Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

S-propargyyli-kysteiini (SPRC), H

2S luovuttaja, on rakenteellinen analogi S-allycysteine ​​(SAC). Tutkittiin sen potentiaali syövän vaikutusta on SGC-7901 mahasyövän solujen ja mahdolliset mekanismit, jotka voivat olla mukana.

menetelmät ja havainnot

SPRC hoito vähensi merkittävästi solujen elinkelpoisuuden, tukahdutti lisääntymistä ja migraatio SPRC-7901 mahalaukun syöpäsoluja, oli proapoptoottisten sekä aiheutti solukierron pysähtymisen G

1 /S-vaiheen. Eräässä

in vivo

tutkimuksessa, intraperitoneaalisena injektiona 50 mg /kg ja 100 mg /kg SPRC merkittävästi vähentää kasvaimen painot ja kasvaimen tilavuutta mahasyövän implanttien nude-hiirissä, joilla on kasvaimen kasvun estoaste 40-75%. SPRC myös indusoi pro-apoptoottisten vaikutus syövän kudosten ja kohonnut ilmaisuja p53: n ja Bax kasvaimissa ja soluissa. SPRC hoito lisäsi myös proteiinin ilmentymistä cystathione-γ-lyase (CSE) soluissa ja kasvaimia, ja kohonnut H

2S tasot soluviljelyalustoissa plasma ja kasvainten CSE aktiivisuus mahasyövän aiheuttaman nude-hiiriin 2, 2.3 ja 1.4 kertaiseksi. Useimmat syövän toimintoja SPRC soluilla ja kasvainten merkittävästi tukahdutti PAG, estäjä CSE aktiivisuuden.

Johtopäätökset

Yhteenvetona tulokset Tutkimuksemme antaa oivalluksia osaksi novel syövän vaikutusta H

2S sekä SPRC mahalaukun syöpä indusoiva aktiivisuus uusi kohde, CSE.

Citation: MA K, Liu Y, Zhu Q, Liu Ch, Duan JL, Tan BK-H, et al. (2011) H

2S Donor, S-propargyyli-kysteiini, Lisäykset CSE SGC-7901 ja Cancer aiheuttama Hiiret: Evidence for Novel syövän vaikutusta Endogeenisen H

2S? PLoS ONE 6 (6): e20525. doi: 10,1371 /journal.pone.0020525

Editor: Lin Zhang, University of Pennsylvania, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 huhtikuu 2011; Hyväksytty: 02 toukokuu 2011; Julkaistu: 27 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 MA et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Toteamme rahoitustuen antamaa avustusta National Distinguished nuorten tutkijoiden Grant 385 (nro 30888002) Kiinassa, National 973 projektin (2007CB512006 ja 2010CB912600) ja Shanghai-Unilever Research Kehitysrahasto (08540750400).

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

S-propargyyli-kysteiini (SPRC) on rakenteellinen analogi S-allycysteine ​​(SAC ) samalla kysteiiniä sisältävä rakenne. SAC, yksi tärkeimmistä yhdisteiden vuotiaiden valkosipuliuute, on peräisin hajoaminen

S

alk (en) yyli kysteiini sulfoksidit (ACS: t). Tällä yhdisteellä on anti-kasvain [1], [2], anti-bakteeri [3], anti-sieni [4], anti-hepatotoksisten [5], sydäntä ominaisuuksia [6] ja apoptoosin [7]. Paklitakseli liposomi, joka on lipidi-pohjainen formulaatio syöpälääke, paklitakseli, on tullut ensilinjan lääkeaine tulenkestävien munasarja-, rinta-, maha- ja ei-pienisoluisen keuhkosyövän. Siksi tutkittiin

in vitro

ja

in vivo

syöpää ehkäisevistä vaikutuksista SPRC ja verrannut niitä kuin SAC ja paklitakselin liposomin.

Cystathione-γ-lyase (CSE) kuuluu laajuisen sulfuration entsyymi perhe ja vastaa katalysoimaan pyridoksaalifosfaattia riippuvan β-disulfidi eliminointireaktio johtaa ammonium, pyruvaatin ja thiocysteine. Thiocysteine ​​voi sitten reagoida muiden tiolien tuottaa H

2S. P53 tuumorisuppressoriproteiinia on merkittävä rooli solujen vastauksena DNA vaurioita ja muiden genomisten poikkeamia. Aktivointi p53 voi johtaa joko solusyklin pysähtymiseen ja DNA korjaukseen tai apoptoosin. Bax on keskeinen osa solujen apoptoosin kautta mitokondrioiden stressi taas Bcl-2 kykenee selviytymisen toiminto vastauksena monenlaisia ​​apoptoottisten ärsykkeiden estämällä mitokondrion sytokromi c: julkaisu. Tässä ensimmäistä kertaa, huomasimme, että syöpää ehkäisevistä vaikutuksista on SPRC mukana rikkivedyn (H

2S) -välitteisen reitin. SPRC voivat läpikäydä β-poistamista CSE tuottaa endogeenistä H

2S, mikä saattaa ajan säädellä geeniekspressiota p53 ja Bax, jolloin solujen proliferaatio ja apoptoosi. Tutkimuksemme osoitti siten uutta syövän vaikutusta endogeenisen H

2S luovuttaja, SPRC, mahalaukun syöpä indusoiva aktiivisuus uusi kohde, CSE. Me osoitettu ensimmäistä kertaa, että SPRC pystyi tukahduttamaan solujen lisääntymistä ja muuttoliike sekä kasvaimen kasvua mahasyövässä aiheuttaman malli nude-hiirten, mikä osoittaa, että se voi olla potentiaalinen aine hoidettaessa mahalaukun syöpää. Tulokset osoittavat, että syövän vaikutuksia SPRC johtuivat suppression solusyklin ja apoptoosin induktion. Lisäksi tuloksemme osoittivat myös, että SPRC voisi säädellä geeniekspressioiden CSE, Bax ja p53. Huomasimme, että PAG, estäjä CSE toimintaa, voisi merkittävästi tukahduttaa syöpää ehkäisevistä vaikutuksista SPRC.

Tulokset

Annoksesta riippuvaa, kasvua estävän ja havaitseminen sytostaatit vaikutuksista SPRC on SGC- 7901-solut

Effects of SPRC on SGC-7901 mahalaukun syövän solut on esitetty kuviossa 1A, 1 uM ja 10 uM SPRC tuotetaan 18-25%: n inhibitio elinkelpoisuuden SGC-7901-soluja. 20 mM ja 30 mM SPRC aiheutti noin 50% solujen elinkelpoisuuden inhibition. Olemme myös havainneet, että SPRC pienillä pitoisuuksilla 1 uM ja 10 uM voisi merkittävästi tukahduttaa pesäkkeitä muodostava ja muuttoliike kyky SGC-7901; nämä vaikutukset olivat merkittäviä verrattuna SAC (kuviot 1 B, 1 C ja 1 D). PAG, estäjä CSE, esti inhiboiva vaikutus SPCR solujen kasvuun (kuviot 1B ja 1C). Nämä tulokset osoittivat, että CSE polku oli mukana SPRC aiheuttaman suppression solujen kasvua.

. Annos-vaste-tutkimus vaikutuksista SPRC kasvuun inhibition SGC-7901-soluja. B. Vaikutukset SPRC, SAC, PAG, PAG + SPRC ja paklitakseli liposomin elinkyvystä of SGC-7901-soluissa. C. Vaikutukset SPRC, SAC, PAG, PAG + SPRC ja paklitakseli liposomin kolonioiden muodostumista SGC-7901-soluissa. D. Vaikutukset SPRC, SAC ja paklitakseli liposomiin siirtolaisuudesta kyvystä SGC-7901-soluissa. Differential solumigraation kyky tutkittiin haavan sulkemisen määrityksessä. E. Vaikutukset SPRC, SAC ja paklitakseli liposomiin haavan sulkeminen nopeus. Arvot on ilmaistu% valvonnan. * Edustaa merkittävää eroa ohjaus vs. SPRC, SAC ja paklitakseli Liposomiryhmissä (p 0,01).

# edustavat merkittävää eroa (p 0,01) välillä SPRC vs SPRC + PAG (p 0,01).

morfologiset muutokset, apoptoosin ja solusyklin analyysi

Apoptosis [ ,,,0],21] on ohjelmoidun solukuoleman, joka on ominaista erityisiä rakenteellisia muutoksia, jotka sisältävät solun kutistuminen, ydin- tiivistyminen ja DNA: n fragmentoituminen. Hoechst värjäys käytettiin tarkkailla morfologisia muutoksia käsiteltyjen solujen Paclitaxel liposomin, SPRC ja SAC. Kuten kuviossa 2A on esitetty, elektronimikroskoopilla paljasti, että morfologiset muutokset ominaista apoptoosia tapahtui SGC-7901-solujen hoidon jälkeen SPRC ed 24 tuntia. Solut osoittivat tiheä värjäyskuvion kanssa DNA: n fragmentoituminen ja ilman erillisiä ydinvoiman kalvot. Kontrollisolut eivät ole samanlaisia ​​morfologisia muutoksia. Apoptoosin indusoiva vaikutus SPRC arvioitiin virtaussytometrialla (kuvio 2B); 24 tunnin hoito SGC-7901-solujen 10 uM SPRC johtanut merkittävään kasvu noin 26%: n apoptoottisten kappaleiden verrattuna kontrolliryhmään. Vertailun prosentuaalinen apoptoottisten solujen Paklitakseli liposomiin ja SAC-käsiteltyjen ryhmien olivat vähemmän noin 8% ja 4%, vastaavasti.

. hoidon SPRC, SAC, PAG, PAG + SPRC ja paklitakseli liposomiin (10 uM) 24 tunnin määrittämisessä apoptoottisten muutosten analysoitiin fluoresenssimikroskoopilla. B. Analyysi apoptoottisten solujen virtaussytometrinen määritys. C. Cell cycle jakeluun. Tussi kuvat osoittavat: 1, valvonta. 2, SPRC 10 uM. 3. SAC 10 uM. 4. PAG 10 uM. 5. SPRC + PAG, kukin 10 uM. 6. Paklitakseli liposomien 10 uM.

Vaikutus SPRC solusyklin aktiivisuuteen SGC-7901-soluissa analysoitiin suorittamalla propidiumjodidivärjäys seurasi havaitseminen kanssa virtaussytometrialla. Yhdenmukainen sen vaikutus solujen kasvun estäminen, SPRC aiheuttama solusyklin pysähtymisen SGC-7901-solujen G

1 /S vaihe (kuvio 2C). 10 uM SPRC myös aikaan lisääntynyt kertyminen 24% solujen G

1 vaiheen ja vähentää 20% solujen S-vaiheen solusyklin, verrattuna kontrolliryhmään. Tämä viittaa siihen, että on olemassa tukos G

1 /S faasimuutos, joka saattaa aiheuttaa solujen kasvua vaimentava tai apoptoosin. Pro-apoptoottinen vaikutus SPRC sekä sen vaikutus solusyklin pysähtymisen G

1 /S faasi myös suurelta osin estettiin PAG.

Effects of SPRC on CSE proteiinin ilmentymisen ja aktiivisuuden ja H

2S tasoilla

ilmauksia CSE proteiinin SGC-7901-solujen (kuviot 3A, B ja C) ja paljaissa hiirissä (kuviot 3 D, E ja F) kasvatti merkittävästi SPRC hoitoa. SPRC annoksella 50 mg /kg ja 100 mg /kg lisäsi merkittävästi CSE aktiivisuuden noin 1,4-kertaisesti (kuvio 3G). CSE aktiivisuus kasvaimia SPRC käsiteltyjen nude-hiiriin oli suurempi kuin kudoksissa SAC-käsitellyssä ryhmässä. H

2S tasot soluviljelyaineessa (kuvio 3H), plasma-nude-hiirten (kuvio 3I) mitattiin. H

2S laajuisesti soluviljelyalustoissa 10 uM SPRC käsiteltyjä soluja ja plasman H

2S 50 mg /kg ja 100 mg /kg SPRC saaneilla nude-hiiriä myös merkittävästi noussut verrattuna kontrolliryhmään (P 0,05). Kun verrataan SAC-käsitellyn ryhmän hiirissä SPRC käsitellyn oli merkittävästi korkeammat H

2S taso (P 0,05). Kohonneet tasot CSE proteiinin ilmentymisen, CSE aktiivisuus ja H

2S vuonna SPRC hoidetussa ryhmässä olivat kaikki suurelta osin vähentää PAG hoitoa. Tulokset näistä kokeista siten ehdotti, että syövänvastainen vaikutus SPRC välitti aktivoitumisen CSE /H

2S kautta.

A, kaista 1, kontrolliryhmä; Kaista 2, paklitakseli liposomi 10 uM; Kaista 3, SPRC 1 uM; Kaista 4, SPRC 10 uM; Kaista 5, SAC 10 uM; Kaista 6, kontrolliryhmä; Kaista 7, SPRC 10 uM; Kaista 8, PAG 10 uM; Lane 9, PAG + SPRC 10 uM. D: Kaista 1, valvonta; Kaista 2, paklitakseli liposomi 10 mg /kg; Kaista 3, SPRC 50 mg /kg; Kaista 4, SPRC 100 mg /kg; Kaista 5, SAC 100 mg /kg; Kaista 6, valvonta; Kaista 7, SPRC 100 mg /kg; Kaista 8, PAG 100 mg /kg; Lane 9, PAG + SPRC 100 mg /kg. Suhteellinen intensiteetti lasketaan vertaamalla voimakkuutta GAPDH käyttäen densitometria (esitetty kuvaajia oikealla). * Edustaa merkittävää eroa ohjaus vs. SPRC, SAC ja paklitakselilla liposomin testiryhmään (p 0,05).

# edustaa merkittävää eroa SPRC 10 pM vs. SPRC + PAG ryhmään. Kuva G esitetään CSE aktiivisuus (umol /g) mahasyövän kaikkien ryhmien. Kuva H esittää H

2S tasot (uM) in soluviljelyalustoissa. Kuva näytän plasma H

2S tasoilla mahalaukun kasvaimet nude-hiirten eri ryhmään.

Vaikutukset SPRC ja SAC geenissä ilmauksia Bax, p53 ja Bcl-2

kasvua vaimentava vaikutus on SPRC on SGC-7901-solujen arvioitiin analysoida vaikutuksia solukierron aktiivisuuden ja ilmauksia apoptoosin säätelygeenien – Bax, p53 ja Bcl-2. Kuten kuviossa 4A ja 4B, huomasimme, että 24 tunnin SPRC hoito lisäsi merkittävästi mRNA tasolla (noin 1,5-kertainen) ja proteiinin taso p53 ja Bax of SGC-7901-soluissa.

. Kaista 1, paklitakseli liposomi 10 uM; Kaista 2, valvonta; Kaista 3, SPRC 10 uM; Kaista 4, SPRC 1 uM; Kaista 5, SAC 10 uM; Kaista 6, SAC 1 uM. Suhteellinen intensiteetti lasketaan vertaamalla intensiteetti β-aktiini käyttäen densitometria (esitetty kuvaajia oikealla). B. kvantitointi Bax, p53 ja Bcl-2: n mRNA ilme. * Edustaa merkittävää merkitys välillä ohjaus vs SPRC, SAC ja paklitakseli liposomiin p 0,05 tasolla.

kasvun hidastuminen [22] ja induktio solujen apoptoosin kasvaimia SPRC

Kehitys mahasyövän arvioitiin kasvaimen tilavuuden merkittävästi vähentää SPRC hoito 50 mg /kg ja 100 mg /kg kehon paino joka toinen päivä kolme kertaa viikossa, jossa IR 40-75% (kuvio 5A ja 5B). Kasvain paino väheni myös merkittävästi vuonna SPRC hoidetuissa ryhmissä (kuviot 5C), kun taas PAG hoito vähensi kasvua vaimentava toiminto SPRC. Edustaja kasvaimia eri ryhmissä osoitti selvää kasvaimen koon muuttaminen (kuviot 5D ja 5E).

. Muutos keskimääräinen kasvaimen tilavuus (mm

3). B. Estoaste (IR) kasvaimen kasvuun eri päivinä. C. Muutos kasvaimen painoa. D. Muutos kasvaimen kokoa. E.

In vivo

kasvaimen kuvantamiseen nude-hiirten käsittelyn jälkeen 24 päivää. * Edustaa merkittävää eroa (p 0,05) välillä ohjaus vs. SPRC, SAC ja paklitakselilla liposomin käsiteltyjen ryhmien.

#represents merkitsevä ero (p 0,05) välillä SPRC 100 mg /kg vs. SPRC + PAG ja PAG käsiteltyjen ryhmien. F. H.E. värjäämällä monistaminen 4 x 10 ja suurempia Amplified kuvia (100 x 10) suorassa kulmassa. G. Tunnel värjäys (100 x 10) apoptoottisten elinten mahalaukun kasvaimet. Numero tussi kuvat osoittavat: 1, ohjata ryhmä; 2, paklitakseli liposomi 10 mg /kg ryhmässä; 3, SPRC 50 mg /kg ryhmässä; 4, SPRC 100 mg /kg ryhmässä; 5, SAC 100 mg /kg ryhmässä.

tutki myös kasvaimen kasvua estävän vaikutuksen SPRC näkyi kasvainsolujen apoptoosin. H Kaista 2 paklitakselia liposomi 10 mg /kg; Kaista 3 SPRC 50 mg /kg; Kaista 4, SPRC 100 mg /kg; Kaista 5, SAC 100 mg /kg. Suhteellinen voimakkuus laskettiin vertaamalla kanssa intensiteetti β-aktiini käyttäen densitometria. B. mRNA: n ilmentymisen. * Edustaa välillä tilastollista merkitystä ohjaus vs SPRC, SAC ja paklitakselilla liposome- testiryhmään (p 0,05). C. immunohistokemiallinen värjäys pro-apoptoottisen proteiinin, Bax. D. immunohistokemiallinen värjäys pro-apoptoottisen proteiinin, p53. E. immunohistokemiallinen värjäys pro-apoptoottisen proteiinin, Bcl-2. Numero tussi kuvaa kuviossa 6 C, D ja E osoittavat: 1, kontrolliryhmä; 2, paklitakseli liposomi 10 mg /kg; 3, SPRC 50 mg /kg; 4, SPRC 100 mg /kg; 5, SAC 100 mg /kg.

H

2S osoitti pro-apoptoosi ja anti- leviämisen vaikutus SGC-7901-soluissa ja mahasyövän malli nude-hiirten

havaitsivat, että SPRC lisääntynyt CSE aktiivisuus ja joka on johtanut kohonnut H

2S tasoja, mikä puolestaan ​​säätelee geeniekspressioiden Bax, p53 ja Bcl2. Bax suoraan indusoi mitokondrioiden perustuva apoptoosin lisäämällä Mt ilmaisun ja laski Bcl-2: n ilmentymisen. P53 tuumorisuppressoriproteiinia on merkittävä rooli solujen vastauksena DNA vaurioita ja muiden genomisten poikkeamia. Aktivointi p53 johtaa joko soluproliferaation inhibointi ja DNA-vaurioita tai apoptoosin kautta Bax-proteiinin kuviossa 7. Nämä tulokset viittaavat siihen, uuden mekanismin syöpää ehkäisevistä vaikutuksista on SPRC kautta CSE /H

2S-indusoidun solujen kasvun esto ja apoptoosin kautta p53 /Bax-reitin.

kasvu tasot H2S ovat kääntyneet moduloi Bax, p53 ja Bcl2 proteiinia ja mRNA: n ilmentymisen. Bax on aiheuttaman apoptoosin kautta Mt ja Bcl-2: n ilmentymisen. p53 johtaa joko soluproliferaation inhibointi ja DNA-vaurioita tai apoptoosin kautta Bax proteiinia.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet uusi syövänvastainen vaikutus SPRC mahalaukun syövän ja myös data ehdottaa sen mahdollinen mekanismi. Useita uusia pisteitä syntyvät Tutkimuksemme. Ensinnäkin, osoitimme, että SPRC pystyi vähentämään solujen kykyä kasvaa merkittävästi ja myös tukahduttaa muuttoa SGC-7901-soluissa. Toiseksi, huomasimme, että SPRC pystyi lisäämään apoptoosiin liittyviä morfologisia muutoksia ja aiheuttama suuri korotus apoptoottisten solujen kanssa samanaikaisesti ilmeinen solukierron pysähtymisen G

1 /S-vaiheen. Yhdessä nämä kaksi toteamusta tukevat todisteet estovaikutusta SPRC on SGC-7901-soluissa. Kolmanneksi osoitti lisäksi, että vatsaonteloon antamisen SPRC annoksilla 50 ja 100 mg /kg kehon paino joka toinen päivä kolme kertaa viikossa on tehokas kasvun estämiseksi mahalaukun kasvaimia nude-hiirissä. Neljänneksi, huomasimme, että SPRC voisi lisätä CSE aktiivisuutta ja myös sen proteiinin ilmentyminen johtaa kohonnut H

2S tasot soluviljelyalustoissa ja plasma nude-hiirten. Viidenneksi, huomasimme, että PAG, estäjä CSE, voitaisiin suurelta tukahduttaa edellä toimintoja SPRC. Kuudenneksi, huomasimme, että SPRC hoito aiheutti ilmeisiä korkeus mRNA ja proteiini ilmauksia Bax ja p53.

On raportoitu, että H

2S [24], [25], [26] voidaan generoida mahasyövän soluissa pyridoksaali-5-fosfaatti-riippuvainen entsyymi CSE, jonka L-kysteiini on substraatti. CSE [27] voisi katalysoida pyridoksaalifosfaatti riippuvainen β-disulfidi ja poistamalla reaktion, jolloin muodostuu ammonium-, pyruvaatin ja thiocysteine. Thiocysteine ​​sitten reagoi muiden tiolien muodostaen H

2S. PAG on käytetty useissa tutkimuksissa testata biologisen vaikutuksen inhiboimiseksi endogeenisen H

2S tuotanto [28] SPRC, analogi SAC on kysteiiniä sisältävä rakenne, joka voi tapahtua β-eliminaatio ja toimia substraattina CSE. Avain Propargyyliryhmän in SPRC saattaa yhdistyvät toiminnan alueet CSE lisäämiseksi CSE aktiivisuutta. Tutkimuksessamme ilmeinen kasvu CSE proteiinin ilmentyminen mahasyövän solujen ja kasvainten nude-hiirten havaittiin SPRC-käsitelty ryhmä; Tämä voitaisiin selittää kuin ”korvaava vaikutus” tuottaa H

2S selviytymään apoptoosin syöpäsoluissa. Ihmisen keuhkojen fibroblasteja käsiteltiin H

2S luovuttaja, NaHS, näkyvät kasvu DNA-vaurioita, solusyklin pysähtymiseen ja vakauttamiseen p53 yhdistettynä induktion loppupään proteiineja, kuten p21, Bax ja sytokromi c [29]. On raportoitu, että hoito haiman asinaarisolujen H

2S on osoitettu indusoivan apoptoosia, joka johtuu kaspaasi 3, vähentynyt proteiinipitoisuus taso Bcl-2 ja aktivointi Bax ilmaisun. H

2S voisi myös indusoida insuliinia tuottavien beetasolujen tehostamalla ER stressin kautta p38 MAPK aktivointi [30]. On raportoitu, että p53 aiheuttaa apoptoosia joko lisäämällä transkriptionaalista aktiivisuutta pro-apoptoottisia geenejä, kuten Bax tai tukahduttaa aktiivisuutta anti-apoptoottisen geenin Bcl-2-perheen [31], [32]. Bax on myös tiedetään indusoivan mitokondriot-ajettu apoptoosiin. Täällä Huomasimme myös, että aktivointi CSE ja lisääntynyt H

2S tasoilla SPRC käsittely kytkettiin koholla p53 ja Bax ilmaisuja mahalaukun soluissa ja kasvaimia. Nämä tulokset viittaavat uusi mekanismi syöpää ehkäisevistä vaikutuksista on SPRC kautta CSE /H

2S aiheuttama solujen kasvun esto ja apoptoosin kautta p53 /Bax-reitin.

Yhteenvetona meidän

in vitro

ja

in vivo

Koetulokset osoittivat, että rikkivedyn luovuttaja, SPRC, oli ilmeinen estävä ja pro-apoptoottinen vaikutus syöpään. SPRC voisi lisätä CSE aktiivisuutta, mikä johtaa tehostettuun H

2S, mikä puolestaan ​​säätelee geeniekspressioiden Bax, p53 ja Bcl2.

Methods

Kaikki eläinkokeiden protokollat ​​noudatetaan Animal Management sääntöjen kuntien ja ”Hoito ja käyttö Laboratory Animals” koe-eläimen keskus Fudanin yliopiston, Shanghai, PRC.

tiedot tutkimuksen hyväksynnän eettinen komitea

eläinten Arviointi sertifikaatti nro .: SCXK hu (Shanghai) 2009-0019

Tutkimus hyväksymistä No .: Fudanin yliopiston koe-eläin tutkimusosasto, hyväksynnän nro SYXK hu (Shanghai) 2009-0082

Nimetty tarkastelu board: puheenjohtaja: Prof. Yi-Zhun ZHU Dean, School of Pharmacy Fudanin yliopisto. Varapuheenjohtaja: Prof. Weiyue Lu, professori Wei Wu, professori Xun Sun, professori Wenjiang Zhou

Jäsenet: Professori Zhang Yun yi, professori Li Cong, prof. Jiang Chen, professori Yin geng li, professori Hong mei ji, professori Li Xu-yang.

Sihteeri: Tao lin lin

Kemikaalit

SPRC syntetisoitiin saattamalla L-kysteiini propargyylibromidilla. Tuote puhdistettiin uudelleen kiteyttämällä etanoli-vesi. Lopputuote varmistettiin 1H ydinmagneettisen resonanssin spektroskopialla. SAC ostettiin Tokyo Kasei (Tokio, Japani). Paklitakseli liposomien oli lahja Luye Pharma Group Ltd., Singapore. Propargylglycine (PAG) ostettiin Yinzheng Chemical CO., LTD (Shanghai, Kiina). MTT (dimetyyli tiatsolyyli liumbromidi) hankittiin Amresco Inc. USA. Hoechst värjäys, Cell Cycle ja apoptoosi analyysi Kits ostettiin Beyotime, Kiina. RPMI 1640 väliainetta GIBCO ™ Invitrogen, USA. Kanin polyklonaalisia vasta-aineita Bax, P53 ja Bcl2 ostettiin Cell Signaling, USA ja vuohen polyklonaalinen vasta-aine CSE Santa Cruz, USA. SuperScript II RT kit ja SYBR Green PCR Master Mix ostettiin Takara, Japani. Tunneli -värjäyspakkausta hankittiin Calbiochem, Saksa.

Solun viiva ja kulttuuri

Human mahakarsinoo- (SGC-7901) solut saatiin Cell Bank of Shanghai Institute for Biological Sciences, Kiina ja viljellyt RPMI 1640-väliaineessa, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä viljelypulloissa 37 ° C: ssa kostutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa. Solut syötettiin konfluenssiin asti ja laajennettiin trypsinaatiolla ja Saharan viljeltiin pienemmät numerot uusiin dosviljelypulloihin.

MTT-määritys

MTT (3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli ) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi) määritys suoritettiin käyttämällä menetelmää Arumugam et al. [8] pienin muutoksin. Lyhyesti, solut suspensiossa, joka sisältää noin 8000 ja 10000 solua lisättiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppaiselle viljelylevylle ja inkuboitiin 24 h 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95% ilmaa ja 5% CO

2. SPRC, SAC ja paklitakselin liposomin liuotettiin viljelyalustaan ​​ja lisättiin soluihin 96-kuoppaisilla levyillä. 10 lopulliset pitoisuudet SPRC (1 uM, 10 uM, 100 uM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM ja 30 mM), SAC (1 uM ja 10 uM) ja paklitakselin liposomi (10 uM) lisättiin soluille tutkia niiden vaikutukset solujen elinkelpoisuuteen. Vaikutus yhdistettynä hoitoon 10 uM SPRC ja 10 uM PAG tutkittiin myös. 24 tunnin jälkeen, 100 ui 1 mg /ml MTT-liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan ja uudelleen inkuboinnin ja sen jälkeen 4 tuntia. 100 ui DMSO: ta lisättiin sitten poistamisen jälkeen MTT-liuosta ja levyjä ravisteltiin 10 minuuttia. Optinen tiheys 96-kuoppaisilla viljelylevyillä mitattiin käyttämällä entsyymi-immunologinen määritys (ELISA-lukijassa). Optinen tiheydet käsitellystä kuopat muutettiin prosentteina elävien solujen ( ”solu eloonjäämisaste”) vastaan ​​hallinnan käyttämällä seuraavaa kaavaa:

Colony muodostava määritys

Colony muodostavat kokeilu oli suoritettiin menetelmän Wang et ai. (1998, 2003) [9], [10]. Yksittäinen solususpensio valmistettiin ja viljeltiin 12-kuoppaisille levyille tiheydellä 150 solua kuoppaa kohti. 24 tunnin kuluttua istutus, 2 pitoisuudet SPRC (10 uM, 1 uM) ja SAC (10 uM, 1 uM) lisättiin. Kokeilun yhdistetty hoito 10 uM SPRC ja 10 uM PAG tutkittiin myös. Soluja inkuboitiin 6 päivää. Sitten solut kiinnitetään 70% etanolilla ja värjättiin 1% Giemsa sininen. Pesäkkeet, joka koostui 50 solua, pisteytettiin ja verrattuna normaaliin kontrolliryhmään. Kukin koe toistettiin kolme kertaa.

Hoechst fluoresenssi

Apoptosis [11], [12] määritettiin käyttämällä Hoechst Värjäys Kit (Beyotime). SGC-7901-soluja käsiteltiin SPRC (10 uM), SAC (10 Um), Paklitakselin liposomi (10 uM) ja yhdistetyt SPRC ja PAG (kukin 10 uM) 24 tunnin ajan. Solut huuhdeltiin kahdesti PBS: llä ja kiinnitettiin sitten 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja värjätään karyophilic väriaine, Hoechst 33258, 5 minuuttia. Sen jälkeen, kun lopullinen huuhtelu PBS: ssä, solut asennettu moiwol, anti-fade ainetta, ja visualisoitiin ultraviolettivalolla fluoresenssimikroskoopilla. Koska tämä väriaine tahrat sekä apoptoottisten ja ei-apoptoottiset solut, apoptoottiset solut tunnistettiin ne näytetään kromatiinin tiivistyminen ja ydinvoiman pirstoutumista.

virtaussytometrianalyysin solukierron vaihejakauman ja havaitseminen apoptoosin

Kaikki solut ensin maljattiin tiheydellä 2,5 x 10

5 solua /kuoppa 6-kuoppaisilla levyillä. Sen jälkeen inkuboimalla SPRC, SAC, paklitakseli liposomin ja yhdistetty SPRC ja PAG hoito 24 tunnin ajan, solut irrotettiin ja kerättiin virtaussytometrialla putkiin ja sentrifugoitiin 1000 rpm: llä 5 minuutin ajan, jolloin saatiin solupelletti.

Apoptosis määritys

solut värjättiin käyttämällä solun apoptoosin havaitsemiseen Kit (Beyotime) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solupelletti pestiin kahdesti PBS: llä. 1 x Binding puskuria lisättiin 1 x 10

6 solua /ml, ja PI lisättiin sitten pimeässä. Kun oli inkuboitu 30 minuuttia pimeässä, solut analysoitiin välittömästi käyttämällä syaani virtaussytometrillä (BD FACSCalibur) ja ModFit ohjelmiston.

Solusyklianalyysiä

Solusyklianalyysiä suoritettiin menetelmällä Herman-Antosiewicz et ai [13]. Lyhyesti, soluja inkuboitiin yksin kasvatusliuoksesta ja elatusaineet sisältävät SPRC, SAC ja paklitakselia liposomiin (10 uM) 37 ° C: ssa 24 tuntia. Solut pestiin kylmällä PBS: llä, kiinnitettiin 70% etanolilla, ja säilytettiin 4 ° C: ssa myöhempää solusyklin analyysi. Kiinnitetyt solut pestiin PBS: lla kerran, sitten uudelleen suspendoitiin 1 ml: aan PI värjäysreagenssin (50 mg /ml propidiumjodidia ja 1 mg /ml RNaasi 1 ml: aan natriumsitraatti-puskuria, pH 7,4). Näytteitä inkuboitiin pimeässä 30 min, ennen kuin solusyklin analyysi. Jakelu solujen solusyklin mitattiin Cyan virtaussytometrillä (BD FACSCalibur) analysointijärjestelmä ja määrän solusyklin jakautuminen suoritettiin käyttämällä Multi-syklin Software (ModFit ohjelmisto). Prosenttiosuus solujen G1, S ja G2-vaiheissa laskettiin.

Haavan paranemista määrityksessä

Solut ympättiin 6-kuoppaisille viljelymaljoille ja annettiin kasvaa 90% konfluenssiin. Samankokoisiin haavat esiteltiin yksikerrossoluissa käyttämällä steriiliä pipetinkärjet. Haavoittuneen yksikerrossoluissa pestiin 3 kertaa PBS: llä solujätteen poistamiseksi; SPRC ja SAC lisättiin sitten kahtena pitoisuutena (1 uM, 10 uM) ja paklitakselin liposomi (10 uM). Nopeus haavan seurattiin ja valokuvattiin jälkeen 12 ja 24 tuntia. Vertaileva nopeus haavan käsiteltyjen solujen vastaan ​​kontrolli laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: (haava leveys käsiteltyjen solujen 0 tuntia – haavan leveys 24 tuntia) /(haavan leveyden Kontrollisoluja 0 tuntia – haava leveys 24 tuntia) x 100.

Quantitative real-time PCR

Kokonais-RNA käänteiskopioitiin käyttämällä SuperScript II RT (Takara, Japani) oligo (dT). Ilmauksia Bcl2, Bax ja p53 mRNA tutkittiin reaaliaikaisella PCR Vaihe yksi PCR -järjestelmää (Applied Biosystems). 2 ui käänteistranskriptio cDNA tuotetta lisättiin 20 ul reaktioseosta, joka sisälsi 10 ui SYBR Esiseos EX Taq (2 x), 0,4 ul ROX Viite Dye (50 x), 0,4 uM aluketta ja 0,4 uM palkita aluketta. Pyöräily olosuhteet olivat seuraavat: pre-inkuboitu 95 ° C: ssa 30 s, jonka jälkeen 40 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 5 s, pariutuminen ja ekstensio 60 ° C: ssa 31 s. Vuoden loppuun pyöräily, sulamiskäyräanalyysillä suoritettiin perustason spesifisyys PCR-tuotteen. Suhteellinen kvantitatiivinen arvo ilmaistiin ΔΔC

T -menetelmä. Ohjaus käytettiin näytteen ja p-aktiini käytettiin endogeenisen ohjaus. Kukin koe suoritettiin kahtena kappaleena ja toistettiin kolme kertaa. Alukkeen sekvenssit ja odotettua tuotetta koko olivat seuraavat: ihmisen β-aktiini: eteenpäin, 5′-CGTGGACATCCGCAAAG-3 ’ja reverse, 5′-TGGAAGGTGGACAGCGA-3′ (201 bp); Ihmisen Bax: eteenpäin, 5’-ATGCGTCCACCAAGAAGC-3 ’ja reverse, 5′-GTCCACGGCGGCAATCA-3′ (95 bp); ihmisen Bcl2: eteenpäin, 5’-AACTGGGGGAGGATTGTG-3 ’ja reverse, 5′-AGGTGCCGGTTCAGGTAC-3′ (128 bp); Ihmisen p53: eteenpäin, 5’-ACCACCATCCACTACAACTA-3 ’ja reverse, 5′-AAACACGCACCTCAAAGC-3’ (136 bp).

Western blot-analyysi

Solut maljattiin ruokia ja käsiteltiin SPRC (1 uM, 10 uM), SAC (1 uM, 10 uM) ja paklitakselin liposomi (10 uM) 24 tunnin ajan. 24 tunnin kuluttua hoidon jälkeen solut pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä. Solut kustakin näytteestä liuotettiin RIPA-puskurissa (50 mM Tris-HCI (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1% NP40, 0,1% SDS, 10 mM natriumdeoksikolaatti, 1 mM fenyylimetyyli-sulfonylfluoride) ja pidettiin jäillä 30 minuutit. Solut lysaatit sentrifugoitiin 10000 g: llä 4 ° C: ssa 10 min ja supernatantit säilytettiin -70 ° C: ssa määritykseen asti. Proteiinipitoisuus mitattiin Bradford-menetelmällä. 25

ui

proteiinin kunkin ryhmän sekoitettiin 5

ui

latauspuskuria erotettiin 10% SDS-polyacrylamine geelillä ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi kalvot [14]. Membraanit blokattiin 2 tunnin ajan 5% rasvatonta maitojauhetta Tris-puskurissa suolaliuosta, joka sisälsi 0,05% Tween 20 (TBST) huoneenlämpötilassa. Saatu jälkeen blotit tutkittiin polyklonaalisilla CHT (cystathionine γ-lyaasi) /CSE Ab (1:500, Santa Cruz, USA), polyklonaalinen Bcl-2 Ab (1: 1000, Cell Signaling, USA), polyklonaalista Bax Ab (1