Krooninen sairaus

tiivistelmä

raportoi äskettäin, että kaksi artemisiinipohjaisten johdettu dimeerejä (dimeerin primaarinen alkoholi 606 ja dimeeri sulfoni 4-karbamaatti 832-4) ovat huomattavasti tehokkaampia inhiboimaan ihmisen sytomegaloviruksen (CMV) replikaation kuin artemisiinipohjaisten peräisin monomeerejä. Meidän jatkuvaan arviointiin toiminnan ARTEMISIINI CMV esto, kaksitoista artemisiinipohjaisten johdetut dimeerit ja viisi artemisiinipohjaisten johdettu monomeerien käytettiin. Dimeerit ryhmänä havaittiin olevan voimakkaita inhibiittoreita CMV replikaation. Vertailu CMV eston ja kaltevuus parametrin dimeerien ja monomeerien viittaavat siihen, että dimeerit ovat erillisiä, niiden anti-CMV toimintaa. Deoksi dimeeri (574), josta puuttuu endoperoxide siltaa, ei ole mitään vaikutusta CMV lisääntymään, mikä viittaa rooli endoperoxide sillan CMV eston. Erot anti-CMV aktiivisuus havaittiin joukossa kolme rakenteellista analogeja dimeerin sulfonia 4-karbamaatti 832-4 osoittaa, että tarkka sijoitus ja hapetustila rikkiatomin voi edistää sen anti-CMV aktiivisuus. Kaikkien testattujen dimeerit, artemisiinipohjaisten peräisin difenyylifosfaatti dimeerin 838 osoittautui kaikkein estäjä CMV replikaation, jossa selektiivisyysindeksi noin 1500 verrattuna meidän aiemmin raportoitu dimeeri sulfoni 4-karbamaatti 832-4 selektiivisyydellä indeksi noin 900. Difenyyli- fosfaattidimeerituotetta 838 oli erittäin aktiivinen vasten Gansikloviiri kestävä CMV rasitusta ja myös aktiivisimpia dimeeri estoon syöpäsolujen kasvua. Siten difenyyli fosfaattidimeerituotetta 838 voi edustaa johtoa kehittämiseksi erittäin voimakas ja turvallinen anti-CMV yhdiste.

Citation: Hän R, Mott BT, Rosenthal AS, Genna DT, Posner GH, Arav-Bogerin R (2011) Lentotoiminnan Artemisiini-Derived dimeeri Has erittäin voimakas anti-sytomegalovirus (CMV) ja Anti-Cancer toiminta. PLoS ONE 6 (8): e24334. doi: 10,1371 /journal.pone.0024334

Editor: Kim D. Janda, The Scripps Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 1. kesäkuuta, 2011; Hyväksytty: 06 elokuu 2011; Julkaistu: 31 elokuu 2011

Copyright: © 2011 He et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: tukemana NIH AI 34885 (GHP), NIH KO8 AI074907, NIH 1R01AI093701 ja maaliskuussa Dimes 6 FY11 268 (RAB). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Infektio CMV, jäsen herpesviruksen perhe, on yleinen ihmisillä. Seropositiivisuus hinnat kasvaa iän myötä ollen 90% yksilöissä yli 80 vuotta [1]. Virus perustana on elinikäinen pysyvän infektion, joka pysyy tavallisesti oireeton. Immunosuppressoiduille isännät kuten elinsiirto ja AIDS-potilailla, CMV-infektio liittyy huomattavaa sairastuvuutta ja kuolleisuutta [2], [3]. CMV on myös yleisin synnynnäisesti-tartunnan saaneilla aiheuttavat kehitysvammaisuus ja kuurous synnynnäisesti-tartunnan saaneille lapsille [4]. Äskettäin havaitseminen CMV immunokompetenteilla yksilöt on yhteydessä tulosten useiden oireyhtymät mukaan lukien sepsis, keuhkojen komplikaatioita tehohoitorauhoite-yksiköitä ja aivokasvain, glioblastoma multiforme [5] – [7]. Vaikka suora rooli CMV nämä oireyhtymät on epäselvä, viruksen lisääntymisen voivat edistää niiden luonnon historiasta, ja rooli anti-CMV terapia näissä olosuhteissa tutkitaan parhaillaan.

Käytettävissä olevat systeemisiä anti-CMV lääkkeet teko kohdistamalla viruksen DNA-polymeraasia. Nämä yhdisteet tehokkaasti estää CMV lisääntymään, mutta niiden käyttöön liittyy huomattavia toksisia vaikutuksia luuytimeen (Gansikloviiri-GCV) ja munuaisissa (Foscarnet ja Cidofovir) [8], [9] ja syntyminen lääkkeille vastustuskykyisten mutanttien pitkäaikaiskäytössä kurssia hoito [9], [10]. Siten uusia yhdisteitä, joilla on alhainen myrkyllisyys ja mieluiten erillinen mekanismi CMV eston tarvitaan CMV terapia.

artemisiinipohjaisten johdetut monomeeristä Artemisia annua alunperin raportoitu estävän CMV replikaatiota

in vitro

ja

in vivo

[11], [12]. Viime aikoina olemme raportoitu kahdesta artemisiinipohjaisten johdettu dimeerejä huomattavasti enemmän voimakas aktiivisuus CMV replikointi

in vitro

verrattuna artemisiinipohjaisten on johdettu monomeereistä [13]. Artemisiinipohjaisten monomeerit ovat tällä hetkellä lääkkeet valinta malarian hoito [14]. Lisäksi sekä artemisiinipohjaisten monomeerit ja dimeerit todettiin analysoitavissa syöpälääkkeen toimintaa [15] – [17]. Voimakas anti-CMV aktiivisuus kaksi artemisiinipohjaisten johdetun dimeerit [13] sai meidät arvioimaan joukon äskettäin syntetisoitujen artemisiinipohjaisten peräisin dimeerit. Raportoimme anti-CMV ja syöpälääkkeen toimintaa voimakkaimmista yhdisteet tässä tutkimuksessa.

Tulokset

vertailu anti-CMV aktiivisuus 17 artemisiinin johdannaisten

Olemme aikaisemmin raportoinut anti-CMV aktiivisuus neljä artemisiinipohjaisten monomeerien (Artemisiini, Artemisia annua, artemeetteriä, ja artefanlide) ja kaksi artemisiinipohjaisten johdettu dimeerit (dimeeriä primaarisen alkoholin 606 ja dimeeri sulfoni 4-karbamaatti 832-4) [13]. Nyt testataan yksi uusi artemisiinipohjaisten peräisin monomeeristä ja 10 ylimääräistä uutta artemisiinipohjaisten peräisin dimeerit ja verrattiin niiden anti-CMV toimintaa kuin aiemmin testattu yhdisteitä. Lyhennettyä nimet 17 yhdisteiden ja niiden moolimassat on lueteltu taulukossa 1. Tässä raportissa kukin yhdisteeseen viitataan sen molekyyli- painon. Esimerkiksi yhdiste 606 viittaa dimeerin primaarinen alkoholi, ja 832-4 viittaa dimeeriä sulfoni 4-karbamaatti (taulukko 1). Sulfoni karbamaatti 551 on monomeerinen versio dimeerin sulfonia karbamaattia 832-4. Kemiallinen rakenne dimeerin sulfonia 4-karbamaatti 832-4 estää sen hajoaa osaksi monomeerin sulfoni 4-karbamaatti 551. Yhdiste 574, joka on deoksi versio 606, valittiin testausta varten, koska malarialääkkeet ja syövän toimintaa of ARTEMISIINI ovat ainakin osittain endoperoxide bridge-riippuvainen [18], [19].

kaksi aiemmin testattu artemisiinipohjaisten peräisin dimeerit oli voimakas anti-CMV aktiivisuutta pitoisuuksissa 1 uM tai alempi, kun taas artemisiniinin johdettu monomeerien saavuttaa samanlainen määrin CMV eston vain suurempina pitoisuuksina 10 uM [13]. Näiden tietojen perusteella, kaikki uudet yhdisteet seulottiin aluksi anti-CMV toimintaa. Aktiivisimpia yhdisteitä testattiin sitten yksityiskohtaisesti niiden anti-CMV toimintaa. Kaikki dimeerit arvioitiin aluksi konsentraatioilla 1 uM, 0,3 uM, ja 0,1 uM. Deoksi dimeeri 574 ja monomeeri sulfoni karbamaatti 551 seulottiin 1 uM ja 10 uM. At 1 uM, dimeerit näkyy voimakas esto myöhään pp28-geenin ilmentymisen (joka hyvin korreloi plackreduktion) [20] mitataan lusiferaasiaktiivisuus, mutta deoksi- dimeeri 574 ja monomeeri sulfoni karbamaatti 551 ei (Fig. 1A). Useat dimeerit olivat myös tehokkaita 0,3 uM, mutta vain kaksi dimeerejä, sulfoni 4-karbamaatti 832-4 ja difenyylifosfaatti 838, olivat erittäin estävä 0,1 uM. Kolme rakenteellista analogien sulfonin 832-4 syntetisoitiin (832-3, 800-3 ja 800-4) vaihtelemalla hapetustilassa ja asema rikkiatomin aromaattisen renkaan (Fig. 1 B). Vaikka meta-sulfidi (800-3), meta-sulfoni (832-3), ja para-rikkivetyä (800-4) olivat aktiivisia CMV replikaatiota 0,3 uM, toisin kuin para-sulfoni 832-4 he eivät olleet aktiivisia 0,1 uM (Fig. 1A). Siksi tarkka sijoitus ja hapetustila rikkiatomin edistää sen anti-CMV aktiivisuus.

: Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus artemsinin johdettujen dimeerit (vasemmalla), deoksi-dimeeri 574, ja artemisiniinin monomeerit (oikealla) . Infected ja käsitelty HFFS kerättiin 72 hpi ja pestiin kerran PBS: llä. Lysaatit analysoitiin lusiferaasiaktiivisuus käyttäen Luciferase Assay Kit (Promega, Madison, WI). B. Kemiallinen rakenne analogien dimeerin sulfonia 4-karbamaatti 832-4. Esitetään kaksi rikkivetyä karbamaatti analogit (800-3 ja 800-4) ja yksi sulfoni 3-karbamaatti analoginen (832-3) sulfonia 4-karbamaatti 832-4. C: Sytotoksisuus kymmenen artemisiinipohjaisten dimeerit ja viisi artemisiinipohjaisten monomeerien HFF. HFFS käsiteltiin dimeerit /monomeerien ilmoitettuina pitoisuuksina kerättiin 72 ja pestiin kerran PBS: llä. Lysaatit analysoitiin solujen elinkelpoisuus käyttäen CellTiter-Glo Luminescent solunelinkykyisyysmääritys Kit GloMax®-Multi + Detection System (Promega) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

seuraavan seulotaan solun myrkyllisyys dimeerien ja monomeerit käyttämällä CellTiter-Glo Luminescent elinkykyyn pitoisuuksilla 10 uM, 50 uM ja 100 uM. Useimmille dimeerejä (paitsi 644 ja 760), 50% solun sytotoksisuus (CC

50) vaihteli 50 100pM (Fig. 1 C). Monomeerien kokonaismäärä näkyy samanlainen sytotoksisuuden kuvio, mutta olivat merkittävästi myrkyllisempiä kuin dimeerien 100 uM (P = 0,03 kaksisuuntaisella t-testillä). Dimeerit 832-4 ja 838 oli paras selektiivisyys (SI), joka on suhde CC

50 EC

50, ja sen vuoksi on valittu edelleen yksityiskohtainen analyysi anti-CMV aktiivisuus.

rakenne-aktiivisuussuhde ja solujen myrkyllisyys dimeerien 832-4 ja 838 sekä vanhemman dimeerit 760 ja 606

yksityiskohtainen vertailu anti-CMV aktiivisuus ja myrkyllisyyteen kuin syövän ensisijainen HFF-soluissa ensi suoritettiin tehokkain dimeerit, 832-4 ja 838 (Fig. 2A). Annoksesta riippuva kasvu anti-CMV aktiivisuus havaittiin 0,01 uM 1 uM sekä dimeerejä 832-4 ja 838 (Fig. 2B, taulukko 2). Cellular toksisuudet, mitattuna 1 100 um (taulukko 2), ei havaittu pitoisuuksina täydellisen CMV inhibition. N

50, CC

50 ja SI on esitetty kuvassa. 2B ja Taulukko 2. dimeerit 832-4 ja 838 oli korkea SI, mutta 838 oli paras yhdistettä. Vanhemman alkoholit, joista 832-4 ja 838 syntetisoitiin, 760 ja 606, vastaavasti, olivat vähemmän tehokkaita kuin niiden johdannaisten CMV eston. Sillä 606-838 parin ero SI oli 5-kertainen, ja että 760-832-4 pari, 30-kertainen (Fig. 2A, 2B). Vaikka dimeeri sulfoni 4-karbamaatti 832-4 ja monomeeri sulfoni 4-karbamaatti 551 on identtiset sulfoni 4-karbamaatti funktionaalisia ryhmiä (Fig. 2A), dimeeriä 832-4 oli vähintään 150-kertaisesti tehokkaampi CMV eston kuin -monomeeriksi 551.

V: Kemialliset rakenteet on kaksi voimakkaimmista artemisiinipohjaisten johdetut dimeerit 838 ja 832-4 ja niitä vastaavat emo- alkoholeja 606 ja 760. Monomeerin 551 on kuvattu vasemmalla dimeerin 832-4. Sulfoni bentsyylin dimetyyli karbamaatti yksikkö on sama monomeeri 551, kuten dimeeri 832-4. Näin ollen parannettu anti-CMV aktiivisuus dimeerin 832-4 yli monomeeri 551 ei johdu mitään eroa sulfonin karbamaatti molekyylin. B: Yksityiskohtainen anti-CMV aktiivisuus dimeerien 832-4 ja 838, ja niiden emo- yhdisteet 760 ja 606. CMV-infektio HFF käsiteltiin dimeerejä 832-4 ja 838 ilmoitettuina pitoisuuksina. 72 hpi lusiferaasin aktiivisuus määritettiin solulysaateista infektoitujen solujen. Luciferase arvot edustavat keskiarvoa ja SD saatujen tietojen vähintään neljästä itsenäisestä kokeesta suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Käyränsovitusmenetelmä Toolbox, Matlab-ohjelmisto (v7.5), Mathworks (Natick, MA) käytettiin määrittämään EY

50-arvot käyttäen neljän parametrin logistinen regressio.

esto a GCV-resistentti CMV-kannan dimeerejä 832-4 ja 838

arvioitiin esto on GCV-resistentti kanta (EY

50 GCV = 7,6 uM), jonka dimeerejä 832-4 ja 838 käyttämällä plakin vähentäminen määritys. Dimeerit 832-4 ja 838 levitettiin infektoituja soluja pitoisuutena 0,1 uM; GCV levitettiin 5 uM ja 30 uM. Kaksikymmentäyksi päivää infektion jälkeen solut värjättiin kristallivioletilla ja plakit laskettiin kunkin ehdon (Fig. 3). Dimeerejä 832-4 ja 838 täysin inhiboitu plakin muodostumista 0,1 uM, kun taas tämä kanta osoitti selvää vastustuskyky GCV 5 uM.

plackreduktion määritystä käytettiin määrittämään inhibition GCV-resistenttejä CMV. CMV-infektiota HFF käsiteltiin 832-4, 838 ja GCV ilmoitettuina pitoisuuksina. Plakit laskettiin 21 päivää infektion.

Rinteet anti-CMV annosvastekäyrät testattujen anti-CMV yhdisteitä

Klassinen kuvaus annos-vastesuhteet on mediaani vaikutus perustuva malli joukkotoiminnan osoittaa, että [21]: tässä toiminnossa, on osuus inhiboitu osa viruksia tai inhibitioprosentti,

D

on lääkeaineen pitoisuus,

EY

50

on lääkkeen pitoisuus, joka saavutetaan 50% suurimmasta estävä vaikutus ja

m

on kulmakerroin parametrin käyrän matemaattisesti. Vaikutus rinteen parametrin anti-HIV-aktiivisuutta äskettäin arvioitiin, ja osoittautui ominaisuus lääkkeen luokan ja ratkaiseva kriteeri ulottuvuuden analyysi antiviraalisen aktiivisuuden [21].

Käytimme tätä mallia meidän johdannaiset ja laskea kaltevuus parametri voimakkaimmista dimeerit (832-4 ja 838), GCV, ja artemisiinipohjaisten johdetut monomeeristä Artemisia annua (taulukko 2). Verrattuna GCV ja Artemisia annua, joka oli anti-CMV

m

arvo on noin 1,

m

arvot 832-4, 838, 760 ja 606 olivat noin 4, osoitus siitä, että nämä yhdisteet ovat erittäin voimakkaita luokan anti-CMV yhdisteitä.

inhibitio syöpäsolun kasvua dimeerejä 832-4 ja 838

Artemisiinipohjaisten johdettujen monomeerien ja useita dimeerit on raportoitu estävän syöpäsolujen kasvun solulinjojen [16], [17]. Neljä dimeerejä (832-4, 838, 760 ja 606), kaksi monomeerit (Artemisia annua ja artefanilide) ja GCV levitettiin kolme syöpäsolulinjoista: HeLa (kohdunkaulan adenokarsinooma), HCT116 (kolorektaalisyövän) ja 1205Lu (melanooma) pitoisuuksina 0,01 uM 1 uM. MTT-analyysi suoritettiin 72 tunnin kuluttua hoidon ja CC

50 kunkin yhdisteen kullakin tasyöpäsolulinja laskettiin (taulukko 3). CC

50 kutakin yhdistettä syöpäsoluissa verrattiin CC

50 syöpäsolujen ensisijainen HFF soluja. Kaikki dimeerit olivat merkittävästi aktiivisempia kuin monomeerit kasvun estämisessä syöpäsolulinjojen. Esimerkiksi dimeeri 838 on ainakin 200-kertaa voimakkaampi estämään kasvua HCT116 ja 1205Lu-solujen ja 37-kertaa voimakkaampi kasvun estämisessä HeLa-solujen, verrattuna Artemisia annua, tehokkain monomeeri tässä määrityksessä. Laadullinen korrelaatiota ei havaittu anti-CMV toiminnan ja syövän vastaista aktiivisuutta niiden neljän dimeerit (838, 832-4, 606 ja 760); dimeeriä 838, tehokkain kaikkien testattujen dimeerien CMV lisääntymään, oli myös voimakkainta vaikutusta kasvun estämistä syöpäsolujen.

Keskustelu

Kerromme täällä anti-CMV aktiivisuutta kymmenen uutta artemisiinipohjaisten peräisin dimeerit, yksi deoksi dimeeri ja yksi uusi artemisiinipohjaisten monomeerin, ja tunnistaminen voimakkaimmista anti-CMV dimeeri. Parannettu anti-CMV aktiivisuus dimeerejä verrattuna monomeerejä ei ollut lisääntyneen cytotoxcity vaan erityisesti anti-CMV aktiivisuus. Kaksi eniten voimakkaita dimeerit olivat tehokkaita eston laboratoriossa sopeutuneet Towne kannan sekä GCV-resistentti kanta. Ne olivat myös osoittanut, että vahvin estävää vaikutusta syöpäsolujen kasvun solulinjoissa.

Kaikki dimeerit osoittivat voimakkaan CMV esto 1 uM. Kuitenkin vain kaksi yhdisteitä (832-4 ja 838) voidaan valita erittäin voimakas anti-CMV aineet perustuen niiden korkea CMV esto 0,1 uM ja niiden sytotoksisuus. Tässä pitoisuudessa, muut dimeerejä joko ei ollut mitään inhibitiota tai enintään 40%: n inhibition lusiferaasin ilmentymistä, kun taas GCV ei ollut estoa lainkaan.

Artemisiinipohjaisten johdannaiset alun perin kehitetty malarianestolääkitystä, mutta myöhemmin olivat myös todettu muita farmakologisia aktiivisuuksia, kuten kasvun inhibition syöpäsolujen ja esto CMV replikaation [12], [13], [22] – [25]. Ovatko nämä uudet toiminnot liittyvät toisiinsa ja osoittaa yhteinen mekanismi, endoperoxide silta näyttää olevan kriittinen kaikessa farmakologisista artemisiinipohjaisten johdannaisia.

Koska yleinen havainto, dimeerit olivat huomattavasti tehokkaampia kuin monomeerien CMV eston. Käyttäen EY

50-arvot

, dimeeriä 838 oli 165-kertaa voimakkaampi kuin Artemisia annua anti-CMV aktiivisuus ja sen SI oli 134 kertaa suurempi kuin Artemisia annua. Tämän tueksi havainnon malli annosvasteen kaltevuus parametri, jota äskettäin käytetty kuvaamaan toimintaa HIV-yhdisteiden [21] paljasti, että dimeerit oli paljon suurempi kaltevuus kuin monomeerejä. Yleensä suurempi kaltevuus korreloi tehokkaamman antiviraalista aktiivisuutta. Tämä voi johtaa joko hyvin suurella affiniteetilla lääkkeen sitoutumisen yhden ligandia tai yhteistoiminnan vaikutuksesta useiden ligandien kanssa samankaltaisella affiniteetilla.

Useita syöpälääkkeet (esimerkiksi estäjät) on osoitettu estävän CMV replikaatiota , mutta yleensä pitoisuuksien saavuttamiseksi tarvitaan CMV inhibition olivat myrkyllisiä soluille ja kielletään niiden käyttö anti-virus ehdokkaita [26]. Mielenkiintoista on, Sorafenibi, multi-estäjät, näyttää estävän CMV replikaation ilman liittyy solujen toksisuutta [27]. Dimeerit raportoitu tässä esti kasvun syöpäsolujen-linjojen ja olivat voimakkaita estäjiä CMV lisääntymään ilman näkyvää solujen toksisuutta. Näin ollen ne voivat tarjota uuden luokan anti-CMV aineita, joilla on erilainen vaikutusmekanismi. Samanlainen anti-CMV aktiivisuus, dimeerit olivat myös tehokkaampia kuin monomeerit estoon syöpäsoluissa. Jatkotutkimuksissa voi paljastaa, onko dual anti-CMV ja syövän vastaisen toiminnan dimeerit johtua yhteinen vaikutusmekanismi. Me ja muut ovat osoittaneet, että inhibitio CMV replikaation artemisiinipohjaisten johdannaiset tulee aikaisessa replikaation aikana ja käsittää mekanismin, joka on erilainen kuin DNA-polymeraasin inhibiittorit [28], [29]. Syövän vastaisen toiminnan ARTEMISIINI on oletettu ottamaan solusyklin pysähtymisen, apoptoosin ja /tai angiogeneesin [30], prosesseja, jotka vaikuttavat myös erityisiä CMV geenejä, useimmiten välitön varhainen geenejä. Jatkotutkimuksissa käsitellään mekanismi CMV inhibition artemisiinipohjaisten johdettu dimeerejä ja niiden mahdollisia päällekkäisyyksiä onkogeenisella signalointi tapahtumia.

Yhteenvetona olemme osoittaneet, että: 1). Dimeerit ovat erittäin aktiivisia CMV replikaatiota, ja dimeeri difenyylifosfaatti 838 on voimakkain CMV inhibition. 2). Annosvasteen kaltevuus parametri dimeerien on merkittävästi korkeampi kuin artemisiniinin monomeerien ja GCV, mahdollinen osoitus siitä, että dimeerit ovat erillisiä luokan anti-CMV yhdisteitä. 3) Dimeerit ovat voimakkaita estäjiä kuin monomeerit sekä syöpäsolun linjat ja CMV.

Materiaalit ja menetelmät

yhdisteet

Gansikloviiri (GCV) saatiin Roche, USA . Kaikki artemisiinipohjaisten johdannaiset Tässä tutkimuksessa käytetyt syntetisoitiin Johns Hopkins University [17], [31] – [33]. Juuri syntetisoitu dimeeriä rikkivetyä 3-karbamaattia (800-3) ja dimeeri rikkivetyä 4-karbamaatti (800-4) sekä dimeeri sulfonia 3-karbamaattia (832-3) syntetisoitiin, kuten on kuvattu Materiaalit S1. Artemisiinipohjaisten johdettu ja -dimeerejä liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) ja varastot 10 mM varastoitiin -80 ° C: ssa. Synteettiset yhdisteet olivat vähintään 98% puhdas perustuen protoni-NMR-spektroskopialla. DMSO itse testattiin CMV-infektoiduissa soluissa, ja se ei ollut antiviraalista aktiivisuutta [13].

Virukset

pp28-lusiferaasi Towne kosntruoitiin kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],20]. Lyhyesti, rekombinantti-virus, joka ilmentää lusiferaasia valvonnassa UL99 (pp28) myöhäinen promoottori muodostettiin insertoimalla reportterigeenin välillä US9 ja US10 avointa lukukehystä (ORF: t) on Towne genomissa. Ekspressiota pp28 -luciferase voimakkaasti aktivoidaan 48-72 tuntia infektion jälkeen (HPI), ja se on lähes täysin estyy, kun läsnä on DNA-polymeraasin inhibiittorit, kuten GCV ja foskarneetti [20]. Olemme äskettäin raportoitu, että pp28-lusiferaasireportterisysteemillä on herkkä, toistettavissa ja erittäin korreloi plackreduktion [20]. Gansikloviiri (GCV) kestävä kanta saatiin potilaalta, jolla CMV-infektio. Se on UL97 mutaatio (H520Q) ja EY:

50 7,6 pM GCV. Tämä kliininen isolaatti saatiin kliinisen virologian laboratoriossa ilman tunnisteita, jotka voivat yhdistää tiettyyn aiheeseen. Johns Hopkins Office of ihmiskoe Institutional Review Board ilmoittaa, että tämä tutkimus voitu soveltaa poikkeusta.

Cell Culture, viruksen ja Anti-virus määrityksissä

ihmisen esinahan fibroblasteja (HFF) kulku 12 -16 (ATCC, CRL-2088 ™) kasvatettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (Gibco, Carlsbad, CA), 5% CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa ja jota käytetään infektiot pp28-lusiferaasi Towne CMV tai GCV-resistentti kanta. Yksi päivä ennen infektion pp28-lusiferaasi, 4 x 10

4 HFF-soluja siirrostettiin jokaiseen kuoppaan 24-kuoppaisille kudosviljelylevyille. Infektio suoritettiin infektiokertoimella 1 PFU /solu (MOI = 1). Seuraavat 90 minuutin adsorption, jotka sisälsivät virusta poistettiin ja korvattiin DMEM: llä, jossa 4% naudan sikiön seerumia (Gibco, Carlsbad, CA), joka sisälsi anti-virus yhdisteitä. Pitoisuus Kunkin yhdisteen laskettiin ja säädettiin tilavuus niin, että se oli vakio koko kokeen ajan.

tartunnan ja käsiteltiin HFF-solut otettiin talteen 72 hpi ja pestiin kerran PBS: llä. Lysaatit analysoitiin lusiferaasi ja solujen elinkelpoisuus käyttäen Luciferase Assay Kit (Promega, Madison, WI) ja CellTiter-Glo Luminescent elinkykyyn Assay Kit, vastaavasti, on GloMax®-Multi + Detection System (Promega) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Ihmisen keuhkojen fibroblasteja (HEL) passage 8-12 (ATCC, CCL-137 ™) kasvatettiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia. Yksi päivä ennen infektiota, 3 x 10

5 solua siirrostettiin jokaiseen kuoppaan 12-kuoppaisille kudosviljelylevyille. GCV-resistenttejä CMV laimennettiin DMEM haluttuun konsentraatioon, joka antoi noin 100 plakkia hyvin ja lisättiin kuhunkin kuoppaan kaksoiskappaleet. Levyjä inkuboitiin 90 minuutin ajan ravistellen 10 minuutin välein; sen jälkeen lisättiin lääkeaineet ja metyyliselluloosa overlay sovelletaan kuhunkin kuoppaan. Kun oli inkuboitu 21 päivää, solut värjättiin kristallivioletilla ja plakit laskettiin mikroskoopin alla 40-kertaisella suurennuksella.

Anti-Cancer Cells Pitoisuus

HeLa (ihmisen kohdunkaulan adenokarsinooma), HCT116 (Human peräsuolen karsinooma) ja 1205Lu (ihmisen melanooma) -soluissa (kaikki ATCC: ltä) pidettiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia. 12-16 tuntia ennen lääkehoitoa, 3 x 10

3-5 x 10

3 solua siirrostettiin jokaiseen kuoppaan 96-kuoppaisille kudosviljelylevyille. Drugs laimennettiin DMEM, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia ja lisättiin soluihin. 72 tunnin kuluttua lääkehoitoa, 20 ui MTT-liuosta (5 mg /ml PBS: ssä) lisättiin kuhunkin kuoppaan, jonka jälkeen ravistelu levyt 150 rpm 5 minuuttia ja 4 tunnin inkubaatio (37 ° C, 5% CO

2). Media poistettiin, levyt kuivattiin ja kukin kuoppa suspendoitiin uudelleen 100 ul MTT formatsaanituotetta /DMSO. Absorbanssi Kunkin kuopan kirjattiin 560 nm GloMax®-Multi + Detection System (Promega).

tukeminen Information

Materiaalit S1.

synteesi 1) dimeeriä rikkivetyä 3-Karbamaatti 800-3. 2) synteesi dimeeri sulfonin 3-Karbamaatti- 832-3. 3) synteesi dimeeri rikkivetyä 4-Karbamaatti- 800-4. 4) synteesi deoksi-artemisiinipohjaisten alkoholi 574. 5) synteesi monomeerillä sulfonin bentsyylisen Dimetyyli Karbamaatti- 551.

doi: 10,1371 /journal.pone.0024334.s001

(DOC) B

Kiitokset

Kiitämme Michael Forman The Department of Pathology, Johns Hopkins Medical toimielimet, Baltimore, Maryland, tarjoamiseksi GCV-resistenttejä CMV.