Krooninen sairaus

tiivistelmä

Johdanto

Lisääntyvä näyttö on osoittanut, että immuunivalvonnan vaarantuu kasvain edistäviä mikroympäristölle potilaille, joilla ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), ja voidaan palauttaa tarkoituksenmukaista kemoterapiaa.

Methods

Voit testata tätä hypoteesia, analysoimme mikrosiru geeniekspressioprofiilien perifeerisen veren mononukleaaristen solujen 30, joilla on vasta diagnosoitu pitkälle NSCLC, ja 20 ikä- ja sukupuolihormoneja ja oheissairaudet-terveisiin. Kaikki potilaat saivat mediaani neljä kurssia kemoterapiaa sisplatiinin ja gemsitabiinin 28 vuorokauden jakson ensimmäisen vaiheen hoidossa.

Tulokset

kuusikymmentäyhdeksän ilmentyvät eri geenien välillä potilaiden ja verrokkien , ja 59 differentiaalisesti ilmentyvien geenien ennen ja jälkeen kemoterapiaa tunnistettiin.

IL4

koulutusjakso on merkittävästi rikastettu sekä kasvaimen etenemiseen ja kemoterapia allekirjoitukset.

CXCR4

ja

IL2RG

olivat alassäädetty, kun taas

DOK2

ja

S100A15

oli säädelty potilailla, ja ilmaisujen kaikkien neljän geenien osittain tai kokonaan päinvastaiseksi kemoterapian jälkeen. Reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR neljän säädelty (

S100A15, DOK2

) ja alassäädetty (

TLR7, TOP1MT

) geenien potilailla, ja kuusi sääteli (

TLR7, CRISP3, TOP1MT

) ja alassäädetty (

S100A15, DOK2, IL2RG

) geenit kemoterapian jälkeen vahvistanut, mikrosirun tuloksia. Edelleen immunohistokemiallista analyysia parafinoidut keuhkosyöpä kudoksia tunnistettu voimakas S100A15 tumavärjäystä paitsi vaiheessa IV ei verrattuna vaiheeseen IIIB NSCLC (p = 0,005), mutta myös potilailla, joilla on stabiili tai etenevä sairaus verrattuna niihin, joilla on osittainen vaste (p = 0,032). Suuri osa S100A15 ydin- värjättyjen solujen (HR 1,028, p = 0,01) oli ainoa itsenäinen tekijä liittyy kolmen vuoden yleistä kuolleisuutta.

Johtopäätökset

Tuloksemme viittaavat mahdollista roolia

IL4

väylän immuunivalvonnan pitkälle edenneen NSCLC, ja immuunijärjestelmän voimistuminen yhdistelmä kemoterapiaa. S100A15 voi toimia mahdollisena biomarkkeri tuumorin luokitus, ja ennustaja huonon ennusteen NSCLC.

Citation: Chen Y-C, Hsiao C-C, Chen K-D, Hung Y-C, Wu C-Y, Lie C-H, et al. (2013) Peripheral Immuunijärjestelmän Cell Gene Expression Muutoksia Advanced Non-pienisoluinen keuhkosyöpä hoidetuilla potilailla ensimmäinen rivi Combination Kemoterapia. PLoS ONE 8 (2): e57053. doi: 10,1371 /journal.pone.0057053

Editor: Sai Yendamuri, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 elokuu 2012; Hyväksytty: 16 tammikuu 2013; Julkaistu: 25 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat tukea (CCMP96-RD-202) valiokunnan kiinalaisen lääketieteen ja farmasian Department of Health, Executive Yuan, Taiwan, ja myös tukee osittain avustusta Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG891301 KD Chen, ja CMRPG881031 että YC Chen). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti. Keskimääräinen 5 vuoden pysyvyys on alle 15%, joka on pysynyt lähes muuttumattomana viimeiset kolme vuosikymmentä. Valtaosa NSCLC potilailla esiintyy kehittynyt taudin diagnoosi, ja joilla on diagnosoitu varhaisessa vaiheessa tauti kokevat usein uusiutumisen ja etäpesäkkeitä [1], [2], [3].

Host immuunisolujen välittävät immuunivalvonnan by hävittämiseksi poikkeavien solujen, ja tämä on vaarantunut kasvaimen edistävä mikroympäris- monille potilaille, joilla on keuhkosyöpä. Useita immuuni vikoja, johon sisältyy siirtyminen kohti tyypin 2 auttaja-T-solujen (Th2) fenotyyppi, ovat ilmeisiä keuhkosyöpäpotilaita [4], [5]. Kuitenkin sama immuunijärjestelmän solut voivat edistää kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden angiogeneesin kautta, ja invaasion soluväliaineen [6], [7]. Ymmärtäminen perustavanlaatuinen molekyyli prosessit, jotka aiheuttavat nämä viat antaisi mahdollisuuden kehittää innovatiivisia hoitoja. Lisäksi immuunijärjestelmän soluvasteita asennettu eri histopatologisia tyypit ja kasvainten vaiheissa keuhkosyöpä voi olla erilainen; kuitenkin, tutkimukset tässä asiassa puuttuvat.

Useat immunosuppressiivisia molekyylejä tuotetaan kasvaimia, kuten interleukiini-10 (IL-10), transformoiva kasvutekijä-beeta (TGF-β), tai COX-2- ( COX-2) metaboliittien kuitenkin erityisiä hoitoja, kuten kemoterapiaa ja sädehoitoa voidaan edistää muuttamalla immuunijärjestelmän toimintaa [4], [6], [8]. Lisääntyvä todistusaineisto viittaa siihen, että puoli immuunivalvonnan voidaan palauttaa asianmukaiset solunsalpaajiin. Esimerkiksi nukleosidianalogin gemsitabiini (GEM) on osoitettu selektiivisesti parantaa adaptiivista immuunivastetta ja edistää soluvälitteinen immuunivaste yli humoraalisen immuunivasteen lisäksi tavanomaista apoptoottisia vaikutuksia [9] – [12]. Lisäksi platina-pohjainen ainetta, sisplatiini (CDDP), on osoitettu tehostavan antituumorivaikutuksia sytotoksisten T-lymfosyyttien välittämä immunoterapia [13]. On myös osoitettu, että käyttämällä platina-pohjainen kaksinkertainen kemoterapiaa tuottaa merkittävää hyötyä kasvaimen vasteen ja eloonjääminen verrattuna yhden aineen hoito [14]. Taustalla mekanismi immuuni voimistumisen yhdistelmä- kemoterapia ei juuri tunneta.

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli parantaa ymmärrystä molekyylitason mekanismeja, jotka säätelevät immuunitutkimusohjelmasta tai syövän etenemisen immuunijärjestelmän soluissa potilailla, joilla on pitkälle edennyt ei-pienisoluinen keuhkosyöpä by tutkivat ilmaisuja geenien perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PBMC), jotka voivat osallistua näihin vaikutuksiin. Oletimme, että geeniekspressioiden PBMC osallisena immuunivasteen pitkälle NSCLC olisivat merkittävästi erilaisia ​​kuin terveillä koehenkilöillä, ja että lisää erot nähtäisiin välillä syöpäpotilaat adenokarsinooma (AC) ja okasolusyöpä (SCC) tai välillä vaiheen III B ja IV. Lisäksi pyrittiin parantamaan ymmärrystä molekyylitason mekanismeja, jotka säätelevät Immunopo- aiheuttama yhdistelmä kemoterapian kanssa CDDP ja GEM, ja toivon, että uudet geenit voivat osoittautua ali- tai ilmaista hoidon jälkeen, mikä tarjoaa uusia oivalluksia parantamiseen tehoa kemoterapiaan.

Useat tutkimukset ovat soveltaneet DNA-siru teknologiaa tutkia geeniekspressioiden potilailla NSCLC [15] – [24]. Yhdessä näistä tutkimuksista, jossa keskityttiin geeniekspressioiden veren valkosoluja sijaan kasvaimen kudokset, 29 geenejä havaittiin muuttunut potilailla, joilla alkuvaiheen NSCLC verrattuna ei-pahanlaatuisia keuhkosairaus. Se, missä määrin valkosolujen geenit osansa kehittynyt NSCLC, ja vaikutukset histopatologia ja kasvaimen vaiheessa geeni allekirjoitukset ovat epäselvät [23]. Siksi laajensimme tutkimuksen myöhäisvaiheen NSCLC analysoimalla koko genomin geeniekspressioprofiilien PBMC potilaista on vastikään todettu pitkälle NSCLC ja histopatologia joko AC tai SCC. Lisäksi luoda suora yhteys geenien ilmentyminen ja kemoterapiaa, jälkikäsittely PBMC 17 potilasta, jotka saivat vähintään neljä kurssia yhdistelmä kemoterapian kanssa CDDP ja GEM saatiin, ja vaikutukset kemoterapian globaaleihin geeniekspressioprofiilien arvioitiin käyttämällä mikrosirujen analyysi.

Materiaalit ja menetelmät

tutkimus hyväksyi Institutional Review Board of Chung Gung Memorial Hospital, Taiwan. Tutkimuksen osallistujat rekrytoitiin keuhkojen klinikoiden ja terveyden tutkimus keskus Kaohsiung Chung Keinutie Memorial Hospital aikana elokuu 2007 kautta tammikuuta 2009. Kaikki osallistuneista potilaista oli vähintään 18-vuotiaita tai vanhempia, joilla on histologisesti vahvistettu, äskettäin diagnosoitu, hoitamaton, IIIB tai IV ei-yhteen tai useampaan mitattavissa (yksiulotteinen) leesion, jonka halkaisija on 10 mm tai suurempi mitataan tietokonetomografia, histopatologisia alatyypin AC tai SCC, ja Eastern Cooperative Oncology Group suorituskyky oli 0, 1, tai 2. Kukin kasvain oli diagnosoitu mukaan histopatologis- alatyypin ja laatu patologi. Kliinisessä vaiheessa katsottiin mukaan International Union Against Cancer (UICC) Kasvaimen etäpesäke luokittelu (6

painos, 2002). Kaikkiaan 42 potilasta keuhkosyöpä seulottiin kelpoisuuden ilmoittautuminen. Potilaat, joilla ensilinjan hoito-ohjelmien muu kuin CDDP ja GEM yhdistelmä kemoterapiaa (4 potilasta), jotka saavat samanaikaisesti sädehoitoa (2 potilasta), vakava kontrolloimaton lääketieteellinen tai psykiatrinen sairaus (1 potilas), historia muiden maligniteetti viimeisen 5 vuoden aikana (1 potilas ), ja kieltäytyy verinäyte tutkimusta varten (4 potilasta) suljettiin pois. Kolmekymmentä potilasta valmistunut seurantaa ja olivat mukana kädessä. Kaikki 30 potilaat saivat ensilinjan kemoterapian kanssa CDDP (keskimääräinen annos 70 mg /m2) päivänä 1 plus GEM (GEMZAR®, Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN; keskimääräinen annos 1000 mg /m2) päivänä 1, 8, ja 15 on 28 päivän jakson. Hoito suunniteltiin enintään kuusi jaksoa (mediaani 4, alue 1-6), ellei se oli keskeytetty, koska etenevä sairaus, stabiili tauti, hyväksyttävää myrkyllisyyttä, tai kuolema. Sen jälkeen lähtötilanteen arviointi, tuumorivaste arvioitiin viikon kuluttua viimeisen annoksen mukaan Response arviointiperusteet kiinteitä kasvaimia. Täydellinen vaste (CR) määriteltiin täydellistä katoamista kaikki todisteet taudista. Osittainen vaste (PR) määriteltiin vähenee vähintään 30%: n suurin halkaisija kohde-vaurion, ilman ulkonäön uusia leesioita. Progression määriteltiin kasvua vähintään 20%: n suurin halkaisija kohde-vaurion tai ulkonäkö yhden tai useamman uusia leesioita. Kokonaiselossaoloaika määriteltiin diagnoosista asti kuolema mistä tahansa syystä, että 3-vuoden seuranta-aikana. Kaksikymmentä Terveillä henkilöillä ei ole todettu maligniteetti viimeisten 5 vuotta tai viime tartuntataudin otettiin kuin kontrolliryhmässä.

prosessit RNA: n eristäminen ja cRNA Synthesis

Oheislaitteet kokoverta (15 ml) kerättiin sen jälkeen kun tietoon perustuvan suostumuksen oli saatu 30 potilailla, joilla on vastikään todettu histopatologisesti vahvisti NSCLC, ja 20 ikä- ja sukupuolihormoneja, ja oheissairaudet-terveisiin (HC). Toinen 15 ml verta kerättiin jälleen viikon kuluttua viimeisen annoksen CDDP ja GEM päässä 17 potilasta, jotka ovat suorittaneet vähintään neljä kurssia yhdistelmä kemoterapiaa. PBMC eristettiin Ficoll-Hypaque-gradientin läpi sentrifugoimalla (Histopaque®-119, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO USA) 90 min veren ottoa, pestiin PBS: ssä, ja sitten tallennetaan RNAlater (Ambion Inc. , Austin, TX, USA) -80 ° C: ssa, kunnes RNA: n eristämistä. RNeasy® Plus Mini Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) käytettiin eristämiseen korkealaatuisia kokonais-RNA ja käsiteltiin DNaasi mukainen valmistukseen protokollaa. RNA eluoitiin sitten RNaasi-vapaaseen veteen. Näytteet ajettiin RNA 6000 Nano Gel System (Agilent Technologies Inc., Palo Aito, CA, USA) käyttäen Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent) ja laadun määrittämiseksi RNA, ja 2 ui RNA: ta käytettiin pitoisuuden määrittämiseksi RNA käyttämällä NanoDrap spektrofotometrillä (Thermo Science, Wilmington, DE, USA). Vain näytteet, joissa A260 /A280-suhteet on 1,9-2,1 käytettiin lisäanalyysiä. Yhteensä 300 ng RNA: ta käytettiin synteesiin ensimmäisen juosteen cDNA: n ja in vitro transkriptio cRNA käyttäen Illumina Totalprep RNA Amplication kit (Ambion, Inc.).

geeniekspressioprofilointi ja Microarray Data Analysis

Illumina (San Diego, CA) HumanRef-8v2 helmi mikrosiruilla käytettiin 750 ng leimatun cRNA kullekin näytteelle mukaan valmistajan protokollaa. Ihmisen Ref-8 versio 2 paneelit koostuvat 22184 koettimien edustavat 18189 ainutlaatuinen ihmisen geenien kahdeksan liuskan muodossa array. Kaikki ilme aineisto on talletettu NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) liittymisen numero GSE39345. Tilastollinen analyysi microarray tietojen suoritettiin käyttäen GeneSpring ohjelmistoversio 11 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA). Jotta ilmaisu arvojen riippumaton spot voimakkuus ja sijainti, lisäksi per geeni normalisoinnin levitettiin ennalta normalisoitu data kussakin array jakamalla raakadataa, jonka mediaani ilmentymistason varten geeni näytteissä terveillä koehenkilöillä. Raakatiedot jälkeen skannaus mikrosiruja kanssa taustakorjatut oli ladattu Illumina n Beadstudio Expression moduuli GeneSpring GX. Tämä vaihe seurasi quantile normalisoinnin ja log2 muutosta. Koetin asetettu suodatin sovellettiin poistaa geenejä, joita ei luotettavasti havaita. Kaiken kaikkiaan 22150 antureista koko 22184 antureista (99,8%) osoitti, jossa vähintään 1 ulos 67 näytettä oli merkitty P (läsnä) tai M (marginaalinen) liput verrattuna tausta-arvoihin. Ei-parametrinen U-testiä varten parittomia vertailuja kahdesta riippumattomasta tai Wilcoxonin testi verrata geeniekspressiotasot ennen ja jälkeen kemoterapiaa sovellettiin. Käytimme Benjamini-Hochberg väärien löytö määrä (FDR) korjaus menetelmä kontrolloiden vääriä positiivisia ja korjatun p-arvo sulku 0,05 käytettiin valita sarjaa merkittävästi ylös- ja alas geenien alin FDR. Geeni sarjaa sitten ryhmiteltiin toiminnallinen luokkaan sen mukaan, Gene ontologia biologisten prosessien luokitus. Reitti rikastusprosessia käytettiin tunnistamaan ominaisuuksia merkittävästi muuttunut alaryhmiä geenien kesken fenotyypin ryhmien ja löytää suoria suhteita kiinnostuksen kohteena olevia geenejä. Tämä tehtiin GeneSpring ohjelmistojen kanssa ”yksinkertainen ja suora vuorovaikutus” algoritmia. Tiedot käyttämä algoritmi saatiin PubMed kirjallisuudessa Natural Language Processing algoritmeja etsiä avainsanoja ja suhteet tiivistelmät. Hierarkkinen klusterointi analyysi suoritettiin klusterointia ja puiden rakentaminen ohjelmia, perustuen suodatettuun geenejä, jotka täyttivät tilastotietojen perusteella, käyttäen kuusikulmainen lamenetelmällä.

tarkastaminen geeniekspressioiden käyttäen TaqMan kvantitointi Reaaliaikainen käänteistranskriptaasi-polymeraasia Chain Reaction (RT-PCR) B

vahvista ekspressiokuvioita tiettyjen kandidaattigeenien, ilmaisuja analysoitiin käyttämällä RT-PCR: llä 32-kuoppaisen. Kunkin geeni, yksi RT-PCR-reaktio suoritettiin samalla RNA näyte PBMC syöpäpotilaiden (N = 30) ja HC (N = 20). Talon pitäminen geeni ihmisen hapanta ribosomaalisen proteiinin (HUPO) valittiin sisäsyntyinen ohjaus normalisoida ilmaisun tiedot kustakin geenistä. Kaikki PCR-alukkeet (random heksameerejä) ja Taqman suunniteltiin ja hankittiin Roche mukaan yhtiön protokollat ​​(www.roche-applied-science.com), ja niiden sekvenssit on esitetty taulukossa S1, joka on julkaistu tukevat tiedot on PLoS One verkkosivuilla. Lyhyesti, kaksi-vaihe kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin. Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin 5 ug RNA: ta käyttäen LightCyclerTaqManMaster kit (Roche, Saksa). PCR-reaktiot ajettiin Roche Light Cycle 2,0 kone. Yhden reaaliaikainen PCR koe suoritettiin kunkin näytteen kunkin kohdegeenin, koska Roch Light Cycler järjestelmä on osoittanut korkea toistettavuus käyttämällä erinomainen lämmönsäädinliitännät ja koetin tunnistus muodossa (https://www.roche-applied-science.com/sis /rtpcr/LCNano/index.jsp?id=LCNano_100000). Suhteellinen ekspressiotasoja laskettiin ΔΔCq menetelmää mediaanin arvo HC ryhmään kuin kalibraattori, kuten tehtiin microarray data [25].

immunohistokemia (IHC) värjäys keuhkosyöpään kudosten S100A15

Tissue parafiinileikkeet poistettiin parafiini ksyleenillä, vedettömät kautta lajitellut etanolia ratkaisuja tislattua vettä, ja sitten pestiin Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa. Antigeeni haku suoritettiin kuumentamalla osat 10 mM natriumsitraattia 10 minuutin ajan mikroaaltouunissa. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus pysäytettiin inkuboimalla 3% H

2O

2 metanolissa 5 minuuttia. Epäspesifinen sitoutuminen tukittiin käyttämällä Protein Block (Dako, Carpinteria, Kalifornia, USA) 20 minuutin ajan. Kudos Sitten leikkeitä inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämmössä anti-ihmisen S100 kalsiumia sitova proteiini A15 (anti-hS100A15, 1:5000, lahjana Stuart H. Yuspa laboratorio syöpäbiologian ja Genetics Center for Cancer Research, National Cancer Institute, USA) yön yli, mitä seurasi 30 min inkubaatio vuohen anti-hiiri-IgG konjugoituna piparjuuren peroksidaasilla leimattua polymeeri (Envision + System; DakoCytomation, Carpinteria, Kalifornia, USA). Lasit kehitettiin 5 min 3,3′-diaminobentsii- kromogeeni ja vastavärjättiin hematoksyliinillä. Negatiivisen kontrollin kudosleikkeiden, ensisijainen vasta-aine korvattiin Isotyyppispesifisessä ei-immuuni-hiiri-IgG.

arviointi immunohistokemiallinen värjäys ja S100A15

Kukin dia arvioitiin S100A15 immunovärjäyksellä käyttäen semi määrälliset pisteytysjärjestelmä sekä värjäyksen intensiteetin ja prosenttiosuus positiivisten kasvainten /keuhkojen epiteelisolujen. IHC värjäys katsaus suoritettiin riippumaton koulutettu lukija (TYW), joka oli sokkoutettu kliiniseen tulokseen, kasvain vaiheessa ja histopatologia. Kudoksen osat pisteytettiin manuaalisesti laskemalla ≥1000 soluja perustuu prosenttiosuus immunovärjätty solujen: 0-10% = 0; 10-30% = 1; 30-50% = 2; 50-70% = 3 ja 70-100% = 4. leikkeet myös saivat puolittain määrällisesti perusteella värjäytymisen intensiteetti negatiivisiksi = 0; lievä = 1; kohtalainen = 2; ja voimakas = 3. kokonaispistemäärä saatiin lisäämällä tulokset prosenttiosuuden positiivisuus ja värjäyksen intensiteetti, ydin- ja sytoplasmista värjäytymistä teki itsenäisesti [26].

Tilastollinen analyysi

Jatkuva arvot esitettiin keskiarvona ± keskihajonta (SD). Mann-Whitney, Wilcoxonin sijoittui summa, Kruskal-Wallisin H, ja chi-neliö testejä käytettiin arvioimaan eroja eri ryhmien tarvittaessa. Pearsonin korrelaatio testiä käytettiin arvioimaan korrelaatio kaksi jatkuvaa muuttujaa. Kaplan-Meier menetelmää käytettiin arvioimaan kokonaiselossaolo, ja Coxin regressioanalyysi kanssa portaittain eteenpäin valinta käytettiin arvioimaan riippumattomien ennustetekijöiden liittyy selviytymisen. Kaikki testit olivat kaksisuuntaisia ​​ja nollahypoteesi hylättiin p 0,05. Tilastollinen ohjelmistopaketti (SPSS, versio 15.0, SPSS Inc., Chicago, IL) käytettiin kaikissa analyyseissä.

Tulokset

mikrosirut päässä 50 aiheita, läpäissyt laadunvalvontaa suodattimet olivat mukana tässä tutkimuksessa. Väestörakenteen ja kliiniset tiedot näistä aiheista (30 potilasta, joilla on edennyt vaiheeseen NSCLC ja 20 HC), on esitetty taulukossa 1. Merkittäviä eroja ei havaittu potilaiden ja HC suhteen ikä, sukupuoli, sairauksien yhteisesiintyminen, ja tupakointi historia . Syöpä potilaista 9 IIIB AC, 12 vaihe IV AC, 5 IIIB SCC, ja 4 vaihe IV SCC.

ilmennetty eri geenien PBMC Associated kanssa syövän etenemiseen

Mistä 22150 antureista, 4463 (20,16%) transkriptit ilmentyvät eri välillä potilasryhmän ja HC ryhmä käyttäen Mann-Whitneyn parittomia testi Benjamini-Hochberg FDR 0,05. Näyttämölle riippuvaa muutosta mRNA ekspressiotasot potilaista vaiheen III B ja IV verrataan HC ryhmä, Kruskal-Wallisin testi Benjamini-Hochberg FDR 0,05 samanaikaisesta 1,5-kertainen kasvu oli sovellettu ja 3989 ilmentyvät eri selostukset tunnistettiin. Lisäksi 3858 nämä selostukset leikkaavat kanssa löytyy Mann-Whitney testi. Käyttämällä toimivien reittien luokkien mukaan GeneSpring koulutusjakson analyysi työkalu valintakriteerit edelleen Vahvistamisen 3858 geeni sarjaa analysoitiin sitten toiminnallinen merkintä on reitin tasolla. Yksitoista tilastollisesti erilaisia ​​toiminnallisia luokkia kartoitettiin, ja 70 geenitranskriptien (69 ainutlaatuinen geenejä) mukana eritystä, DNA topoisomeraasi aktiivisuus, metyylitransferaasin aktiivisuus, histoni asetyylitransferaasivaikutus, kasvutekijää aktiivisuutta, proteiinityrosiinifosfataasi aktiivisuutta, membraanilipidiin aineenvaihduntaa, synnynnäistä immuunivastetta , adheesiomolekyyli sitova, metalloendopeptidaasi inhibitioaktiivisuudesta, ja sytokiinien /kemokiinin välittämien signalointipolkujen identifioitiin putatiivisiksi allekirjoitukset näistä toiminnoista (taulukko S2).

ilmennetty eri geenien PBMC jälkeen Yhdistelmä kemoterapia kanssa CDDP ja GEM in Cancer potilaat

vaikutusten arvioimiseksi kemoterapia perifeeriseen immuunisolujen, geenien ilmentyminen profiileja seitsemäntoista potilailla, jotka ovat suorittaneet vähintään neljä kurssia CDDP ja GEM hoitoa verrattiin ennen ja jälkeen kemoterapian avulla U-testi varten pariksi havainnot (p 0,05), ja ero ilmentyminen 3576 transkriptien tunnistettiin. Lisäksi yhteensä 669 transkriptit leikkaavat välillä ilmennetty eri transkriptien pariksi tapauksissa ne kemoterapiaa ja 3858 selostukset tunnistettu syöpää /lavastus spesifisyyden. Käyttäen polku analyysi työkalun GeneSpring GX, yhdeksän toiminnallista luokittelua kartoitettiin, ja 62 geenitranskriptien (59 ainutlaatuinen geenejä), joissa synnynnäisen immuunivasteen, sytokiinien tuotanto, mikrotubulusten perustuva prosessi, orgaaninen kationi transmembraani- kuljettajan toimintaa, eritysreitin, DNA topoisomeraasi (ATP -hydrolyzing) aktiivisuus, histoni metyylitransferaasiaktiivisuus, histoni asetyylitransferaasivaikutus, ja proteiinityrosiinifosfataasi aktiivisuutta tunnistettiin tästä 669 geenitranskriptien (taulukko S3). Kuusi geeniä suuremmilla ilmaisuja kasvaimen etenemistä osoitti vieläkin suurempi ilmauksia kemoterapian jälkeen:

kysteiini-rikas eritysproteiinigeenien 3

(

CRISP3

; synnynnäisen immuunivasteen proteiinia),

signaalinmuuntajana ja aktivaattori transkriptio 1

(

STAT1

sytokiini ja kasvutekijän reseptorin signalointi välittäjänä),

liuenneen aineen kantaja perheen 22 jäsen 4

(

SLC22A4

; ergothioneine kuljettaja),

Synapsiini II, transkriptio variantti IIa

(

SYN2

; synaptisen transmission),

Brain-hermokasvutekijä

(

BDNF

; kasvutekijä selviytymisen ja erilaistumista neuronien ja synaptisen transmission),

Kalium suuria sähkönjohtokyvyn kalsium-aktivoitujen kanava, subfamily M, alfa jäsen 1

(

KCNMA1

; synaptisen transmission, solusyklin ja solumigraatio). Erityisesti

S100A15

(kutsutaan myös

S100A7A;

orvaskeden kypsymisen ja mikrobilääkkeiden puolustus) oli säädelty kasvaimen etenemiseen ja normalisoitui kemoterapian jälkeen.

Interleukiinin 4 (IL4 ) Pathway

Olemme löytäneet 69 geenien merkittävästi ilmentyvät eri potilaiden välillä ja terveillä verrokeilla, ja 59 geenit ilmentyvät differentiaalisesti kemoterapian jälkeen. Tutkia, onko geenit ilmentyvät differentiaalisesti pitkälle NSCLC ja kemoterapiaa yhteisiä väyliä, tutkittiin niiden yhteydet käyttäen GeneSpring reitin analysointityökalu.

IL4

koulutusjakso on merkittävästi rikastettu molemmissa allekirjoitukset syövän etenemisen ja kemoterapiaa. Niistä 49 liittyvien geenien IL4 reitin, 11 ainutlaatuista geenit (12 geenitranskriptien) on ilmennetty eri potilaiden välillä ja normaalin valvonnan, ja 16 ainutlaatuinen geenejä (19 geenitranskriptien) on ilmennetty eri ennen ja kemoterapian jälkeen. Leikkauspiste Molemmissa vertailuissa johti 7 ainutlaatuinen geeneistä (kuvio 1 ja taulukko 2). Erityisesti

kemo- CXC-motiivin reseptori 4

(

CXCR4

, 7-transmembraaninen G-proteiinin kemokiinireseptorin varten

CXCL12

) oli säädelty, ja

telakointi proteiini 2

(

DOK2

, alustan chmeric p210bcr /abl onkoproteiinia) ja

interleukiini 2 -reseptorin, gamma

(

IL2RG

; interleukiini-reseptori yleinen gamma ketju

IL2, IL4, IL7, IL9, IL15

, ja

IL21

) on alas-säädellä syövän etenemiseen, kun taas ilmaisuja näistä kolmesta geenien muuttunut vastakkaiseen suuntaan kemoterapian jälkeen. Toisaalta,

fosfolipaasi C, gamma 1

(

PLCG1

; guaniininukleotidiä vaihto tekijä ydinaseiden GTPaasi),

Fosfoinositidi-3-kinaasi, katalyyttinen, delta polypeptidi

(

PIK3CD;

autofosforylaatioaktiivisuuden), ja

proteiinikinaasi C, zeta

(

PRKCZ

, epätyypillinen isotsyymi seriini-treoniini proteiinikinaasi C), joka osoitti väheni lausekkeet syövän etenemistä oli edelleen alassäädetty kemoterapiaa, kun taas

STAT1

jotka osoittivat lisääntynyttä ilmaisutapoja kasvaimen etenemiseen oli ylempänä säädelty kemoterapiaan.

yksitoista pois 49

IL4

reittiin liittyvät geenit kartoitettiin vuonna koulutusjakson rikastamiseen analyysi 3858 ilmennetty eri transkriptien PBMC potilailla, joilla on edennyt ei-pieni ell keuhkosyöpä (NSCLC) ja normaalit kontrollit, kun taas 16 ainutlaatuinen geenit kartoitetaan 669 ilmentyvät eri selostukset PBMC potilaista myöhäisvaiheen NSCLC ennen ja jälkeen kemoterapiaa. Seitsemän leikkaavien geenit kahden geenin-sarjaa tunnistettiin ja esitetään Venn-kaavio. Sininen ympyrä ilmaisee ilmentyvät eri geenejä, jotka liittyvät syövän etenemiseen ainoastaan, punainen ympyrä kemoterapiaa yksinomaan, ja violetti ympyrä molemmat vaikutukset.

Erilliset Ekspressiokuvioiden Across Kasvain Vaiheet ja Histopatologisten Alatyypit

selventää vaikutuksia sekä kasvaimen vaiheen ja histopatologisia alatyyppeihin geenissä allekirjoitukset PBMC, differentiaalisesti ilmentyvien geenien ryhmittyivät käyttäen hierarkkinen klusterointialgoritmi joiden keskimääräinen-sidoksen menetelmä ja euklidinen etäisyys metristä sisään GeneSpring GX. Kuviossa 2 on esitetty kaksiulotteinen hierarkkinen klusterointi kaikkien syöpäpotilaiden ja HC perustuu 73 geenejä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti joukossa IIIB AC, vaihe IV AC, IIIB SCC, vaihe IV SCC, ja HC. Cluster 0 oli ominaista korkea ilmaisuja vaiheessa IIIB AC, vaihe IV AC, IIIB SCC, ja vastaava ilmaisu IV vaiheessa SCC verrattuna HC, jonka huippu ilme IV vaiheessa AC. Tämä malli nähtiin 19 73 geenejä. Ryhmä 1 oli ominaista korkea ilmaisuja vaiheessa IIIB AC, vaihe IV AC, IIIB SCC, ja vaihe IV SCC verrattuna HC, ja heikkoa ilmentymistä vaiheessa IIIB SCC yksin verrattuna vaiheen IV AC, jonka huippu ilmaisun vaihe IV AC. Tämä malli nähtiin 16 73 geenejä. Cluster 2 oli ominaista korkea ilmaisuja vaiheessa IIIB, vaihe IV AC, ja vaihe IV SCC, ja vastaava ilmaisu vaiheessa IIIB SCC verrattuna HC. Tämä malli oli yleisin ja nähnyt 20 73 geenejä. Cluster 3 oli myös ominaista korkea ilmaisuja vaiheessa IIIB, vaihe IV AC, ja vaihe IV SCC, ja vastaava ilmaisu vaiheessa IIIB SCC verrattuna HC, mutta suurempi intensiteetti suhteellisen geeniekspression kunkin geenin verrattuna klusterin 2. Tämä malli nähtiin 18 73 geenien (taulukko S4). Näistä 73 geenit, kymmenen päällekkäin 69 geenien tunnistettu vertailun vaihe IIIB /IV syöpäpotilaille ja terveillä verrokeilla:

Transforming kasvutekijä beeta 2

(

TGFB2

; modulaatio proliferatiivisen aktiviteetti, solun erilaistumisen, ja alkionkehityksen),

inhibiini beta E

(

INHBE

; apoptoottisen funktion),

Trombosyyttitekijä 4

(

PF4;

sääntely leukosyyttien ihmiskaupan),

v-kit Hardy-Zuckerman 4 kissan sarkooma viruksen onkogeenin homologi

(

kIT;

hematopoieettisten huolto, kasvua ja erilaistumista),

proteiinityrosiinifosfataasi reseptorin tyyppi N

(

PTPRN,

hormoni ja neuropeptidi eritys),

Phospholipid scramblase 4

(

PLSCR4;

transbilayer liikkeen fosfolipidien solukalvon läpi),

integriini beta 8

(

ITGB8;

TGF-beeta aktivointi),

S100A15

,

komplementtikomponentti 1 q -aliosa C ketju

(

C1QC;

liipaisu komplementti klassisen reitin ja kohensi fagosytoosin), ja

CRISP3

.

(A) Hierarkkinen klusterointi potilailla, joilla on vastikään todettu pitkälle edenneen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (n = 30) ja terveiden verrokkien (n = 20) mukaisesti ilmentymisen 69 geenit ilmentyvät differentiaalisesti joukossa IIIB adenokarsinooma (AC), vaihe IV AC, IIIB levyepiteelisyöpä (SCC), vaihe IV SCC, ja terveillä verrokeilla (HC). Tiedot esitetään matriisimuodossa: jokainen rivi edustaa geeniä microarray ja kukin sarake alaryhmä mRNA näytteitä. Suhteita hybridisaatio fluoresoiva cDNA-koettimet olivat toimenpide suhteellisen geeni-ilmentymisen kunkin kokeellisen näytteen viittaus mRNA näyte, ja on kuvattu seuraavien väriasteikolla: punainen osoittaa korkean tason ilmentymisen; sininen, alhainen ilmaisun; ja keltainen, keskimääräinen ekspressiotaso. (B) Normalized mediaani geenien ilmentyminen arvot klusterin 0-3 geenien viidessä aihe luokkiin (vaihe IIIB AC, IIIB SCC, vaihe IV AC, vaihe IV SCC, HC). Huomaa, että klusteri 1 geenit osoittivat korkeampia ilmaisuja kaikilla keuhkosyöpäpotilaita verrattuna HC. Cluster 0 geenit osoittivat vastaavia ilmaisuja IV vaiheessa SCC ja HC. Sekä klusterin 2 ja 3 geenit osoitti vastaavia ilmaisuja IIIB SCC ja HC. Laatikko tontteja osoittavat 25

th, 50

th, ja 75

th persentiilit, maksimi ja minimi.

Vahvistus Microarray Tulokset käyttäen TaqMan Reaaliaikainen RT -PCR

vahvista saadut tulokset mikrosirut, ilmaus tasot kuusi differentiaalisesti ilmentyvien geenien suhteen pitkälle keuhkosyöpään tai kemoterapiaa arvioitiin riippumaton menetelmällä RNA kvantifiointiin, TaqMan reaa- aika RT-PCR: llä, käyttäen samaa RNA-näytteet, joita käytettiin mikrosiruanalyysillä. Vertailut suhteellisten ekspressiotasoja reaaliaikaisella kvantitatiivinen RT-PCR: llä 4 geenit, jotka olivat säädelty (

S100A15

, p = 0,001, kuvio 3A;

DOK2

, p 0,001 kuvio 3B) tai alassäädetty (

toll-kaltainen reseptori 7

(

TLR7

; synnynnäisen immuniteetin), p 0,001, kuvio 3C;

topoisomeraasi I mitokondrioiden

(