Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Differentially metyloitu alueet (DMRs) liittyvät monet painettu geenejä. Hiirillä metylaation DMR ylävirtaan

H19

geeni tunnetaan Jälki valvonta-alue (IC1) on hankittu uros ituradan ja vaikuttaa metylaatiostatuksen DMRs 100 kb päässä viereisen Insuliinin kaltainen kasvutekijä 2 (

IGF2) B-geenin läpi pitkän kantaman vuorovaikutuksia. Ihmisillä ituradan johdettu tai sen jälkeen tsygoottisesti hankittu painamista vikoja IC1 liittyy poikkeavaan aktivoinnin tai tukahduttamisen

IGF2

, jolloin synnynnäinen kasvuhäiriöt Beckwith-Wiedemann (BWS) ja Silver-Russell (SRS) oireyhtymät, vastaavasti. In Wilms kasvain ja peräsuolen syöpä, bialleelisen ilmentyminen

IGF2

on havaittu yhdessä menetyksen metylaation DMR on

IGF2.

DMR, tunnettu DMR0, on osoitettu olevan metyloidut on hiljainen äidin

IGF2

alleeli oletettavasti sortotoimissa. Vaikutus

IGF2

DMR0 metylaatiomuutokset etiologiassa BWS tai SRS on tuntematon.

Menetelmät /Principal Havainnot

Analysoimme metylaatio tilan DMR0 vuonna BWS, SRS ja Wilmsin kasvain potilaita tavanomaisilla bisulfiitti sekvensointi ja pyrosekvensointi. Osoitamme tässä, että toisin kuin aiempien raporttien

IGF2

DMR0 todella metyloitu aktiiviseen isän alleeli ääreisverenkierron ja munuaisissa. Tämä on samanlainen kuin IC1 metylaatiostatus ja on ristiriidassa ehdotetun hiljentäminen funktio äidin

IGF2

alleeli. Beckwith-Wiedemann ja Silver-Russell potilaalla on IC1 metyloinnin vikoja on samanlainen metylaatio vikoja

IGF2

DMR0, sopusoinnussa IC1 säännellä metylaation

IGF2

in

cis

. Vuonna Wilms kasvain kuitenkin metyloinnin profiilit IC1 ja

IGF2

DMR0 osoittavia metylaatiomuutokset tapahtuvat molemmissa vanhempien alleelit sijaan

cis

.

Johtopäätökset /Merkitys

Nämä tulokset tukevat sitä mallia, jossa DMR0 ja IC1 on vastakkainen alttiuden maailmanlaajuiseen hyper ja hypometylaatio aikana tuumorigeneesin riippumatta vanhemman alkuperän jälki. Sen sijaan alkionkehityksen aikana DMR0 on metyloitu tai demetyloituu mukaan ituradan metylaatio jälki on IC1, joka osoittaa eri mekanismit merkintä menetys neoplastisia ja ei-neoplastisia soluja.

Citation: Murrell A, Ito Y, Verde G , Huddleston J, Woodfine K, Silengo MC, et al. (2008) Distinct metylaatiomuutokset klo

IGF2-H19

Locus in synnynnäinen kasvuhäiriöitä ja Syöpä. PLoS ONE 3 (3): e1849. doi: 10,1371 /journal.pone.0001849

Editor: Suzannah Rutherford, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 joulukuu 2007; Hyväksytty: 19 helmikuu 2008; Julkaistu: 26 maaliskuu 2008

Copyright: © 2008 Murrell et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat CRUK Senior Cancer Research Fellowship (AM) ja Società Italiana di Cancerologia ja Fondazione Pezcoller apurahan (FC) ja avustukset AICR (AM), MIUR PRIN 2005 (AR), Istituto Superiore di Sanità (AR), Associazione Italiana Ricerca sul cancro (AR ja DP), Telethon-Italia Grant No. GGP04072 (AR), ja Associazione Bianca Garavaglia, Busto Arsizio, Varese, Italia (DP).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia edut ovat olemassa.

Johdanto

Aberrant painamista insuliinin kaltaisen kasvutekijän 2 (

IGF2

) geeni on rooli patogeneesissä liikakasvua häiriö Beckwith-Wiedemann oireyhtymä (BWS, OMIM # 130650), kasvua rajoitus kunnossa Silver-Russell syndrooma (SRS, OMIM # 180860), sekä erilaisia ​​ihmisen syövissä kuten Wilmsin kasvain, poikkijuovaislihassarkoomaa hepatoblastooma, peräsuolen ja rintasyövät [1] – [6] .

hiiri malleja on käytetty osoittamaan, että painettu ilmaus liittyy läheisesti

IGF2

ja

H19

geenien ohjataan erityisillä erilaisesti metyloituja alueita (DMRs) [7 ] – [10]. Yksi näistä DMRs (

H19

DMR) sijaitsee 5 ’

H19

promoottori on metyloitu on isän kromosomista tunnetaan merkintä valvonta-alue, IC1, koska se toimii eristeenä välittämän CCCTC sitova tekijä (CTCF) [11] – [14]. Poistaminen äidin IC1 johtaa aktivoitumiseen normaalisti hiljainen äidin

IGF2

alleeli ja alas-säätely

H19

[9]. Lisäksi hierarkkinen suhde metylaation IC1 ja

IGF2

olemassa siten, että poistetaan tai mutaatio IC1 johtaa myös metylaation muutoksiin DMRs sisällä

IGF2

geeni [15]. Olemme aiemmin osoittaneet, että IC1 todella vuorovaikutuksessa

IGF2

DMRs poissulkevalla ja vanhempi alkuperä erityisellä tavalla vaikuttaneet CTCF sitova ja DNA: n metylaatio [16], [17]. Sovellus tämän mallin ihmisen ovat haitanneet erot gemonin

IGF2

DMRs hiiren ja ihmisen. Erityisesti

IGF2

DMR0, joka sijaitsee 5 ’tärkein

IGF2

promoottorien on metyloitu on äidin alleeli vain istukkaa hiiressä [18], mutta on ero metylaatio kaikissa kudoksissa ihmisillä [19]. Metylointi DMR0 on äidin

IGF2

alleeli oli päätelty käyttäen solulinjoja peräisin BWS potilaan jossa isä uniparentaalinen disomia at 11p15.5 loci (UPD) [19] ja Wilmsin kasvain munuaispotilaan menetys Heterotsygotian äidin alleelin [20]. Metyloituvuutta

IGF2

DMR0 on toteutettu monissa syövän tutkimuksissa seuraavat osoitus siitä, että hypometylaatio tämä DMR liittyy menetys painamista vuonna Wilmsin kasvain [20] ja peräsuolen syöpä [21]. Nykyinen tulkinta näistä tuloksista on se, että menetys metylaatio klo

IGF2

DMR0 on merkitystä aktivoituminen hiljainen äidin alleelin [21].

molekyyliperustan BWS on heterogeeninen 5 % potilaista, joilla voitto metylaation IC1 bialleelisilla aktivointi

IGF2

ja bialleelisten vaiennettu

H19.

Toinen ryhmä BWS potilaista on normaali IC1 metylaatio mutta epänormaali metylointi IC2, emolle metyloitu painamista ohjaus alue sisällä

KCNQ1

ja

KCNQ1OT1

geeniklusterin joka näyttää toimivan riippumaton

IGF2

ja

H19

[2]. BWS potilaalla on IC1 vikoja on erityisen korkea alttius kehittää Wilmsin kasvain, kun taas potilailla, joilla IC2 viat ovat ilmeisesti alttiimpia muiden kasvainten [2], [22]. Hypermetylaation on IC1 on myös usein ominaisuus kuin oire- Wilmsin kasvain potilailla, jotka yhdessä erilliset kasvainalttius profiileja BWS potilailla viittaavat siihen, että samanlaisia ​​epigeneettisellä viat johtavat soma laajuinen liikakasvua ja syöpä. SRS on myös monimutkainen heterogeeninen molekyyli etiologia ja osajoukko yksilöitä on menetys metylaation IC1 bialleelisilla vaiennettu

IGF2

ja bialleelisten aktivointi

H19

[6].

tähän mennessä ei ole ollut raportteja metylaatiostatuksen

IGF2

DMR0 alueella BWS ja SRS potilaiden ja sitä ei tiedetä, missä määrin ehdotettu hiljentäminen tehtävä tämän DMR myötävaikuttaa etiologiassa BWS ja SRS. Siksi tutkittiin vanhempi alkuperän metylaation DMR0 eri alatyyppien BWS ja SRS potilaiden ja myös kohortin Wilmsin kasvain näytteitä. Tuloksemme osoittavat, että aktiivinen isän

IGF2

alleeli on metyloitu DMR0 in

cis

kanssa

H19

metylaatio kuin terveillä henkilöillä ja että SRS ja BWS DMR0 ja IC1 on samanlainen metylaatio poikkeavuuksia. Sitä vastoin Wilmsin kasvain näytteissä DMR0 metylaatio korreloi negatiivisesti IC1 metylointi. Nämä tulokset viittaavat

IGF2

painamista vikoja synnynnäinen kasvuhäiriöitä ja Wilms kasvaimet syntyä erilaisten epigenetic mekanismien.

Tulokset

IGF2 DMR0 metylaatio tilaansa BWS ja SRS potilaiden

tutkittiin metylaatiostatuksen DMR0 perifeerisen veren leukosyyttien DNA peräisin BWS potilailla, joilla on IC1 hypermetylaation (n = 7), IC2 hypometylaatio (n = 37) tai normaali metylaation sekä IC1 ja IC2 (n = 27) ja SRS potilailla, joilla on IC1 hypometylaatio (n = 2), käyttäen bisulfiitti ja pyrosekvensointi analyysi. Alueella analysoitu näkyy kuvassa 1A. Yllätykseksemme 6/7 BWS potilaalla on hypermetylaation at IC1 oli myös hypermetylaation at DMR0 (mediaani metylaatio 69,2%, kvartiiliväli (IQR) 60,5%, 75,1%) ja 2/2 SRS kanssa IC1 hypometylaatio oli myös DMR0 hypometylaatio (28,2% ja 36.28%). Potilaat, joilla on normaali metylaation IC1 tai hypometylaatio at IC2 oli normaali metylaatiotasoilla at DMR0 (mediaani metylaatio 53%; IQR 48,2%, 57,1%). Nämä tulokset viittaavat siihen, että joko metylaatiomuutokset vuonna BWS ja SRS oli esiintynyt

trans

tai että metylaatio on DMR0 on isän alleeli.

. Sijainti DMR0 sisällä

IGF2

geenin suhteen isältä metyloitunut merkintä ohjaus alue IC1, joka on ylävirtaan

H19.

Pyrosekvensointi käytettiin analysoimaan metylaatio kuudelta CpG: t sisällä DMR0 alueella (NCBI 36 : 11, 2125904-2126160, joka sisältää SNP rs3741210). Bisulfiitti (BSQ) ja pyrosekvensointi (PSQ) pohjamaali kannat ovat kuten. Tämä alue sisältää CpG: t (numeroitu 15,16,17) merkitty harmaalla, jotka on aikaisemmin julkaistu olevan hypometyloidut kolorektaalisyövässä [21]. Pystysuorat viivat osoittavat

Msp

I /

Hpa

II sivustoja DMR0. B. Box käyrä, mediaanit, IQR, max. ja min. arvot

IGF2

DMR0 metylaatiotasoilla mitattuna pyrosekvensointi bisulfiitin muunnetun DNA saatu ääreisveren näytteistä BWS ja SRS potilaita. Metylointi prosenttiosuudet kuvata sitä osuutta bisulfiitin muunnetaan sytosiineista klo CpG: t mitataan määrityksessä. Normaali metylaatiotasoilla varten painettu DMRs ovat 45-55% (katso C). Luokat BWS Osalla näistä potilaista oli: ei kuvaan vika on IC1 alueen ja IC2 alue (NM); alhainen metylaatio (LM) klo IC2 (IC2-LM); lisääntynyt isän 11p15 kautta paternal päällekkäisyyksien tai uniparentaalinen disomia (pUPD); ja hypermetylaation at IC1 (IC1-HM). SRS potilaista kaksi kustakin äidin päällekkäisyyttä 11p15 (Mat Dup) ja hypometylaatio klo IC1 (IC1-LM). BWS kanssa hypermetylaation on IC1, myös hypermetylaation at DMR0, kun SRS kanssa hypometylaatio IC1 on hypometylaatio klo DMR0. C. Parent alkuperän erityisiä metylaation normaalissa, BWS ja SRS potilaita. BWS ja SRS potilaat ovat painamista vikoja IC1. Bisulfiitti konvertoidaan DNA monistettiin alleeli-spesifisiä alukkeita rs3741210 polymorfismi

IGF2

DMR0 ennen pyrosekvensointi metylaation. T-alleelin näkyy neliöitä ja C-alleelien osoittama kolmiot tonteista. Ympyrät osoittavat prosenttiosuuden kaikista metylaation CpG: t analysoitiin. Isän alleeli on metyloitu DMR0 kuin äidin alleeli. Molemmat alleelit hypermetyloitunut BWS ja molemmat alleelit ovat hypometyloidut SRS.

erottamaan näitä mahdollisuuksia, tutkimme 13 BWS potilaalla on liikaa kopioita isän 11p15.5 (12 potilaalla oli isän UPD ja yksi potilaalla oli 11p15.5 päällekkäisyys) ja kaksi SRS potilaalla on äidin 11p15.5 päällekkäisyyksiä. Olemme myös päättäneet suoraan vanhempien alkuperää metylaation

IGF2

DMR0 joissakin meidän BWS ja SRS potilaiden ja 6 verrokkiyksilöiden varmistaakseen havaintomme. Potilaat emon päällekkäisyyttä oli alentunut metylaatiotasoilla (44%), kun taas kaikkien isän UPD ja isän päällekkäisyys potilailla oli hypermetylaation ((mediaani metylaatio 60,2%; IQR 56,1%, 64,3%), Fig. 1 B). Kaikissa informatiivinen perheet pystyimme vahvistamaan, että isän alleeli ensisijaisesti metyloitu DMR0 (erityisesti CpG: t 15-17) in

cis

kanssa metylaation IC1 (Fig. 1 C ja kuvio. S1). Nämä tulokset siis viittaavat siihen, että metylaatio on IC1 vaikutteita metylaation

IGF2

DMR0. BWS ja SRS tapauksia metylaatio vikoja IC1 saada samat metylaatio vika on DMR0 ituradan tai aikaisin sikiön kehitykseen niin, että äidin

IGF2

alleeli voittoja metylaatio ja aktivoidaan (BWS) tai isän alleeli epäonnistuu tulla metyloidut ja vaimentuu (SRS). Nämä alleelispesifisen metylaatiomuutokset vaikutuksesta jälki kytkimen niin, että molemmat alleelit näyttävät joko isän alleelin (BWS) tai äidin alleeli (SRS). Pyrosekvensointi tulokset varmistettiin bisulfiittimassasta sekvensoimalla (Fig. S1).

IGF2 metylointianalyysi in wilmsin kasvain näytteissä

Analysoimme DMR0 metylaatio kahdella Wilmsin kasvain potilasta, jotka olivat syntyneet yksilöt vaikuttavat BWS ja joukko ei-oire- Wilmsin kasvain potilailla. Yksi BWS potilaista oli perustuslaillinen hypermetylaation at IC1, toinen oli isän UPD. Ei-oire- Wilmsin kasvain potilailla koostuu henkilöistä, joilla oli kasvain-spesifisen IC1 hypermetylaation (n = 10), 11p15.5 LOH menetys äidin alleelin (n = 13) tai normaali metylointi (n = 10) IC1. Merkillistä, kaikki kasvaimista hypermetylaation on IC1 ja suurin osa niistä, joilla LOH, myös syntynyt yksityisille, joita BWS, oli vähentynyt metylaation DMR0 (mediaani metylaatio 24,8%, IQR 16,52, 34,9), kun taas ne, joilla on normaali IC1 metylaatio oli normaali DMR0 metylaatio (mediaani metylaatio 45,1%, IQR 34,2; 52,3) (Fig. 2A-B). Itse asiassa merkittävä käänteinen korrelaatio (Pearson r = 0,7118, CI -8718-0,4146) ei voitu osoittaa näiden DMR0 ja IC1 metylaatiotasoilla in Wilms kasvaimen potilaan (Fig. 2C). Kuten leukosyytit, vieressä olevaan ei kasvainkudos osoitti hallitseva metylaation isän alleelin (Fig. 2D ja tietoja ei ole esitetty). Nämä tulokset osoittavat selvästi epigeneettiset muutokset Wilmsin kasvain verrattuna synnynnäisten kasvuhäiriöitä.

Box käyrä, mediaanit, IQR, max. ja min. arvot

IGF2

DMR0 metylaatiotasoilla mitattuna pyrosekvensointi ääreisverenkierron (avoin laatikko), normaali munuainen (haudottu laatikko) ja kasvainbiopsioissa (harmaa laatikko) alkaen wilmsin kasvain potilaat, joilla ei ole BWS. Metylointi prosenttiosuudet kuvata sitä osuutta bisulfiitin muunnetaan sytosiineista klo CpG: t mitataan määrityksessä. Normaali metylaatiotasoilla varten painettu DMRs ovat 45-55% (katso D). Wilms Kasvaimen potilaan näytteitä ovat ääreisverenkierron ja kasvaimen DNA potilaalla normaali metylaation IC1 niiden kasvaimet (NM); ääreisverenkierron, normaali munuainen ja kasvaimen DNA-näytteitä potilaista, joilla hypometylaatio IC1 niiden kasvaimet (IC1-HM); ja kasvaimen DNA-näytteitä potilaista, joilla Heterotsygotian menetys (LOH) niiden kasvaimia. Silmiinpistävän, wilmsin kasvain potilailla, joilla hypermetylaation at IC1 on hypometylaatio klo DMR0 niiden kasvaimia. B metylaatiotasoilla ääreisverenkierrossa, ennallaan munuaisten kudosten ja Wilmsin kasvain munuaiskudosnäytteillä kahdesta BWS potilasta (yksi IC1 hypermetylaation ja yksi pUPD). Molemmat potilaat ovat hypometylaatio

IGF2

DMR0 niiden kasvaimia. C Lineaarinen regressio käyrä käänteinen suhde metylaatiotasoilla klo IC1 ja DMR0 in wilmsin kasvain. Kasvaimet kanssa hypermetylaation on IC1 ovat menettäneet metylaation DMR0. D. Perifeerisen veren ja munuaiskudosnäytteillä potilaalta, jolla wilmsin kasvain, joka ei ole hypermetylaation klo IC1. C-alleeli on hypermetyloitunut, kun taas T-alleelin on hypometyloidut sekä veren ja munuaisen osoittaa samanlainen vanhempi alkuperän metylaation näissä kudoksissa.

Keskustelu

tulokset meidän geneettiset tutkimukset osoittavat, että DMR0 on metyloitu on isän alleeli ristiriidassa johtopäätökset kahden edellisen tutkimuksia, jotka ovat ilmoittaneet, että DMR0 metylaatio on äidin alleeli [19], [20]. Ensimmäisessä raportissa metylaatio tutkittiin koko

IGF2

geenin Wilms kasvain näytteitä ja kärsimättä painamista [20]. Tässä tutkimuksessa ero metylaatio klo DMR0 alueella näkyi normaaleissa munuaisissa ja kasvaimissa monoallelic ilme, kun taas kasvaimissa, joissa menetys painamista, olivat hypometyloidut [20]. CpG: t että olemme analysoineet meidän metylaatio määrityksissä tutkittiin myös nämä kirjoittajat käyttämällä

Msp

I

/Hpa

II restriktioanalyysi (kuvio 1) ja alue on kesti anturi 9 kuvissa 1 ja 3 [20]. Neljässä tapauksessa menetys hetero- 11p15.5 jossa äidin alleeli oli kadonnut säilytettyjen isän alleelin havaittiin olevan metyloimatonta ja näin äidin alleeli päätellä olevan normaalisti metyloitua alleelia [20]. Tutkimme 13 tapauksissa LOH ja osoittivat samanlaisia ​​hypometylaatio kuvioita, mikä viittaa siihen, että solut LOH ovat taipuvaisia ​​metylaatiomuutokset on DMR0 seurauksena on kasvaimia. Toinen tutkimus raportoi, että DMR0 on emolta metyloitua tunnettu romaani selostukset

IGF2

kehityksen aikana. Nämä kirjoittajat tutkinut solulinja perustetaan pUPD potilaan ja totesi, että DMR0 oli hypometyloidut [19]. Olemme havainneet, että DMR0 pyrkii demetyloida hybridoomasolulinjoja yhden ihmisen kromosomin 11, riippumatta siitä, vanhempien alkuperästä (julkaisematon havainto), ja olettaa, että tämä voi olla soluviljelmässä ilmiö.

toiminto DMR0 on vielä tuntematon. On oletettu, että rooli DMR0 metylaatio on ylläpitää hiljentäminen on äidin

IGF2

alleeli. Kuitenkin tiedetään, että vanhempien alkuperä

IGF2

DMR0 metylaatio on isän eliminoi roolinsa metylaation välittämää tukahduttamisesta äidin

IGF2

alleeli. Itse mieluummin kuin toimii autonomisena säätelijänä painamista, tulokset viittaavat siihen, että DMR0 metylaatio vaikuttaa IC1 metylointi ei-neoplastisia soluja. Siten alkionkehityksen aikana, vanhempi alkuperän erityisiä metylaatiovyöhykkeiden at ihmisen

IGF2

–

H19

lokus on vahvistettu

cis

samanlainen havaintojen hiirillä [15].

hiirillä jossa CTCF sivustoja on muuntunut, sulkeminen CTCF peräisin äidin IC1 on johtanut metylaatio IC1 [23] ja

IGF2

DMRs [16]. Lisäksi aikuisen hiiren suonipunoksen aivot kudos, jossa

IGF2

ilmennetään molemmissa alleeleissa ja

H19

ei ilmaista, IC1 ja

IGF2

DMRs metyloituvat molemmin vanhempien kromosomit [24]. Osoitamme tässä, että poikkeava voitto tai tappio metylaation IC1 on kytketty samaan metylaatio muutoksen

IGF2

DMR0. Tärkein ero on, että hiirillä on DMR1 ja istukan erityinen DMR0, kun taas ihmisillä, DMR1 puuttuu ja DMR0 tuntuu käyttäytyä lähempänä hiiren DMR1. Lopullinen vaikutus IC1 vaikuttaminen

IGF2

metylaatio että epimutation IC1 on seurausta sekä vanhempien alleelien näyttämällä isän jäljen tapauksessa BWS tai äidin jäljen tapauksessa SRS (Fig. 3).

normaalissa yksilöitä,

IGF2

ilme on peräisin isän alleeli

H19

on peräisin äidin alleelin. IC1 ja DMR0 metyloituvat on isän kromosomista. Vuonna BWS The epigenotype ja ekspressiokuviota äidin kromosomista muunnetaan isän ja SRS The epigenotype ja ekspressiokuviota isän kromosomista muunnetaan äidin (jälki kytkentä). Vuonna Wilms kasvain,

IGF2

aktivointi ja

H19

hiljentäminen liittyvät häiriöt sekä äidin ja isän painatuksia (somaattinen menetys painamista).

Jos pitkä -mallisto vuorovaikutukset DMRs tässä lokuksessa ovat samanlaisia ​​hiirillä ja ihmisillä, tämä selittää merkintä vikoja, jotka löytyvät liikakasvuun häiriöt BWS ja SRS. Kuitenkin merkintä viat Wilmsin kasvain on edelleen vaikea sovittaa yhteen edistäjän kilpailuun ja pitkän kantaman DMR vuorovaikutuksen malleja. Meidän analyysi tämän valitun ryhmän Wilmsin kasvain potilaita, metylaatio klo DMR0 on hävinnyt isän alleeli, kun taas IC1 voitot metylaatio on äidin alleeli. DMR0 metylaatiotasoilla ovat erityisen alhainen joissakin kasvainten, mikä osoittaa lähes täydellisen hävittämisen metylaation tällä sivustolla luultavasti molemmissa alleeleissa (Fig. 2A-C). Epigeneettiset uudelleenohjelmointi näin tapahtuu molemmin vanhempien kromosomit sijaan

cis

, mikä osoittaa, että erilaiset mekanismit ohjaavat

IGF2

painamista vuonna neoplastisten ja ei-neoplastisten solujen (Fig. 3). Soma laajuinen IC1 hypermetylaation sisään BWS altistaa Wilms kasvain ja niiden kaltaiset epigeneettiset muutokset tapahtuu munuaisten kautta preneoplasti- tapahtumia Wilms kasvainten synnyssä [25]. On mahdollista, että DMR0 hypometylaatio liittyy enemmän jatkuva aktivointi

IGF2

kasvainsoluissa seurauksena vaihtoehtoisten korkean tason kromatiinin konformaation edistää kasvaimen erityisiä aktivaattoreita.

aikana tuumorigeneesiä maailmanlaajuisen hypometylaatio esiintyy toista rikkailla alueilla, LINE ja SINE elementit, kun taas CpG-saarekkeiden liittyvät promoottorit voivat hypermetylaation [26]. DMRs metyloitavaa ituradan ja DMRs metyloitavaa somaattisten solujen voivat erota niiden kyky ohjelmoida uudelleen aikana tuumorigeneesin. Edelleen vertailun eri DMRs kannalta ituradan vs. somaattisten ja emästä verrattuna isältä metyloitu sekä geneettiset ja epigeneettiset ominaisuuksien tulisi johtaa syvempää ymmärrystä epigeneettiset uudelleenohjelmointi syövässä. Ennen Tutkimustemme menetys metylaation on ainoa kuvattu epimutation klo DMR0 syövissä, kun sekä hyper ja hypometylaatio on kuvattu IC1 [21], [27]. Lisäksi kaikki raportit osoittavat suoraa korrelaatiota

IGF2

ilmaisun ja DMR0 metylaatiomuutokset tässä lokuksessa ja olemme raportoitu poikkeuksia rintasyövässä (Ito

et al.

Toimitettu), kun taas toiset ovat raportoitu poikkeuksia munasarjojen ja virtsarakon syövän [28], [29]. Nämä tutkimukset, jotka osoittavat tilanteen suhde menetys DMR0 metylaation ja menetys kuvaan tarvitse tulkita uudelleen, koska metylaation DMR0 alue häviää aktiivisesta isän alleeli eikä tuotteiden hiljainen alleeli.

Yhteenvetona osoitamme kolme erilaista uudelleenohjelmointi tapahtumista minä

IGF2-H19

lokuksen ja liittyy painamista menetys BWS, SRS ja wilmsin kasvain. Vuonna kasvuhäiriöt, ituradan alleelispesifinen metylaatiomuutokset vaikutuksesta jälki kytkimen niin, että molemmat alleelit näyttävät joko isän alleelin (BWS) tai äidin alleeli (SRS), kun taas syöpä sekä vanhempien merkit menetetään ja ohjelmoida uudelleen. Meidän havainnot osoittavat, että menetys

IGF2

merkintä on monimutkainen ilmiö, joka esiintyy eri mekanismeja ihmisen sairauden, johtuu todennäköisesti eri molekyyli- syitä ja vastauksia.

Materiaalit ja menetelmät

aiheet

85 BWS ja 3 SRS tapausta rekrytoitiin eri Italian Pediatric Osastot ja oli kliinisesti diagnosoitu perusteiden mukaisesti kuvattu kirjallisuudessa (https://www.geneclinics.org). Tutkimuksessa mukana 40 wilmsin kasvain potilaita ilmoittautunut Paediatric Oncology yksikköä sidoksissa Associazione Italiana Ematologia Oncologia Pediatrica (AIEOP). Kaikki olivat histologisesti diagnosoitu.

Eettinen hyväksyminen

Tämä hyväksyi tutkimuksen eettisiä valiokuntien Napolin toinen yliopisto ja Istituto Nazionale Tumori, INT, Milano.

Identification IC1 ja IC2 metylaatio, UPD, LOH ja kopioluvun poikkeavuudet

DNA metylaatio IC1 ja IC2 analysoitiin Southern blottauksella metylaatioherkät restriktioentsyymejä tai COBRA kuvatulla [2]. Kolme näytettä kanssa IC1 hypermetylaation peräisin BWS potilaista oli myös perinyt microdeletions [30], [31]. UPD, LOH ja päällekkäisyyttä 11p15.5 loci määritettiin microsatellite analyysi, kuten on kuvattu [32].

Analyysit DMR0 metylaation

Suunnittelimme standardi pyrosekvensointi määritystä varten

IGF2

DMR0 alue (NCBI36: 11,2125904-2126160), joka sisälsi kuusi CpG: t, joista kolme aiemmin raportoitu hypometyloidut peräsuolen potilailla, joilla LOI osoitteessa

IGF2

[21]. CpG: t tällä alueella sisältyvät DMR0 alueella analysoitiin muiden [19], [20]. 100 ng-2 ug genomista DNA per näyte bisulfiittimassasta käsiteltiin käyttäen EZ DNA: n metylaatio Kit (Zymo Research). Bisulfiitti käsitelty DNA käytetään tuottaa PCR-monistettiin malleja pyrosekvensointi käyttäen seuraavaa eteenpäin aluke: 5’TGAGGATGGGTTTTTGTTTGGTAT3 ”ja biotinyloitua reverse-alukkeen 5’TCCTCAATCCACCCAAAATAATAT3”. 10 ui biotinyloitua PCR-tuotetta käytettiin kutakin sekvensointi määritystä käyttäen seuraavia sekvensointialukkeita 5’GGGGTGGAGGGTGTA 3 ’ja 5′-AAAAGTTATTGGATATATAGT 3’. Pyrosekvensointi vietiin PSQ HS 96 Järjestelmä ja PyroMark MD System käyttäen Pyro Gold Reagent sarjat (Biotage, Uppsala, Ruotsi). Alleelispesifisen pyrosekvensointi suoritettiin korvaamalla yllä biotinyloitua aluketta alleelispesifisillä biotinyloitua alukkeita, 5’CCCAAAATAATATCTATAAAAAAAAAATTCAC3 ”tai 5’CCCAAAATAATATCTATAAAAAAAAAATTCAT3” jossa tunnustetaan G tai A-alleelin rs3741210 polymorfismin kääntöpuolella lohkon jälkeen bisulfiitin muuntamisen.

metylaatio kvantifioitiin käyttäen Pyro Q-CpG Software (Biotage, Uppsala, Ruotsi), joka laskee suhde muunnetun C: n (T: n) ja kääntymättömät C: n kussakin CpG ja ilmaisee tämän prosentteina metylointi. Keskimäärin metylaatio poikki DMR0 kaikille 6 CpG: t laskettiin. Mediaani ja IQR metylaation erityyppisille potilaista analysoitiin Prism Graphpad ohjelmistoa.

todentaa alleelispesifinen metylaation tavanomaisilla bisulfiittimassasta sekvensoimalla kloonatut PCR-tuotteiden kaikissa informatiivinen tapauksissa.

tukeminen Information

Kuva S1.

bisulfiittimutaqeneesi sekvensointi analyysit IGF2 DMR0 Metylointi normaalissa, synnynnäinen kasvuhäiriöitä ja wilmsin kasvain. IGF2 DMR0 Metylointi normaalissa, synnynnäinen kasvuhäiriöitä ja wilmsin kasvain. Metylointi 6 CpG: t määritettiin bisulfiittimassasta genomista sekvensointia DNA uutetaan ääreisverivalkosolut (normaali, BWS ja SRS) tai kasvain kudoksen (wilmsin kasvain) yksilöiden informatiivinen rs3741210 polymorfismin. Täytetyt ympyrät edustavat metyloitu CpG: t ja avoimet ympyrät metyloitumaton CpG: t. Äidin (MAT) ja isän (PAT) alleelit IGF2 DMR0 alue on merkitty.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0001849.s001

(1,33 MB TIF) B

Kiitokset

Kiitämme panos AIEOP wilmsin kasvain tieteellinen komitea ja kaikki potilaat ja heidän perheensä niiden osallistumisesta tähän tutkimukseen.