Krooninen sairaus

tiivistelmä

Gambogic happoa (GA), tärkein vaikuttava komponentti Gamboge hartsia, on voimakas antituumorivaikutus sekä

in vivo

ja

in vitro

. Kuitenkin taustalla molekyylitason mekanismit ovat edelleen epäselviä. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että GA voisivat käynnistää autophagy kolorektaalisyövässä soluissa, ja inhibitio autophagy kiihtyi vaikutus proliferatiivisen inhibition ja apoptoottisen solukuoleman aiheuttama GA, mikä suojaava rooli autophagy. Kaksiulotteinen elektroforeesi-pohjainen proteomiikan osoitti, että GA hoito muuttunut ilmentyminen useiden proteiinien mukana redox signalointi ja rasva-aineenvaihduntaan. Funktionaaliset tutkimukset paljastivat, että GA aiheuttama dysregulation rasva-aineenvaihdunnan voisi aktivoida 5-lipoksigenaasin (5-LOX), jolloin solunsisäinen ROS kertymistä, jonka jälkeen estämällä Akt-mTOR signalointi ja autophagy aloittamista. Lopuksi, tulokset käyttäen ksenograftimallia ehdotettu ROS-indusoidun autophagy suojaamaan antituumorivaikutusta ja GA. Yhdessä nämä tiedot osoittivat uuden biologisen toiminnan GA vastaan ​​peräsuolen syövän taustalla suojaava rooli ROS aiheuttaman autophagy. Tämä tutkimus antaa arvokasta oivalluksia tulevaa tutkimuksia koskien syövän vastaisen mekanismeja GA.

Citation: Zhang H, Lei Y, Yuan P, Li L, Luo C, Gao R, et al. (2014) ROS-välitteisen Autophagy aiheuttama dysregulaatio lipidiaineenvaihdunnan Toistot suojaava merkitys peräsuolen syövän solut Hoidettu Gambogic Acid. PLoS ONE 9 (5): e96418. doi: 10,1371 /journal.pone.0096418

Editor: Spencer B. Gibson, University of Manitoba, Kanada

vastaanotettu: 25 joulukuu 2013; Hyväksytty 7 huhtikuuta 2014; Julkaistu: 08 toukokuu 2014

Copyright: © 2014 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (Grant numero: 30672480), National High Technology Research ja kehittämisohjelma Kiina (863 Program, No.2012AA020201), National 973 Basic Research Program of China (2013CB911300) ja koulutus Department of Hubein maakunnan tieteen ja teknologian tutkimushankkeet olevien nuorten kykyjen hanke (Q20091207). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi suurin syy syövän ja neljäs syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti [1], [2]. Jos CRC voidaan diagnosoida ja hoitaa varhaisessa vaiheessa, noin puolet CRC potilaista voitaisiin parantaa leikkauksella ja multimodaalinen hoito ennen etäpesäke tapahtuu [3]. Tähän mennessä tehokkaampien hoitomenetelmien kehittäminen kokeneille CRC ovat rajalliset. 40-50% potilaista on metastaattinen sairaus, josta 90% kuolee 5 vuoden sisällä diagnoosista [4], [5]. Huolimatta kasvavista edistysaskeleet molekyylilääketieteen, tehokas varhainen havaitseminen, seuranta ja hoito CRC edelleen ongelma. Siksi parannettu systeeminen terapeuttiset strategiat kiireellisesti tarvitaan tehokkaasti poistaa ensisijainen tai metastaattinen, joille uusien lääkkeiden kehittämiseen voi olla hyötyä.

Gambogic happo (GA; C

38H

44O

8, MW 628,76), joka on polyprenylated ksantoni, on tärkeä vaikuttava aine Gamboge eristetty

Garcinia

[6], [7]. On raportoitu perinteisen kiinalaisen lääketieteen että Gamboge on kylmä, hapan, acerbic ja myrkyllisiä [8]. Kaakkois-Aasiassa, GA on pitkä käyttöhistoria vieroitus, homeostaasiin, tulehdusta ja parasitisidin lääkkeet [7], [9], [10], [11]. Kuluneen puolen vuosisadan, farmakologiset tutkimukset ovat paljastaneet, että GA on vahva antituumoriaktiivisuuksia vastaan ​​erilaisten kasvainten kuten ihmisen leukemia, hepatooma, suun, rinta-, maha-, haima-, eturauhas-, epiteelin kohdunkaulan ja keuhkosyövän [9], [12], [ ,,,0],13]. Viime aikoina GA on myös raportoitu olevan merkittävä kasvainten vastainen vaikutus CRC solujen

in vivo

ja

in vitro

[14], [15]. Laajan kirjon antituumorivaikutus minimaalinen myrkyllisyys normaaleille soluille, GA on hyväksynyt Kiinan Food and Drug Administration hoidettaessa erilaisia ​​syöpiä, ja on valmis vaiheen II kliinisissä kokeissa [7], [16]. Vaikka GA: n kemiallinen rakenne tunnistettiin vuonna 1980 sekä yksityiskohtaiset NMR ja röntgenkristallografiset tutkimuksissa [12], [17], [18], ja useita kasvaimenvastaista mekanismit (mukaan lukien induktio ohjelmoidun solukuoleman, solusyklin säätelyssä, telomeraasi masennus, T-lymfosyyttien aktivointi, angiogeneesin esto, reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) sukupolvi

jne.

) ovat ehdottaneet useat tutkimusryhmät maailmanlaajuisesti [7], [12], [13], [18] , [19], [20], molekyylimekanismeja koskevat sen voimakas syövän vastaista aktiivisuutta epäselviksi ja vaativat lisätutkimuksia.

Autophagy on erittäin konservoitunut catabolic prosessin ominaista kuljetukseen solun komponenttien kaksikerroksisen autophagosomes lysosomeihin varten hajoaminen ja kierrätys vastauksena ravintoaineprofiilin nälkään tai metabolisen stressin [21]. Autophagosome nucleation aloitetaan PI3-kinaasi tyypin III-Atg6 /Beclin 1 kompleksin, kun taas venymä seurataan Atg12-Atg5 ja Atg8 /LC3-fosfatidyylietanoliamiini konjugaatin järjestelmiä, jotka molemmat ovat tärkeitä ominaisuuksia autophagy [21], [22] , [23]. Autophagy voidaan indusoida useita kemoterapeuttisten aineiden, kuten arseenitrioksidi ja oksaliplatiinin [24], [25]: kuitenkin, rooli autophagy syövän on kiistanalainen, [26], [27], [28]. Säännellyllä autophagic vastaus voi varmistaa fysiologista liikevaihdon vahingoittuneiden soluelimiin ja kierrätetään makromolekyylien vastaamaan energiantarpeeseen vastauksena sytotoksisten lääkkeiden, mikä pitkittynyt solujen eloonjäämistä [26], [29]. Sitä vastoin, massiivinen kerääntyminen autophagic ontelot voivat johtaa joko autophagic solukuolemaa (tyypin II ohjelmoitu solukuolema), ja lopullinen yritetään solun hengissä riippuen kasvaimen tyypistä, vaiheessa, geneettinen tausta ja ympäröivän solun ympäristöön [26] , [29], [30].

reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) on kollektiivinen termi, joka kattaa epätäydellinen hapen pelkistyksen, kuten superoksidianionin (O

2

-), vetyperoksidi (H

2O

2) ja hydroksyyliradikaalin (HO •) [31], [32]. Pääasialliset lähteet solujen ROS syntyvät mitokondrion elektroninsiirtoketju (Mito-ETC), NADPH oksidaasin (NOX) kompleksi ja Endoplasmakalvosto [31], [32]. Syöpäsolujen pitkälle kasvaimia käyttäytyvät usein korkea oksidatiivisen stressin, mikä viittaa siihen, että kohonneita ROS tärkeä rooli syövän etenemiseen ja myös synnyttää syöpäsolujen alemman toleranssi ROS [33], [34]. Aktivointi onkogeenien menetys on toimiva p53, poikkeavan aineenvaihdunnan ja kemiallinen käsittely on raportoitu lisäävän ROS syöpäsoluissa [33], [34]. Solunsisäinen redox homeostaasiin on keskeinen tekijä solujen kohtalon: liiallinen tuotanto ROS johtaa yleensä sytotoksisia vaikutuksia ja johtaa apoptoottisen solukuoleman, vaikka kohtuullisesti ROS voi toimia toisen messenger sääntelyyn erilaisten solun prosesseja, kuten solu selviytyminen, leviämisen ja etäpesäkkeiden [35], [36], [37]. Kertyminen ROS on raportoitu yhdistää aloittamisen autophagy ja olla aina mukana tulos autophagy (solujen eloonjääminen tai kuolema) [38], [39]. On yleisesti hyväksyttyä, että ROS voi aiheuttaa autophagy, ja että autophagy puolestaan ​​auttaa puhdistumaan liiallisen ROS suojaamaan soluja hapettumista, joka voi heijastaa tasapainoa joko solujen eloonjääminen tai kuolema [28], [38], [39].

Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että GA voi aiheuttaa kertyminen ROS syöpäsoluissa edistää syövän vastaista aktiivisuutta [40], [41], [42], kun taas autophagy voi estää terapeuttista vaikutusta GA on glioblastoomasolua [43]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että GA voisi edistää apoptoosia ja autophagy peräsuolen syöpäsoluissa

in vitro

ja

in vivo

, ja esto autophagy parannettu herkkyys vastaan ​​GA hoitoa. Lisäksi, kertyminen solunsisäisen ROS johtuvat 5-LOX vaadittiin GA-indusoidun autophagy.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmä ja reagenssit

Ihmisen koolonkarsinoomasolulinja linjat, HCT116 ja SW620 ja jyrsijän koolonkarsinoomasolulinja C26 ostettiin ATCC: ltä. Soluja viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 10

5 U /l penisilliiniä ja 100 mg /l streptomysiiniä, 37 ° C: ssa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2.

seuraavat reagenssit käytettiin tässä tutkimuksessa: Gambogic happoa (Gaia Chemical Corp, G1000), MTT: tä (Sigma, M2128), 3-metyyliadeniini (3-MA) ​​(Sigma, M9281), NAC (Sigma, A9165), Z-VAD -fmk (Sigma, V116), akridiini oranssi (Sigma, A6014), dimetyylisulfoksidi (DMSO) (Sigma, D2650) Apocynin (Sigma, A10809), rotenoni (Sigma, R8875), Nordihydroguaiaretic Acid (NDGA) (Sigma, 74540) , pepstatiini A: ta (Sigma, P4265), E64d (Sigma, E8640). Varastointiin, joka on 10 mM liuosta, jossa oli GA valmistettiin DMSO: ssa, säilytetään -20 ° C: ssa, ja laimennettiin sitten tarpeen kasvatusväliaineeseen.

vastaisia ​​vasta-aineita seuraavia proteiineja käytettiin: katkotun Kaspaasi 3 (Soluviestintä , 9664S), Beclin 1 (Santa Cruz, sc-11427), LC3 (Abcam, ab58610), Atg5 (Abcam, ab78073), Atg7 (Abcam, ab53255), p62 (Abcam, ab91526), ​​5-LOX (Abcam, ab39347 ), aktiini (Santa Cruz, sc-1616), Akt (Soluviestintä, 4685), fosfori-Akt (Soluviestintä, 4051), mTOR (Soluviestintä, 2983), fosfori-mTOR (Soluviestintä, 2971), p70 S6K (Santa Cruz, sc-9027), fosfori-p70 S6K (Santa Cruz, 7984-R), piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua anti-kani sekundääristä vasta-ainetta (Santa Cruz, sc-2004), HRP-konjugoitua anti-hiiri- vasta-ainetta (Santa Cruz, sc-2005).

solunelinkykyisyysmääritys

Solut ympättiin 96-kuoppaisille viljelylevyille ja käsiteltiin 12 h, 24 h ja 36 h vastaavasti. Sen jälkeen solujen elinkelpoisuus arvioitiin käyttäen MTT-määritystä [44]. Absorbanssi mitattiin 490 nm: ssä (testi aallonpituus) ja 570 nm (viite aallonpituus), jossa usean hyvin spektrofotometrillä (MDC, Sunnyvale, CA).

anneksiini V-FITC /PI Kaksoisleimattuja Virtaussytometria

havaitsemiseksi apoptoottisten suhde käsiteltyjen solujen GA (0,25, 0,5 tai 1,0 uM), ilmaus anneksiini V-FITC ja syrjäytymisen PI todettiin käyttäen kaksivärinen virtaussytometria (FCM). HCT116 tai SW620-solut otettiin talteen käyttämällä EP: n putkiin, pestiin kahdesti PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen 500 ui sitomispuskuria. Näytteitä inkuboitiin 5 ui anneksiini V-FITC: llä 10 minuuttia huoneenlämpötilassa ja sen jälkeen 5 ui PI lisättiin. Kukin näyte inkuboidaan vielä 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä ennen fluoresenssin intensiteetti kvantifioitiin käyttäen virtaussytometriä (Beckman Coulter, Miami, FL, USA).

GFP-LC3 Värjäys Autophagosomes

HCT116 ja SW620-soluja transfektoitiin pEGFP-LC3 plasmidin (jota kutsutaan GFP-LC3) lipofektamiinin avulla 2000 (Invitrogen, 11668027) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Fluoresenssi GFP-LC3 katseltiin ja prosentuaaliset GFP-LC3-leimattua vacuole muodostuminen (autophagosomes) laskettiin fluoresenssimikroskoopilla [45], [46]. Solut, joissa GFP-LC3 pistemäinen pisteitä määriteltiin positiivinen, jos solut, jotka oli 5 tai enemmän GFP-LC3 pisteitä sytoplasmassa [47].

Detection of Happamia vesikulääristä soluelimiin

Solut (1 x 10

5) maljattiin 6-kuoppaisille levyille. Seuraavat lääkehoitoa, solut värjättiin 1 ug /ml akridiinioranssia 15 min, pestiin PBS: llä ja tutkittiin fluoresenssimikroskoopilla [48], [49].

Electron Microscopy

Soluja talteen, pelletoitiin ja kiinnitettiin paraformaldehydillä (0,1% glutaraldehydiä 0,1 M natriumkakodylaattia) 2 h, jälkikiinnitettiin 1% OsO

4 1,5 h, pestiin ja lopuksi värjättiin 1 tunnin ajan 3%: ista uranyyliasetaatilla. Sitten näytteet huuhdottiin jälleen vedellä, kuivattu jossa lajitellut alkoholia (50%, 75% ja 95-100% alkoholia) ja upotettiin Epon-Araldite-hartsia (Canemco, 034). Ultrathin leikattiin Reichert ultramikrotomilla, vastavärjättiin 0,3% lyijyä sitraattia ja tarkastellaan Philips em 420 transmissioelektronimikroskoopin. Solut, joissa autophagic vacuoles määriteltiin positiivinen, jos heillä oli 5 tai enemmän autophagic vacuoles. Valtaama alue autophagic vacuoles ja sytoplasmaan määritettiin Image Pro Plus Image Analysis Software version 3 ja käytetään laskettaessa sytoplasmisen alueen viemä autophagic onteloita [50].

TUNEL Pitoisuus

TUNEL-määritys suoritettiin käyttäen DeadEnd Fluorometric TUNEL-järjestelmä (Promega, G3250), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. TUNEL-positiivisia soluja tutkittiin fluoresenssimikroskoopilla [51].

RNA Interference

Atg5

,

Beclin 1, 5-LOX

ja negatiivisen kontrollin siRNA syntetisoitiin Genepharma. Sekvenssit siRNA olivat seuraavat: ihmisen

Atg5

siRNA, sense-5′-GAC GUU GGU.ta AAC UGA CAA ATT-3 ’ja antisense 5′-UUU GUC AGU UAC CAA CGU CTT-3’; ihmisen

Beclin 1

siRNA, aistia 5′-GGA GCC AUU UAU UGA AAC UTT-3 ’ja antisense 5′-AGU UUC AAU AAA UGG CUC CTT-3’. 5-LOX on suunniteltu mukaan edellisessä tutkimuksessa (kohdentavan sekvenssin: 5′-GCGCAAGTACTGGCTGAATGA-3 ’; NM_000698) [52]. SiRNA transfektoitiin Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen, 11668027) 24 h HCT116-soluissa mukaan valmistajan protokollan.

reaktiivisen hapen (ROS) Mittaus

Solunsisäinen ROS taso detektoitiin värjäämällä solut 2 ’, 7’-dikloorifluoresiinidiasetaattia (DCFH-DA) (GENMED, GMS10016.2) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. DCFH-DA-signaali mitattiin Molecular Devices SpectraMax M5 fluorimetriä (490 nm: n virityksellä ja 530 nm emissio).

Immunoblotvärjäys

Proteiinit uutettiin RIPA-puskuriin (50 mM Tris-base, 1,0 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 1% Natriumdeoksikolaatti, 1 mM PMSF) ja kvantifioidaan DC-proteiinin iinianalyysikitissä (Bio-Rad). Näytteet erotettiin 12% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-membraaneille. Membraanit blokattiin yön yli Tris-puskuroitu suolaliuos, jossa Tween 20 (TBST) (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) 5% rasvatonta maitoa 4 ° C: ssa, ja sen jälkeen tutkittiin käyttäen ensisijaisena vasta-aineita: kaniini-anti-Beclin 1 (laimennettu 1:500), kanin anti-Atg5 (laimennettu 1:1,000), kanin anti-atg7 (laimennettu 1:500), kanin anti-LC3 (laimennettu 1:1,000), kani -anti-5-LOX (laimennettu 1:1,000), kanin anti-Akt (laimennettu 1:1,000), kanin anti-fosfo-Akt (laimennettu 1:1,000), kanin anti-mTOR (laimennettu 1:1,000) , kaniini-anti-fosfo-mTOR (laimennettu 1:1,000). Blotteja inkuboitiin vastaavien primaaristen vasta-aineiden 2 h huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen kun oli pesty kolme kertaa TBST: ssä, blotteja inkuboitiin HRP-konjugoitua anti-kani sekundääristä vasta-ainetta (laimennettu 1:5,000) tai HRP-konjugoidulla anti-hiiri-vasta-ainetta (laimennettu 1:6,000) 1 h huoneen lämpötilassa. Blotit visualisoitiin käyttäen Immobilon Länsi kemiluminesenssin reagenssit (Millipore, WBKLS0500).

mittana autophagic vuon, immunoblot ja LC3 suoritettiin puuttuessa tai läsnä lysosomaalisen entsyymin estäjiä. LC3 vuon määritettiin suhde densitometrinen arvo LC3-II suhteessa vastaavaan DMSO-käsitelty kontrolli ilman lääkehoitoa, kuten on kuvattu muualla [23], [53].

2-DE ja MS /MS-analyysi

2-DE ja MS /MS-analyysi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [54]. Lyhyesti, solut liuotetaan lyysipuskuria (7 M urea, 2 M tioureaa, 4% CHAPS, 100 mM DTT: tä, 0,2% pH 3-10 amfolyyttiä, Bio-Rad, USA) läsnä ollessa proteaasi-inhibiittorin (Sigma). Näytteet ladattiin IPG nauhat (17 cm, pH3-10NL, Bio-Rad) käyttäen passiivisia nesteytys menetelmällä ja altistetaan sitten isoelektristä fokusointia (Bio-Rad). Toinen ulottuvuus erotus suoritettiin käyttämällä 12% SDS-PAGE tasapainotuksen jälkeen. Geelit värjättiin CBB R-250 (Bio-Rad). Tunnistaminen ja kvantitointi proteiinin paikkoja geeli saavuttaa käyttämällä PDQuest ohjelmisto (Bio-Rad).

-geeli-proteiinin digestio suoritettiin käyttäen massaspektrometriaa luokka trypsiinin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Geeli Pilkut väri poistettiin 100 mM NH

4HCO

3/50% asetonitriiliä (ACN) ja kuivattu 100% ACN. Sitten geelejä inkuboitiin trypsiinin kanssa (Promega, V5280), jonka jälkeen kaksinkertainen uuttaminen 50% ACN /5% trifluorietikkahappoa (TFA). Peptidi uutteet kuivattiin speed-VAC keskitin (Thermo), ja alistettiin massaspektrometrianalyysissä käyttäen Q-TOF massaspektrometrillä (Micromass, Manchester, UK) varustettu ESI lähde.

Immunohistokemia

Immunohistokemia suoritettiin käyttäen Dako EnVision System (Dako Cytomation GmbH, Hampuri, Saksa). Peräkkäiset parafiini-sulautettujen kudosleikkeiden (3-5 um) poistettiin vaha ja nesteytyksestä. Antigeeni haku suoritettiin esikäsittely liukuu sitraattipuskurissa (pH 6,0), mikroaaltouunissa 12 minuutin ajan. Tämän jälkeen objektilasit jäähdytettiin huoneenlämpötilaan deionisoituun veteen. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus pysäytettiin inkuboimalla liukuu metanolia, joka sisälsi 3% vetyperoksidia, minkä jälkeen pestiin PBS: ssä 5 min, minkä jälkeen leikkeitä inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa normaalia vuohen seerumia ja sen jälkeen inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli ensisijainen vasta-aineita. Seuraavaksi leikkeet huuhdeltiin pesupuskurilla (PBS, jossa oli 0,1% naudan seerumin albumiinia) ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasiin liitetty vuohen anti-kani-vasta-aineita, mitä seuraa reaktio diaminobentsidiinillä ja counterstaining Mayerin hematoksyliinillä.

ksenograftimallissa

Kokeelliset protokollat ​​tehtiin noudattaen Euroopan yhteisöjen neuvoston direktiivi 24 päivänä marraskuuta 1986 (86/609 /ETY) suostumuksella eettisen komitean Tongji Medical College. Terveille hiiret (BALB /c, 6-8 viikkoa ikäisiä, ei-hedelmällinen ja 18-20 g kukin) injektoitiin subkutaanisesti C26-soluja (miljoona solua per hiiri). Kun kasvaimet olivat noin 5 mm x 5 mm: n koon (tavallisesti kymmenen päivän kuluttua siirrostuksen), eläimet jaettiin satunnaisesti Pair-täsmäsi kahteen ryhmään (yhdeksän hiirtä ryhmää kohti) seuraavasti: kontrolliryhmä (intraperitoneaalinen injektio Ajoneuvon: 5% DMSO , 50% PEG-400 PBS: ssä) ja gambogic happoryhmää (vatsaonteloon 8 mg /kg gambogic happoa kerran joka toinen päivä kuusi kertaa). Kasvain volyymit arvioitiin seuraavasti: kasvaimen tilavuus (mm

3) = (pituus x leveys

2) /2. Eläimet lopetettiin 12 päivää injektion jälkeen. Kasvaimet leikeltiin ja jäädytettiin nestetypessä tai kiinnitetty formaliiniin välittömästi.

tehokkuuden testaamiseksi combinative hoitojen, jolloin kasvaimet olivat noin 600 mm

3, eläimet otettiin pareittain neljään ryhmään (8 hiirtä per ryhmä): vertailuryhmä, GA, GA + NAC, ja GA + 3-MA. Kontrolliryhmä: vatsaonteloon Ajoneuvon: 5% DMSO, 50% PEG-400 PBS: ssä. GA hoito: vatsaonteloon 8 mg /kg gambogic happoa kerran joka toinen päivä kymmenen kertaa. NAC käsittely: Eläimet saivat joko ionivaihdettua vettä tai vettä, joka sisältää NAC (7 mg /ml; neutraloidaan pH-arvoon 7,4 NaOH: lla); Oletimme keskimääräinen hiiren painoa 25 g ja päivittäinen veden kulutusta 6,7 ​​ml, arvioitu päivittäinen äidin annos oli 1,9 g /kg /vrk [55]. 3-MA hoito: ihonalaiset suolaliuosta (kontrolli) tai 1 mg /kg 3-MA, ja injektio toistettiin joka päivä [56]. Kasvain volyymit arvioitiin seuraavasti: kasvaimen tilavuus (mm

3) = (pituus x leveys

2) /2.

Statistical Data Analysis

vertailut kahden ryhmän välillä olivat suoritettiin Studentin testiä. Tilastollinen merkittävyys määritettiin

* p 0,05;

** p 0,01;

*** p 0,001.

Tulokset

GA indusoi apoptoosia peräsuolen syövän solut

vaikutuksen määrittämiseksi GA peräsuolen syövän soluja, HCT116 ja SW620-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla GA 12 h, 24 h tai 36 h. MTT-määritystä käytettiin määrittämään solujen elinkelpoisuuden. Kuten kuviossa 1A, hoito GA johti proliferatiivisen esto HCT116-solujen sekä annoksesta ja aikaa riippuvaisella tavalla IC

50-arvot noin 1,1 uM, 0,6 uM ja 0,5 uM 12 tuntia, 24 tuntia ja 36 h, vastaavasti. SW620 solut osoittivat vain annosriippuvaista inhibition kanssa IC

50 arvoon noin 2 uM. Lisäksi vaikutus GA kolorektaalisyövän solukuolema tutkittiin käyttämällä anneksiini-V: fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) ja propidiumjodidilla (PI) kaksinkertainen värjäys sekä TUNEL määrityksissä. Kuten kuviossa 1B on esitetty, osuus anneksiini-V-positiivisten solujen, mikä osoittaa kuolleiden solujen, oli merkittävästi lisääntynyt hoidon jälkeen GA. Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​niiden kanssa, joka on saatu TUNEL-määritys (kuvio 1C). Seuraavaksi tutkittiin, GA-solukuolema oli kaspaasiriippuvaisen. Kuten kuviossa 1D, pilkottiin kaspaasi 3 kertyi, kun GA hoitoon. Lisäksi GA solukuolema voitaisiin merkittävästi kumota yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä, Z-VAD-fmk (kuva S1), mikä viittaa siihen, että GA indusoi kaspaasiriippuvaisen apoptoottista solukuolemaa.

(A) HCT116 ja SW620-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla GA 12 h, 24 h tai 36 h, ja solujen elinkyky indeksi mitattiin MTT-määrityksellä. (B) HCT116 ja SW620-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla GA: ssa 24 tuntia, solun apoptoosi havaittiin anneksiini-V fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) ja propidiumjodidilla (PI) kahden värjäyksessä, mitä seurasi virtaussytometria-analyysi. Pistekuvaajan näyttö anneksiini-V FITC-fluoresenssia versus propidiumjodidista fluoresenssi esitetään logaritmisella asteikolla. Eläviä soluja olivat kielteisiä sekä anneksiini V-FITC ja PI. Populaatiot testaus anneksiini V positiivinen /PI-negatiivinen luokiteltiin alkuvaiheen apoptoottisia soluja, ja double-positiivisia soluja luokiteltiin kuolleita soluja. Bar kaavio, jossa prosenttiosuus kuolleita soluja eri käsittelyjen jälkeen. (C) HCT116 ja SW620-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla GA: ssa 24 tuntia, kuolleet solut havaittiin TUNEL-määrityksellä. TUNEL-positiiviset solut laskettiin vähintään 100 satunnaisesti kenttiä. (D) Immunoblot-analyysi pilkottiin kaspaasi 3 lysaateista HCT116 ja SW620-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla GA: ssa 24 tuntia, tai niitä käsiteltiin 1 uM GA: ssa 12 h ja 24 h.

GA aloittaa Autophagy kolorektaalisyövässä solut

Ymmärtääksemme paremmin syövän vaikutusta GA, The äärirakenteessa HCT116-soluja käsiteltiin GA tai DMSO ( 0,1%) analysoitiin läpäisevällä elektronimikroskoopilla (TEM). Lukuisat kalvoon sitoutuneen vacuoles ominainen autophagosomes, havaittiin sytoplasmassa GA-käsiteltyjä soluja, kun taas kalvoon sitoutuneen onteloita voi harvoin löytyy solut käsiteltiin DMSO: ssa (kuvio 2A). Lisäksi akridiinioranssivärjäyksellä käytettiin analysoimaan muodostuminen happamien vesicular soluelimiin (Avós), toinen merkittävä piirre autophagy. Kuten on esitetty kuviossa 2B, HCT116-solut käsiteltiin GA johti selvää muodostumiseen kelta-oranssi Avós verrattuna DMSO-käsiteltyihin soluihin.

(A) ylempi paneeli. Edustavien lähetyksen nimikroskooppikuvia kuvaa ultrastructures ja HCT116-soluja käsiteltiin joko DMSO (kontrolli, 0,1%) tai 1 uM GA 24 tuntia. Alempi paneeli. Solujen autophagic vacuoles määriteltiin solut, jotka oli viisi tai enemmän autophagic vacuoles. Prosenttiosuus solujen autophagosomes ja keskimäärin vakuolit solua kohti analysoitiin vähintään 100 satunnaisesti valitun TEM kentät. Mittaviivat: 1 pm; 100 nm (merkitty laajentumisten). (B) akridiinioranssivärjäyksellä in HCT116-soluissa käsiteltiin DMSO (kontrolli, 0,1%), 0,5 uM GA tai 1,0 uM GA: ssa 12 h. Kaikki tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. ** P 0,01.

lokalisointi ja yhdistämistä LC3 tiedetään olevan tärkeitä liikenteen ja kypsymistä autophagosome [57]. Näin ollen, pEGFP-LC3 plasmidi transfektoitiin lyhytaikaisesti sekä HCT116 ja SW620-solut edelleen vahvistaa, onko GA aloittaa autophagy peräsuolen syövän soluissa. Kuten kuviossa 3A, prosenttiosuus GFP-LC3-positiivisten solujen ja keskimääräinen määrä GFP-LC3 pisteitä olivat molemmat merkittävästi kasvanut, kun GA hoitoa annoksesta riippuvalla tavalla. Lipidoitunut muoto LC3 muuttumassa LC3-I LC3-II korreloi laajuus autophagosome muodostumisen [57]. GA myös tehosti merkittävästi liikevaihtoa LC3-I LC3-II, joka edelleen kertynyt läsnä E64d ja pepstatiini A: ta (sekä lysosomaalisen proteaasin estäjät) (kuvio 3B), mikä viittaa siihen, että GA voitaisiin lisätä autophagic vuon. Lisäksi LC3, ilmaisut sarjan autophagic liittyvien proteiinien, mukaan lukien p62, Beclin 1, Atg7 ja Atg12-Atg5, on osoitettu muuttaa aikana autophagy [23]. Siksi tutkimme näiden proteiinien ilmentymisen, kun GA hoitoon. Kuten kuviossa 3C on esitetty, GA upregulated ilmentymistä Beclin 1, Atg7 ja Atg12-Atg5 annoksesta riippuvalla tavalla, kun taas kerääntyminen p62 laski. Nämä tulokset osoittivat edelleen, että GA voi indusoida autophagosomes peräsuolen syövän soluissa.

(A) HCT116 ja SW620-soluja, jotka on transfektoitu pEGFP-LC3 plasmidi käsiteltiin osoitetulla pitoisuuksilla GA 24 tuntia. Solut määriteltiin positiivinen, jos heillä oli 5 tai enemmän GFP-LC3 pisteitä sytoplasmassa. Prosenttiosuus solujen GFP-LC3 pisteitä ja keskimääräinen lukumäärä GFP-LC3 pisteitä solua kohden analysoitiin vähintään 100 satunnaisesti kenttiä. (B) immunoblot-analyysi konversio LC3-I LC3-II HCT116-solut ja SW620-soluissa sen jälkeen, kun käsiteltiin osoitetulla pitoisuuksilla GA 24 tuntia, tai 1,0 uM GA: ssa 12 h ja 24 h puuttuessa tai läsnä lysosomaalisten estäjien (E64d ja pepstatiinia kutakin 10 ug /ml). (C) immunoblot-analyysi ilmentymistason Atg12-Atg5 konjugaatin, Atg7, Beclin 1 ja p62 jälkeen käsiteltiin osoitetulla pitoisuuksilla GA 24 tuntia, tai 1 uM GA: ssa 12 h ja 24 h. Aktiini toimi latauskontrollina. * P 0,05; ** P 0,01.

estyminen Autophagy Parantaa GA aiheuttama apoptoosi

Kun otetaan huomioon paradoksaalinen rooli autophagy edistämisessä solukuoleman tai eloonjääminen, me käsiteltiin edelleen peräsuolen syövän solut yleisesti käytetty autophagy estäjä (3-MA) ​​joko yksinään tai yhdessä GA määrittää toiminnallista roolia autophagy GA: n indusoiman apoptoosin. Kuten on esitetty kuviossa 4A, esikäsittely HCT116-solujen 3-MA merkittävästi parannettu vaikutus GA-indusoitu tukahduttaminen. Tämän mukaisesti, tulokset anneksiini V /PI kaksinkertainen värjäyksen (kuvio 4B) ja TUNEL määritykset (kuvio 4C) osoittivat myös, että GA yhdistettynä 3-MA osoitti vahvempi proapoptoottinen vaikutus verrattuna GA yksin. Lisäksi, lyhytaikaisella transfektiolla, jossa Atg5- tai beclin1 kohdistettu siRNA ablaation Atg5 tai beclin 1 ilmentyminen voi estää GA-indusoitua LC3-II kertymistä, sekä lisätä anti-proliferatiivisia ja pro-apoptoottinen vaikutus GA HCT116-soluissa (kuvio 4D-G). Nämä tiedot viittaavat siihen, että autophagy suojaa GA-käsitelty peräsuolen syövän solut apoptoottista solukuolemaa.

(A-C) HCT116-soluja käsiteltiin ajoneuvon ohjaus (1 ‰ DMSO, Control), 3-MA, 1 uM GA (GA), tai 1 uM GA läsnä 3-MA (GA + 3-MA) ​​24 tuntia. Ja sitten solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT-määrityksellä (A), ja apoptoottisen vaikutuksen havaittiin PI /anneksiini-V-värjäyksellä (B) ja TUNEL-määritykset (C). (D) Immunoblot havaitseminen ilmentymisen ATG5, beclin-1 ja LC3 on HCT116-soluissa käsitelty GA läsnä tai poissa kanssa siATG5 tai siBeclin 1. (E-G) HCT116-soluja käsiteltiin Lipofectamine 2000 (Control), ohjaus siRNA (siControl), siATG5 (siATG5), 1 uM GA (GA), GA läsnä ohjaus siRNA (GA + siControl), siATG5 (GA + siATG5) tai siBeclin1 (GA + siBeclin 1) 24 tuntia. Ja sitten solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT-määrityksellä (E), ja apoptoottisen vaikutuksen havaittiin PI /anneksiini-V-värjäyksellä (F) ja TUNEL-määritykset (G). * P 0,05; ** P 0,01.

Redox säätelyhäiriön aiheutettiin kun GA Treatment

tutkia mekanismia, jolla GA indusoi autophagy, me profiloitu ilmennetty eri proteiineja HCT116 käsitellyissä soluissa tai ilman GA. Vertaamalla 2-DE kuvioita, ilmentyvät eri proteiinit määriteltiin tilastollisesti mielekäs (p 0,05), jos molemmat seuraavista kriteereistä täyttyvät: 1) intensiteetti korjauksilla 2,0-kertaisesti ja 2) havaittiin vähintään kolme yksittäistä kokeita. 25 paikkoja, jotka täyttivät nämä kriteerit valittiin ja analysoitiin ESI-Q-TOF tandemmassaspektrometrian, ja yhteensä 27 proteiinien tunnistettiin (Fig. 5A, taulukko I). MS /MS-tiedot tiedusteltiin käyttämällä hakualgoritmi MASCOT vastaan ​​Expasy proteiinisekvenssitietokannassa. Proteiinit tunnistettiin perustuu useisiin kriteereihin, mukaan lukien pl, MW, peptidi tunnistaminen ja kattavuus (taulukko I). Näistä 13 proteiinit alassäädetty taas 14 proteiinit sääteli post GA hoitoon (Kuva. 5D). Tunnistetut proteiinit jaettiin eri ryhmiin niiden solunosasijainti ja biologisia toimintoja (Fig. 5B ja 5C). Proteiinit havaittiin sijaitsee sytoplasmassa (59%), nucleus (4%), mitokondrioissa (15%), solukalvon (11%), tai solulimakalvoston (11%). Tämä sekaantunut rooleja leviämisen ja Apopotosis (37%), Redox asetuksen (22%), rasva-aineenvaihdunta (15%), sokeriaineenvaihdunnassa (15%), translaatiotutkimus Protein muutos (4%), ja Molecular Chaperone (7%). Sen jälkeen leviämisen ja Apopotosis, seuraavaksi eniten muuttunut proteiinit olivat mukana redox asetuksessa upon GA hoito, mikä viittaa ROS voi osallistua GA aiheuttama autophagy.

(A) edustaja kaksiulotteinen geeli kuvia ohjaus- ja GA saaneilla (1 uM, 24 h) HCT116-soluissa. Kokonaisproteiinia uutteet erotettiin, pH 3-10 epälineaarinen immobilisoitu pH-gradientti liuskojen ensimmäisessä ulottuvuudessa ja sen jälkeen 12% SDS-PAGE toisessa ulottuvuudessa ja visualisoitiin CBB-värjäys. (B) Todettu proteiinit luokitellaan ryhmiin niiden subsellulaariseen paikkoihin. (C) 27 erilliset proteiinit luokiteltiin 6 ryhmään niiden biologisia toimintoja. (D) Protein klusterin kartta tuottaman klusteriohjelmiston. Expression proteiinien kontrolli oli vakio 0, kun taas proteiinit yläreguloituja GA-käsitellyissä soluissa ovat punaisia, ja vaimentua proteiinit ovat vihreitä. Intensiteetti väri vihreä tai punainen vastaa aste muutos vastaavasti mukaan väri kaistale alareunassa luku.

ROS tarvitaan GA aiheuttama Autophagy <