Krooninen sairaus

tiivistelmä

Phenethyl isotiosyanaatti (PEITC) on lupaava syövän chemopreventive komponentti syötävien cruciferous vihanneksia

in vivo

teho eturauhassyöpää vastaan ​​kokeellisessa jyrsijöillä. Syöpä chemopreventive vastaus PEITC on ominaista sen kyky estää useita kasvaimia synnyttävän signalointireittien, kuten Nukleaaritekijä-KB, Akt, ja androgeenireseptorin. Tämä tutkimus osoittaa ensimmäistä kertaa, että PEITC hoito aktivoi Notch signalointi pahanlaatuisia sekä normaalin ihmisen eturauhasen soluissa. Altistuminen ihmisen eturauhasen syöpäsolujen (LNCaP, PC-3, ja DU145) ja normaalin ihmisen eturauhasen epiteeli- solulinjan (PrEC) ja PEITC johti pilkkominen (aktiivinen muoto) ja Notch1 ja Notch2, ja lisääntynyt transkriptionaalista aktiivisuutta Notch. PC-3 ja LNCaP-solut, PEITC hoito aiheutti induktion Notch ligandien Jagged1 ja Jagged2 (PC-3), yliekspressio γ-sekretaasin monimutkaisia ​​osia Presenilin1 ja nikastriini (PC-3), ydin- rikastamista pilkottiin Notch2, ja /tai enintään -regulation on

Notch1

,

Notch2

,

Jagged1

, ja /tai

Jagged2

mRNA. PEITC-indusoitua apoptoosia in LNCaP-ja PC-3-solut oli merkittävästi heikennetty RNA-interferenssi on Notch2, mutta ei farmakologinen inhibitio Notch1. Esto PC-3 ja LNCaP solumigraatio johtuvat PEITC altistus merkittävästi täydennetty knockdovvn Notch2 proteiinin sekä farmakologinen esto Notch1 aktivointia. Nuclear ilmentyminen pilkkoa Notch2 proteiinia oli merkittävästi korkeampi PC-3-ksenografteissa päässä PEITC-käsitellyistä hiiristä ja dorsolateral prostates päässä PEITC-fed TRAMP-hiirissä verrattuna vastaaviin ohjaus. Koska Notch signalointi on osallisena epiteelin-mesenkymaalitransitioon ja etäpesäkkeiden esillä tutkimus osoittaa, että anti-metastaattinen vaikutus PEITC voidaan vahvistaa yhdistämällä hoito, johon liittyy Notch estäjä.

Citation: Kim SH, Sehrawat A, Sakao K, Hahm ER, Singh SV (2011) Notch aktivointi Phenethyl isotiosyanaatti vaimentaa sen estävä vaikutus Eturauhassyöpä Cell Migration. PLoS ONE 6 (10): e26615. doi: 10,1371 /journal.pone.0026615

Toimittaja: S. K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 29 syyskuu 2011; Julkaistu: 24 lokakuu 2011

Copyright: © 2011 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat National Cancer Institute apurahan RO1 CA101753-08. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Käytännön ja turvallinen yksityiskohtaiset kemopreventioon eturauhassyövän ovat kliinisesti houkuttelevia, koska suuri kuolleisuus liittyy tähän syöpään American men [1]. Kasvituotteiden, mukaan lukien ainesosia hedelmiä ja vihanneksia, edelleen houkutella huomiota löytö uusia syövän kemopreventiivisiä aineita [2]. Fenetyyli-isotiosyanaatti (PEITC) on yksi tällainen lupaava syövän chemopreventive agentti runsaasti syötävien cruciferous vihannekset, kuten vesikrassi [3]. Todisteet suojaava vaikutus cruciferous vihannekset ja niiden komponentteja, mukaan lukien PEITC, eturauhassyöpää vastaan ​​peräisin väestöpohjaiset havainnointitutkimukset sekä laboratoriotutkimukset [3] – [9]. Esimerkiksi väestöpohjainen tapauskontrollitutkimuksessa ehdotti käänteinen yhdistyksen välillä saanti cruciferous vihannekset ja eturauhassyövän riskiä [4].

In vivo

chemopreventive tehoa PEITC eturauhassyöpää vastaan ​​on nyt perustettu siirtogeenisen hiiren mallia (siirtogeeniset Adenokarsinooma Hiiri Eturauhasen malli; jäljessä lyhennettynä TRAMP) [5], [6]. Ruokinta 3 umol PEITC /g ruokavaliota merkittävästi vähentynyt ilmaantuvuutta sekä taakka (ihoalue) huonosti erilaistunut syövän dorsolateral eturauhasen TRAMP hiirillä [6]. Cancer chemopreventive vaste PEITC ei rajoitu eturauhasen syövän eston kemiallisen karsinogeneesin tai poistaminen spontaania syövän kehittymisen muihin sivustoihin (

esim

, keuhko-, paksusuoli-, ja ruokatorvi) tämän ravinnon komponentti on myös dokumentoitu [7] – [9]. Lisäksi kasvua ihonalainen eturauhassyöpäksenografteissa kateenkorvattomissa hiirissä oli merkittävästi hidastaa antamalla PEITC tai

N

-acetylcysteine ​​konjugaatti [10] – [12]. Erityisesti suun PEITC annon täydennetty proapoptoottiset vastauksena doketakselin

in vivo

eturauhassyöpäksenografteissa [13].

Turvallisuus, hyötyosuus, selektiivisyyttä syöpäsoluja, ja kyky kohdistaa useisiin onkogeenisen reitit ovat toivottavia attribuutteja kliinisesti käyttökelpoinen syövän chemopreventive agentti. Tutkimus toistaiseksi osoittavat, että PEITC täyttää kaikki nämä kriteerit. Ensinnäkin PEITC on hyvin siedetty kokeellinen jyrsijät [6] – [9]. Toiseksi, farmakokineettiset määritykset osoittavat erinomainen hyötyosuus PEITC [14], [15]. Kolmanneksi PEITC osoittaa myös selektiivisyyttä syöpäsoluja aiheuttaa apoptoosin ja autophagy [11], [16], [17]. Lopuksi PEITC pystyy tukahduttamaan useiden onkogeenisten signalointireittien jotka ovat hyperaktiivinen ihmisen eturauhassyövän [18], mukaan lukien Nukleaaritekijä-KB (NF-KB) [19], Akt [20], signaali anturin ja aktivaattori transkription 3 (STAT3 ) [21], ja androgeenireseptorin [22].

Tässä tutkimuksessa laajennetaan näitä havaintoja [19] – [22] ja tutkii vaikutusta PEITC hoidon aktivointi Notch1 ja Notch2, jotka kuuluvat perheeseen läpäisevien reseptorien osallisena eturauhasen syövän kehittymisessä ja etäpesäkkeiden [23], käyttämällä viljeltyjä ihmisen eturauhasen syöpäsolujen (LNCaP, PC-3, LNCaP-C4-2, ja DU145), normaali ihmisen eturauhasen epiteeli- solulinjan (PrEC), PC- 3 ksenografteissa kontrollista ja PEITC käsitellyillä hiirillä [13], [16], ja dorsolateral eturauhasen kontrollista ja PEITC ruokitaan TRAMP hiirillä [6].

tulokset

PEITC hoidossa lisääntyy tasojen pilkottu Notch1 ja Notch2 eturauhassyöpäsoluissa

ligandi-riippuvainen aktivaatio Notch on monimutkainen vaaditaan katkaisun γ-sekretaasi kompleksin [23], [24]. Notch-reseptorit aktivoituvat sitoutumisen niiden vieressä ligandien (

esim

, Jagged1 ja Jagged2), jonka uskotaan aiheuttavan konformaatiomuutos sisällä Notch-reseptorin jolloin altistuminen S2 katkaisukohdan tuumorinekroositekijä-α konvertoivan entsyymin [23], [24]. Sen jälkeen, Notch-reseptorien läpi toisen välittämän pilkkoutumisen γ-sekretaasin kompleksia dasta, joka sijaitsee Notch transmembraanidomeeni [24]. Net tuloksista katkaisu vapauttaa Notch solunsisäisen domeenin sytoplasmaan, joka sitten siirtyy tumaan, säätelemään kohdegeenin ilmentymistä [23], [24]. Taso pilkkoa Notch1 proteiinia nostettiin käsittelemällä PEITC molemmissa LNCaP (Fig. 1A) ja PC-3-solut (Fig. 1 B) joskin eri kinetiikkaa ja intensiteettiä. Päinvastoin PEITC hoito aiheutti vankka ja jatkuva kasvu tason pilkkoa Notch2 proteiinin molemmissa LNCaP (Fig. 1A) ja PC-3-solulinjojen (Fig. 1 B) varsinkin 5 uM annoksesta. Perustuen Notch2 RNA interferenssin tiedot esitetään myöhemmin, alempi kaista on Notch2 Western blot kuvassa. 1B on epäspesifinen. Vaikutus PEITC hoidon Jagged1 ja Jagged2 proteiinin ilmentyminen oli erilainen välillä LNCaP ja PC-3-solut. PEITC-käsitelty LNCaP-solulinjasta yleensä esillä lasku tasot Jagged1 ja Jagged2 proteiineja (Fig. 1A). Jyrkässä ristiriidassa LNCaP, ohimenevä (Jagged1) tai jatkuva (Jagged2) induktion Jagged proteiinin ilmentyminen oli selvästi näkyvissä PEITC saaneilla PC-3-solut (Fig. 1 B). Differential vasteet olivat havaittavissa myös koskee vaikutusta PEITC hoidon Presenilin1 ja nikastriini proteiinien välillä LNCaP ja PC-3-solujen varsinkin 8-tunnin kohdalla.

immunoblottaus pilkotun Notch1, halkaistut Notch2, Jagged1, Jagged2, Presenilin1 ja nikastriini käyttämällä lysaatit (A) LNCaP, (B) PC-3, ja (C) LNCaP-C4-2 solujen jälkeen 8-, 16- tai 24-tunnin hoidon dimetyylisulfoksidin (DMSO) tai PEITC (2,5 tai 5 uM). Nuoli paneeli B identifioi lohkaista Notch2, alempi kaista on epäspesifinen perustuu siRNA tuloksiin kuvassa. 4A. Blotit stripattiin ja uudelleen koetettiin anti-aktiini-vasta-aine. Immunoblottaus kullekin proteiinia tehtiin ainakin kahdesti käyttäen itsenäisesti valmis lysaatit. Numerot edellä band edustavat muutoksia proteiinin tasot suhteessa vastaaviin DMSO-käsiteltyihin kontrollieläimiin.

PC-3-solulinjan, joka on androgeeni-riippumaton, on suhteellisen aggressiivinen verrattuna androgen-reagoiva LNCaP-solujen suhteen joukkotuhoaseiden leviämisen,

in vivo

kasvun ksenograftimallia, ja solujen vaeltamiseen. Me kyseenalaisti jos ero vaste LNCaP

versus

PC-3 solujen PEITC välittämää muutoksia Notch signalointi komponenttien liittyi androgeeni-riippumaton fenotyyppi. Me käsitellyt tätä kysymystä käyttäen androgeenista riippumaton muunnelma LNCaP (LNCaP-C4-2). Vaste LNCaP-C4-2 solujen PEITC välittämää muutoksia Notch viestintäproteiinit oli yleisesti ottaen samanlainen kuin havaittiin vanhempien LNCaP (Fig. 1 C). Yhdessä nämä havainnot osoittivat, että vaikka PC-3 ja LNCaP differentiaalisesti vastasi PEITC välittämää muutoksia Notch ligandeja ja γ-sekretaasi monimutkainen, lohkaisu Notch1 ja Notch2 proteiinien päälle PEITC altistus oli yhdenmukainen kussakin solulinjassa testattu. Myös siirtyminen LNCaP-solujen androgeenireseptorin itsenäisyyttä (LNCaP-C4-2) ei ole merkittävää vaikutusta PEITC välittämän muutoksia tasojen Notch signalointi komponenttien.

PEITC hoito kasvaa transkriptionaalista aktiivisuutta Notch

epäilivät PEITC -välitteisen pilkkomisen Notch1 ja Notch2 käännetty lisääntynyt transkriptionaalista aktiivisuutta Notch. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, hoito LNCaP ja PC-3-solujen kanssa 5 uM PEITC tilastollisesti merkittävään kasvuun lusiferaasireportterista aktiivisuuden RBP-Jk (alavirran modulaattori Notch signalointi) verrattuna dimetyylisulfoksidin (DMSO) hoidetun valvontaa. Käytimme toinen hyvin tunnettu kastraation kestävä ihmisen eturauhassyövän solulinjaa (DU145) määrittää vaikutuksen PEITC hoidon transkriptionaalista aktiivisuutta Notch. Kuten voidaan nähdä kuviosta. 2A, PEITC hoito lisäsi RBP-Jk lusiferaasireportteri aktiivisuutta DU145 soluissa samoin. Lisäksi PEITC käsiteltyjen DU145 soluista osoittivat samanlaisia ​​kinetiikka Notch1 ja Notch2 pilkkominen (Kuva. 2B) kuten havaittiin PC-3-solulinjassa (kuvio. 1 B).

(A) vaikutus PEITC kohtelu RBP-Jk lusiferaasireportteri aktiivisuutta (mitta transkriptionaalista aktiivisuutta Notch) LNCaP, PC-3, DU145, ja PrEC solut jälkeen 8- tai 16 tunnin hoidon dimetyylisulfoksidin (DMSO) tai 5 uM PEITC. Esitetyt tulokset ovat keskiarvo ± SD (n = 3). * Merkittävästi erilainen (

P

0,05) verrattuna DMSO hoidettuun kontrolliryhmään yksisuuntaisella ANOVA seurasi Dunnettin testi (LNCaP ja PC-3) tai Studentin t-testiä (DU145 ja PrEC). (B) immunoblottaus lohkaistiin Notch1 ja pilkotaan Notch2 käyttämällä lysaatit DU145 ja PrEC soluja käsiteltiin DMSO (kontrolli) tai PEITC (2,5 tai 5 uM) varten osoitetun ajanjaksoja. Blotit stripattiin ja uudelleen koetettiin anti-aktiini-vasta-aine. Nuoli paneeli B (DU145 solut) identifioi lohkaistaan ​​Notch2, alempi kaista on epäspesifinen perustuu siRNA tuloksiin kuvassa. 4A. Immunoblottaus kullekin proteiinia tehtiin ainakin kahdesti käyttäen itsenäisesti valmis lysaatit. Numerot taajuuskaistalta edustavat muutoksia proteiinin tasot suhteessa vastaaviin DMSO hoidettuun kontrolliryhmään. Kukin koe toistettiin ainakin kaksi kertaa.

Seuraavaksi käytimme normaalin ihmisen eturauhasen epiteeli- solulinjan (PrEC) sen määrittämiseksi, onko PEITC aktivaatio Notch1 ja Notch2 oli ainutlaatuinen syöpä eturauhasen soluissa. Tämä oli arvokas tutkimuksen tavoite huomioon ottaen suuria eroja on todettu suhteen vaikutuksesta PEITC välillä syöpä- ja normaalien eturauhasen soluissa. Esimerkiksi, olemme osoittaneet aikaisemmin, että PrEC solulinja on merkittävästi resistenttejä PEITC inhibitiota oksidatiivisen fosforylaation, reaktiivisen hapen tuotannon, ja apoptoosin induktio verrattuna PC-3 ja LNCaP-soluja [11], [17]. Lisäksi PC-3 ja PrEC solut reagoivat differentiaalisesti PEITC-välitteisen ilmentymisen muutosten antioksidanttipuolustuksen geenien [25]. Samanlainen syöpäsolujen (Fig. 1), PEITC hoito johti kohonneeseen pilkkoa Notch1 ja Notch2 in PrEC soluissa varsinkin 16-tunnin kohdalla sekä 2,5 ja 5 uM pitoisuuksilla (Kuva. 2B). Yhdenmukainen tuloksiin, PEITC välittämää kasvu RBP-Jk lusiferaasireportteri aktiivisuutta havaittiin myös PrEC soluissa jälkeen 16 tunnin hoito 5 uM PEITC (Fig. 2A). Näiden tulosten perusteella päättelemme, että PrEC ja syöpä eturauhasen solut (PC-3, LNCaP, LNCaP-C4-2, ja DU145) käyttäytyvät samalla suhteen PEITC aktivaatio Notch.

vaikutus PEITC käsittely ydinvoiman tasoilla pilkkoa Notch2

Koska vaikutus PEITC hoito oli suhteellisen selvempi ja jatkuvaa ja Notch2 pilkkominen verrattuna pilkotun Notch1 etenimme määrittää lohkaista Notch2 tasot DMSO saaneilla ohjaus ja PEITC saaneilla LNCaP ja PC-3-solut. PEITC saaneista LNCaP ja PC-3-solut osoittivat selvän kasvun ydinvoiman tasot pilkkoa Notch2 verrattuna DMSO hoidettuun kontrolliryhmään (Fig. 3A). Nämä tulokset osoittivat, että PEITC hoito johti ydin- rikastuminen pilkkoa Notch2 eturauhassyöpäsoluissa, joka on sopusoinnussa havaittu lisääntyminen transkriptionaalista aktiivisuutta Notch mukaan PEITC hoito (Fig. 2A).

(A) Immunofluoresenssi mikroskooppinen kuvaavan ydin- tasot pilkkoa Notch2 proteiinin LNCaP ja PC-3-solujen jälkeen 8 tunnin hoidon dimetyylisulfoksidin (DMSO) tai 5 uM PEITC 100 x tavoite suurennus. Kvantitointi

Notch1

,

Notch2

,

Jagged1

, ja

Jagged2

mRNA-tasoja reaaliaikaisella RT-PCR (B) LNCaP ja ( C) PC-3-solujen jälkeen 8 tunnin hoidon DMSO (kontrolli) tai PEITC (2,5 tai 5 uM). Esitetyt tulokset ovat keskiarvo ± SD (n = 3). * Merkittävästi erilainen (

P

0,05) verrattuna DMSO hoidettuun kontrolliryhmään yksisuuntaisella ANOVA Dunnettin säätö. Jokainen koe toistettiin ainakin kaksi kertaa.

vaikutus PEITC hoidon

Notch1

,

Notch2

,

Jagged1

, ja

Jagged2

mRNA

tiedot vaikutuksen PEITC hoidon mRNA tasoilla

Notch1

,

Notch2

,

Jagged1

, ja

Jagged2

on esitetty kuviossa. 3B (LNCaP) ja Fig. 3C (PC-3). Expression of

Notch1

(2,5 ja 5 uM PEITC) ja

Jagged1

(5 uM PEITC) mRNA lisääntyi merkittävästi, kun 8 tunnin hoito LNCaP-solujen PEITC (Fig. 3B). Samanlainen PEITC hoito johti tukahduttamiseen

Notch2

(5 uM PEITC) ja

Jagged2

(5 uM PEITC) mRNA-tasot LNCaP-soluissa (kuvio. 3B). Toisaalta, PC-3-soluja käsiteltiin 8 tunnin ajan 5 pM PEITC esillä merkittävää induktion

Notch1

,

Notch2

,

Jagged1

, ja

Jagged2

mRNA ilmaisu verrattuna DMSO hoidettuun kontrolliryhmään (Fig. 3C). Merkittävä induktio

Notch1

,

Jagged1

, ja

Jagged2

mRNA 2,5 uM PEITC hoidon havaittiin myös PC-3-solut (Fig. 3C). Jälleen kerran, nämä tulokset viittasivat siihen solulinja liittyviä eroja PEITC välittämää muutoksia ilmentymisessä

Notch1

,

Notch2

,

Jagged1

, ja

Jagged2

mRNA: sta.

RNA-interferenssiä Notch2 antaa suojan PEITC indusoiman apoptoosin

O’Neill et al [26] ovat osoittaneet, aiemmin, että Notch2 säätelee apoptoosia MDA-MB-231-soluja. Koska PEITC hoito johdonmukaisesti nostivat pilkkoa Notch2 proteiinia kussakin solulinjassa testattu, se oli vain loogista onko Notch2 osaltaan PEITC indusoiman apoptoosin. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, proteiinin tason katkaistun Notch2 pieneni noin 40-60%, kun ohimenevän transfektion LNCaP-ja PC-3-solujen kanssa Notch2 kohdistettujen pieni-häiritsevä RNA (siRNA), verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu kontrollina (epäspesifinen) siRNA. PEITC välittämää kasvu tasojen pilkkoa Notch2 proteiini näkyi selvästi ohjaus siRNA-transfektoiduissa LNCaP ja PC-3-solujen, joka oli lähes täysin kumottu RNA-interferenssi on Notch2 (Fig. 4A). Knockdovvn Notch2 proteiinin yksinään ei ollut mitään merkittävää vaikutusta histoni-liittyvä DNA-fragmentti vapautumisen sytosoliin, joka on hyvin hyväksyttyä menetelmää kvantitoimiseksi apoptoosin, joko solulinja (Fig. 4B). Toisaalta, PEITC-indusoitua apoptoosia oli suhteellisen selvempää LNCaP-ja PC-3-soluja, jotka oli transfektoitu ohjaus siRNA verrattuna transfektoitu Notch2 kohdistetun siRNA (Fig. 4B). Nämä tulokset osoittivat, että Notch2 pudotus siirrettävä suoja PEITC: n indusoiman apoptoosin.

(A) immunoblottaus pilkotaan Notch2 proteiinia käyttäen teissa LNCaP-ja PC-3-soluja transfektoitiin ohimenevästi ohjaus (ei-spesifinen) siRNA tai Notch2 kohdistetut siRNA ja käsiteltiin 24 tuntia dimetyylisulfoksidin (DMSO) tai 5 uM PEITC. Numerot taajuuskaistalta edustavat muutoksia proteiinin tasot vertailuryhmään nähden siRNA-transfektoiduissa soluissa käsitelty DMSO. Nuoli (PC-3) identifioi lohkaistaan ​​Notch2, alempi kaista on epäspesifinen. (B) histoni-associated DNA-fragmentti vapautumisen sytosoliin (mitta apoptoosin) LNCaP-ja PC-3-soluja transfektoitiin ohimenevästi ohjaus siRNA tai Notch2 kohdistettu siRNA ja käsiteltiin 24 tuntia DMSO (kontrolli) tai 5 uM PEITC. Tulokset on esitetty apoptoosin rikastamiseen suhteessa kontrolliin siRNA-transfektoiduissa soluissa, joita käsiteltiin DMSO: lla. (C) immunoblottaus lohkaistaan ​​Notch1 ja pilkotaan Notch2 proteiinit käyttämällä lysaatit LNCaP-ja PC-3-soluja käsiteltiin 8 tunnin ajan tai 24 tunnin DMSO (kontrolli) tai 5 uM PEITC puuttuessa tai läsnä oli 50 uM DAPT. Numerot taajuuskaistalta edustavat muutoksia proteiinin tasot suhteessa vastaaviin DMSO hoidettuun kontrolliryhmään. (D) histoni-liittyvä apoptoottisen DNA-fragmentti vapautumisen sytosoliin LNCaP-ja PC-3-soluja käsiteltiin 24 tuntia DMSO (kontrolli) tai 5 uM PEITC puuttuessa tai läsnä oli 50 uM DAPT. Tulokset on esitetty apoptoosin rikastukseen verrattuna DMSO-käsiteltyihin kontrollieläimiin. Tulokset (paneelit B ja D) ovat keskiarvo ± SD (n = 3). * Merkittävästi erilainen (

P

0,05) eroksi ryhmien yksisuuntaisella ANOVA seurasi Bonferronin monivertailutestillä. Kukin koe toistettiin kahdesti, ja edustavia tietoja yhdestä sellaisesta kokeesta on esitetty.

Suunnittelimme kokeet käyttäen farmakologisia estäjä γ-sekretaasin {N- [N- (3,5-difluorophenacetyl-L alanyyli)] – S-fenyyliglysiini-t-butyyliesteri; jäljessä lyhennettynä DAPT} edelleen testata roolia Notch PEITC aiheuttaman apoptoosin. PEITC-välitteisen kasvu tasojen pilkkoa Notch1 proteiinia, mutta ei lohkaista Notch2, oli merkittävästi tukahdutti yhtäaikainen käsittely 50 uM DAPT (Fig. 4C). Kuten odotettua, DAPT hoito yksinään alentuneesta pilkotun Notch1 ja Notch2 sekä LNCaP-ja PC-3-solut, joskin vaihtelevassa määrin (Fig. 4C). PEITC n indusoiman apoptoosin joko ei muuttunut ollenkaan (PC-3-solut) tai hieman lisääntynyt (LNCaP) samanaikaisella käsittelyllä DAPT (Fig. 4D). Näiden tulosten perusteella päättelemme, että aktivointi Notch2, mutta ei Notch1, edistää PEITC-indusoitua apoptoosia ainakin PC-3-soluja.

RNA-interferenssiä Notch2 täydentää PEITC inhibitiota solumigraation

Koska Notch signalointi on osallisena solujen invaasiota ja epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) [27], [28], suunnittelimme toiminnallisia kokeita määrittämään seuraukset Notch aktivoinnin PEITC kyvystä estää LNCaP ja PC-3 solujen muuttoliikettä. Ohimenevä transfektio Notch2 kohdistettujen siRNA pelkällä tukahduttamiseen LNCaP (Fig. 5A) ja PC-3 (Kuva. 5C) solumigraation verrattuna vastaaviin ohjaus siRNA-transfektoiduissa soluissa määritettynä Boyden kammion määrityksessä. Migraatio ohjaus siRNA-transfektoiduissa LNCaP (Fig. 5B) ja PC-3-solut (Fig. 5D) vähensi myös merkitsevästi käsittelemällä 5 uM PEITC. Lisäksi PEITC estoa LNCaP (Fig. 5B) ja PC-3 (Kuva. 5D) solumigraation merkittävästi täydennetty Knockdown on Notch2 proteiinin.

Kuvat ovat (Boyden kammion määritys) kuvaa kulkeutumista (A) LNCaP ja (C) PC-3-solut transfektoitiin kontrolli (ei-spesifinen) siRNA tai Notch2 kohdistettu siRNA ja käsiteltiin 24 tuntia dimetyylisulfoksidissa (DMSO) tai 5 uM PEITC 200-kertaisella suurennuksella. Kvantitointi siirretty (B) LNCaP-soluja, ja (D) PC-3-solujen kokeista on esitetty paneelien A ja C Kolmesta neljään kentät kukin suodatin pisteytettiin siirretty soluja käännettyä mikroskooppia 200-kertaisella suurennuksella. Esitetyt tulokset ovat keskiarvo ± SD (n = 3). * Merkittävästi erilainen (

P

0,05) eroksi ryhmien yksisuuntaisella ANOVA seurasi Bonferronin monivertailutestillä. Kukin koe toistettiin kahdesti, ja edustavia tietoja yhdestä sellaisesta kokeesta on esitetty.

farmakologinen suppressio Notch1 aktivointi täydentää PEITC inhibitiota solumigraation

DAPT yksin aiheutti vaatimaton väheneminen LNCaP (Fig. 6A) ja PC-3 (Fig. 6C) solumigraation verrattuna vastaaviin DMSO hoidettuun kontrolliryhmään. Samanlainen dataa Notch2 siRNA, yhtäaikainen käsittely DAPT täydennetty PEITC estoa LNCaP (Fig. 6B) ja PC-3 (Fig. 6D) solumigraation. Nämä tulokset osoittivat, että Notch1 ja Notch2 aktivaatio PEITC vaikuttaa negatiivisesti sen kyky estää eturauhassyövän solujen vaeltamiseen.

Kuvat ovat (Boyden kammion määritys) kuvaa kulkeutumista (A) LNCaP ja (C) PC-3-solujen jälkeen 24 tunnin hoito dimetyylisulfoksidiin (DMSO) tai 5 uM PEITC puuttuessa tai läsnä oli 50 uM DAPT 200-kertaisella suurennuksella. Kvantitointi siirretty (B) LNCaP-soluja, ja (D) PC-3-soluissa, sen jälkeen 24 tuntia hoidon DMSO: ssa tai 5 uM PEITC ja /tai 50 uM DAPT. Kolmesta neljään kenttiin kukin suodatin pisteytettiin siirretty soluja käännettyä mikroskooppia. Esitetyt tulokset ovat keskiarvo ± SD (n = 3). * Merkittävästi erilainen (

P

0,05) eroksi ryhmien yksisuuntaisella ANOVA seurasi Bonferronin monivertailutestillä. Jokainen koe toistettiin kahdesti, ja edustavia tietoja yhdestä sellaisesta kokeesta esitetään.

immunohistokemiallinen analyysi vaikutuksen PEITC on pilkkoa Notch2 proteiini

in vivo

käytimme arkistoituja kudosten meidän aikaisemmin suorittanut tutkimuksia [6], [13], [16] määrittää

in vivo

merkitys solujen havaintoja (Fig. 1). Koska vaikutus PEITC hoito oli kaikkein johdonmukainen ja jatkuvaa ja pilkotun Notch2, immunohistokemiallinen analyysi rajoitettiin tätä proteiinia. Edustaja immunohistokemiallista kuvia lohkaistaan ​​Notch2 ilmentymistä PC-3 -tuumoriksenografti osastoja ohjaus ja PEITC-käsitellyissä hiirissä on esitetty kuviossa. 7A. Kanssa ja tulokset on esitetty viljellyissä PC-3-solut (Fig. 3A), ydin- ilmentyminen katkaistun Notch2 oli merkitsevästi korkeampi PC-3-ksenografteissa päässä PEITC-käsitellyistä hiiristä verrattuna kontrolli (Fig. 7A). Samoin ydin- taso pilkkoa Notch2 proteiinin dorsolateral eturauhasen oli merkitsevästi korkeampi PEITC ruokitaan TRAMP hiirissä verrattuna kontrolli (Fig. 7B).

(A) edustaja H suurennus, 400 x). Monistaminen valittu alue näkyy upotetussa. Kvantitointi ydin- ilmentymisen Notch2 proteiinin PC-3 ksenografteissa kontrollista ja fenetyyli isotiosyanaatin (PEITC) saaneilla hiirillä näkyy pylväskaaviona (keskiarvo ± SD, n = 3). (B) immunohistokemia josta esitetään lohkaistaan ​​Notch2 proteiinin ilmentymistä dorsolateral prostates neljästä TRAMP hiiristä osoitetun ryhmien (asteikko bar, 50 mikrometriä; suurennus, 400 x). Monistaminen valittu alue näkyy upotetussa. Kvantitointi ydin- ilmentymisen pilkkoa Notch2 proteiinin dorsolateral prostates valvonta- ja PEITC ruokitaan TRAMP hiirillä näkyy pylväskaaviona (keskiarvo ± SD, n = 4). Tilastollinen merkittävyys määritettiin Studentin t-testiä.

Keskustelu

tarkka rooli Notch signaloinnin eturauhassyövän kehitykseen on vielä epäselvä, mutta tutkimukset ovat yrittäneet ratkaista tämän ongelman käyttämällä eturauhassyövän solulinjoissa ja ihmisen eturauhassyövän koepaloja. Down-regulation of Jagged1 on osoitettu estävän proliferaation eturauhassyöpäsolujen [29]. Sama ryhmä tutkijat raportoitu myöhemmin RNA-interferenssi on Notch1 myönnettyä suojaa eturauhasen syöpäsolun muuttoliike ja invaasiota [30]. Samaan aikaan, yliekspressio konstitutiivisesti aktiivisen Notch1 on myös osoitettu estävän proliferaation LNCaP-solujen [31]. Koska Notch signalointi on varsin monimutkainen, joihin liittyy vuorovaikutus neljä reseptorien (Notch1-Notch4) ja viisi ligandit [Jagged1, Jagged2, Delta kaltaiset ligandit (Dll1, Dll3, ja Dll4)] [23], [24] ja jokainen komponentti Notch signalointi ei ole yleisesti tutkittu [29] – [31], on todennäköistä, että ero johtuu korvaavista muutoksista muut laukaisi knockdovvn Notch1 tai Jagged1. Kuitenkin Jagged1 ilmentyminen eturauhassyövässä koepaloja liittyy lisääntynyt etäpesäke ja toistumisen [32]. Tämä tutkimus paljastaa, että PEITC aktivoi Notch1 ja Notch2 syöpäsoluissa ja normaalissa eturauhasessa soluissa. Lisäksi PEITC hallinto aiheuttaa merkittävän kasvun ydin- tasoilla pilkkoa Notch2

in vivo

eturauhastuumoreissa kahdelta eri jyrsijämallia. Osoitamme myös, että aktivointi Notch1 ja Notch2 vähentää PEITC kyky inhiboida eturauhassyövän solujen vaeltamiseen. Näiden havaintojen perusteella olemme houkutus spekuloida, että antimetastaattisia vaikutus PEITC voidaan vahvistaa yhdistämällä hoito, johon liittyy Notch estäjä.

LNCaP ja PC-3-soluilla hätkähdyttäviä eroja suhteen PEITC välittämää muutokset Notch signalointi osat, erityisesti Notch ligandeja ja γ-sekretaasin komponenttien. Kaksi selvää mahdollisuudet ansaitsevat huomiota selittää näitä eroja PEITC vastauksena välillä androgen reagoiva LNCaP-soluja (villityyppinen p53)

versus

kastraatio kestäviä ja p53-null PC-3-solut. Yksi tällainen mahdollisuus koskee eroa tilan p53 välillä LNCaP-ja PC-3-soluja, kuten Notch1 on osoitettu olevan suora kohde p53 [33]. Palauttaminen p53 ilmentymistä ihmisen syöpäsolulinjoissa on osoitettu ajan säätelemään Notch1 [33]. Koska PC-3 ja DU145-soluja, jotka molemmat puuttuu toimiva p53, käyttäytyvät samalla suhteen PEITC aktivaatio Notch1 ja Notch2, mahdollisuus, että tasauspyörästö vasteen välillä LNCaP ja kastraatio-resistenttien solujen (PC-3 ja DU145) ilmenee, osittain ellei kokonaan, joita p53 ei voida hylätä tällä hetkellä. Samalla olemme tietoisia siitä, että asetus ilmentymisen sekä aktivointi Notch1 on varsin monimutkainen välittävät muut tekijät kuin p53, kuten Nrf2, ETS transkriptiotekijä perheenjäsen PEA3, epidermaalisen kasvutekijän reseptori signalointi, ja Akt mainitakseni muutaman [34] – [37]. Vaikka lisätutkimuksia tarvitaan ratkaista tämän kysymyksen ympäröivä p53, on kohtuullista päätellä, että ero vasteen välillä LNCaP ja PC-3-solujen ei liity androgeenista reagointikykyä koska LNCaP ja sen androgen riippumaton variantti LNCaP-C4-2 näytteille yleensä verrattavissa vastaus PEITC välittämää muutokset Notch signalointi komponenttien. Tässä yhteydessä on tärkeää mainita, että

Notch

kohdistaa HEI (Karvainen /Enhancer of split-liittyvät YRPW motiivi) on androgeenireseptorin selektiivinen co-repressori [38].

Activation ja Notch2 yli-ilmentyminen sen solunsisäisen domeenin edistää apoptoosia MDA-MB-231-soluja [26]. Se oli kiinnostavaa määrittää seuraukset Notch aktivoinnin proapoptoottiset vastauksena PEITC mallissamme. Toisin Notch1 [30], joka on 40-60% knockdovvn Notch2 proteiinia ei ole merkittävää vaikutusta apoptoosin LNCaP tai PC-3-solut. Kuitenkin apoptoosin johtuvat PEITC altistumisesta merkittävästi vaimennettu Notch2 Knockdown ainakin PC-3-solut. Toisaalta, tukahduttaminen Notch1 aktivaation DAPT ei ole vaikutusta proapoptoottiset vastaus PEITC. Näiden tulosten perusteella voimme päätellä, että Notch1 on tarpeeton solukuoleman johtuvat PEITC altistuminen PC-3 ja LNCaP. Mekanismi, jolla Notch2 Knockdown antaa suojan PEITC indusoiman apoptoosin ei ole vielä selvä. Inhibitio useiden anti-apoptoottisia reittejä, kuten NF-KB: n ja STAT3, yhdessä muutoksia ollut Bcl-2-perheen proteiinit ovat osallisena apoptoosin induktion PEITC [10], [11], [17], [19] , [39]. On mahdollista, että Notch2 knockdown sivupersoonat vaikutus PEITC joitakin näistä väyliä antavat suojan apoptoosin.

Etäpesäke on ensisijainen kuolinsyy eturauhassyöpään. Erityisesti Notch on ollut mukana EMT [27], joka edistää etäpesäkkeitä [40]. Lisäksi hoito LNCaP-ja PC-3-solujen γ-sekretaasin estäjä DAPT on osoitettu estävän solun liikkuvuus [41]. Tämä tutkimus paljastaa, että liikkuvuus sekä LNCaP-ja PC-3-solujen vähenee merkittävästi knockdovvn Notch2 proteiinin avulla siRNA (vähentynyt mutta ei merkittävää LNCaP) sekä DAPT estoa Notch1 aktivaation (alennettu, mutta ei merkittävä PC- 3). Lisäksi PEITC estoa LNCaP ja PC-3 solumigraatio on täydennetty knockdovvn Notch2 proteiinin sekä farmakologinen esto Notch1 katkaisun (PC-3 vain). Mekanismi, jolla Notch2 Knockdown estää solujen vaeltamiseen edelleen heikko, mutta tämä asia on tutkittu Notch1 [28]. Kohdennettu ehtyminen Notch1 estää PC-3 ja 22Rυ1 migraatiota by alaspäin säätäminen ilmentymisen matriksimetalloproteinaasi-9 ja urokinaasi plasminogeeniaktivaattori [28]. On mahdollista, että Notch2 pudotus saa aikaan samanlainen vaste on matriksimetalloproteinaasi-9 ja urokinaasi plasminogeenin aktivaattorin.

Yhteenvetona, esillä oleva tutkimus osoittaa, että PEITC hoito edistää lohkaisu Notch1 ja Notch2 johtaa niiden transkription aktivaation molemmissa syöpä ( LNCaP, PC-3, ja DU145) ja normaali (PrEC) eturauhasen soluja. PEITC indusoiman apoptoosin eturauhassyöpäsoluissa on hieman heikennetty knockdovvn Notch2, mutta ei farmakologinen inhibitio Notch1 aktivointi.