäisen solun klooneja resistenttejä puromysiinille laajennettiin ja alistettiin seulonnan MTDH ilmentymisen Western-blottauksella.

Kohdun limakalvon kudokset ja kudosmatriisien

Normaali kohdun kudoksiin ja kohdun limakalvon kudokset kohdun limakalvon syöpiä kerättiin yliopistosta Iowan Sairaalat ja klinikat. Kohdun tautikirjo (kohdun limakalvon syövän eteneminen) kudoksen array (UT 801) ostettiin USA Biomax, Inc. (Rockville, MD).

Reagenssit, Antibodies ja Western blotting

Ihmisen yhdistelmä-TRAIL (TNF-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi) ostettiin R ja anti-pilkotaan kaspaasi-3, kaspaasi-8, DR4, DR5, Bim, Bid, FLIP, XIAP, p21, PARP-1 p-AKT S473, p-AKT T308, PDK1, p-PDK1 S204, histoni 3, p -histone 3 serine10 ja histoni 3 lysiinin 9 asetylointi vasta-aineet olivat peräisin Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA). Koko-solu-proteiini lysaatit valmistettiin ja analysoitiin Western-blottauksella, kuten on aiemmin kuvattu [34].

Expression Array ja RT-qPCR Analyysi

Kokonais-RNA eristettiin MTDH pudotus ja hallita kohdun limakalvon syöpä solu linjat (biologisissa kolmena rinnakkaisena valvonta- ja MTDH pudotus solut) käyttäen

mir

Vana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX), ja cDNA luotiin käyttäen High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Ihmisen geenijärjestelyillä 1.0 ST (Affymetrix, Santa Clara, CA) kuulusteltiin käyttäen biologisia kolmena kappaleena DNA Core Facility Iowan yliopistossa, ja Partek Genomics Suite (Partek Inc, St. Louis, MO) ohjelmistoa käytettiin synnyttämään geeniekspression arvot. Kaikki tiedot on MIAME yhteensopiva ja raakadataa on talletettu on MIAME valituksen tietokanta GEO, kuten yksityiskohtaisesti sivuilla https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/query/acc.cgi?acc= GSE26134. Liittymistä numero Hec50co solujen on GSE26134 ja Ishikawa H solujen GSE27828. Useat MTDH alavirran geenien valittiin satunnaisesti validoimiseksi microarray dataa TaqMan-alukkeita ja koettimia (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) ja kvantitatiivinen RT-PCR-analyysillä.