Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aim

vapautuminen FOXM1 on dokumentoitu eri syöpiä. Tutkimuksen tavoitteena oli arvioida roolia FOXM1 munasarjasyövän kasvainten synnyssä ja paklitakselin vastus.

Experimental Suunnittelu

Expression of FOXM1 tutkittiin 119 kliinisissä näytteissä immunohistokemiallisesti ja korreloivat kliinispatologiset parametrien . Vaikutukset FOXM1 Knockdown on munasarjasyövän solujen vaeltamiseen, invaasiota ja mitoosi katastrofin tutkittiin myös. qPCR ja siru-qPCR käytettiin luomaan KIF2C uutena FOXM1 kohdegeenin sekaantuneet chemoresistance.

Tulokset

Korkea ydin- FOXM1 ilmentymistä munasarjasyöpä potilaiden näytteistä liittyi merkitsevästi pitkälle edennyt (

P

= 0,035), lyhyempi yleinen (

P

= 0,019) ja taudista vapaan (

P

= 0,014) selviytymistä. Monimuuttuja-analyysi vahvisti FOXM1 ilmaisu itsenäisenä ennustetekijä varten munasarjasyöpä. FOXM1 pudotus esti merkittävästi maahanmuutto- ja invaasion munasarjasyöpäsoluja ja parannettu paklitakseli välittämä solukuolema ja mitoottista katastrofin p53-riippumattomalla tavalla. Bioinformatiikan analyysi ehdotti useita potentiaalisia transkription tavoitteista FOXM1. Yksi mahdollisia kohteita, KIF2C, näytteillä samanlainen ilme kuvio FOXM1 vuonna chemosensitive ja solunsalpaajaresistentti solujen reaktiota paklitakselille hoitoon. FOXM1 voitiin havaita promoottori KIF2C ja FOXM1 hiljentäminen merkittävästi alassäädetty KIF2C.

Johtopäätös

havainnot viittaavat siihen, että FOXM1 liittyy huono potilaiden hoitotuloksiin ja edistää paklitakselin vastus estämällä mitoottisiin katastrofi. KIF2C tunnistetaan uutena FOXM1 transkription kohde- että voi kohdistua hankintaan chemoresistance. FOXM1 tulisi tutkia tarkemmin mahdollisena prognostinen markkeri ja terapeuttinen kohde munasarjasyöpä.

Citation: Zhao F, Siu MKY, Jiang L, Tam KF, Ngan HYS, Le XF, et al. (2014) yli-ilmentyminen Forkhead Box Protein M1 (FOXM1) munasarjasyövässä korreloi Poor Patient Survival ja edistää Paklitakseli Resistance. PLoS ONE 9 (11): e113478. doi: 10,1371 /journal.pone.0113478

Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Lasten Hospital Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 helmikuu 2014; Hyväksytty: 28 lokakuu 2014; Julkaistu: 20 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 Zhao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Fung Zhao on vastaanottaja HKU-ICL yhteinen stipendi. Ana Gomes on tohtorintutkinnon mies tukee Cancer Research UK. Laura Bella tukee stipendi rintasyöpään kampanja. Pasarat Khongkow tukee stipendejä Thaimaan Goverment. Eric Lam työtä tukee avustuksilla Breast Cancer kampanja ja Cancer Research UK. Annie Cheung työtä tukee rahoituksella Research Grants neuvosto HKSAR. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on tappavin gynekologinen syöpä maailmanlaajuisesti useimmilla potilailla, kun diagnosoitu, esittelyyn edennyt sairaus [1]. Vaikka parannusta mediaanielinajassa on havaittu viime vuosikymmeninä, uusiutumisen ja kuolleisuus ovat edelleen korkealla johtuu osittain hankintaan chemoresistance [2]. Yhdistelmä paklitakselin ja karboplatiinin on laajalti käytetty ensilinjan kemoterapiaa munasarjasyöpä potilaille. Paklitakseli vaikuttaa nimenomaan aikana G2-M-vaiheen solusyklin indusoimalla epänormaali karat ja häiriöitä mikrotubulusdynamiikan, mikä estää solusyklin etenemistä. Huolimatta alkuperäisen tehokkuutta syövän terapeuttisen aineen, useimmissa tapauksissa potilaat lopulta herkkä paklitakseli kemoterapiaan ja uusiutumisen. Siksi on tärkeää tunnistaa uusia ennustetekijöitä markkereita ja terapeuttisia tavoitteita, erityisesti geenit liittyvät etäpesäkkeiden ja lääkeresistenssi.

Forkhead laatikko (FOX) proteiinit kuuluvat superperheen evoluutiossa konservoituneen transkriptiotekijöiden vastaa ajallisesti ja fine -Tuning laajan valikoiman transkription ohjelmia, joita tarvitaan normaalin homeostaasin ja kehitystä [3]. Joista forkhead laatikko proteiinia M1 (FOXM1) osallistuu monenlaisia ​​biologisia prosesseja kuten solujen lisääntymisen, solusyklin etenemistä, solujen erilaistuminen, DNA vahinkosaneeraus, kudos homeostaasin, angiogeneesiä ja apoptoosin [4], [5]. Siksi ei ole yllättävää, että sääntelyn purkaminen FOXM1 voi aiheuttaa vakavia patologisia tiloja, mukaan lukien syövän. Todellakin, FOXM1 yli-ilmentyminen on dokumentoitu keuhko-, rinta-, maksa-, eturauhas- ja paksusuolen jne viittaa siihen, että FOXM1 on avainasemassa kasvainten synnyssä [3], [6]. Viime aikoina on osoitettu, että vapautettu FOXM1 ilmentyminen voidaan resistenssin kemoterapeuttiset lääkkeet, kuten sisplatiini ja epirubisiini, suojaamalla soluja vastaan ​​DNA-vaurion indusoiman solukuoleman, ja häiritsevät mitoosi tarkistuspisteen [7] – [9].

tässä tutkimuksessa tutkimme ekspressiokuviota FOXM1 munasarjasyövän. Vaikutukset FOXM1 ilmaisun syöpäsolujen muuttoliikettä, invaasiota ja paklitakselin kestävyys tutkittiin myös yrittää arvioida FOXM1 mahdollisena molekyyli- ennustetekijöitä merkki ja terapeuttinen kohde munasarjasyöpä. Lisäksi analyysit suoritettiin tunnistamaan KIF2C uutena FOXM1 transkription tavoite, jotka saattavat olla osallisina hankintaan chemoresistance.

Materiaalit ja menetelmät

Kliiniset näytteet ja solulinjoissa

arkistoinnin parafiiniin kudosblokeista vuodesta 1987-2004 haettiin Patologian osasto, Queen Mary Hospital, University of Hong Kong. Näytteet ovat 2 hyvänlaatuinen cystadenomas, 2 rajatapaus kasvaimia, 94 ensisijainen karsinoomien ja 21 metastaasipesäkkeiden syövän (at nivelside, gut, imusolmuke ja kohdun herakalvon). Kaikki potilaat, joilla syöpä leikattiin seurasi standardi ensilinjan kemoterapia kuten platina /paklitakseli. Seuranta-aikana vaihteli 5-209 kuukautta (mediaani 63 kuukautta). Käyttö Näiden näytteiden hyväksyi Institutional Ethical Review Board. Kunkin potilaan näyte arvioitiin patologit ja varmistettu sisältää yli 70% tuumorisoluja.

Munasarjasyöpä solulinjoissa SKOV-3 ja OVCAR-3, hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). SKOV3–TR solut olivat antelias lahja tri Lawrence XF Le (Division of Cancer Medicine, University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas, USA) [10]. PEO1 ja PEO1-TaxR ovat viime aikoina kehitetty solulinjoja ja on todennettu Cancer Research UK laitokseen. Käyttö PEO1 ja PEO1-TaxR sijasta SKOV-3 ja SKOV3-TR joidenkin kokeiden tarjoaa ylimääräisiä keinoja varmistaa, että resistenttien mekanismeja tunnistettu SKOV-3 ja SKOV3-TR ovat yhteisiä kaikille paklitakseliin resistenttien munasarjasyöpäsoluja eikä ainutlaatuinen SKOV-3 ja SKOV3-TR. Tärkeää on, sekä PEO1 ja PEO1-TaxR pidetään alentaa kohtia välttämään nietoksille vastuksen ja hankintaan toissijainen mutaatioista [10] [11]. OVCAR-3 kasvatettiin 01:01 Medium 199 (Invitrogen, CA, USA): MCDB105 (Sigma, MO, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 100 yksikköä /ml penisilliiniä-streptomysiiniä (Invitrogen). SKOV3, SKOV3-TR, PEO1 ja PEO1-TaxR viljeltiin RPMI1640 (Sigma), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 100 yksikköä /ml penisilliiniä-streptomysiiniä (Invitrogen). PEO1-TaxR täydennettiin 50 nM paklitakselia. Kaikkia solulinjoja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2. Solujen viljelyväliaine vaihdettiin joka 3-5 päivä riippuen solutiheydestä. Rutiini kulkua, kun solut saavuttivat 85%: sta 90% konfluenssiin, ne jaettiin suhteessa 1:04.

immunohistokemia

Immunohistokemia suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [12], [13 ]. Lyhyesti, formaliinilla kiinnitetyt parafiinia leikkeitä inkuboitiin anti-FOXM1-vasta-ainetta (NBP1-30961, 01:40, Novus Biologicals, CO, USA) huoneen lämpötilassa yön yli ja värjättiin käyttäen EnVision + Dual Link System (K4061, Dako, CA, USA) . Antigeeni haku suoritettiin käyttäen EDTA-puskuria, pH 8,0, painekattilassa 30 min. Kaikki osat arvioitiin kahden riippumattoman tutkijat. Immunoreaktiivisuus FOXM1 vasta-intensiteetti värjättyjen solujen ja niiden prosenttiosuudet mitattiin intensiteettinä ja prosenttiosuus tulokset vastaavasti. Prosenttiosuus pisteet vaihtelivat 0-4: 0 = 5% positiivisesti värjättyä solua, 1 = 5-25% positiivisesti värjättyä solua, 2 = 26-60% positiivisesti värjättyä solua, 3 = 61-85% positiivisesti värjätään solut, ja 4 = 86-100% positiivisesti värjäytyneiden solujen. Immunohistokemiallinen (IHC) pistemäärä (0-16) laskettiin kertomalla intensiteetti pisteet (0-4) ja prosentuaalinen pistemäärä (0-4), jossa maksimipisteet 16 [12], [13]. FOXM1 ydin- ja sytoplasman immuunivaikutukset pisteytettiin erikseen.

Western blot

Solut kerättiin lyysipuskurilla [0,125 m Tris, pH 6,8 22 ° C: ssa, joka sisälsi 1% NP-40 (v /v ), 2 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA), 2 mM N-etyylimaleimidiä, 2 mM fenyylimetaanisulfonyylifluoridi (PMSF), 1 mM natriumortovanadaattia ja 0,1 um natrium- okadate] ja sentrifugoitiin 4 ° C: ssa 10 min. Proteiinipitoisuus määritettiin pesuaineiden kanssa yhteensopivissa (DC) proteiinin määritys (Bio-Rad). Kaksikymmentä mikrogrammaa proteiinia erotettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE), siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvo ja hybridisoitiin seuraavien anti-elimet: anti-FOXM1 (sc-502, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) anti-kaspaasi 9 (9502, Cell Signaling Technology, MA, USA), anti-KIF2C (WH0011004M1, Sigma), anti-kaspaasi 7 (9492, Cell Signaling) ja anti-β-tubuliinia (sc-9104, Santa Cruz Biotechnology ).

Quantitative real-time PCR

Quantitative real-time PCR (qPCR) suoritettiin käyttäen Virta SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) ja analysoitiin ABI7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems ). L19 (RPL19), joka ei ole säännelty ribosomaalinen siivous geeniä käytettiin sisäisenä kontrollina normalisoinnin käyttämällä delta-delta Ct menetelmällä. Seuraavia alukkeita käytettiin:

KIF2C Forward 5 ’: sta 3’: CATGATTGCCACGATCTCAC

KIF2C Reverse 5 ’: sta 3’: CGTTAGAGCAGGCTTCCATC

L19 Forward 5 ’: sta 3’: GCGGAAGGGTACAGCCAAT

L19 Reverse 5 ’: sta 3’: GCAGCCGGCGCAAA

ohimenevä knockdovvn FOXM1

oN-TARGET Plus Human FOXM1 siRNA ja Non-kohdistaminen ohjaus siRNA (Thermo Scientific, CO , USA) oli ohimenevää vaiennettu FOXM1 käyttäen Oligofectamine transfektioreagenssia (Invitrogen) kohti valmistajan ohjeiden.

In vitro

maahanmuutto- ja invaasion määritykset

in vitro

maahanmuutto- ja invaasion määritykset suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [12], [13]. Lyhyesti, 1,25 x 10

5 solua maljattiin ylempään osastoon Transwell kammion (Corning Life Sciences, MA, USA). Siirrettävissä määrityksiä, solujen annettiin kulkeutua gelatiini-päällystetyn kalvon. Invaasiolle määrityksiä, solujen annettiin tunkeutua läpi Matrigel-päällystetty kalvo. 24 tunnin kuluttua solut ylä- puolelle kalvon poistettiin ja siirretyn tai tunkeutuu solut kiinnitettiin, värjättiin ja laskettiin.

TdT-välitteisen dUTP nick end merkintöjä (TUNEL) määritys ja arviointi mitoosi katastrofin indeksi

jälkeen FOXM1 pudotus 48 tuntia ja paklitakselihoidolla (50 nM) 24 tunnin ajan, TUNEL-määritys suoritettiin käyttäen In Situ Death Detection Kit (Roche Biochemical, IN, USA) noudattaen valmistajan protokollaa [14]. Apoptotic ja mitoosi katastrofi luvut arvioitiin alla fluoresenssimikroskopian. Mitoosi katastrofi lukuja havaita morfologisia muutoksia ytimet (DAPI värjäys) [10]. Yli 1000 eläviä soluja kussakin kokeessa tutkittiin ja mitoosi katastrofin indeksi arvioitiin prosentteina solujen laskettiin. Jokainen määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Solusyklianalyysiä

Solusyklianalyysiä suoritettiin propidiumjodidivärjäys kuten aiemmin on kuvattu [15]. Lyhyesti, molemmat kiinnittyneet ja suspension solut kerättiin ja värjättiin propidiumjodidilla (1 mg /ml), kun läsnä on DNaasi-vapaata RNaasi virtaussytometrianalyysiä. Solusyklin profiili analysoitiin käyttämällä solun Diva -ohjelmistoa (Becton Dickinson UK Ltd.).

Kromatiini immunosaostus

40 ui Dynabeads proteiini A (10002D, Invitrogen) pestiin 200 ul: TSE I puskuria kolme kertaa ja laimennetaan 40 ui TSE I puskuri. Anti-FOXM1 (sc502, Santa Cruz Biotechnology) (4 ug) ja kanin IgG ohjaus (X0903, DAKO) (4 ug) otettiin ensimmäisen kerran erikseen laimennettuna Buffer D, sekoitetaan laimennettu Dynabeadsilla ja sitten kierretään O /N 4 ° C: ssa. PEO1 ja PEO1-TaxR solujen 90% konfluenssiin 100 mm viljelymaljalla oli silloitettu 1% formaldehydiä 10 minuutin ajan, huuhdeltiin jääkylmällä PBS: llä ja inkuboitiin 2,5 M glysiiniä 5 min. Sitten solut otettiin talteen 2 ml romuttamista puskuria. Sen jälkeen, kun juokseva PBS-pesu, puskuri I ja puskuri II, solu- pelletti suspendoitiin uudelleen 300 ul: aan lyysipuskuria, ja sonikoitiin optimoiduissa olosuhteissa (20 min 30 s ja 30 s pois). Sitten supernatantti laimennettiin 300 ui: aan puskuria D, joka 100 ui otettiin INPUT ohjaus. 200 ui solu- lysaattia sekoitettiin valmis Dynabeads ja pyöritetään O /N 4 ° C: ssa. Sen jälkeen, kun juokseva pesun TSE I, TSE II, puskuri III ja TE-puskuria, 100 ui eluutiopuskuria lisättiin Dynabeads, ja seosta pyöritettiin huoneenlämpötilassa 1 h. Eluoitunut näyte kerättiin Eppendorf ja Dynabeads uudelleen eluoitiin toisella 100 ui eluutiopuskuria. 200 ui näytettä de-silloitettu inkuboimalla 65 ° C: ssa O /N. PCR Purification Kit (Qiagen) käytettiin sitten DNA: n puhdistamiseksi. Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR suoritettiin seuraavilla alukkeilla: KIF2C (Forward 5 ’: sta 3’: GCCAAGTCTCCAACTTGCTC; Reverse 5 ’: sta 3’: TTCCCAACCATCTTCCTACG).

ChIP-qPCR data normalisoitiin IgG-ohjaus ja piirrettiin prosentteina tulo. Koostumus puskurien taulukossa 1.

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi suoritettiin tilasto Package for Social Science versio 19.0 for Windows (IBM). Vertailu kahden ryhmää epäparametrinen data suoritettiin Mann-Whitney

U

-testissä. Eloonjäämisen todennäköisyys analysoitiin käyttämällä Kaplan-Meier lähestymistapaa. Monimuuttuja-analyysi ennustetekijöiden suoritettiin käyttäen Coxin regressiomallin.

P

-arvot 0,05 katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

FOXM1 yliekspressio korreloi huonon säilymisen

Ilmaisu ydin- FOXM1 munasarjojen hyvän- ja rajatapauksia kasvaimet sekä invasiivisia syöpiä arvioitiin immunohistokemiallisesti. Munasarjasyöpiä näkyy vahvempi ydin- FOXM1 värjäytymisen kuin hyvänlaatuisia ja rajatapaus kasvaimia. Kuitenkin, ei ollut merkittävää eroa FOXM1 ilmaisun välillä ensisijaisen karsinoomat ja niiden etäispesäkkeitä (

P

= 0,6). Korkeampi ydin- FOXM1 ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä pitkälle edennyt munasarjasyöpä (

P

= 0,035) (Kuva. 1A). Vaikka oli tilastollisesti merkityksetöntä, FOXM1 yli-ilmentyminen näkyy suuntaus liittyvä vakavasta histologinen tyyppi (

P

= 0,142), korkealaatuista syöpiä (huono erilaistuminen) (

P

= 0,235) ja chemoresistance (

P

= 0,282) (taulukko 2). Jotta tutkittaisiin yhdistys FOXM1 ilmaisun potilas- lopputulokseen, potilaat luokiteltiin kahteen ryhmään käyttäen cutoff pisteen IHC pisteet 0. Kuten esitetään Kaplan-Meier kokonaiselinaikaa kuvaaja (kuvio. 1 B), potilailla, joilla on negatiivinen FOXM1 värjäytyminen oli merkittävästi pidempi yleinen (

P

= 0,019) ja taudista vapaan eloonjäämisen (

P

= 0,014) kuin ne, joilla on positiivinen FOXM1 ilme. Monimuuttuja eteneminen tutkimus paljasti ilmentymä FOXM1, pitkälle edennyt syöpä vaiheissa ja huono histologinen eroavuus (high grade) todettiin olevan riippumaton ennustavat tekijät lyhyitä kokonaiselinaikaa (95% CI, 0,906-5,754, HR 2.283,

P

= 0,08; 95% CI, 0,953-5,963, HR 2,384,

P

= 0,06; 95% CI, +2,137-40,638, HR 9,318,

P

= 0,003) ja taudista elinaika (95% CI, 1,025-6,631, HR 2,607,

P

= 0,04; 95% CI, 1,039-6,555, HR 2,61,

P

= 0,04; 95% CI, 1,821 -35,091, HR 7.993,

P

= 0,006, tässä järjestyksessä). Mielenkiintoista on, että sytoplasminen värjäys FOXM1 havaittiin myös lisäksi ydin- ilmentymisen, mutta ei merkittävää korrelaatiota kliinis parametrien havaittiin (tuloksia ei ole esitetty).

, Kuvat ovat immunoreaktiivisuuden ydin- FOXM1 in (I) hyvänlaatuinen cystadenoma, (II) rajatapaus kasvain, (III) vaiheessa I kohdunkaulan syöpä, (IV) vaiheen II kohdunkaulan syöpä, (V) vaiheen III kohdunkaulan syöpä ja (VI) vaihe IV kohdunkaulan syöpä. Suurennoksilla X400. Upotteet Alueet kanssa suurennettava ydinvoiman FOXM1 värjäystä. B, kumulatiivinen kokonaismäärä ja taudista vapaan eloonjäämisen tontteja käyttäen Kaplan-Meier lähestymistapa.

ohimenevä knockdovvn FOXM1 estää SKOV-3 solumigraation ja invaasiota

Seuraava tutkittu roolia FOXM1 munasarjasyövän etenemiseen.

In vitro

TranswellTM määrityksiä käytettiin tutkimaan vaikutuksia ohimenevä vaiennettu FOXM1 on munasarjasyövän solun liikkuvuus ja invaasiota. Väheni merkittävästi muuttoliikkeen ja invaasiota (

P

0,05) havaittiin SKOV-3-solut transfektoitu ON-TARGET Plus Human FOXM1 siRNA (siFOXM1) verrattuna soluihin transfektoitu ohjaus siRNA (siControl), mikä osoittaa, että knockdovvn FOXM1 kykeni estämään muuttoliikettä ja invaasion SKOV3- soluja (Fig. 2).

. Edustavia kuvat osoittavat solut vaelsivat (gelatiinipäällystetyille kalvo) tai tunkeutuneet (Matrigel-päällystetty kalvo) 24 tunnin kuluttua. B. Edustavia Western blot-analyysi osoittaa tehokkuutta FOXM1 ohimenevä Knockdown in SKOV-3. C. graafinen esitys muuttoliike (vasen paneeli) ja invaasiota (oikea paneeli) tulokset kertainen muutos siirtynyt ja tunkeutuu soluihin suhteessa kontrolliin vastaavasti viidellä kolmen kuopan kolmesta itsenäisestä kokeesta; * P 0,05, merkittävä; Mann-Whitney

U

-testissä.

paklitakselihoidolla downregulates ilmentymistä FOXM1 in SKOV-3 mutta ei paklitakseli-resistenttejä SKOV3-TR

Koska IHC värjäys osoittaa, että kohonnut FOXM1 ilmentyminen liittyy huonoon ennusteeseen, ja näin ollen chemoresistance, pari perustettu munasarjasyövän solulinja herkkiä ja resistenttejä paklitakselia, eli SKOV-3 ja SKOV3-TR vastaavasti, käytettiin vaikutuksen tutkimiseen paklitakselihoidolla ilmenemistä koskevat FOXM1. Soluja käsiteltiin paklitakselia (100 nM) ja kerättiin eri aikapisteissä 0, 8, 16, 24, 48 ja 72 tuntia. Kiehtovan, immunoblottauksella osoitti FOXM1 lauseke väheni 48 h ja 72 h SKOV-3. Kuitenkin FOXM1 ilme pysyi suhteellisen vakiona korkeilla tasoilla SKOV3-TR upon paklitakselihoidolla (Fig. 3), mikä viittaa rooli FOXM1 välittämisessä paklitakselin resistenssin munasarjasyöpäsoluja. Erityisesti siellä myös näytti olevan vain marginaalinen nousu ilmaus katkaistun kaspaasi-9 ja kaspaasi-7 sekä SKOV-3 ja SKOV3-TR upon paklitakselihoidolla, viittaa siihen, että apoptoosin ei ehkä tärkein tapa indusoimaan solukuoleman näissä munasarjakarsinoomasolut.

paklitakselia herkällä SKOV-3 ja kestävä SKOV3-TR munasarjasyövän soluja käsiteltiin 100 nM paklitakselin ja kerättiin ajoittain tarkoitettu Western blot-analyysi. Paklitakselihoidolla alassäädetty FOXM1 ilmentymistä ajankohtina 48 h ja 72 h SKOV-3, mutta ei SKOV3-TR esitetyllä immunoblottauksella. Oli myös ole merkittyjä muutoksia halkaistut kaspaasi-9 ja kaspaasi-7 ilme.

ohimenevä vaiennettu FOXM1 merkittävästi parantaa paklitakseli välittämää mitoottisiin katastrofi

aiemmin osoitti, että paklitakseli tappaa munasarjasyöpäsoluja pääasiassa indusoimalla mitoosi katastrofin sijaan apoptoosin soluissa [10]. Valaista mahdollista roolia FOXM1 munasarjasyövän chemoresistance, SKOV-3 ja OVCAR3 munasarjasyövän solulinjoissa hoidettiin paklitakselilla 24 tunnin seuraavista FOXM1 ehtyminen siRNA, värjättiin DAPI ja tutkittiin fluoresenssimikroskopialla. Tulos osoitti, oli lisääntynyt määrä multi-tumallisia soluja (nuoli) munasarjasyövän solujen FOXM1 taintumisen (

P

= 0,03 ja 0,01, vastaavasti) (kuvio. 4), mikä viittaa siihen, FOXM1 ehtyminen merkittävästi parannettu paklitakseli -välitteisen mitoottista katastrofi sekä SKOV-3 ja OVCAR3. On huomattava, että apoptoosi oli tuskin havaittavissa näissä paklitakseli-käsitellyt solut. Tämä johtui luultavasti siitä, että molemmat SKOV-3 ja OVCAR3 satama huonosti p53 ja p53: n, on tarpeen paklitakselin indusoiman apoptoosin munasarjasyöpäsoluja.

SKOV-3 ja OVCAR3 solut transfektoitiin joko siRNA-altaat vastaan ​​FOXM1 tai ohjaus siRNA poolit hoidettiin paklitakselilla (100 nM) ja värjättiin DAPI. A. Edustavia värjäys Tulokset on esitetty osoittavat, että ohimenevää FOXM1 pudotus tehostaa merkittävästi paklitakselin aiheuttama mitoottisiin katastrofi (nuoli) in SKOV-3 ja OVCAR3 soluissa (ylempi paneeli). B. Kuvaajat edustavat tulokset kolmen erillisen kokeen, joka osoittaa solujen prosenttiosuus meneillään mitoosi katastrofi, * P 0,05, merkittävä; Mann-Whitney

U

-testissä.

FOXM1 Knockdown indusoi pientä nousua kertyminen G2 /M ja kuolleet solut päälle paklitakselihoidolla että resistenttien SKOV3-TR solulinja

Solusyklianalyysiä sitten suoritettiin selvittämään roolin FOXM1 paklitakselin-välitteistä solukuolemaa. Tätä varten, SKOV-3 ja SKOV3-TR-solut transfektoitiin ohimenevästi ohjaus ja FOXM1 siRNA 48 tuntia ja viljeltiin läsnä ollessa tai puuttuessa paklitakselihoidolla (100 nM) 48 tuntia. Saatu solut kerättiin, värjättiin propidiumjodidilla ja alistettiin virtaussytometria-analyysi. Tulokset osoittivat, että paklitakseli indusoi merkittäviä määriä solukuoleman (sub-G1 väestöstä) in SKOV-3-solut transfektoitiin joko FOXM1 tai ohjata siRNA allas (Fig. 5A, yläpaneeli). Lisääntynyt solujen lukumäärä kertyneiden Saharan G1 DNA sisältö SKOV3-TR FOXM1 taintumisen (8,1%) (Fig. 5A, ylempi paneeli) verrattuna SKOV3-TR transfektoitu ohjaus siRNA (4,2%) (Fig. 5A, yläpaneeli ), mikä viittaa siihen, FOXM1 edistää paklitakselin resistenssin munasarjasyöpäsoluja ja FOXM1 hiljentäminen voivat parantaa paklitakseli-välitteistä solukuolemaa. Kun paklitakselihoidolla, vaatimaton kasvu soluissa estetty G2 /M vaiheessa havaittiin myös SKOV3-TR käsitelty siRNA vastaan ​​FOXM1 kontrolliin verrattuna, mikä viittaa FOXM1 hiljentäminen saatetaan parantaa paklitakseli välittämä solukuolema kautta mitoosi katastrofi (Fig. 5A, alempi paneeli, Fig. 5B). Köyhtyminen FOXM1 herkillä SKOV-3-soluissa ei ole lisävaikutus paklitakseliin hoitoon. Tämä johtuu todennäköisesti siitä, että paklitakseli toimii kautta vähen- tämisessä FOXM1 ilmaisun kuten paljastui Western blot-analyysi (katso Fig. 3).

. Virtaussytometrianalyysin toteutettiin seuraavat propidiumjodidivärjäys SKOV-3 ja SKOV-3-TR-solujen hoidettiin paklitakselilla (100 nM) tai jätettiin käsittelemättä transfektion jälkeen siRNA altaat vastaan ​​FOXM1 tai kontrolloida siRNA altaita. Edustavat tiedot näkyvät osoittaa, että FOXM1 hiljentäminen on omiaan lisäämään kuolleiden solujen ja solujen estetty G2 /M solusyklin vaihe SKOV-3-TR verrattuna soluihin käsitelty ohjaus siRNA. B. Bar kaavioissa eri vaiheissa solusyklin in SKOV-3 ja SKOV3-TR hoidettiin paklitakselilla transfektion jälkeen ohjaus tai siRNA vastaan ​​FOXM1. Tulokset edustavat tietoja kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta.

KIF2C tunnistetaan uutena FOXM1 transkription tavoite, joka voidaan osallisina hankintaan chemoresistance

Bioinformatics analyysi paljasti KIF2C, jäsen KIF superperheen proteiinien, mahdollisena kohteena geenin FOXM1 konsensus forkhead sitoutumiskohdat, joka sijaitsee ylävirtaan transkription aloituskohdasta (Fig. 6D). Käyttäen pari paklitakseli-herkän (PEO1) ja kestävä (PEO1-TaxR) munasarjasyövän solulinja, paklitakselihoidolla alassäädetty ilmaus KIF2C 48 h ja 72 h PEO1. Kuitenkin KIF2C ilme pysyi suhteellisen vakiona PEO1-TaxR upon paklitakselihoidolla (Fig. 6A), mikä viittaa rooli KIF2C välittämisessä paklitakselin resistenssin munasarjasyöpäsoluja. Kiehtovan, ilmaukset FOXM1 muuttunut samansuuntainen (Fig. 6A). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR (qPCR) käytettiin sitten vaikutuksen tutkimiseen ohimenevä hiljentäminen FOXM1 on transkriptio tasosta KIF2C. FOXM1 Knockdown johti merkittävästi alassäädetty mRNA ilmauksia KIF2C molemmissa solulinjoissa (P 0,05) (Fig. 6B). Kromatiinin immunosaostus-qPCR (ChIP-qPCR) osoittivat lisäksi, FOXM1 kykeni sitoutumaan promoottorialueen KIF2C (P 0,05) (Fig. 6C), mikä KIF2C voisi toimia uutena FOXM1 transkription kohteena.

A, paklitakselihoidolla (50 nM) alassäädetty FOXM1 ja KIF2C ilmaisuja 48 h ja 72 h PEO1 muttei PEO1-TaxR. B, FOXM1 Knockdown vähensi transkriptio tasoa KIF2C vuonna PEO1 ja PEO1-TaxR. Data edustaa kolmen rinnakkaisen kolmen kokeen. * P = 0,04, *** P = 0,0003. siControl: Epäspesifinen ohjaus. siFOXM1: FOXM1 knockdown. C, siru-qPCR osoitti FOXM1 merkittävästi vetää alas KIF2C promoottorialueen PEO1 ja PEO1-TaxR verrattuna negatiiviseen IgG kontrolli. Data edustaa kolmen rinnakkaisen kolmen kokeen. * P = 0,04, *** P = 0,0001. D, Kaavamainen diagrammi, joka esittää sijainteja forkhead vaste-elementin (FHRE) ja sitoutumiskohdan käytetyt alukkeet ChIP-qPCR ylävirtaan transkription aloituskohdasta KIF2C.

Keskustelu

tässä tutkimuksessa, osoitamme, että ydinvoiman FOXM1 ilmentyminen korreloi merkitsevästi vaiheessa lyhyempi kokonaiselossaoloaika ja taudista vapaan eloonjäämisen munasarjasyöpä potilaille. Monimuuttuja-analyysi osoittaa, että FOXM1 ilmaus voisi toimia itsenäisenä ennustetekijä. Lisäksi ohimenevä FOXM1 ehtyminen kykenee inhiboimaan munasarjasyövän solujen vaeltamiseen. Nämä havainnot viittaavat siihen, että FOXM1 voi olla ratkaiseva rooli munasarjan syövän synnyn ja etenemisen ja voi ennustaa potilaiden lopputulosta.

Vaikka FOXM1 osallistumisesta korkealuokkaisesta munasarjakarsinoomat on raportoitu [16], onko FOXM1 osallistuu hankintaan paklitakselin vastus määrittelemätön. Itse asiassa vapautettu FOXM1 ilmentyminen on osoitettu resistenssin kemoterapeuttisten kuten sisplatiini ja epirubisiini [8], [9]. Ottaen huomioon immunohistokemiallisella havainto viittaa yhdistyksen välillä FOXM1 ja chemoresistance, pari perustettu paklitakselia herkkä ja kestävä solulinjoissa, SKOV-3 ja SKOV3-TR [10], käytettiin tutkimaan vaikutusta paklitakselin on FOXM1. Mielenkiintoista, paklitakselihoidolla johti alas-säätely FOXM1 in SKOV-3, mutta ei vastustuskykyisten solulinjassa SKOV3-TR, mikä rooli on FOXM1 välittämisessä paklitakselin resistenssin munasarjasyöpäsoluja. Immunofluoresenssikoe tutkimus osoitti lisäksi, ohimenevää FOXM1 Knockdown voisi parantaa paklitakseli-välitteistä solukuolemaa kaksi munasarjasyövän solulinjoissa, SKOV-3 (poistetaan p53) [17] ja OVCAR3 (mutantti p53) [18]. Ei ole yllättävää, että apoptoottiset solut olivat tuskin havaittavissa, koska molemmissa solulinjoissa satama huonosti p53. Äskettäin on ehdotettu, että induktio p53-riippumattoman apoptoosin tapahtuu aktivointi kaspaasi-9 [19]. Kuitenkin immunoblottaus paljasti kaspaasi-9 ei aktivoituu paklitakselihoidolla in SKOV-3 ja SKOV-3-TR-soluissa, mikä osoittaa, että molemmat paklitakseli ja FOXM1 hiljentäminen vaikutus solukuolemaan ensisijaisesti tehostamalla mitoosi katastrofin sijaan apoptoosin munasarjasyöpäsoluja, joka yleisesti on toimimaton p53-reitin. Tämä vastaa aiempia havaintoja paklitakselia rintasyövässä [20].

Mitoottista katastrofi voidaan pitää eräänlaisena solukuoleman aikana esiintyvien mitoosin tai johtuvat mitoosi vika [21]. Kaksi mekanismeja on ehdotettu ratkaisevia mitoosi katastrofin eli G2 /M ja sukkularihmaston tarkistuspisteitä [22]. Sillä G2 /M tarkastuspiste, inaktivoimiseksi geenejä, kuten

p53

,

p21

CIP1

ja

14-3-3Sigma

on raportoitu aiheuttavan DNA vahinkoja aiheuttama mitoottisiin katastrofi [23], [24]. Virtaussytometrianalyysin suoritetaan tutkimuksessamme ehdotti FOXM1 Knockdown että solunsalpaajaresistentti munasarjasyövän solulinja SKOV3-TR voi aiheuttaa solukuoleman. Paklitakselihoidolla ja immuunifluoresenssivasta analyysi ehdotti lisäksi FOXM1 hiljentäminen voisi parantaa paklitakseli välittämää mitoottista katastrofin p53-riippumatonta ja kaspaasi-9-riippumattomalla tavalla. Rajaaminen oleva mekanismi, jolla FOXM1 välittää paklitakselin vastus valottaa uusia lähestymistapoja hoidon.

kinesiiniin superperheen proteiineista (KIFS) pelata keskeisiä rooleja intrasellulaarisen kuljetukseen soluelimiin ja ylläpito kehräkokoonpanon aikana mitoosin ja meioosin [ ,,,0],25]. Koska perustajajäsen ja parhaiten tunnettu jäsen kinesiinin-13 perheen, KIF2C /MCAK on elintärkeää kaikkien uskollinen erottelu kromosomien mitoosin ja turvaamiselle kromosomi vakauden [26]. Ei ole yllättävää, ajan määräykset KIF2C on dokumentoitu useisiin ihmisen syövissä ja KIF2C on ehdotettu olevan tärkeä rooli syövän synnyssä [27], [28]. Nykyisessä tutkimuksessa, immunoblottaus analyysi osoitti KIF2C ilmentymistä PEO1 muuttunut samaa kaavaa kuin FOXM1 ilmaus näyttämällä alassäätöä 48 h ja 72 h päällä paklitakselihoidolla. Sen sijaan, KIF2C ilmaisu pysynyt suhteellisen muuttumattomana PEO1-TaxR, syytetään KIF2C saattaa liittyä paklitakselin kehittämisessä resistenssin munasarjasyöpä. Tämä havainto on johdonmukainen tuoreessa raportissa osoitetaan menetys KIF2C voisi lisätä herkkyyttä kiinanhamsterin munasarjan (CHO) paklitakseli [29]. Lisäksi KIF2C tunnistettiin uutena FOXM1 transkription tavoite, joka voisi olla keskeinen rooli välittäjänä paklitakselin resistenssin munasarjasyöpäsoluja.

Yhteenvetona yliekspressio FOXM1 havaittiin korreloivan huonon potilaiden selviytymisen ja paklitakseli-välitteisen mitoottista katastrofin munasarjasyöpäsoluja.