Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Se on suuri kliininen haaste, mitkä potilaat, joilla on edennyt vaiheeseen pään ja kaulan okasolusyöpä, niillä ei ole kasvaimen koon pienentyminen induktion jälkeen kemoterapiaa välttämiseksi myrkyllisiä vaikutuksia tehottomia kemoterapiaa ja viiveitä riippumatta vahvistaa muita hoitovaihtoehtoja. Lisäksi on kiinnostavaa tietää, missä määrin geenin allekirjoituksen, joka tunnistaa potilaat, joilla kasvaimia, jotka eivät reagoi tiettyyn induktiokemoterapiaa, on sovellettavissa, kun uusia kemoterapeuttiset aineet lisätään hoito.

Menetelmät /Keskeiset havainnot

tunnistamiseksi ennustavien geenien kasvain resistenssin induktio sisplatiinin /5-fluorourasiili (PF) tai PF ja taksaani, analysoimme potilas kasvainbiopsioissa kanssa koko genomin mikrosiruja ja määrällinen käänteistranskriptaasi-PCR (TLDA) kortit. Jätettävää yksi rajat validointimenettelyä sallittu arvioinnin ennustustyökalun. Kymmenen geeni microarray allekirjoitus luokiteltu oikein 12/13 vasteen ja 7/10 vastaamattomien PF (92%: n spesifisyys, 82,6% tarkkuudella). TLDA analyysi (käyttäen samoja luokittelija) potilaista luokiteltu oikein 12/12 vasteen ja 8/10 ei-vastetta (100%: n spesifisyys, 90,9% tarkkuudella). Edelleen, TLDA analyysi ennusti oikein vaste 5 uutta potilasta ja kaiken 12/12 vaste ja 13/15 ei-vastetta (100%: n spesifisyys, 92,6% tarkkuudella). Proteiinituotteiden geenien muodostavan allekirjoituksen fyysisesti assosioitua 27 muiden proteiinien, mukaan geenin ilmentymisen säätelemiseksi, joka muodostaa vuorovaikutuksen kautta. Sen sijaan TLDA-pohjainen ennuste (samalla geenin allekirjoitus) vastausten induktion PF ja kahdella taksaaneja oli huono (0% spesifisyys, 25% tarkkuudella ja 33,3% tarkkuus, 25% tarkkuudella).

Johtopäätökset /merkitys

onnistunut siirto microarray-pohjainen geeni allekirjoituksen itsenäinen, PCR-pohjainen tekniikka viittaa siihen, että TLDA-allekirjoituksia voisi olla hyödyllinen sairaala-pohjainen tekniikka määrittämiseksi terapeuttisia vaihtoehtoja. Vaikka erittäin spesifinen tuumorivasteita PF induktio, geeni allekirjoitus ei onnistu, kun taksaaneja lisätään. Tulokset kuvaavat hienovaraisuus kehittämisessä ”henkilökohtainen medicine”.

Citation: Tomkiewicz C, Hans S, Mucchielli MH, AGIER N, Delacroix H, Marisa L, et al. (2012) Head and Neck syöpäkasvain Response-Specific Gene allekirjoitus sisplatiini, 5-fluoriurasiili induktiokemoterapiaa epäonnistuu Lisätty taksaanit. PLoS ONE 7 (10): e47170. doi: 10,1371 /journal.pone.0047170

Toimittaja: Andrew Yeudall, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 12, 2012; Hyväksytty 10 syyskuuta 2012 mennessä; Julkaistu: 09 lokakuu 2012

Copyright: © Tomkiewicz et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat CNRS (Centre National de la Recherche scientifique), INSERM (Institut National de la Sante et de la Recherche médicale), tukijakson Publique-Hôpitaux de Paris (CRC03017), Pariisi Descartes yliopisto. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) on kuudenneksi yleisin syöpä maailmassa [1]. Ranskassa yli 20000 uutta tapausta ja noin 6000 kuolemantapausta raportoitu vuonna 2003 ja viiden vuoden pysyvyys on edelleen alhainen (50%). Hoitostrategioiden kehittyneen pään ja kaulan alueen syöpä ovat muuttuneet viimeisten 30 vuoden aikana. Strategiat tänään, erityisesti kurkunpään, oro- ja hypopharyngeal syöpä, keskittyvät kirurgisia ja muita kirurgiset toimenpiteet, jotka säilyttävät funktionaalisen elin. [2].

Historiallisesti kahdessa kliinisessä tutkimuksessa, Department of Veterans Affairs (DVA) Kurkunpään Cancer Study Group [3] sekä Sädehoito Oncology Group (RTOG) 91-11 [4], ovat vaikuttaneet hallintaan kehittyneitä kurkunpään syöpä. DVA tutkimuksessa [3] oli ensimmäinen edistää elimen säilyttäminen strategiaa ja todistaa, että potilas selviytymisen jälkeen neoadjuvant tai induktiokemoterapiaa (sisplatiinin ja 5-fluorourasiili) ja sen jälkeen sädehoitoa oli lähes sama kuin jälkeen koko laryngektomian ja postoperatiivinen sädehoito.

kuitenkin käyttää ja hyötyä kemoterapian pysyi keskustelun aiheena jälkeen meta-analyysissä, vuonna 2000, 63 kokeiden vuosien 1965 ja 1993, joka osoitti, että kemoterapia ei-metastasoitunut pään ja kaulan okasolusyöpä in 10741 potilaalla on syöpä nielu, suuontelon, kurkunpään tai hypopharynx antoi vain pienen merkittävä eloonjäämishyötyä samanaikaiseen chemoradiation hoitoa [5].

Vuonna 2007 Eastern Cooperative Oncology Group vaiheen II monikeskustutkimus [6] raportoitu korkean elin-säilyttäminen rate jossa taksaanin kemoterapian suun ja nielun syöpä mutta ei kurkunpään syöpään. Kaksi kliinistä tutkimusta [7], [8] julkaistiin vuonna 2007 verrattuna intensiivisempää induktio kemoterapiahoidon; doketakselia lisättiin tavanomaiseen sisplatiini /5-fluorourasiili hoito. Peräkkäinen hoidon induktio doketakselin, sisplatiinin ja 5-fluorourasiili (TPF) paransi eloonjäämistä ja ilman taudin etenemistä verrattuna pelkkään sisplatiiniin ja 5-fluorourasiili (PF) paikallisesti edennyt kurkunpään, oro- ja hypopharyngeal syöpä [7] viittaa käyttöä peräkkäisiä TPF seurasi karboplatiini kemosädehoidon kuin hoitovaihtoehto elinten säilytystä ja parantaa eloonjääminen paikallisesti edennyt kurkunpään, oro- ja hypopharyngeal syöpä. Eurooppalainen TAX 323 tutkimusryhmän [8] verrattuna TPF PF kuten induktiokemoterapiaa potilailla, joilla locoregionally kehittynyt, leikkaushoitoon sairaus ja osoitti, että mediaani ilman taudin etenemistä oli 11,0 kuukautta TPF ryhmässä verrattuna 8,2 kuukautta PF ryhmässä. Vaikka lisäys taksaanin doketaksolina sisplatiiniin /5-fluorourasiilin induktiokemoterapiaa parantaa kliinisen vasteen ja eloonjääminen verrattuna sisplatiiniin /5-fluorourasiilin yksin tai sisplatiini /5-fluorourasiilin yhdistettynä sädehoito, se voi olla suurempi haittavaikutusten hematologisia tapahtumia (neutropenia ja siihen liittyvät komplikaatiot) [9]. Kuitenkin noin 30% potilaista osoittaa joko ei lisäänny tai potilaan tilan heikkeneminen induktion jälkeen. On siis suuri kliininen haaste, mitkä potilaat eivät hyödy induktiokemoterapiaa i) välttää myrkyllisiä vaikutuksia tehottomia kemoterapiaa; ii) välttää viiveet muita hoitovaihtoehtoja ja iii) minimoida hoidon.

Aiemmat tutkimukset on vasteena induktiolle kemoterapiaan HNSCC osoitti, että erot genotyypit eri entsyymien liittyy vaihteluita vastauksena sisplatiini induktiokemoterapiaa [10]. Sykliini ilmentyminen HNSCC ennusti vastata paremmin sisplatiini /5-fluorourasiilin kemoterapiaa [11]. Myös parempi eloonjäämisen indeksit potilaille havaittiin, kun ilmaus laminiinin ja syndekaani-1 muuttunut vastauksena kemoterapiaa [12]. Kuitenkin kaikki nämä tutkimukset keskittyvät vain yhteen tai muutamaan geenejä. Microarray-pohjainen geeniekspressioprofilointi pään ja kaulan syöpien on käytetty pääasiassa luokitteluasteikot kasvaimia tai ennustaa kaukaisia ​​etäpesäkkeitä tai tulos [13] – [15]. Vaikka geeni-ilmentymisen analyysit ovat arvioineet vaste ennen leikkausta Kemoterapia [16] tai induktiokemoterapiaa 5-fluorourasiilin, sisplatiinin ja adriamysiini [17] pään ja kaulan syöpä, ei genominlaajuisten mikrosirujen tutkimuksessa on osoitettu sisplatiini /5-fluorourasiili induktio hoito. Tässä tutkimuksessa käytetään genominlaajuisia mikrosiruanalyysi, pyrimme tunnistamaan geenejä, jotka olivat ennustava kasvaimen vaste induktiokemoterapiaa sisplatiinin /5-fluorourasiili. Olemme edelleen pyrittiin määrittämään, missä määrin tämä geeni allekirjoitusta sovellettiin kun ylimääräinen kemoterapia-aineiden (sisplatiini /5-fluorourasiili ja taksaani-doketakseli tai paklitakseli) lisättiin hoito.

Methods

potilaille ja induktiokemoterapiaa

Vuodesta 2002 vuoteen 2007, histologisesti todettu nielusta syöpä ilman aiemmin ollut syöpä tai useita kasvain paikoissa ja puuttuvat vasta-sisplatiini-kemoterapian olivat kirjoilla tutkimuksessa on Georges Pompidou Euroopan Hospital (HEGP), Pariisi. Potilaat, jotka kaikki oli edennyt (vaihe 3 tai 4) syövät, saivat joko PF (100 mg /m

2 sisplatiinia Day (D) 1 ja 1 g /m

2 5-FU D1-D5) tai TPF (joko carboplatine (paraplatine) -AUC5 D1 (jossa AUC on käyrän alapuolinen alue, kaava, joka voidaan laskea annos mukauttaa se arvo kreatiniinipuhdistumasta) ja 175 mg /m

2 paklitakselia D1 (T1PF) tai PF ja doketakselin: 75 mg /m

2 sisplatiinia D1, 75 mg /m

2 doketakseli D1, ja 750 mg /m

2 5-FU jatkuvana perfuusio D1-D5 ( T2PF) induktiokemoterapiaa. keskimäärin 3 kurssia (vaihteluväli 2-5) annettiin 14-21 päivää välein välillä kurssien ja annokset säädettiin ottamaan huomioon yksittäisten toleranssi ja vasteen. potilaat arvioitiin pään ja kaulan kasvain hallitus HEGP (koostuu pään ja kaulan asiantuntijoita, radiologien ja patologit). Tutkimme potilaalla kahdessa neljästä ryhmien ECOG luokittelun [18], jotta on kaksi ryhmää, jotka olivat ”kliinisesti” eri . Vastaus määriteltiin sekä kliinisen ja radiologisia tutkimus; Täydellisen kliinisen vasteen (CCR) osoitti yli 90% lasku kasvaimen koon taas ei-responder ryhmä (ET) osoittivat alle 50%: n lasku kasvaimen koon tai sairauden etenemistä.

HES-NR ja HES CCR vastaavat hematoksyliini- eosiini-safran värjäys edustavan ei-responder ja täydellinen kliininen vaste yksilöiden, vastaavasti, ja IHC-p16 ja HIS-onkogeenisten HPV vastaavat edustavaa positiivisia immunohistokemia varten p16-antigeenin (ruskea värjäytyminen ) ja hybridisaatio

in situ

onkogeeniselle HPV-DNA (sininen punktaatti tumavärjäystä), tässä järjestyksessä. Palkki edustaa 40 mikronia ylemmässä paneelien ja 20 mikronia alemman paneelit.

Ethics

Tutkimuksen luvan eettinen komitea (CCPPRB Pariisi-Broussais-HEGP nro 2002-035) ja totteli Ranskan biolääketieteellisen tutkimuksen lainsäädäntö. Tietoon kirjallinen suostumus saatiin kaikki osallistujat.

Näytteenotto, histologia ja Virology

Diagnostisia tarkoituksia varten, kasvain näytteet saatiin aikana tähystys nukutuksessa ennen minkäänlaista käsittelyä. Kukin Tuumorinäytteiden välittömästi panna RNAlater (Ambion) hajoamisen välttämiseksi RNA. Biopsia leikattiin 2 kappaletta, yksi patologinen tutkimus ja toinen välittömästi jäädytettiin -80 ° C: ssa, kunnes jatkokäsittely RNA. Formaliini-, parafiiniin upotettujen kudosten lohkojen valmistamiseen käytettiin dioja 1) hematoksyliini-eosiini-safran (HES) värjäämällä arviointia kasvaimen tilan ja prosenttia kasvainsolujen biopsia, 2) immunohistokemiallisella värjäyksellä ja p16-antigeenin ja 3)

in situ

-hybridisaatio käyttäen INFORM HPV (ihmisen papilloomavirus) III Family 16 Probe (B) kit havaita tärkeimmät HPV-DNA onkogeenisistä 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 (Roche Diagnostics, Ranska). Värjäys suoritettiin käyttäen BenchMark Clyde ULTRA Ventana Roche laite. Valmistajien protokollia käytettiin. HPV tila ei ole voitu varmistaa yhden CCR yksilön PF käsitellyssä ryhmässä. Histologinen analyysit ilmi, että kaikki kasvaimet olivat okasolusyöpää (kuvio 1 esitetään edustavat HES värjäystä koepalat NR ja CCR henkilöä). NR ja CCR ryhmissä näytteillä samanlainen yleinen laajuudet kasvaimen erilaistumista ja prosenttia kasvaimen soluihin.

10-geeni luokittelija selvästi erottaa jäsenet NR (sininen aloilla) ja CCR (punaisina palloina) ryhmiä. 82-83 prosenttia vaihtelevuutta näissä ensimmäisessä kolmessa ulottuvuudessa.

valmistelu ja arviointi RNA Quality

”Tripure eristäminen reagenssilla” (Roche) käytettiin poimia RNA alkaen koepala. Lyhyesti, biopsia (alle 100 mg) homogenoitiin 1 ml: Tripure 3 steriiliä volframi helmiä Retsch MM20 Mixer Mill (3 min hionta nopeudella 29, 3 kertaa). Kun oli lisätty kaksisataa ui kloroformia, putken ravisteltiin voimakkaasti huoneenlämpötilassa vähintään 5 minuutin ajan ja annettiin seistä vielä 5 minuuttia ennen sentrifugointia (15 min, 12500 rpm, 4 ° C). Vesipitoinen yläkerros, joka sisältää RNA: ta kerättiin. Jälkeen lisäämällä 500 ui isopropanolia ja inkuboimalla -20 ° C: ssa 10 minuutin ajan, RNA pelletoitiin sentrifugoimalla (15 min, 12500 rpm, 4 ° C). Pelletti pestiin 1 ml: lla 75% etanolia, sentrifugoidaan edellä kuvatulla tavalla ja kuivattiin huoneen lämpötilassa 10 minuuttia. Kokonais-RNA suspendoitiin uudelleen osaksi 40 ui RNaasi-vapaata vettä. RNA puhdistettiin edelleen RNaasi-vapaata DNaasia Set (Qiagen) ja RNeasy minielute siivous (Qiagen), mukaisesti valmistajan protokollaa. RNA: t kvantitoitiin käyttäen Nanodrop ND-1000 spektrofotometrillä ja niiden laatu arvioitiin elektroforeesilla käyttämällä Bioanalyzer (Agilent).

leimaaminen ja puhdistus Probes

microarray tutkimuksia, yhteensä 23 näytteitä ja universaali RNA viittaus, joka käsittää RNA: ta 10 eri ihmisen kudoksista (Clontech), käytettiin syntetisoimaan leimatun cRNA. Lyhyesti, 200-300 ng kokonais-RNA uutetaan koepaloja tai RNA viittaus leimattiin käyttäen cyanine3-CTP tai cyanine5-CTP ja ”Low RNA Input loisteputki Linear -monistustarvikesarjaa” (Agilent), mukaan valmistajan ohjeiden. Fluoresoivat koettimet puhdistettiin (Purification RNeasy Mini Kit, Qiagen) ja pitoisuus koettimien ja taso sisällyttämällä väriaineiden osaksi koettimien mitattiin (Nanodrop D-1000 spektrofotometrillä). Agaroosielektroforeesin leimattujen koettimien (1,2%: sessa agaroosigeelissä, 0,5 x TBE) suoritettiin mikroskoopin objektilasille yhdessä DNA-markkereita (100 bp, Biolabs) suoritettiin ja fluoresenssi geelin arvioitiin GeneTAC IV skanneri (Perkin-Elmer ). Sekä signaalin voimakkuuden ja profiilin näytteiden osoitti laatua merkintöjä.

hybridisaatio ja pesu mikrosirujen

Anturit (1 ug kutakin koepala näyte ja viitteen , suora suunnittelu) sitten hybridisoitiin yleiseurooppalainen genominen ihmisen 44K mikrosiru (Agilent), joka sisältää 41000 koettimia, jotka vastaavat geenit tai ilmenevän geenin osiksi, käyttäen Agilent 60-mer oligo mikrosiru käsittely protokolla (Agilent). Hybridisaatio suoritettiin 17 tuntia 60 ° C: ssa pyörimään hybridisaatio uunissa (Agilent), kuten valmistaja on kuvannut. Mikrosiruissa pestiin kuvatulla valmistajan protokollan ja kuivataan välittömästi speed vac sentrifugoidaan 2 minuuttia.

Array skannaus ja kuvankäsittely

mikrosiruja skannattiin käyttämällä Axon 4000B skanneri ( Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 5 um resoluutio. PMT jännitteet olivat automaattisesti tasapainottaa jakaumat punaisen ja vihreän intensiteettejä ja optimoida dynamiikkaa kuvan kvantifiointiin. Nopeus kyllästettyä pikseliä rajoittui 0,01%. Tuloksena 16 bittinen kuvat analysoitiin ja määrällisesti signaalien paneelit suoritettiin käyttäen GenePix Pro 6.0-ohjelmisto (Axon Instruments, Union City, CA). Segmentointi laskettiin kanssa ”mukautuva ympyrä” käsittelytapa. Taustat ei vähennetä eikä löytänyt, tyydyttyneitä ja huonoja paikkoja hylättiin. Sisäinen array normalisointi (ilman valvontaa paikkoja, 2615 koettimet) suoritettiin käyttäen lössi menetelmää, jossa on 0,5 span parametri.

Tilastollinen analyysi

Genes ilmentyvät eri välillä CCR ja NR mikrosirulla tutkimuksessa olivat tunnistaa mutivariable permutaatio testi ohjaamalla vääriä löytö määrä (moderoitu t-testi säätö p-arvot [19] avulla mango ohjelmistoa [20]. Genes valittiin merkittävästi ilmentyvät eri kun p-arvo oli alle 0,025 keskimääräinen kertainen muutos (taitoksen muutos välillä keinot normalisoitu signaalien 13 täydellisen kliinisen vasteen ja 10 ei vasteelliset) on suurempi kuin 1,3 absoluuttisena arvona ja keskimääräinen intensiteetti (log

2 (Cy5 * Cy3) /2) on suurempi kuin 7. Jokaisessa geenissä on ainakin yksi arvo kahden keskiarvot log

2 (NR /ref) ja log

2 (CCR /ref) suurempi kuin 0,4 absoluuttisena arvona ja ainakin yksi arvo kahden keskihajonnan log

2 (NR /ref) ja log

2 (CCR /ref) alle 0,5. Lisäksi on minimaalinen hyödyntämistä välillä CCR ja NR (