Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

tutkia avain säätelygeenit liittyy keuhkosyöpä, jotta vähentää sen esiintyminen ja eteneminen hiljentäminen näiden keskeisten geenien.

Methods

tunnistaa keskeiset sääntely- osallistuvia geenejä keuhkosyöpä, suoritimme yhdistelmä geenijärjestelyillä ja bioinformatiikan analyysejä verrata geenin transkription profiileja 3 monoklonaalinen solukantoja korkea, keskitaso tai matala metastaattinen kykyjä, jotka erotettiin SPC-A-1sci ja SPC-A-1 solulinjat rajoittavan laimennuksen monokloonausta määrityksessä. Sitten analysoimme ne geenien biologinen toiminta lakkauttamalla niiden ilmaisun SPC-A-1sci soluissa käyttäen siRNA ja lenti-virus- shRNA vektorit, jonka jälkeen määrityksiä invaasion ja muuttoliike ominaisuuksia tuloksena solulinjojen in vitro samoin kuin niiden potentiaali indusoimiseksi esiintyminen ja etäpesäkkeiden keuhkosyöpään in vivo. Tutkia kliinistä merkitystä näiden havaintojen olemme analysoineet ekspressiotasot tunnistettujen geenien ihmisen keuhkosyöpä kudoksia (n = 135) ja sovitettu viereisten normaaleissa kudoksissa immunohistokemiallisella (IHC) värjäys.

Tulokset

kolme monoklonaalinen solukantoja ominaista korkea, keskitaso tai matala metastasoitunut kykyjä onnistuneesti valittu. Geenijärjestelyillä ja bioinformatiikan analyysit ymmärtää, että osteo-, LAMB3 ja ITGB1 olivat keskeisiä geenien keuhkosyöpä. Pudotus näistä geeneistä vaimentaa ihmisen keuhkosyövän invaasio ja metastaasi in vitro ja in vivo. Kliininen näyte osoittivat, että osteo-, LAMB3 ja ITGB1 proteiinin ekspressiotasot olivat korkeampia keuhkosyöpäpotilaita, verrattuna ei-syöpä viereisten kudosten ja korreloi imusuonten etäpesäkkeitä.

Johtopäätökset

vahvistaneet osteopontiinin LAMB3 ja ITGB1 pelataan tärkeä rooli esiintymisen ja etäpesäkkeiden keuhkosyöpään, mikä tarjotaan tärkeitä vihjeitä ymmärtäminen molekyyli- mekanismi etäpesäke ja edistää terapeuttiseen hoitoon keuhkosyöpään.

Citation: Wang XM, Li J, Yan MX, Liu L, Jia DS, Geng Q, et al. (2013) Integrative Analyysit Tunnista Osteopontin, LAMB3 ja ITGB1 elintärkeiden Pro-Metastaattinen Geenit Lung Cancer. PLoS ONE 8 (2): e55714. doi: 10,1371 /journal.pone.0055714

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 12 elokuu 2012; Hyväksytty: 29 joulukuu 2012; Julkaistu: 18 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Key Basic Research Program of China (2009CB521803), ja ”toimintaohjelma innovaatio” Shanghai Science and Technology Fund (10140902400). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on edelleen johtava syy syövän kuolema maailmassa (

1 miljoonaa kuolemantapausta vuodessa maailmanlaajuisesti) [1] – [2]. Etäpesäke on merkki ja piirre pahanlaatuisen keuhkosyöpää ja on myös pääsyy keuhkosyöpään liittyvä kuolema ja hoidon epäonnistumisen [3]. Vaikka yli vuosisadan intensiivisen työn on keskittynyt tutkii metastaattinen prosessi, molekyylitason mekanismit, jotka helpottavat etenemistä carcinoma in situ metastasoitunut edelleen suurelta osin hämäräksi. Se on kuitenkin varma, että etäpesäke on dynaaminen ja progressiivinen monivaiheinen prosessi. Useita erillisiä vaiheita ovat havaittavissa biologinen cascade etäpesäkkeiden: tappio soluadheesiota, lisääntynyt liikkuvuus ja invasiivisuus, merkintä ja selviytyminen verenkierrossa, levisi uutta kudosta ja lopulta kolonisaatio kaukainen sivuston [4]. Huomattavia maamerkki tutkimukset ovat todenneet, että vain tietyt alaryhmien primaarikasvain on invasiivinen ja metastaattinen potentiaali käytävä läpi koko metastaattisen prosessin hyökkäystä, intravasation ja ekstravasaatio [5] – [6]. Kehittyvien näistä tutkimuksista oli kaksi käsitettä olennainen meidän syövän sanasto: ”metastaattinen osapopulaatioiden” ja ”metastaattinen tehottomuus” [7]. Siten tutkimus eri geeniekspressioprofiilien välillä metastaattisen osapopulaatioiden ja metastasoituneen tehottomuus geenitekniikan sirutekniikka paljastaa kriittinen osallistuvia geenejä syövän etäpesäkkeiden.

Meidän edellinen työ, loimme erittäin invasiivinen solun alalinja (SPC -A-1sci) ja heikosti invasiivisia solun alilinja (SPC-A-1) in vivo valinta NOD /SCID-hiirissä [8]. Nämä solulinjat tarjotaan sopiva malli tutkittaessa metastaattisen mekanismi keuhkosyöpään. Täällä me edelleen erottaa 2 monoklonaalisia solulinjagenotyypissä päässä SPC-A-1sci solulinja sekä monoklonaalista solu rasitusta SPC-A-1 (emosolulinjassa), joka ominaista korkea, keski tai matala metastaattinen kykyjä vastaavasti rajoittamalla laimennus monokloonausta määritys. Suoritimme sitten geeni-siru yhdistää bioinformatiikan analyysit näiden kolmen kannan.

mukaan geenijärjestelyillä tuloksia, löysimme 2277 säädelty ja 2257 alas geenien joukossa kolme solua kantoja. Bioinformatiikan analyysi paljasti lisätietoja merkittävistä toiminnoista, polkuja, ilmeikäs taipumuksia ja signaali virrat näiden eri geeneistä. Tuloksena kaavio signaalista virtauksen malli osoitti sääntelykysymystä rooleja SPP1 (tai osteo-), LAMB3, MAPK1 ja kesäkuu että etäpesäke SPC-A-1sci solulinjassa.

Aiemmin se on ollut raportoitu, että solut muuttamaan solu- soluadheesiota ominaisuudet, järjestää niiden soluväliaineen (ECM) ympäristö, ja järjestää uudelleen solun tukirankojen maahanmuuton avustamisessa ja invasion.A paljon todisteita ovat osoittaneet, että osteo- helpottanut kiinnitys solujen ECM sitoutumalla useita tyyppisiä integriinien (INTs), parannettu ilmaisua ja MMP-2, ja edistettävä kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden aktivoitumisen kautta eloonjäämisreittejä [9] – [13]. Laminin myös edistänyt soluadheesiota ja muuttoliikkeen vuorovaikutuksessa INTs [14] – [16]. Täällä todentaa, että knock-down osteopontiinin, LAMB3 ja ITGB1 vähensi etäpesäke SPC-A-1sci solulinja läpi sarjan kokeita sekä in vitro että in vivo. Nämä havainnot ovat vahvistaneet, että osteo-, LAMB3, ja ITGB1 pelataan tärkeitä rooleja etäpesäke keuhkosyövän ja tarjota arvokkaita johtolankoja tutkimuksen metastaattisen mekanismin keuhkosyöpään.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka lausunto

Kaikki eläinkoetta protokollat ​​tässä tutkimuksessa käytetyt hyväksyi Shanghai Medical Experimental animal Care komissio Shanghai Jiaotong yliopisto (hyväksyminen ID ShCI-12-023).

Solulinjat

ihmisen keuhkon adeno- karsinoomasolulinja SPC-A-1 saatiin Cellular Institute of Chinese Academy of Science (Shanghai, Kiina). Tämä solulinja eristettiin alun perin kirurgisesta yksilöitä kiinalainen mies kehittynyt keuhkojen adeno- karsinooma Shanghai Rinta Hospital and Cellular Institute of Chinese Academy of Science vuonna 1980 [17]. Ihmisen korkea metastaattisen keuhkosyövän solulinjaa SPC-A-1sci perustettiin Ming Yao (Shanghai Jiaotong yliopisto, Shanghai Cancer Institute) [8]. Molemmat linjat viljeltiin DMEM-alustassa, joka sisälsi 10% (v /v) naudan sikiön seerumia, 37? C: ssa, 5% CO

2.

rajoittavan laimennuksen monokloonausta eristäminen

SPC-A -1sci solut trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen DMEM pitoisuutena 100 solua per 10 ml, josta 0,1 ml lisättiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppaisilla levyillä, jotka jo sisältävät 0,1 ml 10% FBS: ää DMEM. Kaksi viikkoa myöhemmin, kukin kuoppa mikroskoopilla, ja 20 monoklonaalinen kantoja SPC-A-1sci solut valittiin ja kasvatettiin.

Microarray Data Analysis

Kokonais-RNA kustakin solulinjasta oli talteen käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kokonais-RNA lähetettiin Shanghai Biotekniikka Co, Ltd (Shanghai, Kiina). Kokonais-RNA hybridisoitiin päälle Affymetrix U133 plus 2.0 array (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) ja käsitellään Affymetrix teknistä protokollia. Tilastolliset algoritmeja käytettiin analysointiin GeneChip- ekspressiotietojen.

Bioinformatics Analysis

Gene ontologia (GO) analyysi.

GO analyysiä sovellettiin analysoida päätoiminnot differentiaalisesti ilmentyvien geenien mukaan Gene ontologia, keskeiset toiminnalliset luokittelu NCBI. Yleensä Fisherin testiä ja χ

2 testiä käytettiin luokitella GO luokka, ja väärä löytö määrä (FDR) laskettiin korjaamaan

P

-arvo ja pienempi FDR vastaa pienempi virhe arvioitaessa

P

-arvo. FDR määriteltiin, jossa N

κrefers lukumäärään Fisherin testi

P

-arvot alle χ

2 testi

P

-arvot. Me lasketaan

P

-arvot GO luokitukset kunkin differentiaalisesti ilmaisi geenin. Rikastamiseen antaa mitan merkitys toiminto: kun rikastamisen kasvaa, vastaava toiminto on tarkempi, joka auttaa meitä tunnistamaan ne alkuperätakuita kokeiluun konkreettisempia toiminnan kuvaukset. Kussakin merkittävä tyylinen rikastus (Re) antoivat:, jossa n

f

on määrä ero geenien sisällä tiettyyn ryhmään,

n

on kokonaislukumäärä geenit kuuluvat samaan luokkaan,

N

f

on määrä differentiaalisesti ilmentyvien geenien koko microarray, ja

N

on kokonaismäärä geenien microarray [18] – [21].

Go-kartalla.

Go-kartan, vuorovaikutusverkosto merkittävistä alkuperätakuiden differentiaalisesti ilmentyvien geenien, rakennettiin mukaan Gene ontologia luokituksia tunnistaa vuorovaikutuksen merkittävät alkuperätakuiden suoraan ja systeemisesti. Tämä kartta mahdollisesti yhteenveto vuorovaikutuksia differentiaalisesti ilmentyvien geenien sairaustiloissa [22] – [24].

Pathway analyysi.

Vastaavasti reitti analyysiä käytettiin määrittämään merkittävä reitit differentiaalisesti ilmentyvien geenien mukaan Kegg, BioCarta ja Reatome. Jälleen käytimme Fisherin testiä ja χ

2 testiä Valitse merkittävien polkuja, ja kynnys merkitys määriteltiin

P

-arvo ja FDR. Rikastamista laskettiin yhtälön mukaisesti edellä kuvattu [19], [21].

Path-Net.

Path-Net on rakennettu suoraan ja systeemisesti tunnistaa vuorovaikutuksen merkittävien reittejä differentiaalisesti ilmentyvien geenien mukaan vuorovaikutus polkuja on Kegg tietokannasta. Se tarjosi yhteenvedon reitin vuorovaikutuksista differentiaalisesti ilmentyvien geenien sairaustiloissa ja avustaa määritettäessä, miksi tietty polku aktivoitiin [23].

Signal-flow

Ulkoiset solun ärsyke vaikuttaa solujen käyttäytyminen ja heijastuu proteiini-vuorovaikutuksen ja geenin ilmentymisen kinetiikka. Siksi päätellä dynaamista geeniregulatiivista verkko, lasketaan kertaiseksi geenien ilmentymistä ja niiden vuorovaikutusta väyliä. Suhteet Geenin ilmentymisen tietoja päätellä käyttäen jatkuvaa aika toistuva neuroverkon (CTRNN) abstraktina dynaaminen malli geeniregulatiivista verkko välittämisessä solujen päätös siirtää Kyseinen ulkopuolinen ärsyke. Malli kuvaa keskinäinen vaikutus geenien ja niiden ärsyke vaste dynaamisia elementtejä, riippumatta siitä, miten tällaisen vuorovaikutuksen tai stimulaation toteutuu konkreettisesti biologisessa mielessä. CTRNN malli kuvataan yleisesti, missä tarkoittaa aikavakio, merkitsee ulkoinen tulo

tarkoittaa paino-geenin

j

osaksi geeni

i

, tarkoittaa offset-geenin

j

, tarkoittaa sigmoid aktivaatioalueesta, ja merkitsee geenin

i

ilmaisu arvoon

t

aika kohta. Käyttämällä tätä geneettinen algoritmi, arvioimme Malliparametreistä [25].

siRNA Transfektio

siRNA oligonukleotidien seuraavat sekvenssit syntetisoitiin yhtiön (Jima, Shanghai, Kiina): negatiivinen kontrolli siRNA, sense : 5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG Utt-3 ’ja antisense: 5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA Att-3′; osteopontiinin siRNA, sense: 5’-CCA UUC UGA UGA AUC UGA U-3 ’ja antisense: 5′-AUC AGA UUC AUC AGA elokuu G-3′; LAMB3 siRNA, sense: 5’-CCA UUC UGA UGA AUC UGA U-3 ’ja antisense: 5′-AUC AGA UUC AUC AGA elokuu G-3′; ITGB1 siRNA, sense: 5’-CCA UUC UGA UGA AUC UGA U-3 ’ja antisense: 5′-AUC AGA UUC AUC AGA elokuu G-3’. Toimitus siRNA: t saatiin aikaan käyttämällä LipofectAMINE 2000 reagenssia (Invitrogen, Burlington, ON) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 3 x 10

5 solua /kuoppa maljattiin 6-kuoppalevyille, viljeltiin yön yli saavuttaa 50-70% konfluenssiin, sitten pestiin DMEM-ravintoalustalla ilman seerumia ja antibiootteja. LipofectAMINE-2000 reagenssi ja siRNA sekoitettiin ja lisättiin soluihin loppupitoisuuksina 5 ul /kuoppa ja 2,5 ug /kuoppa, vastaavasti, mitä seurasi inkubointi 37 ° C: ssa 48 h.

valmistus Protein uutteet

proteiinit viljellystä SPC-A-1sci solulinjoja, jotka saivat siRNA hoidot kerättiin ja yhdistettiin 10 kuoppien kaksi 6-kuoppaisille levyille. Kaikki proteiiniuutto toimenpiteet suoritettiin jäissä. Lyhyesti, solut huuhdeltiin kylmällä PBS: llä, kaavittu soluraaputtimella, sitten siirrettiin 1,5 ml: n putkille ja lyysattiin 200 ui jääkylmää lyysipuskuria putkea kohti. Sen jälkeen, kun 40-min inkuboinnin jälkeen jäillä homogenaatteja sentrifugoitiin 12000 g: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantit kerättiin sen jälkeen kun centrifugation.All proteiinia uutteet säilytettiin -20 ° C: ssa.

Western blot -analyysi

käyttäminen proteiinin kokonaismäärän eristetty edellä. SDS-PAGE (12%) ajettiin ja sen jälkeen siirrettiin nitroselluloosamembraaneille 4? C. Membraanit blokattiin PBS: llä, joka sisälsi 5% maitoa 2 tuntia, minkä jälkeen lisättiin primaarisen vasta-aineita osteopontiini (1:400), ITGB1 (1:500), LAMB3 (1:500), ja β-aktiini (1: 15000) Ensisijainen vasta-aineita inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa, jonka jälkeen inkuboitiin asianmukaisten HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita huoneen lämpötilassa 1,5 tuntia. Kalvot pestiin sitten PBST: llä (150 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 0,05% Tween-20), ja erityiset proteiinit detektoitiin käyttämällä HRP-järjestelmää.

Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR-analyysi

kokonais-RNA viljellyistä SPC-A-1sci solulinjoja, jotka saivat siRNA hoidot kerättiin käyttämällä Trizol-reagenssia mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Käänteistranskriptio saatiin aikaan käyttämällä käänteinen transkriptio Reagenssit (Takara) ja seuraten valmistajan ohjeita. Reaaliaikainen PCR-analyysi suoritettiin 7300 Real-Time PCR System SDS RQ Study ohjelmisto (Applied Biosystems) mukaan valmistajan ohjeiden. cDNA malleja yhdistettiin SYBR Green esiseos joka sisältää Rox (Takara) suorittaa kvantitatiivinen PCR-reaktioissa. Käytetyt alukkeet kvantitatiivisella PCR: llä olivat seuraavat: osteo- eteenpäin: 5′-GACAGCCAGGACTCCATT-3 ’; osteopontiinin reverse: 5’-GATGTCAGGTCTGCGAAA -3 ’; LAMB3 eteenpäin: 5’-AGGCAAGAACTGTGAGCG-3 ’; LAMB3 reverse: 5’-GGGTTGGCGTAGGTGAGT-3 ’; ITGB1 eteenpäin: 5’-AATGTAACCAACCGTAGC-3 ’; ITGB1 reverse: 5’-CAGGTCCATAAGGTAGTAGA-3 ’; p-aktiini eteenpäin: 5’-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3 ’; p-aktiini käänteinen: 5’-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3 ’. Geenien ilmentyminen normalisoitiin P-aktiini. Kaikki reaktiot suoritettiin kolminkertaisina.

Scratch-haavan paranemiseen määritys

scratch-olisi parantava määritys suoritettiin pienin muutoksin kyseisestä aiemmin kuvattu [26]. Soluja viljeltiin noin 90% konfluenssiin 24-kuoppalevyille sitten nälässä matalan seerumin elatusaineessa (1% FBS DMEM: ssä) yli yön. Suora naarmun yksisolukerros tehtiin käyttämällä 200 ui pipetin kärki simuloida haavan. Solut huuhdeltiin PBS: llä ja viljeltiin 1% FBS: ää DMEM: ssä vielä 24 h. Kolme kuvaa per kaivo kerättiin sitten satunnaisesta kenttien avulla CKX41 mikroskooppia (Olympus, Japani). Prosenttiosuus haavoittunut alue, joka oli täynnä laskettiin seuraavasti: {(keskiarvo haavoittuneen leveys – keskimääräinen jäljellä oleva leveys) /keskiarvo haavoittuneita leveys} x 100 (%).

Muuttoliike ja Invasion Analyysit

solujen migraation ja invaasion analyysit suoritettiin käyttäen 6,5 mm: n laajuisten hyvin kammiota (8 um huokoskoko, Corning) kuten aiemmin on kuvattu, muutamin muutoksin [27]. Solut ympättiin 100000 solua kuoppaa kohti laajuiset hyvin kammiot ja Matrigel päällystetty trans-hyvin kammiot muuttoliikkeen ja invaasion määrityksissä. Kuopat pestiin PBS: llä 24 h molemmissa määrityksissä. Solut, jotka olivat vaeltaneet ja tunkeutuneet sen pohjapinta membraanin kiinnitettiin ja värjättiin H 5-24% sijoitettiin ”1”; 25-49% sai ”2”; 50-74% sai ”3”; ja yli 74% sai ”4”.

Tilastollinen analyysi

Tulokset esitetään keskiarvona ± SD. Vertailut määrällisten analysoitiin Studentin

t-

testi kahden ryhmän välillä (kaksisuuntainen;

P

0,05 katsottiin merkitseväksi). Fisherin tarkkaa testiä käytettiin vertaamaan kvalitatiivisia muuttujia. Analyysit suoritettiin SAS 9.0 for Windows.

Tulokset

eri kantaa SPC-A-1sci Cell Line Display Eri metastasoituneen potentiaalit

Meidän edellinen työ, erittäin metastaattisen keuhkosyövän solulinjaa (nimeltään SPC-A-1sci) perustettiin päässä huonosti metastaattisen ihmisen keuhkosyövän solulinjassa SPC-A-1 kolmen sykliä in vivo valinnassa. Merkittävästi suurempi metastaattisen potentiaalin SPC-A-1sci solulinja suhteessa SPC-A-1 linja on todistettu sarjan kokeita in vivo ja in vitro. Tutkia syitä korkean metastaattisen potentiaalin solulinjan SPC-A-1sci, me edelleen saatu monoklonaalinen solukantoja SPC-A-1sci H ja SPC-A-1sci M SPC-A-1sci soluihin ja monoklonaalinen SPC -A-1L solukantaan päässä SPC-A-1 solulinja rajoittavan laimennuksen klonaalinen määrityksessä, kuten aiemmin on kuvattu, vähäisin muutoksin (kuvio 1A).

(A) morfologiset viisi monoklonaalisen solukantoja valittu SPC-A-1sci ja SPC-A-1-solulinjat rajoittavan laimennuksen määritystä. Emo SPC-A-1sci solujen ja SPC-A-1sci H ja SPC-A-1sci M-solun kannat kaikki näytteille spin muoto. (B) Liikkuvuus toiminta SPC-A1sci, SPC-A1sci H, SPC-A1sci M, SPC-A-1 ja SPC-A1 L-solut määritettiin scratch-haavan paranemista määrityksissä. (C) Invasion määritykset SPC-A-1sci, SPC-A1sci H, SPC-A1sci M, SPC-A-1 ja SPC-A1 L-solut (400-kertainen suurennus). (D) Migration määritykset SPC-A-1sci, SPC-A1sci H, SPC-A1sci M, SPC-A-1 ja SPC-A1L solut (400-kertainen suurennus). Kolme riippumatonta koetta suoritettiin; Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona + SD; * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001.

tutkia metastaattisen potentiaalit SPC-A-1sciH, SPC-A-1sciM ja SPC-A-1L , scratch-haavan paranemista (kuvio 1 B) ja kulkeutuminen ja invaasion analyysit suoritettiin (kuvio 1 C, D). Tulokset osoittivat, että kolme monoklonaalinen solukantoja esitetään selvästi erilainen metastaattinen potentiaali; SPC-A-1sci H oli metastaattinen potentiaali, joka muistuttaa SPC-A-1sci, SPC-A- L oli metastaattinen potentiaali samanlainen SPC-A-1, ja SPC-A-1sciM oli väli- metastaattista potentiaalia.

bioinformatiikka- analyysit monoklonaalisia Cell Kannat High, Lähi ja Low Metastaattinen potentiaalit

Ensimmäinen tunnistimme geenit ilmentyvät differentiaalisesti vähintään kaksinkertaiseksi SPC-A-1sciH, SPC-A-1sciM soluissa verrattuna SPC-A-1L soluissa. Olemme havainneet, että yhteensä 4534 geenit ilmentyvät differentiaalisesti leikkauksena SPC-A-1sciH vs. SPC-A-1L ja SPC-A-1sciM vs. SPC-A-1L. Näistä geeneistä, 2277 geenejä voimistunut, ja 2257 geenejä vaimentua.

täsmällisemmin tunnistaa keskeiset geenit liittyvät keuhkosyöpään etäpesäkkeiden, bioinformatiikan analyysi voidaan hahmottaa toiminnalliset ja reitin eroja SPC-A- 1sciM vs SPC-A-1L ja SPC-A-1sciH vs SPC-A-1L, vastaavasti (kuviot S1, S2). Tulokset esitetään Go-kartan paljasti vuorovaikutukset ja attribuutioista jos merkittäviä toimintoja differentiaalisesti ilmentyvien geenien. Kynnykseen

P

-arvo 0,0001 toiminnalliselta analyysin sääteli ilmentyvät eri geenit, huomasimme, että merkittävät toiminnot liittyvät pääasiassa hemidesmosomi kokoonpano, positiivinen säätely punasolujen erilaistumiseen, rakkula organisaatio, synaptogenesis, mikrotubulusten ja solun tukirangan organisaatioon ja sääntelyä, solusyklin pysähtymiseen ja sääntelyä, soluadheesiota ja endosytoosin, DNA transkriptio, inaktivoitumista MAPK aktiviteetti, aminohapon defosforyloinnilla ja solunsisäisen proteiinin kuljetuksen. Soluproliferaation, erilaistumisen ja apoptoosin vaikutti lisäksi, jonka liitteenä on asiaa immuunivastetta ja tulehdusta toimintoja. Samalla, suurin osa alassäädetty ilmentyvät eri geenien tehtävät olivat soluproliferaatioon lukien: DNA: n replikaatiota ja sääntelyn mitoosin aikana, kara organisaatio, sentrosomimäärän päällekkäisyyttä ja solukierron tarkastuspiste, nukleotidin ja negatiivisen säätelyn epiteelisolujen proliferaatiota samoin vastauksena DNA vaurioita ärsyke läpi DNA: n korjaukseen rekombinaatio, chromatin kokoonpano tai purkaminen, hiilihydraattien, lipidien ja aminohappoa aineenvaihduntaa ja muut.

Valitse polku analyysi ja Path-Net, tulimme siihen tulokseen, että ylös -regulated geenit pääasiassa osallistua MAPK signalointireitillä, Wnt-signalointireitin aktivaatio, JAK-STAT signalointireitin, TGF-beeta-signalointireitin ja soluadheesion. Tunnistetut geenit vaikuttavat myös kyky solun muuttaa solun tukirangan ja napaisuus ja osallistuvat esiintymiseen, muuttoliike ja aineenvaihduntaa kasvaimia. Samaan aikaan alas geenien lähinnä osallistui mismatch korjaus ja homologisen rekombinaation tai liittyivät PPAR, TGF-beeta, ja p53 signalointireittejä, ECM-reseptorin vuorovaikutuksia ja lukuisat metaboliareitteihin (kynnys

P

-arvo 0,001) (kuviot S3, S4).

mukaan merkittäviä polkuja edellä mainitut ja vuorovaikutukset differentiaalisesti ilmentyvien geenien mukana väyliä (mukaan Kegg tietokanta), signaali-flow malli oli rakennettu. Määrällinen sääntelyn verkko, se lasketaan neuroverkon avulla signaalin voimakkuuksia differentiaalisesti ilmentyvien geenien. Määritetään painon ero 2: n geenien ja geenien, että kukin geeni on kytketty, tila SPP1, LAMB3, MAPK1 ja Jun keskeisenä säätävät osoitettiin (kuvio 2). Ilmentymistasojen osteopontiinin, LAMB3, ja ITGB1 mitattiin qRT-PCR: llä, ja tulokset olivat yhtäpitäviä kanssa geeniekspressioprofiilit. Ilmaisu tasot osteopontiinin LAMB3, ja ITGB1 olivat korkeammat SPC-A-1sci H ja SPC-A-1sci M solulinjojen kuin SPC-A-1 L-solulinja (kuvio S5).

Signaalin virtauksen mallin ero geeniekspression liitto. Piste edustaa geeniä ja suunnan viiva suuntaan asetuksen. Numero linjalla on asetuksen paino: mitä suurempi paino, sitä paksumpi viiva ja vahvempi sääntely kyky. Nuoli tavoite muoto viiva aktivoinnin asetuksen tilassa.

SPC-A-1sci transfektoiduissa soluissa siRNA Against Osteopontin, LAMB3, ja ITGB1 Näyttö Low Migration and Invasion In vitro

Tutkitaan roolit osteopontiinin LAMB3 ja ITGB1 että etäpesäkkeiden keuhkosyövän, transfektoimme SPC-A-1sci solujen siRNA-osteopontiiniin, siRNA-LAMB3 tai siRNA-ITGB1 ja suoritetaan muuttoliike ja invaasion määrityksissä. RT-PCR ja Western blot-analyysi osoitti tehokasta knock-down osteopontiinin, LAMB3 ja ITGB1 että SPC-A-1sci soluissa (kuvio 3A, B). SPC-A-1sci solut transfektoitiin joko siRNA-osteopontiiniin, siRNA-LAMB3 tai siRNA-ITGB1 näkyy huomattavasti pienempi maahanmuutto- ja invaasio-ominaisuudet verrattuna emosolulinjassa SPC-A-1 sci (kuvio 3C, D). Seuraavaksi osteopontiini mRNA ja proteiini ekspressiotasot mitattiin SPC-A-1sci joka transfektoitu siRNA vastaan ​​LAMB3 ja ITGB1, tulokset osoittivat knock-alas LAMB3 ja ITGB1 ekspressiotasot ollut vaikutusta OPN proteiinin ilmentymiseen. LAMB3 ja ITGB1 oli samat tulokset (kuviot S6A, B). Määrittää välisiä suhteita osteopontiinin, LAMB3 ja ITGB1, transfektoimme SPC-A-1sci solujen siRNA-osteo- + siRNA-LAMB3, siRNA-osteo- + siRNA-ITGB1, siRNA-ITGB1 + siRNA-LAMB3 ja siRNA-osteopontiinin + siRNA-LAMB3 + siRNA-ITGB1, migraatio ja hyökkäys kyky nämä solut kotransfektoitiin kahden tai useamman siRNA oli merkittävästi vähentynyt verrattuna hyökkäyksen ja muuttoliike kyky solujen kotransfektoitiin yhdessä siRNA ((kuviot S6 C, D, E). tulokset osoittavat laajuisen sääntelyn rooli osteopontiinin LAMB3 ja ITGB1 keuhkosyövässä etäpesäkkeitä.

(A) RT-PCR suoritettiin ja se osoitti tehokasta knock-down ilmaisun välittämien siRNA-osteopontiiniin, siRNA-LAMB3 ja siRNA-ITGB1. (B) Western blot osoitti vähentynyttä ilmentymistä osteopontiinin, LAMB3 ja ITGB1. (C ja D) Muuttoliike ja hyökkäys määritykset SPC-A-1sci, SPC-A1sci /siRNA-osteopontiiniin, SPC-A-1sci /siRNA-LAMB3 ja SPC-A1sci /siRNA-ITGB1 (400-kertainen suurennus). Kolme itsenäistä koetta suoritettiin, tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona + SD; * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001.

Knock-down of Osteopontin, LAMB3, ja ITGB1 In SPC-A-1sci Cells johti Low etäpesäkkeiden mahdollisuus vivo

lisäksi paljastaa, onko osteopontiinin LAMB3 ja ITGB1 osallistuvat etäpesäkkeiden keuhkosyövän in vivo, 4-6-viikkoisen naaras-nude-hiiret randomnly jaettu 4 ryhmään ja saivat häntälaskimoon injektion 2 × 10

6 SPC-A-1sci transfektoitujen solujen shRNA-negatiivinen kontrolli, shRNA-osteopontiinin shRNA-LAMB3 tai shRNA-ITGB1. Kymmenen viikkoa myöhemmin, keuhkot kerättiin immunohistokemiallista analyysia varten (kuvio 4).

edustaja histologisia kuvia hiiren keuhkojen tarkastettava läsnäolo mikroskooppisia leesioita (20 x, ylempi, 400 x, alempi) kymmenen viikon kuluessa takaluukun vein injektiota SPC-A-1sci soluista, jotka ilmentävät stabiilisti shRNAs vastaan ​​negatiivinen kontrolli (shRNA-NC, vasen 1), osteo- (shRNA-osteopontiinissa; vasen 2), Laminin β3 (shRNA-LAMB3, oikea 2), ja integriini β1 ( shRNA-ITGB1, oikea 1).

lasketaan myös hiiret keuhkosyöpää etäpesäkkeitä ja metastaattisen solmut jokaisessa ryhmässä. Kuten esitetään taulukossa 1, muutaman keuhkojen solmukohtien etäpesäkkeitä havaittiin hiiriä, joihin injektoitiin SPC-A-1sci transfektoitujen solujen shRNA-osteopontiinin shRNA-LAMB3 tai shRNA-ITGB1. Sen sijaan, keuhkometastaaseja oli nähtävissä hiirissä, joihin injektoitiin negatiivisen kontrollin soluissa. Siksi on ilmeistä, että osteo-, LAMB3 ja ITGB1 tärkeitä rooleja etäpesäkkeisessä prosessissa keuhkosyövän solulinjaa SPC-A-1sci.

Osteopontin, LAMB3 ja ITGB1 ekspressiotasot keuhkosyöpä liittyvä Advanced Clinical Stage, histologinen Grade, ja imusolmukemääritysmenetelmä metastaasin

vahvistaa vaikutusten osteopontiinin LAMB3 ja ITGB1 ilmaisun keuhkosyöpä, vertasimme niiden ekspressiotasot ihmisen keuhkosyöpä kudoksia (n = 135) ja Hyväksytty viereisten normaalien kudosten immunohistokemiallisella (IHC) värjäys.