Krooninen sairaus

tiivistelmä

Onco-miR-182-5p on raportoitu olevan yli-ilmentynyt virtsarakon syöpä (BC) kudokset kuitenkin yksityiskohtainen toiminnallinen analyysi miR-182-5p ei ole toteutettu BC. Siksi Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli: 1. tekemään funktionaalinen analyysi miR-182-5p virtsarakon syöpä, 2. arvioida sen käyttökelpoisuus tuumorimarkkeri 3. tunnistaa miR-182-5p kohdegeenien BC. Aluksi havaittiin, että miR-182-5p ilmentyminen oli merkitsevästi korkeampi virtsarakon syövän verrattuna normaaleihin kudoksiin ja korkea miR-182-5p ekspressio liittyy lyhyempi elinaika BC potilailla. Tutkia toiminnallinen merkitys miR-182-5p, me yliekspressoitujen miR-182-5p kanssa miR-182-5p esiaste ja totesi, että solujen lisääntymistä, muuttoliike ja invaasio kyvyt korotettiin BC soluissa. Kuitenkin apoptoosia estyi miR-182-5p. Havaitsimme myös

Smad4

ja

RECK

mahdollisina kohdegeenien miR-182-5p käyttämällä useita algoritmeja. 3’UTR lusiferaasiaktiivisuus näiden kohdegeenien oli vähentynyt huomattavasti, ja proteiinin ilmentymistä näiden kohdegeenien oli merkittävästi säädellään ylöspäin miR-182-5p estäjä Transfektoituja virtsarakon syövän soluissa. MiR-182-5p myös lisääntynyt ydinvoiman beeta-kateniinin ilmaisun ja samalla Smad4 tukahdutettu ydin- beeta-kateniinin ilme. Lopuksi todettakoon, että tiedot viittaavat siihen, että miR-182-5p on tärkeä rooli, kuten onkogeeni, jonka kaatamalla RECK ja Smad4, jolloin aktivointi Wnt-beeta-kateniini signalointireitin virtsarakon syövän.

Johdanto-osan: Hirata H, Ueno K, Shahryari V, Tanaka Y, Tabatabai ZL, Hinoda Y, et ai. (2012) onkogeeninen miRNA-182-5p Tavoitteet Smad4 ja RECK Human virtsarakon syövän. PLoS ONE 7 (11): e51056. doi: 10,1371 /journal.pone.0051056

Editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 syyskuu 2012; Hyväksytty: 29 lokakuu 2012; Julkaistu: 30 marraskuu 2012

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Center for Research Resources Yhdysvaltain National Institutes of Health kautta Grant Number RO1CA138642, RO1CA130860, RO1CA160079, VA Merit Review avustukset, ja VA Program Project. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

virtsarakon syöpä (BC) on kolmanneksi yleisin kuolinsyy urologiset kasvaimet ja yleisin histologinen tyyppi virtsarakon syöpä on urothelial karsinooma (UC), joka tunnettiin aiemmin nimellä siirtymäkauden cell carcinoma (TCC) [1]. Noin 75% potilaista ovat ”ei-lihas- invasiivisia UC (PTA, pTis, pT1) ja on 5 vuoden pysyvyys on välillä 88-98% [2]. Yhteinen hoito näille potilaille on endoskooppinen resektio [1], [3]. Potilaat, joilla on lihas invasiivisia UC hoidetaan yleensä radikaali cystectomy tai kemoterapia sädehoito [1], [4]. Kuitenkin puolet lihas invasiivisen UC potilaille kehittyy myöhemmin etäpesäkkeitä kuluttua ensimmäisestä aggressiivinen hoito [1], [5]. Aiemmat tutkimukset ovat tunnistaneet useita mahdollisia molekyylitason biomarkkereita virtsarakon syöpään [6], [7]. Inaktivointi tuumorisuppressorigeeneille

TP53

ja

Rb

ja

Ras

onkogeeni aktivointi on pidetty tärkeänä avaintoimijoita virtsarakon syövän syövän synnyn [6].

aktivointi Wnt-beeta-kateniinin signalointi on myös tutkittu ja raportoitu liittyvän syövän etenemiseen ja huonon ennusteen virtsarakon syövän [8], [9]. Transformoiva kasvutekijä beeta (TGF-beeta) on keskeinen rooli alkion kehitykseen patogeneesi useiden sairauksien ja syövän [10]. Todisteet välistä ylikuulumista TGF-beeta- ja muut signalointireitteihin, mukaan lukien Wnt-signalointi on raportoitu [10]. Smad4 on keskeinen solunsisäisen signaalitransduktion komponentti TGF-beeta- ja viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että Smad4 toimii yhdessä beeta-kateniinin useita caners [11] – [14].

RECK on ratkaiseva repressorin matriksin metalloproteinaasien (MMP: t ) ja aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että RECK ilmentyminen on huomattavasti alhaisempi virtsarakon syövän kudoksissa verrattuna normaaliin urothelial kudoksissa [15] – [17].

toistaiseksi monet MikroRNA on tunnistettu ja raportoitu olevan tärkeitä monissa syövissä [18]. MikroRNA (miRNA) ovat pieniä ei-koodaavat RNA: t, noin 22 nukleotidia pitkiä, jotka kykenevät säätelemään geenin ilmentymistä sekä transkription ja translaation tasolla [19]. MiRNA sitoutuvat 3’UTR kohde-mRNA ja tukahduttaa käännös mRNA proteiineihin tai aiheuttaa mRNA pilkkominen ja siten säätelemään kohdegeenien [20].

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että miR-182- 5p oli merkitsevästi korkeampi virtsarakon syövän kudoksissa verrattuna normaaliin urothelial kudoksiin ja korkea miR-182-5p ilmentyminen oli merkitsevästi yhteydessä lyhyempi kokonaiselossaolo. Tähän mennessä ei ole ollut raportteja toiminta miR-182-5p virtsarakon syöpään. Niinpä olemme keskittyneet miR-182-5p, suoritetaan toiminta-analyysejä tunnistaneet useita kohdegeenien miR-182-5p useilla algoritmeja ja tunnistettu

Smad4

ja

RECK

kuin kohdegeenien. Lopuksi yli-ilmentynyt näiden kohdegeenien (

Smad4

ja

RECK

) virtsarakon syöpäsolujen tutkia mekanismi miR-182-5p toiminto.

Tulokset

miRNA-182-5p Expression on merkitsevästi korkeampi virtsarakon syövän kudokset ja Associated kanssa Shorter Kokonaiselossaoloaika

Vertasimme miRNA-182-5p ekspressiotasot virtsarakon syövän kudoksissa (n = 18) ja normaali urothelial kudokset (n = 6) reaaliaikaisella PCR: llä. MIR-182-5p ekspressio oli merkittävästi suurempi virtsarakon syövän kudoksissa (kuvio 1A). Tutkimme yhdistys miR-182-5p ja useita kliinisiä parametrejä kuten kuvassa 1-B ja havaittiin, että korkea miR-182-5p ilmentyminen oli merkitsevästi yhteydessä lyhyempi eloonjäämiseen.

. miR-182-5p ilmentymistä kliinisissä näytteissä ja virtsarakon syövän solulinjoissa, B. Association of miR-182-5p kanssa klinikalla-patologinen parametrit, C. Kaplan Meier kuvaajia kokonaiselinaika.

Mitä useita muut kliinisten parametrien, mitään merkittävää suhdetta ei havaittu. Jaoimme 18 virtsarakon syöpäpotilailla kahteen ryhmään perustuen mediaanin Kaplan Meier tonttien osoitti kokonaiselinaikaan oli lyhyempi korkean miR-182-5p ilmentävät (p-arvo = 0,0349, log-rank test) (kuvio 1- C).

miRNA-182-5p Expression lisääntyy merkittävästi virtsarakon syövän solulinjoissa

Vertasimme miR-182-5p ilmentymistä useissa virtsarakon syövän solulinjoista ja sen ilmentymistä T24 ja UM -UC-3-soluissa oli alueella että virtsarakon syöpä kudoksiin. Niinpä käytimme näitä kahta virtsarakon syövän solulinjoista lisäkokeita varten tässä tutkimuksessa (kuvio 1A).

vaikutus mikroRNA-182-5p Over-ilmentymisen elinkykyyn ja maahanmuutto virtsarakon syövän Cell Lines

vahvista toiminto miR-182-5p, transfektoimme miR-182-5p esiaste osaksi virtsarakon syövän solulinjoissa (T24 ja UM-UC-3). 24 tunnin transfektion jälkeen miR-NC tai miR-182-5p esiaste osaksi virtsarakon syövän solujen miR-182-5p ekspressiotaso varmistettiin reaaliaikainen PCR (fold muutos, 4545, 5920, vastaavasti Fig. 2-A) . Sitten useita toiminnallisia analyysit tehtiin. Havaitsimme huomattavasti solujen proliferaatiota (Fig. 2-B), invaasiota (Fig. 2-C) ja kulkeutuminen (Fig. 2-D) miRNA-182-5p transfektoiduissa soluissa verrattuna miR-NC transfektoiduissa soluissa. Lisäksi, miR-182-5p laski merkittävästi solujen apoptoosin (Fig. 2-E).

kaksi virtsarakon syöpäsolulinjoista (T24 ja UM-UC-3) transfektoitiin väliaikaisesti joko miR-182-5p esiaste tai ohjaus (miR-NC). A. Suhteellinen miR-182-5p ilmentymistä, B. Solujen elinkyvyn, C. Invasion määritys, D. Haavan paranemista määritys (24 tuntia), E. virtaussytometrinen analyysi apoptoosin miR-NC tai miR-182-5p transfektoitiin BC soluja.

3′-UTR-lusiferaasimäärityssysteamiä ja Target Protein Expression in miR-182-5p Transfektantit

RECK mRNA on yksi taas Smad4 on kaksi potentiaalista ilmainen sitoutumispaikan asennuspalveli- 182-5p sen 3 ’UTR (Fig. 3-A). Näiden tulosten perusteella suoritimme 3’UTR Lusiferaasimäärityksiä ja totesi, että suhteellinen lusiferaasiaktiivisuudet nämä sivustot ovat pienentyneet merkittävästi miR-182-5p transfektoitujen virtsarakon syövän solujen (T24, UM-UC-3) (Fig. 3-B ). Nämä tulokset viittaavat siihen, että RECK ja Smad4-mRNA: t ovat mahdollisia kohdegeenien miR-182-5p. Western-analyysi vahvisti, että RECK ja Smad4-proteiinin ekspressio oli lisääntynyt miR-182-5p estäjä transfektoiduissa soluissa (Fig. 3-C).

. RECK ja Smad4 3’UTR asema ja täydentävä miR-182-5p sekvenssit. B. 3’UTR lusiferaasianalyysissä (miR-NC ja miR-182-5p esiaste), C. RECK, Smad4 ja beeta-tubuliinin proteiinin ilmentymistä miR-NC estäjän tai miR-182-5p estäjä transfektoitujen virtsarakon syöpäsolujen (T24, UM-UC-3).

Effects of Yli-ilmentymisen RECK ja Smad4 on Virtsarakon syövän Cell (T24) toiminto

tarkastella toimintaa RECK ja Smad4, me yli-ilmennetään RECK ja Smad4 in T24-soluissa, jotka on vahvistettu mittaamalla mRNA: ta (Fig. 4-A), ja proteiinin ilmentymisen tasot (Fig. 4-B). Sitten suoritimme useita toiminnallisia analyysejä. Kuten kuviossa 4 on esitetty, solujen elinkykyä (Fig. 4-C), invaasiota (Fig. 4-D) ja kulkeutuminen (Fig. 4-E) oli merkittävästi inhiboitu RECK ja Smad4 transfektoitiin T24 virtsarakon syövän soluissa. Kuten kuviossa 4-F, prosenttiosuus apoptoottisten solujen määrä oli lisääntynyt RECK tai Smad4 transfektoiduissa soluissa.

A. 24 tunnin kuluttua transfektiosta joko pCMV6-tyhjä, pCMV6-RECK tai pCMV6-Smad4 osaksi virtsarakon syöpä soluja (T24), RECK ja Smad4 ekspressiotasoja varmistettiin reaaliaikainen RT-PCR (kertainen muutos, 24744, 8563, vastaavasti) ja Western-analyysi (B) C. solunelinkykyisyysmääritys, D. invaasiomääritys, E. Haavan parantava määrityksessä, F. virtaussytometrinen analyysi apoptoosin tyhjä, RECK ja Smad4 transfektoitiin T24-soluissa. Tiedot ovat keskiarvo ± S.D. neljästä itsenäisestä kokeesta. G. beeta-kateniinin ilmentymistä tumafraktios-, CREB käytettiin kontrollina.

vaikutus miR-182-5p ja Smad4 Beta-kateniinin Ekspressio tumafraktios-

kuvion 4-G, beeta-kateniinin ilmentymistä tumafraktios- oli merkittävästi lisääntynyt miR-182-5p transfektoitujen T24-soluissa. Sen sijaan, beeta-kateniinin ilmentymistä tumafraktios- oli merkittävästi vähentynyt Smad4 transfektoiduissa T24 soluja.

Keskustelu

Useat MikroRNA on todettu kasvaimia estävä tai onkogeenien perustuu niiden ilmentymistason virtsarakon syöpä kudoksia ja /tai toiminnallinen analyysi. Kuitenkin monet miRNA tutkimukset ovat keskittyneet tuumorisuppressorigeenin miRNA lukien miR-125b, -133a, -143, -145, -200 perhe (200a, 200b, 200c, 141, 429), -203, -205, -218, – 449A, -493 ja -517a [21] – [29]. Kaksi miRNA (miR-21 ja miR-129) on tunnistettu ja vahvistettu onkogeenien virtsarakon syöpä [30], [31].

MiR-182-5p on myös raportoitu olevan onkogeenin useita syövät [32] – [37]. Samanlaisia ​​tuloksemme, yksi Raportin mukaan miR-182-5p ilmentyminen oli merkitsevästi korkeampi virtsarakon syövän kudoksissa verrattuna normaaliin uroteeliin kuitenkin toiminnallinen analyysi ei tehty tässä tutkimuksessa [38]. Siten tutkimme suhdetta miR-182-5p ilmaisun ja kliinisten parametrien mukaan luettuna patologinen vaiheet ja hoitotuloksia ja totesi, että miR-182-5p ilmentyminen korreloi lyhyempi eloonjäämiseen jälkeen operaation virtsarakon syöpäpotilailla. Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-182-5p voi olla uusi ja käyttökelpoinen diagnostinen biomerkkiaine virtsarakon syövän.

Seuraava tavoitteena oli määrittää, onko miR-182-5p toimii virtsarakon syöpä onkogeeni. Kolmen virtsarakon syövän solulinjoissa (T24, UM-UC-3, J82), ilmentymistä miR-182-5p kahdessa solulinjoissa (T24 ja UM-UC-3) oli alueella ekspressiotaso havaittiin virtsarakon syövän kudoksissa . Niinpä käytimme näitä kahta virtsarakon syövän solulinjoista (T24 ja UM-UC-3) toiminnallista analyysiä kokeita. Huomasimme, että yli-ilmentyminen miR-182-5p merkittävästi edistänyt virtsarakon syövän solujen elinkykyä, muuttoliike ja invaasion ja estivät apoptoosin. Käytimme useita algoritmeja etsiä mahdollisia miR-182-5p kohdegeenien koska MikroRNA niiden vaikutukset säätelemällä kohdegeenin ilmentymisen. Havaitsimme RECK ja Smad4 potentiaalisia kohde-geenien 3’UTR lusiferaasianalyysissä ja Western-analyyseillä.

MMP on tärkeä rooli syövän eteneminen ja metastaasit ja MMP-2 korkeus virtsarakon syövän kudoksissa on raportoitu korreloivan kasvaimen vaiheen ja huonon ennusteen virtsarakon syöpäpotilailla [39], [40]. RECK on ratkaiseva MMP-2-repressorin ja RECK ekspressio on aiemmin raportoitu olevan säädeltiin virtsarakon syövän kudoksissa verrattuna normaaliin uroteeliin [16], [17]. Lisäksi DNA: n metylaatio on tunnistettu RECK vaiennettu mekanismi [41]. Äskettäin miR-21 tunnistettiin säätelijänä

RECK

geeniekspressiota useissa syövissä [42], mutta tähän mennessä ei ole raportti, joka osoittaa suoraa sääntelyä RECK by miR-182-5p.

Tutkimme myös tehtävä RECK yli ilmaisemaan näitä virtsarakon syövän solulinja (T24). Kuten on esitetty, RECK estivät solujen proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota kykyjä virtsarakon syövän solujen ja apoptoottisten solujen määrässä korotettiin RECK transfektiolla.

Smad4 on tärkeä signaali transduktio komponentti TGF-beeta- ja viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että Smad4 toimintoja yhteistyössä beeta-kateniinin useissa syövissä.

Wnt-beeta kateniinia signalointi on ratkaisevaa embryogeneesiin ja tuumorigeneesiä [43]. Syöpäsoluissa, Wnt-reitti aktivoituu yleensä aiheuttaa fosforyloitumaton beeta-kateniinia kerääntyy sytoplasmassa ja siirtyy tumaan, jossa se sitoutuu TCF /LEF ja transkriptionaalisesti säätelee Wnt kohdegeenien edistää tuumorigeneesiä [43]. Virtsarakon syöpä, vapautettiin Wnt-beeta-kateniinin signaloinnin tärkeä rooli etenemisen ja etäpesäkkeiden. Niinpä me katsoimme onko beeta-kateniinin ilmentymistä muuttui joko miRNA-182 tai Smad4 transfektiota. Kuten havaitaan, miR-182-5p lisääntynyt ydinvoiman beeta-kateniinin ilme taas Smad4 laski ydin- beeta-kateniinin ilme. Sikäli kuin tiedämme, ei ole ollut raportteja miR-182 ja Wnt-beeta-kateniinin signalointi ja tulokset viittaavat siihen, että onkopsykologista miR-182-5p voi olla mukana Wnt-beeta-kateniinin liittyviä geenejä.

tutkimuksessamme Smad4 yli-ilmentyminen väheni virtsarakon syövän solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion kyky. Apoptoosi lisääntyi myös Smad4 yli-ilmentymisen virtsarakon syövän soluissa. Koska menetys Smad4 on raportoitu olla syy rooli aloittamista okasolusyöpää ihon, ruoansulatuskanavan yläosassa sekä adenokarsinooma ruoansulatuskanavan [44], tuloksemme voivat osoittaa, että Smad4 on tärkeä rooli virtsarakon syöpä. Koska olemme keskittyneet pelkästään Smad4 että Wnt-signalointi cascade, on mahdollista, että muut geenit voidaan suoraan tai epäsuorasti säätelee miR-182-5p. Muita kokeita tarvitaan selvittämään tarkkaa roolia miR-182-5p in Wnt-beta kateniinia signalointi. Yhdessä tämä tutkimus osoittaa, että miR-182-5p kykenee sen kasvaimia aiheuttavalle vaikutukselle virtsarakon syövän soluissa alaspäin säätäminen RECK ja Smad4.

Tämä on ensimmäinen raportti myös dokumentoida että miR-182-5p ilme on merkittävästi lisääntynyt virtsarakon syövän kudoksissa, joissa se toimii onkogeenin estämällä RECK ja Smad4 ilmaisun, ja se voi mahdollisesti olla käyttökelpoinen ennusteen biomarkkerina. Nämä tulokset viittaavat myös siihen, että miR-182-5p voi olla terapeuttista potentiaalia hoidettaessa virtsarakon syöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Formaliinifiksoidusta, paraffiini- sulautettujen (FFPE) virtsarakon syöpä näytteitä saatiin San Francisco Veterans Affairs (VA) Medical Center. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta ja tutkimuksen hyväksyi UCSF komitean Human Research (Hyväksyntänumero: H9058-35751-01).

Kliiniset näytteet

Yhteensä 18 male potilaalla on patologisesti vahvistettu virtsarakon syöpä otettiin tässä tutkimuksessa (Veterans Affairs Medical Center at San Francisco).

Cell Culture

kolme virtsarakon syövän solulinjoissa (J82, ATCC: HTB-1, T24, ATCC: HTB-4, UM-UC-3, ATCC: CRL-1749) hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). J82 ja UM-UC-3 solulinjoja viljeltiin MEM Eagle kanssa Earlen BSS, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia. T24 solulinja viljeltiin McCoyn 5A-väliaine, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia.

RNA ja proteiini Extraction

RNA (microRNA ja kokonais-RNA) uutettiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) ihmisen virtsarakon syöpä ja ei-syöpä normaalissa virtsarakossa kudoksissa (urothelial solut) käyttäen miRNeasy FFPE (Qiagen) sen jälkeen, kun laser micro-dissection perustuu patologien arvostelua. Kokonais-RNA uutetaan myös virtsarakon syövän solulinjoissa käyttämällä miRNeasy mini kit (QIAGEN). Solut lyysattiin RIPA-puskurilla (Thermo Scientific, Rockford, IL), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita (Sigma, St. Louis, MO). Proteiini kvantifiointi suoritettiin käyttämällä BCA-proteiinin määrityskittiä (Thermo Scientific, Rockford, IL). NE-PER Ydin- ja sytoplasmisia Extraction Reagent käytettiin erottamaan ydin- ja sytoplasmisen proteiinin fraktiot virtsarakon syövän solujen (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL).

MicroRNA transfektio (pre-miR esiasteen ja miR Inhibitor)

Pre-miR ™ miRNA lähtöaineiden [negatiivinen kontrolli (miR-NC) tai HSA-miR-182-5p, Ambion] transfektoitiin transientisti virtsarakon syövän solujen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Anti-miR ™ miRNA-inhibiittori [negatiivinen kontrolli (inh-NC) tai miR-182-5p estäjä (miR-182: n estäjä), Ambion] transfektoitiin transientisti virtsarakon syövän solujen SIPORT NeoFX transfektio Agent (Ambion) mukaan valmistajan ohjeiden. Transfektion jälkeen soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 48 tunnin ajan, kunnes arviointi.

elinkykyyn, Cell Invasion, haavan paraneminen Pitoisuus

Solujen elinkelpoisuus mitattiin 3 päivää transfektion jälkeen MTS (CellTiter 96 vesipitoiset Yksi ratkaisu proliferaatiomääritystä, Promega). Tiedot ovat keskiarvo ± S.D. 6 itsenäisen kokeen. Soluinvaasion määritykset suoritettiin CytoSelect 24-kuoppaisen solu- invaasiomääritys kit (Cell Biolab, San Diego, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Transfektoidut solut suspendoitiin uudelleen elatusaineeseen ilman FBS: ää ja laitettiin ylemmän kammion kolmena kappaleena. 48 tunnin kuluttua inkuboinnin 37

o C (5% CO2), solut vaeltavat kalvon läpi oli värjäytynyt. Tulokset ilmaistiin tunkeutuneet soluissa määrällisesti OD 560nm. Haavojen paranemista alkaa kudosmatriksia remodeling, muuttoliike, ja lopulta sulkeminen haava-alueen. Siksi tässä määrityksessä käytetään usein arvioida syövän solujen vaeltamiseen. Haavan paranemista määritys suoritettiin CytoSelect 24 ja haavoja iinianalyysikitissä mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Voit luoda haava kenttä, transfektoituja soluja viljeltiin, kunnes ne muodostivat yksikerroksista ympärille insertin. Poistamisen jälkeen insertti, joka on 0,9 mm: n avoin haava kenttä on luotu ja solujen annettiin siirtyä molemmin puolin kuilua. Haavan seurattiin ja prosentuaalinen sulkemista mitattiin. [Prosenttia sulkeminen korko (%) = siirtynyt solun pinta-ala /kokonaispinta-ala x100)].

Apoptosis Analyysit

Solut (48 tuntia transfektion jälkeen) pestiin kahdesti 1x PBS: lla ja trypsinoitiin. Inaktivoinnin jälkeen trypsiini täydellisessä väliaineessa, solut suspendoitiin uudelleen jääkylmään 1x sitovaa puskuria (70 ui). Anneksiini V-FITC-liuosta (10 ui) ja 7-AAD elinkelpoisuuden väriainetta (20 ui) lisättiin 70 ul: aan solususpensiota. Kun oli inkuboitu 15 minuuttia pimeässä, 400 ui jääkylmää 1x sitovaa puskuria lisättiin. Apoptoottisen solujen jakautuminen, kussakin näytteessä määritettiin sitten käyttämällä FACS (Cell Lab QUANTA SC, Beckman Coulter, Fullerton, CA). Tiedot ovat keskiarvo ± S.D. neljästä itsenäisestä kokeesta.

Plasmidin rakentaminen ja 3’UTR-Luciferase Assay

rakennettu yksittäisten plasmidien kunkin sitoutumiskohdan 3’UTR mRNA: n mahdollisten kohdegeenien perustuu microRNA.org tiedot. Sitten vahvistettu miR-182-5p sitoutumisen kohdegeenien mRNA: n 3’UTR lusiferaasin määrityksessä miR-182-5p esiaste. PmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target ekspressiovektoria käytetään suorittamaan 3’UTR lusiferaasi määritystä (Promega, Madison, WI, USA). Aluke sekvenssejä käytettiin plasmidin inserttien on esitetty taulukossa 1. kokonaistilavuudessa 20 ui, 5 ui kutakin 100 uM forward-aluketta ja reverse-aluketta, 2 ui 10x hybridisointipuskuriliuosta (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M NaCl, 10 mM EDTA) ja 8 ui vettä lisättiin 200 ui PCR-putkeen, ja niitä inkuboitiin 95 ° C: ssa 5 minuuttia ja sitten sijoitetaan huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan. Oligonukleotidit ligatoitiin

Pme

I

Xba

I -kohtaan pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector. Colony suora PCR suoritettiin insert tunnustamista käyttämällä REDTaq (Sigma, St. Louis, MO, USA). Käytetyt alukkeet PCR olivat seuraavat: eteenpäin aluke, 5′-cgtgctggaacacggtaaaa-3 ’; reverse-aluke, 5’-gcagccaactcagcttcctt-3 ’. PCR-parametrit pyöräily olivat seuraavat: 94 ° C 3 minuuttia, 30 PCR-sykliä 94 ° C 30 sekuntia, 55 ° C 30 sekuntia ja 72 ° C 30 sekuntia, 72 ° C: ssa 10 minuuttia ja 4 ° C 10 minuutin ajan. PCR-tuote hajotettiin NotI (Takara /Fisher Scientific,

Pittsburgh

,

PA, USA

). Koot vektoreita, jotka sisältävät inserttejä oli noin 200 bp ja 100 bp: n elektroforeesilla koska Notl-tunnistussekvenssi sisällytettiin alukkeita. Mir-182-5p esiaste transfektio, virtsarakon syöpä solut ko-transfektoitiin miR-NC ja pmirGLO tai miR-182-5p ja pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target ekspressiovektorit käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Lusiferaasiaktiivisuus arvioitiin käyttäen Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega) (48 tunnin kuluttua niiden transfektion).

yliekspressio Plasmidi kohdegeenien (RECK, Smad4) ja toiminnalliset analyysit

jotta rakentaa kohdegeenin (RECK, Smad4) yli ilmentävät plasmidit, geenit monistettiin kokonais-RNA ihmisen aikuisen normaalista munuaiskudokset (luettelo #: R1234142-50, BioChain Institute, Newark, CA) ja RWPE-1 transkriptio-polymeraasi ketjureaktio (RT-PCR). Sekvenssit alukkeiden kloonausta varten on esitetty taulukossa 1. Polymeraasiketjureaktio tuotteet kloonattiin pTargeT-Mammalian Expression Vector System (Promega, Madison, WI). Sitten pCMV6-RECK tai pCMV6-Smad4 saatiin subklonaamalla Nhel-Xhol- fragmentti peräisin pTargeT-RECK /Smad4 Nhel-Xhol pCMV6-Entry Vector.

Aluksi transfektoimme pCMV6 tyhjä ja pCMV6- RECK tai -Smad4 osaksi virtsarakon syövän solujen ja RNA: n ja proteiinin uutettiin. Yliekspressio RECK tai Smad4 vahvistettiin reaaliaikainen RT-PCR: llä ja Western blot -analyysi ja funktionaalisia analyysejä suoritettiin.

Kvantitatiivinen reaaliaikainen RT-PCR

Quantitative reaaliaikaisen RT-PCR oli suoritettiin kolminkertaisesti Applied Biosystems Prism 7500 Fast Sequence Detection System käyttäen TaqMan Universal PCR master mix mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). TaqMan-koettimet ja alukkeet toimitti Applied Biosystems. Ihmisen GAPDH ja RNU48 käytettiin endogeenista kontrolli. Tasot RNA-ilmentymisen määritettiin käyttämällä 7500 Fast System SDS-ohjelmiston versio 1.3.1 (Applied Biosystems).

Western-analyysi

Yhteensä solun proteiini (15-20 ug) käytettiin Western blotting . Näytteet ratkaistiin 4-20% Tarkka proteiinigeeleissä (Thermo Scientific, Rockford, IL) ja siirrettiin PVDF-kalvoille (Amersham Biosciences, Fairfield, CT). Membraanit upotettiin 0,3% rasvatonta maitoa TBS: ssä, joka sisälsi 0,1% Tween 20: ssa 1 tunnin ajan ja tutkittiin yli yön 4 4 ° C: ssa primaaristen polyklonaalisen ja monoklonaalisen vasta-aineen Smad4 (# 9515), RECK (# 3433), beeta-kateniini ( # 9562), CREB (# 9197) ja beeta-tubuliinia (# 2128) Cell Signaling Technology, Beverly, MA. Blotit pestiin TBS: ssä, joka sisälsi 0,1% Tween 20: tä ja leimattu piparjuuren peroksidaasilla (HRP) konjugoidun sekundaarisen anti-hiiri- tai anti-kani-vasta-ainetta (Cell Signaling Technology, Beverly, MA). Proteiinit parantaa kemiluminesenssin (Amersham ECL plus Western blotting tunnistusjärjestelmä, Fairfield, CT) visualisointiin. Proteiini ekspressiotasoja ilmaistiin suhteessa beta-tubuliinia tai CREB tasoilla.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen StatView (versio 5; SAS Institute Inc., NC).

p

-arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Kiitokset

Kiitämme tohtori Roger Erickson hänen tuen ja avun valmistelun käsikirjoituksen .