Krooninen sairaus

tiivistelmä

retrovirukset ovat perustava syöpätutkimuksessa alusta lähtien tutkimuksissa tunnistettu esikasvaintekijät kohteina insertionaalisiin mutageneesillä. Integrointi hiiren gamma-retrovirusten isännän genomiin suosii promoottorit ja tehostajat ja edellyttää vuorovaikutusta virusintegraation isännän BET /bromodomain tekijöitä. Kerromme, että tämä integraatio malli on konservoitunut kissan leukemiavirus (FeLV), gamma-retrovirus, joka tartuttaa monet ihmisen solutyyppejä. Analyysi FeLV insertiokohtiin MCF-7 rintasyöpä solulinjassa paljasti vahva bias kohti aktiivista kromatiinin tavaramerkkien mitään merkkejä jälkeinen integraatio kasvun valinta. Näkyvin FeLV integraatio tavoitteita oli vähän päällekkäisyyttä runsaimmin ilmaisivat selostukset, mutta voimakkaasti rikastettiin selityksin syövän geenien. Meta-analyysi perustuu useisiin gamma-retrovirus integraatio profilointi (GRIP) tutkimukset ihmisen soluissa (CD34 +, K562, HepG2) paljasti samanlaisen syöpää geeni bias mutta myös merkittäviä solutyypissä spesifisyys, merkittävässä poikkeuksin johon kuuluu yleinen integrointi hotspot klo Pitkien ei-koodaavan RNA

MALAT1

. Vertailu GRIP tavoitteiden tietokantojen super-parantajia samasta solulinjoista osoitti, että näillä on vain vähän päällekkäisyyttä ja että GRIP tarjoaa ainutlaatuisen oivalluksia ylävirtaan kuljettajien solujen kasvua. Nämä havainnot selvittämiseksi onkogeenisiä teho gamma-retrovirusten ja tukevat laajempaa käyttöä GRIP tunnistaa geenejä ja kasvusäätelygeenien piirejä, jotka ohjaavat erilliset syöpätyyppeihin.

Citation: Gilroy KL, Terry A, Naseer A, de Ridder J, Allahyar A, Wang W, et al. (2016) Gamma-Retroviirus Integration Marks solutyyppispesifiselle Cancer Geenit A Novel profilointityökalun Cancer Genomics. PLoS ONE 11 (4): e0154070. doi: 10,1371 /journal.pone.0154070

Editor: Mary Bryk, Texas A M University, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 15 helmikuu 2016; Hyväksytty: 10 huhtikuu 2016; Julkaistu: 20 huhtikuu 2016

Copyright: © 2016 Gilroy et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja, tai on annettu aikaisemmin kautta julkaistu käsikirjoituksia.

Rahoitus: KLG, AT, AN, AK, ERC ja JCN tuettiin yhteisen ohjelman Cancer Research UK ja Bloodwise (lupanumeroita A11951 (CRUK) ja 13046 (Bloodwise); URL-osoitteet ovat https://www.cancerresearchuk.org/ja https://bloodwise.org.uk/). JDR Rahoitin Veni avustus (639.021.233) maasta NWO (Alankomaat tieteellisen tutkimuksen järjestön, https://www.nwo.nl/). AM rahoittivat Canadian Institutes for Health Research (MOP 97798, https://www.cihr-irsc.gc.ca/). GK-SW rahoittivat Alberta innovoi Technology Futures (AITF, https://www.albertatechfutures.ca/) ja innovoi Centre of Research Excellence (iCORE). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kyky retrovirusten ohjata vakaa integraatio on luonnostaan ​​mutageeninen ja voi hämmentää isäntäsolun geenien provirus- insertiokohdassa tai jopa huomattavan etäisyyden [1,2]. Vaikka tämä ominaisuus on alettu pitää lähinnä ei-toivotun komplikaatio käyttöön retrovirusvektorien geeniterapiassa [3,4], se on jo pitkään ollut arvokas syöpätutkimuksessa, koska integrointi sivustoja retrovirusten luonnossa esiintyviä tai kokeellisesti aiheuttamien syöpien linnuista, hiiret ja kissat ovat tarjonneet runsaan sadon syövän kuljettajan geenien ja perheille myös

Myc

,

Myb

,

Pim

,

Runx

,

Bmi1

,

Gfi1

ja

Notch

[1]. Valmistuminen hiiren genomin ja kynnyksellä suurikapasiteettisten kloonaus ja sekvensointi insertiokohtiin laajensi näiden tutkimusten massiivisesti, paljastaen monia uusia mahdollisuuksia kohdegeenien [5-7]. Oletettiin alussa tutkimuksissa, retroviruksen integraation on tehokkaasti satunnainen, ja että syöpä-erityiset yhteiset integraatio sivustoja (CISS) syntyi pelkästään kloonilaajenemisen jälkeen harvinainen insertiot Herkkien sivustoja, jotka samaan aikaan itsenäisissä kasvaimia sattumalta. Sen sijaan, on tullut selväksi viime vuosina, että retrovirukset ovat merkittäviä integraation mieltymyksiä, jotka heijastavat niiden erottavat biologiset ominaisuudet ja muotoja isännän kolonisaation.

predilection lentivirusten HIV integroitumaan aktiivisesti puhtaaksi geenit on keskeinen piirre sen synnyssä jossa se kauttakulkuvirrat välillä piilevä infektio ja sytopaattisen replikointi. HIV-, tähän prosessiin liittyvää vuorovaikutusta virusintegraation proteiinia ja LEDGF, transkriptionaalisen koaktivaattoria että hihnoja integraatio monimutkainen chromatin ja helpottaa integraatiota [8,9]. Sen sijaan gamma-retrovirusreplikaation on yleensä ei-sytopaattisen ja pysyvästi infektoituneista isännät voi näyttää korkeita viremia, jossa kasvaimia aiheuttama insertiomutageneesiin suhteellisen yleinen tulos infektion [10,11]. Ei-satunnaisuus hiiren leukemiaviruksen (MLV) integrointi ensin arvostettu aikaisesta tutkimuksista, korostettu harhat kohti DNaseI yliherkkä sivustoja ja transkription aloitus- sivustoja [12]. Tämän perusteella erityisyyttä hiljattain selvitetty esittelyn että MLV integraasin vuorovaikutuksessa BET /bromodomain proteiineja (Brd2, 3 ja 4), jotka puolestaan ​​sitoutuvat asetyloitua histoni H3K27ac, merkintä joitakin aktiivisia alueita chromatin [13-15 ]. Tämän tärkeys vuorovaikutus korostuu merkittävä väheneminen tiitteri ja /tai menetystä TSS kohdentamista MLV kasvanut läsnäollessa BET estäjien JQ1 ja I-BET

in vitro

[13-15]. Tämä luo lisäksi yhteyden syövän tutkimuksen BET estäjiä tutkitaan parhaillaan kliinisissä kokeissa hoitoon useita syöpiä [16].

koko laajuus lähtö satunnaisesta MLV integraatio on tullut selväksi vain kynnyksellä suuren mittakaavan menetelmiä kaapata ja sekvenssin integraation sivustoja polyklonaalisia tartunnan solupopulaatioiden

in vitro

ennen mitään merkittävää kasvua valinta. Laajamittaiset tutkimukset MLV vektorin integraation ihmisen CD34 soluissa tai MLV pseudotyyppi infektio ihmisen syövän solulinjoista on paljastanut huomattavan selektiivinen prosessi, jossa yli puolet integraatiot tavoite alle 2% ihmisen genomin [17,18]. Lisäksi edullinen genomista sivustoja esiintyä aktiivisen chromatin markkaa ja sisältää vahvat parantajina sekä promoottorit.

Tässä tutkimuksessa selvitimme integrointi mieltymykset toisen gamma-retrovirus, kissan leukemiavirus (FeLV). Käytimme FeLV-B, joka on luonnossa esiintyvä variantti FeLV, joka pystyy infektoimaan käytännössä kaikki viljellyissä ihmisen soluja ilman ilmeistä sytopatologialle [19] kanssa tapahtuvan vuorovaikutuksen kautta ilmentyy laajalti fosfaatti transporter PIT1 [20]. Alussa analysoitu integraatiot MCF-7 ihmisen rintasyövän solulinjaa, joka on salliva levitettäväksi korkea titteri FeLV-B replikointi, ja on yksi parhaista tunnettu syövän solulinjat suhteen funktionaalinen genomiikka. FeLV-B näytetään samanlaisen mieluummin transkription aloituspaikkoja ja aktiivinen chromatin markkaa MLV, sopusoinnussa säilyttäminen C-terminaalin silmukka integraasin joka sitoutuu BET /BRD [21]. Kuitenkin FeLV integraatio erityisyyttä ei ensisijaisesti suunnattu runsaimmin ilmaisi geenit mutta voimakkaasti vinoutunut kohti rintasyöpä kuljettajaa geenejä. Tämä havainto inspiroi meta-analyysi gamma-retrovirus integraatio etusija useista tutkimuksista, jotka paljastivat suurta solutyypissä spesifisyys, kun taas syöpä geenit suositaan kaikissa tapauksissa, myös normaaleissa soluissa. Nämä havainnot viittaavat siihen, että gamma retroviruksen integraation profilointi (GRIP) ovat arvokas väline tunnistamiseksi solulinjasuuntautuneita erityisiä syövän kuljettaja geenien monenlaisia ​​ihmisen syöpätyyppeihin.

Tulokset

FeLV integraatio ihmisen rintasyövän solujen kohdistuu transkription aloituspaikkoja ja aktiivinen chromatin merkkien

kloonaus FeLV-B integraatio sivustoja tartunnan MCF-7 rintasyöpäsolujen linkkeriskan- välittämä PCR ja kartoitus ihmisen genomiin tuotti 20634 aito virus- isäntä risteyksessä fragmentteja, jotka vastaavat 8052 ainutlaatuinen lisäyksiä (kuvio 1A, S1 aineisto). Suhteellisen pieni määrä kopiota ainutlaatuinen lisäys ehdotti, että merkittävää kloonivalinnan oli tapahtunut lyhyen kasvujakson

in vitro

, ja tätä kysymystä tutkittiin edelleen analysoimalla proviraalisten suuntauksen poikkeama. Vaikka yhdentymisprosessikin on satunnainen suhteen suuntautumiseen rasituksilta gamma-retrovirusten aktivoida isännän geenejä tehostajana lisäys, prosessi, joka vaikuttaa voimakkaasti suunnan, johtaa syntyminen hallitseva kloonia lausutaan bias ratkaisevissa integraatio hot-spotit joka voidaan osoittaa tilastollisesti jonka pään hännät ”analyysi [22]. Käytimme tätä testiä FeLV /MCF-7 aineisto. Niistä 100 geenit useimmin kohdennettuja, 8 ilmeni merkkejä suuntauksen poikkeama (p-arvot +0,011-0,049 Fisherin tarkka testi), mutta mikään näistä havainnoista selviytyi Bonferronin tai Benjamini-Hockberg korjaus useiden testaus (kaikissa 8 tapausta p arvo Bonferronin korjaus oli 1, ja p arvo Benjamini-Hockberg korjaus oli 0,612). Lisäksi yksikään läheisen geenien selityksin syöpä kuljettajia, eikä kukaan näkyy klassista ”alkupään ja taaksepäin” klustereiden joka on useimmin havaittu tässä tilassa onkogeenin aktivaation [1]. Lisäksi insertiot on 100 useimmin suunnattu geenit ei havaittu lisääntynyt kopiomäärä verrattuna aineisto kokonaisuutena, jossa on keskimäärin 2,7 ja 2,6 kopiota /lisäys vastaavasti (p = 0,44). Nämä havainnot viittaavat siihen, että mahdollisimman vähän kloonivalinnan jälkeen on tapahtunut integraatio ja että havaitut ei-satunnainen jakauma genomissa johtuu pääasiassa pistokohtaan etusija. Klusterointi FeLV lisäyksiä noin transkriptio alkaa sivustoja (TSSs) oli ilmi aineisto, jossa kaksinkertainen piikki +/- 1,5 kb ja kouru suoraan TSS mahdoton erottaa malli raportoitu MLV [17] (Kuva 1 B). Asento insertiot lähimpään geenin määritettiin ja on esitetty kuviossa 1C. Useimmat lisäysten sijaitsevat sisällä geeni, ja seuraavaksi suurin ryhmä ylävirtaan geenistä, sopusoinnussa niiden kohdentamista tehostinelementit.

V: Experimental työnkulku. B: asema lisäyksiä MCF-7-solujen suhteen TSS, osoittaa kaksinkertainen piikki, alimpien TSS. C: Pie kuvaava asemaa lisäyksiä MCF-7-solujen suhteen lähimpään geeniä.

onko tietyn epigeneettisellä tavaramerkit suunnattiin myös viruksen, datan ENCODE konsortio analysoitiin. ChIP-seq aineistoja kaikkien saatavilla histonimerkkien MCF-7-solut käsitellään ja huiput selityksin kuvatulla Materiaalit ja menetelmät. Käytettävissä histonimerkkien olivat H3K27ac, H3K9me3, H3K36me3, H3K27me3 ja H3K4me3. Päällekkäisyys MCF-7 insertiot kanssa histonimerkkien määritettiin ja on esitetty yhteenvetona kuviossa 2. Ensinnäkin merkkiaineiden aktiivinen chromatin katsottiin, sillä nämä ovat H3K27ac (tehostajana merkki), H3K4me3 (aktiivinen promoottori merkki) ja H3K36me3 (merkkiaine venyminen). Kuten koottu kuvioon 2A, suuri osa MCF-7 insertiot päällekkäin näillä histonimerkkien (41,8%); suurin päällekkäisyyttä esiintyy joko H3K4me3 yksinään (1119 insertiot, 15,7%), tai sekä H3K4me3 ja H3K27ac (1508 insertiot, 21%). Harkittaessa tukahduttavaa merkkien H3K9me3 ja H3K27me3, oli hyvin vähän päällekkäin MCF-7 insertiot (vain 0,97% yhteensä, kuviossa 2B). Ottaen huomioon merkitys pairwise päällekkäisyyden MCF-7-insertioita, jossa kunkin viiden histonimerkkien, yksikään ei ollut tilastollisesti merkitsevä, lukuun ottamatta H3K27ac, joka oli erittäin merkitsevä ap arvo 4.96E-69 (p-arvot kaikille muille pareittain päällekkäiset 1). Tutkittuaan väliset suhteet yleisellä Histonimerkki huomautusta ja MCF-7 lisäys, suhde histonimerkkien merkittävimmistä lisääminen klustereita tutkittiin. A ’lähin geeni ”analyysi suoritettiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät, jossa kullekin lisäys geeniin ja merkittävyyttä arvioitaessa lisäyskohdan tuohon geeni. Samoin histonimerkkien olivat selityksin ja merkitys tulokset (p-pisteiden) saadaan käyttämällä Galaxy /Cistrome suite kuvatulla Materiaalit ja menetelmät. Ylimmän 500 geeni osumia jokaista Histonimerkki (tunnistaa p-pisteet) koottiin ja verrattiin alkuun retroviruksen integraation tavoitteita ja limittäin arvioitu. Todennäköisyys päällekkäisyys esiintyvä sattumalta arvioitiin käyttäen Monte-Carlo simulointi, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tiedot on koottu kuvioon 2C ja taulukossa 1. Kolme aktiivinen chromatin arvosanat osoittavat merkittävää päällekkäisyyttä kun merkittävimmät geenit klusterit katsotaan, jossa p-arvot 1.67E-8, 0,00236 ja 0,0014 varten H3K27ac, H3K4me3 ja H3K36me3 vastaavasti. Tukahduttava chromatin merkitsee H3K9me3 ja H3K27me3 osoita mitään merkittävää yhteyttä MCF-7 insertiot (p = 1 ja p = 0,97 vastaavasti). Kaiken vertailu kaikkien saatavilla histonimodifikaation osoittaa johdonmukaisesti, että lisäykset kohdistetaan aktiiviseen chromatin merkit ja puuttuvat tukahduttavia markkaa.

V: Global yhdistys insertioita aktiivisen histonimerkkien osoittavat määrän risteävän ominaisuuksia. B: Global yhdessä tukahduttavia histonimerkkien. C: Statistical yhdistys kaikkein merkittävästi rikastettu lähimpään geenejä insertiot ja histonimerkkien. Muuttunut p-arvot näkyvät. Katkoviiva esittää p = 0,05. D: Esimerkki geeniryppäät kohteena FeLV MCF-7-soluissa, kuten näkyy UCSC Genome Browser. Insertiot näkyvät violetti yläosassa, jonka jälkeen kaavioita geenin rakenne, ja lopuksi H3K27ac chip seuraavissa signaalin tiheys.

määrä päällekkäisiä geenejä ylhäältä 500 on merkitty, samoin kuin p arvot merkitys päällekkäin. Huomaa, että p-arvo H3K27ac edustaa 1 60×10

6 mahdollisuudet yhdistyksen esiintyvien sattumalta, mutta todellinen p-arvo on pienempi kuin tämän tason päällekkäisyyttä ei havaittu 60×10

6 simulaatioita.

FeLV integraatio tavoitteita syöpää kuljettajan geenejä MCF-7 rintasyöpäsolujen

Aiemmat suuren mittakaavan tutkimukset ovat keskittyneet hiiren gamma-retrovirus- ja vektorin integraation normaaleissa ja pahanlaatuisten solujen ja todettiin anecdotally että monet vektori insertiot normaaleissa CD34 soluissa olivat ”vaaralliseksi” sivustojen osalta tätä riskiä, ​​mukaan lukien LMO2 lokuksen, joka on esillä kuin usein tavoitteeksi vektorin integraation geeniterapia liittyy leukemiat [3,4]. Alkutarkastus suurten klustereiden FeLV laittamista MCF-7-solut osoittivat merkittävä pitoisuus geenien raportoitu yli-ilmentyminen tai vahvistus rintasyövän tai tappiota-of-function pudotus fenotyyppi MCF-7-soluissa. Esimerkki geeniryppäät kuvassa 2D kuuluu kolme HOX-geeni klustereita, mukaan lukien pitkän ei-koodaavat RNA

hotair

yhdessä chromobox

CBX2

ja pitkän ei-koodaavat RNA

MALAT1

. Useimmiten lisäykset samaan aikaan ensisijaisesti huiput H3K27 asetylointi, ja vähemmässä määrin kanssa H3K4 trimethylation ja H3K36 trimethylation tavaramerkkien yhdenmukaisia ​​tietojen yläpuolella osoittavat yhdessä aktiivinen chromatin markkaa (täysi histoni huomautus Näiden geenien esitetään S1 kuviossa) .

Nämä havainnot kannusti meitä toteuttamaan systemaattisemman edullisen insertiokohtia. Lähin geenin analyysi tunnistaa 6926 geenejä. Top 100 geenit määritettiin valitsemalla ensin tilastollisen merkitsevyyden (p 0,05 Fisherin testi), ja sitten ranking määräyksestä määrän lisäyksiä. Top 100 MCF-7 integraatio tavoitteita näillä kriteereillä kattavat 773 insertiot (6,7% kaikista lisäyksiä), ja ne esitetään S1 taulukossa. Nämä rajat verrataan Cancer Gene Census [23], tiukka, säännöllisesti päivitettävä tietokanta syövän geenien vahvan näytön kuljettajan geenin aseman (https://cancer.sanger.ac.uk/census/).

11 top 100 MCF-7 integraatio tavoitteita todettiin syöpä kuljettajan geenejä (katso kuvio 3A ja S2 taulukko). Tämä on erittäin merkittävä rikastamiseen taustatason yläpuolelle syövän kuljettajan geenejä genomissa koko, joka on 2,2% (p = 2.01E-09). Tutkia reittejä kohteena FeLV integraatio, top 100 kohde- geeniä kuulustelivat QIAGENin Ingenuity Pathway Analysis (IPA) ohjelmistopaketti (IPA, QIAGEN Redwood City, www.qiagen.com/Ingenuity). Huomasimme, että alkuun biologinen prosessi on määritelty tämän geenin asetettiin ”Cancer” (s arvoalueen 1.95E-2-4.6E-6, mediaani p = 0,00789), joka tarjoaa lisätodisteita valikoivuuden syöpään geeni-ohjelmien (kuvio 3B). Todettuaan, etuoikeutettu kohdentaminen syöpään kuljettajan geenejä, solutyypin spesifisyys kohdegeenien tutkittiin. IPA ”syöpä” huomautusta huipulle MCF-7 osumaa tutkittiin edelleen tarkastelemalla syöpä osaprosessit. Silmiinpistävän, kolme viidestä syöpään osaprosessit liittyivät rintasyöpään, osoittaa vahvaa kudosspesifisiä syöpää geeni allekirjoitus Top integraatio tavoitteet (kuvio 3C).

V: Prosenttiosuus top 100 insertion geeniryppäät jotka ovat syöpää kuljettajan geenejä verrattuna genomin koko. B: IPA top prosessit ryhmittymien osoittaa valikoima transformoitujen p-arvot, jossa mediaani merkitty harmaalla risti. C: Top 5 ’syöpä’ alatyyppejä tunnistaa IPA kanssa transformoitujen s arvo näytetään. Pisteviiva p = 0,05. D: Prosenttiosuus top 100 lisäys geeniryppäät joilla tiedetään rintasyöpä annotaatio määritettynä systemaattinen kirjallisuuskatsaus verrattuna satunnainen joukko 100 geenejä.

Voit tarkistaa rikastettu rintasyöpägeenin huomautus MCF -7 top integraatio sivustoja, näytön ja vertaisarvioitujen tieteellisessä kirjallisuudessa suoritettiin alkuun 100 MCF-7 kohdegeenien verrattuna 100 geenejä valittu sattumanvaraisesti. Minimoida bias, kussakin tapauksessa samassa hakusana käytettiin ( geenin nimi + ”rintasyöpä”), ja samoja perusteita tunnettu rintasyövän merkintä (suoraa yhteyttä geenin rintasyöpä kanssa jälkitarkastus esim knockdown tai lauseke tutkimukset). 29 alkuun 100 MCF-7 integraatio tavoitteet oli tiedossa rintasyöpä huomautusta, verrattuna 5 Satunnaisen 100 geenit, ero, joka oli erittäin merkitsevä (p = 3.35E-28, kuvio 3D). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että integraatio ensisijaisesti kohdistettu solutyyppispesifiselle geeni joukko, joka on myös merkitystä syövän fenotyyppiin.

Genes edullisissa insertiokohtiin FeLV näyttää heterogeeninen ekspressiotasot

Edellinen tutkimukset ovat osoittaneet, että gamma-retrovirukset integroituvat alueille aktiivisen geenin ilmentymisen, usein säätelyalueita, kuten tehostaja ja promoottori alueille. Sen määrittämiseksi, ovatko FeLV kohdistuu pisimmälle ilmaisivat geenit, top MCF-7 integraatio tavoitteita verrattiin pisimmälle ilmaistuna geenejä MCF-7-soluissa käyttäen aiemmin julkaistu microarray aineisto [24]. MCF-7 geenien luokiteltu intensiteetti ja asema top 100 GRIP kohdegeenien huomattava (kuvio 4A). Tämä analyysi ei osoittanut bias FeLV yhdentymisen pisimmälle ilmaisi geenejä. Analysoida suhteen tilastollisesti, lisäämällä otoskokoja käytettiin tutkimaan miten suhde vaihteli harkittaessa vain ylhäältä osumia tai laajemman geenin valinta. Taso päällekkäisyyttä kunkin näytteen koon verrattiin ennustetaan tapahtua sattumalta Monte-Carlo simulointi, ja p-arvot lasketaan (katso materiaalit ja menetelmät lisätietoja).

V: paremmuusjärjestyksessä käyrä, intensiteetti kaikki microarray koettimia MCF-7. Punaisella ovat top 100 geeniryppäät kohdistettuja mukaan FeLV paikoilleen. B: Muuttunut p arvot merkitystä yhdistyksen ylä- lisäyskohde geenien ja korkeimmin ilmaisi geenit eri näytekokoa. Katkoviiva p = 0,05 merkitsevyystasolla. C: Taulukko, joka osoittaa p-arvot edustettuina B eri otoskoot.

Top 150 retrovirus-kohdegeenien ei osoittanut suurempaa päällekkäisyyttä alkuun 150 erittäin ilmentyvien geenien odotettua sattumalta MCF-7 solut (p-arvot top 50, 100 ja 150 geenit olivat 1, 0,22 ja 0,43 vastaavasti (kuvio 4B ja 4C)). Pitkään ei-koodaavat RNA

MALAT1

oli ainoa geneettinen elementti, joka päällekkäin pisimmälle ilmaisivat geenien ja edullinen retrovirus- tavoitteet tässä analyysissä. Sillä varoituksella, että transkriptionopeuksien ja vakaassa tilassa RNA-tasot eivät ole synonyymejä, nämä tulokset viittaavat siihen, että alkuun 150 retroviruksen integraation tavoitteet ovat valitaan hienovaraisempaa prosessia kuin affiniteetti aktiivisin alueita isännän chromatin. Sen sijaan ulottuu analyysin useampien Edullisia kohteita ( 200) havaittiin yhä päällekkäisiä pisimmälle ilmaisivat geenejä, mikä viittaa bimodaalisen valintaprosessissa.

Gamma-retroviruksen integraation etusija: meta-analyysi

on osoittanut, että FeLV valikoivasti kohdistettu syövän kuljettaja geenien ihmisen rintasyövän solulinjaa, me soveltanut samaa lähestymistapaa julkaistu aineistoja on ”valitsematta” gamma retrovirus integraatiopaikkoja ihmissoluissa vahvistaa yleisyyttä nämä havainnot. Tämän meta-analyysi käytimme julkaistu insertion tietoja kahdesta ihmisen syöpäsolulinjasta, K562 ja HepG2 [18] ja normaalit CD34 + soluihin [17]. Vaikka nämä tutkimukset suoritettiin hiiren gRVs ja infektio ihmisen solujen saavutettiin Pseudotyypitys tarttuvien MLV viruksen VSV-G kirjekuori [18] tai amfotrooppisia vektorin toimitus [17] sijasta luonnollinen infektio, histoni koodi etusija hyvin samanlainen kuin meidän tutkimus totesi, mikä viittaa siihen, että konservoitunutta integraasin toiminta on määräävä tekijä spesifisyyden.

tiedot aineistot käytetään meta-analyysi on koottu kuvioon 5A. Julkaistut sarjat ovat huomattavasti suurempia kuin meidän MCF7 asetettu ja saada samanlainen useita edullisia insertiokohdan geenien asetamme korkeamman merkitys kynnys ennen sijoitusta geenien lukumäärästä lisäyksiä kuten aiemmin. Kolmen MLV aineistot oli jälleen erittäin merkittävä rikastamiseen syövän kuljettajan geenejä. CD34 + soluja, 15%: n ylä- kohdegeenien pisteytettiin syövän kuljettajien (rikastettu verrattuna koko genomin lähtötilanteessa, p = 2.69E-18) varten K562 määrä oli 11% (p = 2E-9) ja HepG2 6% (p = 0,0096).

V: Yhteenveto käytettävien tietojen mukaan luettuna koko aineistot. B: Heatmap osoittaa maailmanlaajuinen yhdistys GRV sisäänpanokohdat kanssa histonimodifikaation kaikille solulinjoissa. Sininen edustaa suosi arvosanat taas punainen edustaa asettaa epäedulliseen markkaa. Tähdellä merkitsevät merkitsevyystaso, jossa * on p 0,05, ** p 0,01 ja *** p 0,001. C: rikastaminen syövän kuljettajan geenejä jalostaminen top osumia kaikissa solulinjoissa. Katkoviiva prosenttiosuutta syövän kuljettajan geenien genomin (2,2%) D: kanta insertioita suhteessa transkription aloituspaikan kaikille solulinjoissa. Arvioitu määrä yhteensä lisäyksiä on esitetty alla kunkin kaavion.

epigeneettisellä merkkien kohteena viruksen kunkin solun yhteydessä tutkittiin edellä kuvatulla tavalla käyttäen chip seuraavat tiedot ENCODE (varten K562 ja HepG2-solut) tai Human Epigenetiikka tiekartta (CD34-solut). Samat histonimodifikaation katsottiin MCF-7-solut, sillä nämä ovat H3K27ac, H3K4me3, H3K36me3, H3K9me3 ja H3K27me3. Sopusoinnussa aiemmin julkaistujen tutkimusten, oli yleinen rikastamiseen viruksen insertiot aktiivisille chromatin markkaa (H3K27ac, H3K4me3 ja H3K36me3) samalla tukahduttava markkaa (H3K9me3 ja H3K27me3) on epäsuosiossa virus [17,18]. Ainoa poikkeus tähän kuvioon oli K562s jotka osoittivat rikastuminen lisäyksiä klo H3K27me3 merkki, vaikka tämä ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Tulokset on koottu kuvioon 5B.

Kuva 5C esittää selkeä suuntaus yhä rikastamiseen syövän kuljettaja geenien kohti eniten kohdistettuja geenit kaikissa neljässä solulinjoissa. Tämä kuvio on ainakin selvää HepG2 aineisto, vaikka on syytä epäillä, että alkuun osumia ehkä verhotaan kyllästyminen tähän valtavaan aineisto (3 x 10

6), johtuen pisteytystä aidosti riippumattomia lisäyksiä merkittävimpien hotpots kaksoiskappaleiksi. Todisteet tukevat tätä tulkintaa, jonka tarkastus jakelu lisäysten noin transkription aloituspaikkoja. Kun nämä normalisoidaan piikin korkeus, HepG2 näyttää paljon suuremman perustason kuin TSS insertiot, sopusoinnussa kylläisyyttä hypoteesin (kuvio 5D).

Kuvio 6A esittää päällekkäisyys geenien top 100 kullekin testatuista solulinjoista. Vaikka on olemassa joitakin yhteisiä kohdegeenien jaettu useamman kuin yhden solun tyyppi, mikä on herättävin on, että useimmat alkuun osumia ovat ainutlaatuisia, että tietyn solutyypin suhteellisen vähän päällekkäisyyttä. Laajentaminen aineistoja käsittämään 500 geenien ei vähennä tätä yleensä yksinoikeudella kuvio solutyypin mukaan, vaikka tämä rennompi cut-off paljasti pienessä määrässä kuusi ”yleisesti” kohdennettuja elementtejä:

MALAT1

,

MIR7851

.

1

,

RCC1

,

VMP1

,

ZC3H4

ja

ZMYND8

(kuvio 6B).

V: Venn-kaavio, josta ilmenee sen päällekkäisyyden top 100 geenikohteet kussakin solulinjassa testattu. B: As (A), mutta huomioon päällekkäisyys alkuun 500 geenit kustakin solulinjasta.

Gamma-retroviruksen integraation profilointi täydentää super-tehostajana profilointi

viimeisten tietojen mukaan GRV integraatio on välittää sitoutuminen BET paljasti pakottavia linkin syöpään, koska BET sitoutuminen asetyloitu histones on yksi määräävä piirre ”super-parantajia”, termi kuvaamaan suuria klustereita parantajia, jotka näyttävät tiheä sitoutumisen master sääntelyviranomaisten ja rooli kudosspesifisellä solun tunniste [25]. Lisäksi inhibiittorit BET sitoutuminen voi häiritä syöpäsolujen kasvun [16] ja tämä ilmiö on katsottu johtuvan akuutin herkkyyttä BET häiriöitä super-parantajina at onkogeenien kuten MYC ja BCL2 [26,27].

tutkimiseksi yhtäläisyyksiä GRIP ja super-parantajina määritelty biokemiallisia lähestymistapoja, vertasimme lähin geenejä tunnistaa molempia menetelmiä. Luettelot super-tehostaja liittyvät geenit saatiin dbSUPER tietokannasta [28] ja MCF7, K562, HepG2 ja CD34 primäärisiä soluja (RO01480, RO01536 ja RO01549). MCF-7-solut, vain 98 geenit kirjattiin super-tehostajana lista, ja näistä 8 oli syöpä kuljettajan geenejä määrittelemän viimeisimmän Cancer Gene Väestölaskentatiedot, verrattuna 11 alkuun 100 GRIP tavoitteet (kuvio 7A) . Samanlaisia ​​havaintoja havaittiin muiden aineistoja, ja vain K562 sarja paljasti vahvempaa rikastamiseen syövän kuljettaja geenien super-tehostajana liittyvät geenit päälle GRIP tavoitteet (23% vs. 11%; p = 0,004). Määrittelyn vaikeudesta tarkka raja-välillä super-parantajina ja tavanomaisten parantajia [29] havainnollistetaan suuren vaihtelun määrä super-parantajina tietyn solutyypin, jossa kolme ensisijaista CD34 + dbSUPER merkintöjä, joiden määrä superenhancers vaihdellen alkaen 326 733.

V: Prosenttiosuus top 100 geenit tunnistettu GRIP ja superenhancers jotka ovat syöpää kuljettaja geenit kaikissa solulinjoissa. B: Päällekkäisyys ylä- 100 geenit GRIP ja superenhancers kussakin solulinjassa.

Huolimatta yhtä paljon syöpää kuljettajan geenien tunnistettiin käyttäen kahta menetelmää, tunnistettujen geenien olivat enimmäkseen erillisiä, ja vain 2 /11 syöpä kuljettaja geenejä tunnistaa GRIP havaittiin myös super-tehostajana tietokanta MCF-7-solut (S2 taulukko). Tarkasteltaessa laajempaa geenin sarjaa, oli myös suhteellisen vähän päällekkäisyyttä tunnistettujen geenien top 100 GRIP ja super-tehostajana tavoitteet (kuvio 7B).

Pathway analyysi paljastaa selvästi ylävirtaan säätelijöinä retrovirus- tavoitteiden ja super-tehostajana liittyvien geenien

IPA ohjelmistopaketti sisältää moduulin arvioida todennäköisiä ylävirtaan transkription säätelijöinä tahansa otetun geeniperimä, auttaen valaisemaan biologisia toimintoja, jotka solukkojärjestelmässä. Jos haluat kattavan ja tilastollisesti vankka analyysi, olemme analysoineet 500 GRIP kohdegeenien kunkin solutyypin (taulukko 2). Vahvasti ennustettu ylävirtaan ohjaimet MCF-7 GRIP aineisto sisältyvät pääasiassa syövän kuljettajien (MYC, KMT2A) ja syöpään liittyvät geenit (ATF4). Erityisesti nämä geenit olivat itse kohdistettuja retroviruksen insertio, mikä niiden transkriptionaalisesti aktiiviseen tilaan ja saatavuuden integraatiota. Tämä analyysi viittaa siihen, että nämä geenit ovat mukana orchestrating ilmaus GRIP asetettua tavoitetta ja siten voi edustaa keskeisessä asemassa syövän ohjelman. Samanlaisia ​​havaintoja havaittiin muiden syöpäsolun linjat, ja normaaleille CD34 + soluja, vaikka jälkimmäisessä tapauksessa kaksi eniten voimakkaasti ennustettu alkupään kuljettajat olivat sytokiinien (CSF, IL- 15), joita ei ole kohdistettu retroviruksen integraation ja eivät ilmeisesti olleet kopiointia aktiivinen kohdesoluissa.

Tämä analyysi suoritettiin myös super-tehostajana liittyvän geenin sarjaa, ottaen top 500 geenit määritettynä ”sijoitus” on dbSUPER tietokannan merkintä, tai koko asettaa, jos oli vähemmän kuin 500 geenejä. Vaikka super-tehostajana liittyvän geenin setit olivat joissakin tapauksissa pienempiä (vaihteluväli 98-742 geenit), ne tuotti ennustivat ylävirtaan sääntelyviranomaisten kanssa samanlaisen tilastollisen tulokset. Jälleen nämä ylävirran sääntelyviranomaisten paljasti suhteellisen vähän päällekkäisyyttä GRIP ja super-tehostajana geenien, jotka kuvaavat erillisiä näkökulmia taustalla kasvuohjelmilla paljastanut näiden yhteydenottojen. Toinen ero on, että retroviruksen integraatio oli huomattavasti todennäköisempää kohdistaa GRIP ylävirtaan sääntelyviranomaisten verrattuna super-tehostajana sarja (p = 0,005, Fisherin tarkka testi).

Keskustelu

Tämä tutkimus osoittaa että gamma-retrovirus integraatiota ihmisen soluissa on vääristynyt syöpä kuljettajaa geenien erittäin solutyyppispesifisten tavalla. Vaikka gamma-retroviruksia on laajalti käytetty syövän geeni löytö työkaluja johtuen niiden insertionaalisesta Mutageenisuutta luonnollisessa isännät, tämä lähestymistapa edellytti työläs tehtävä kerätä useita loppuvaiheen kasvaimia eläinmalleissa ja vertailevaa genomista analyysit vahvistaa merkitystä havaintojen ihmisen syövän [5-7,11,30].