Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kasvava geneettisiä ja molekyylibiologisia todisteet viittaavat siihen, että häiriöt tasapaino Eritettyjen Frizzled-Related Protein-1 ( SFRP1) ja β-kateniinin on tärkeä rooli aloittamisen ja kehittämisen useita syöpiä. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia, onko ilmaus SFRP1 ja β-kateniinin liittyy kliinisiä-patologinen piirteitä potilaalla on eturauhassyöpä (PCA), ja arvioida niiden mahdollisia rooleja ennakoivaa ja prognostisia biomarkkereita. Tässä tutkimuksessa yhteensä 61 potilasta PCA ja 10, joilla on hyvänlaatuinen eturauhasen liikakasvu oli mukana, ja osoitimme, että ilmaus SFRP1 ja β-kateniinin korreloi Gleason pisteet, eloonjäämisaste ja vastaus hormonaalisen hoidon Eturauhassyövän. Eloonjäämislukuja PCa potilaalla on matala SFRP1 ilme (P = 0,016) tai korkea β-kateniinin lauseke (P = 0,004) olivat merkittävästi huonommat. Negatiivinen korrelaatio (r = -0,275, p = 0,032) välillä SFRP1 ja β-kateniinin havaittiin Chi-square testi. Monimuuttujamenetelmin ehdotti, että SFRP1 (riskisuhde 0,429; 95%: n luottamusvälit, ,227-,812; P = 0,009) voi toimia itsenäisenä ennakoivaa ja ennustetekijä PCA. Osoitimme myös, että proteiini ja mRNA tasot SFRP1 in androgeeniriippuvaisissa PCa LNCaP olivat merkittävästi korkeammat kuin androgen riippumaton PCa solulinjoissa DU145 ja PC3. Kuitenkin proteiinin taso β-kateniinin LNCaP-soluissa oli merkittävästi pienempi kuin vuonna DU145 ja PC3-soluissa, ja mitään merkittävää eroa β-kateniinin mRNA-tasolla havaittiin LNCaP, DU145 ja PC3-soluissa. Bisulfiitti sekvensointi PCR paljasti merkittävästi alhaisempi metylaatio taso

SFRP1

promoottori LNCaP-soluissa kuin siinä, DU145 ja PC3-soluissa. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että SFRP1, mikä ilmaisu käänteisesti korreloi kuin β-kateniinin, on suotuisa ennakoiva ja ennustetekijöiden biomarkkereiden.

Citation: Zheng L, Sun D, ​​Tuuletin W, Zhang Z, Li Q Jiang T (2015) Diagnostic arvo SFRP1 kuin myönteinen Ennakoiva ja Prognostiset biomarkkereiden potilailla, joilla Eturauhassyöpä. PLoS ONE 10 (2): e0118276. doi: 10,1371 /journal.pone.0118276

Academic Editor: Craig N. Robson, Northern Institute for Cancer Research, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 02 elokuu 2014; Hyväksytty: 12 tammikuu 2015; Julkaistu: 26 helmikuu 2015

Copyright: © 2015 Zheng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksin (21272032 TJ) National Natural Science Foundation of China (https://www.nsfc.gov.cn/publish /portal1 /). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on yleinen pahanlaatuinen kasvain virtsateiden, joka on kuudenneksi yleisin syy syövän liittyvän kuoleman miehillä [1-3], vaikuttaa vakavasti potilaan elämänlaatua. Suvussa tauti, etnisyyden ja korkea ikä tunnustetaan tärkeimmät tekijät ajo PCA taas yksityiskohtaiset patogeneesi tämä sairaus on vielä epäselvä [4]. Tällä hetkellä radikaali kirurginen resektio, säteily ja hormonaalisen hoidon käytetään hoidot Eturauhassyövän [5-8]. Kuitenkin tämä tauti on yleensä kuolemaan useimmille potilaille diagnosoitu myöhemmissä vaiheissa. Siksi on hyvin tärkeää tunnistaa arvokkaita ennakoivaa sekä varoituksia biomarkkereita varhaiseksi toteamiseksi ja selventää synnyssä Eturauhassyövän.

Wnt proteiineista erittyy kysteiinirikkaan glykosyloituneen ja lipidien muunnetut proteiinit, joka on merkittävä osa useissa soluprosesseja, kuten solujen erilaistuminen, proliferaatio, muuttoliike, synaptisen aktiivisuuden ja alkionkehityksen [9-14]. Nämä proteiinit aikaansaavat elintoimintoja läpi Wnt signalointireitille. Wnt-proteiinit sitoutuvat seitsemän transmembraanisen (7-Tm) reseptorien frizzled perheen, ja aktivoi sitten monimutkainen signalointi kaskadi, lopulta johtaa aktivaatioon alavirran kohdegeenien, kuten

c-myc, c-Jun, fibronektiiniä

ja

sykliini D1

[15,16]. β-kateniinin on tärkeä osa Wnt-signalointireitin, jonka muuttunut lokalisointi on tunnustettu merkkinä Wnt-signalointireitin aktivaatio [16]. Puuttuessa Wnt ligandin, sytoplasminen β-kateniinin on hajota β-kateniinin tuhoaminen kompleksi koostuu telineet ak- siini-proteiinin, kaseiinikinaasin 1 (CK1), adenomatoottisen polypoosin coli (APC) ja glykogeenisyntaasikinaasi 3 (GSK3) kautta ubikitiinipromoottori -proteasome kautta. Kuitenkin, kun läsnä on Wnt ligandin, Wnt ligandi sitoutuu reseptoriinsa, jolloin eston β-kateniinin tuhoa monimutkainen. Myöhemmin fosforyloitumaton β-kateniinin molekyylien kerääntyä sytoplasmassa, josta osa menevän tuman ja kohdistavat toimivat yhteistyössä aktivaattori LEF /TCF transkriptiotekijöitä, lopulta johtaa aktivoitumiseen Wnt kohdegeenien ilmentyminen [9]. Nykyisin yhä viittaavat siihen, että vapauttaminen Wnt-signalointireitin liittyy läheisesti PCA tuumorigeneesiä aikuisilla [17-20].

Eritettyä frizzled liittyvä proteiini-1 (SFRP1), joka tunnetaan myös SARP-2, ensin eristettiin ihmisen osteoblastisolujen, joka kuuluu erittyvä glykoproteiini SFRP perhe. Se satamat kaksi erillistä rakennedomeenien eli netrin domain ja CRD-domeenin. CRD verkkotunnus on homologinen frizzled reseptoreihin [16,21]. Tutkimukset osoittavat, että SFRP1 on antagonisti Wnt-signalointireitin aktivaatio, ja se voi sitoutua Wnt-proteiinien kautta CRD-domeenin kilpailukykyisellä tavalla kanssa transmembraanisen frizzled-reseptorin, mikä johtaa inhibitioon Wnt-signalointireitin [22-25]. SFRP1 tarvitaan eturauhasen kehittämiseen, ja kykenee sen rooli strooman-to-epiteelin parakriinisen modulaattori epiteelin kasvun haarautumisineen morphogenesis, ja epiteelin geeniekspressio [26]. Se on myös tunnustettu ehdokkaaksi välittäjänä strooman-to-epiteelin signalointi PCA [27]. Inaktivointi SFRP1 on raportoitu, koska korkea metylaatio

SFRP1

-geenin promoottori eri maligniteetteja, mukaan lukien PCa [28-35]. Lisäksi SFRP1 estää transkriptionaalista aktiivisuutta androgeenireseptorin (AR) ja leviämisen androgeeniriippuvaisen LNCaP-soluja [36]. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia roolia SFRP1 ja β-kateniinin ilmentymistä ihmisen PCa synnyssä.

Tässä raportissa, osoitimme, että oli negatiivinen korrelaatio SFRP1 ja β-kateniinin ihmisen PCa kudoksissa arvioimalla kliiniset-patologisen ominaisuuksia. Monimuuttuja-analyysi paljasti, että SFRP1 voi toimia itsenäisenä ennakoivaa ja ennustetekijä PCA. Proteiini ja mRNA tasot SFRP1 in androgeeniriippuvaisissa PCa LNCaP olivat merkittävästi korkeammat kuin androgen riippumaton PCa solulinjoissa DU145 ja PC3. Kuitenkin proteiinin taso β-kateniinin LNCaP-soluissa oli merkittävästi pienempi kuin vuonna DU145 ja PC3-soluissa, ja mitään merkittävää eroa β-kateniinin mRNA-tasolla havaittiin LNCaP, DU145 ja PC3-soluissa. Osoitimme myös, että metylaatio taso

SFRP1

promoottori oli merkitsevästi pienempi LNCaP kuin että DU145 ja PC3-soluissa. Yhdessä meidän tiedot osoittivat, että SFRP1 on todennäköisesti suotuisa ennakoivaa ja ennustetekijöiden biomarkkereiden.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tässä tutkimuksessa mukana ihmisen osallistujat hyväksyttiin eettisen komitean Dalian Medical University. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta ihmisen osallistujille. Kaikki tutkimus suoritettiin periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistuksen.

Soluviljely ja Experiment reagenssit

Ihmisen PCa solulinjat LNCaP, DU145 ja PC3 saatiin solusta pankin Shanghai haara Kiinan tiedeakatemia. LNCaP-soluja viljeltiin Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Gibco, USA), 100 ug /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. DU145-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Gibco, USA), 100 ug /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. PC3-soluja viljeltiin DMEM /F12, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Gibco, USA), 100 ug /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Kaikki solut inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2.

Kanin monoklonaalista anti-SFRP1 (ab126613) ja hiiren monoklonaalinen anti-β-kateniinin (ab22656) saatiin Abcam (Cambridge, UK). Hiiren monoklonaalinen anti-β-aktiini (C4) (sc-47778), vuohen anti-hiiri-IgG ja vuohen anti-kani-IgG saatiin Santa Cruz Biotech (CA, USA). Proteaasinestäjä seosta ostettiin Roche Applied Science (Basel, Sveitsi). 5Aza saatiin Sigma (Santa Clara, USA). SMARTpool siRNA: t (ohjaus ja β-kateniinin) neljällä yksittäisten siRNA kohdistaminen yhden geenin saatiin Thermo (USA).

PCa kudosnäytteitä immunohistokemiallista määritystä

Yhteensä 71 näytettä otettiin First Affiliated sairaala Dalian Medical University, Liaoning, Kiina 2002-2008, mukaan lukien 61 näytteitä potilaista, jotka patologisesti tai sytologisesti todennettujen adenokarsinooman eturauhasen ja 10 eturauhasen hyvänlaatuista liikakasvua näytteitä. Kaikki PCa näytteet olivat potilailta, joilla ikävaihtelu 44-84 (keski-ikä 72 vuotta). Kasvain laadut kirjattiin Gleason 7 (34 yksilöt), ja Gleason score≤7 (27 yksilöt). Mukaan kasvaimen etäpesäke (TNM) kehittämä järjestelmä American sekakomitean Cancer (AJCC), kaikki potilaat osallistuivat tähän tutkimukseen olivat T

3 /T

4 /N

x-1 M

0 vaiheessa. Eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun näytteet saatiin potilailta hoitoon ei-kasvain sairauksia, joissa iät vaihtelevat 48-81 (keski-ikä 71,8 vuotta). Kaikki potilaat seurattiin joulukuuhun 2013. elinaika vaihteli 3-60 kuukautta, ajan mediaani oli 38 kuukautta. Tänä aikana 38 potilasta kuoli syövän uusiutumiseen.

arviointikriteerit hoitovaste hormonaalisen hoidon: (1) Tehokas hormonaalisen hoidon. Sen jälkeen hormonitoimintaa hoitoon (lääkkeiden tai kirurgisen kastraation), PSA taso palaa normaaliksi ja 2 ng /ml kolmen vuoden kuluessa. Ei uusia etäpesäkeleesioita näkyvät luun kautta CT, MRI tai ECT skannaus; (2) Tehoton hormonaalisen hoidon. Sen jälkeen hormonitoimintaa hoito, PSA taso ei vähennä tai heikentää ohimenevästi ja sitten lisää. Disease pahentaa, ja uudet etäpesäkeleesioita näkyvät luun kahdessa vuodessa.

immunohistokemiallinen määritys

Kaikki näytteet analysoitiin immunohistokemiallisesti. Yksilöt irrotettiin toiminta kiinnitettiin 10% puskuroituun formaliiniin 24 tuntia, ja sitten kiinteät kudokset upotettiin parafiiniin. Neljä mikrometriä osat peräkkäisten parafinoidut näytteet leikattiin immunohistokemiallista analyysia varten, jossa apuna Histostain-Plus (Invitrogen, Camarilo, CA). Kaikki kohdat poistettiin parafiini ksyleenillä ja nesteytyksestä on lajitellut etanoliliuoksella. H

2O

2 (3%) käytettiin sammuttamiseksi endogeeniseen peroksidaasit yksilöiden ja sitten leikkeitä inkuboitiin esto seerumissa 10 minuuttia 37 ° C: ssa. Sitten leikkeitä värjättiin sitraattipuskurilla (pH 6,0), joka sisälsi joko anti-SFRP1 tai anti-β-kateniinin laimennoksella 1: 100 yli yön 4 ° C: ssa. Sitten leikkeitä inkuboitiin biotinyloidun vuohen anti-kani-immunoglobuliinin laimennoksena 1: 200 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, ja inkuboitiin sitten avidiini-biotiini-peroksidaasikompleksin kanssa 10 min ajan huoneenlämpötilassa. Lopuksi leikkeitä inkuboitiin DAB (diaminobentsidiini) käytettiin kromogeenina.

SFRP1-positiivista värjäytymistä tapaukset osoittivat kirkas ruskea keltaisia ​​rakeita sytoplasmassa. β-kateniinin-positiivista värjäytymistä tapaukset osoittivat kirkas ruskea keltainen rakeet cytomembrane ja tumassa. Pisteytys värjäytyminen tehtiin mukaisesti seuraavin perustein: (1) Pisteytys perustuu värjäytymisen intensiteettiä. 0, ei solujen värjäystä; 1, solut vaaleankeltainen; 2, solut vaaleanruskeaa; 3, solujen ruskea. (2) Pisteytys perustuu positiivisten solujen prosenttiosuuden. Näytteitä tarkkailtiin suuri teho suurennus (400 x). 10 satunnaisesti kentät valittiin, ja 100 solua per kenttä laskettiin. 0, 25% cell värjäys; 1, 25% -50% solunvärjäysmenetelmällä; 2, 51% ~75% solunvärjäysmenetelmällä; 3, 75% cell värjäystä. Yhdessä (1) + (2) 3 kirjattiin positiivista näytettä, kun taas (1) + (2) ≤3 kirjattiin negatiivista näytettä.

Western blot -määritys

LNCaP, DU145 ja PC3-solut käsiteltiin tai ei 5Aza (DNA: n metylaatio estäjä) kerättiin ja lyysattiin kylmään puskuriin (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0,5% natriumdeoksikolaattia, ja proteaasinestäjä seosta). Sen jälkeen kun oli sentrifugoitu 12000 rpm: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa, näytteet supernatanttia suoritettiin SDS-PAGE. Sitten proteiini bändejä geeli siirrettiin poly vinylideenifluoridi (PVDF) (Millipore), ja tutkittiin osoitetulla primaarisen vasta-aineen yli yön 4 ° C: ssa. Seuraavaksi PVDF-kalvo inkuboitiin sopivan sekundäärisen vasta-aineen kanssa 4 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Tulokset analysoitiin kemiluminesenssidetektiolla. Tiedot kvantitoitiin skannaamalla sopiva bändejä kiinnostava ja piirrettiin suhteellinen tiheys harmaasävyjen. Koe toistettiin kolme kertaa.

kvantitatiivinen RT-PCR-määritys

Yhteensä RNA: ta kustakin solulinjasta (LNCaP, DU145 ja PC3) uutettiin käyttäen RNAiso Plus-reagenssia (Takara, Dalian, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden. Käänteinen transkriptio suoritettiin avulla käänteisen transkription (Takara, Dalian, Kiina). Reaaliaikainen PCR suoritettiin LightCycler Real-Time PCR System (Roche Diagnostics, Basel, Sveitsi). Seuraavia alukkeita suunnitteli Primer Premier 5,0 käytettiin: 5′-CCCGAGATGCTTAAGTGTGACAA-3 ’(sense) ja 5′-ACTCGCTGGCACAGAGATGTTC-3’ (antisense) ja

SFRP1

; 5′-AGAAAAGCGGCTGTTAG-3 ’(sense) ja 5′-ATACAGGACTTGGGAGGT-3’ (antisense) ja

β-kateniinin

; 5′-CAGGTCATCACTATCGGCAA-3 ’(sense) ja 5′-CAAAGAAAGGGTGTAAAACGC-3’ (antisense) ja

β-aktiini

. Näytteet, jotka sisältävät cDNA: ta, sopiva alukkeiden parin ja maksimit SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo) tehtiin seuraavan reaktion: alkudenaturaatio vaihe 95 ° C: ssa 10 min; ja 40 sykliä 95 ° C 30 s, 55 ° C: ssa 15 s, ja 72 ° C: ssa 20 s. 2

– △△ CT menetelmää käytettiin tietojen analysointia. MRNA tasot

SFRP1

ja

β-kateniinin

normalisoituivat

β-aktiini

, joka toimi endogeeninen kontrolli.

bisulfiittimodifiointi sekvensointi PCR-määritys (BSP) B

DNA: ta kustakin solulinjasta (LNCaP, DU145 ja PC3) uutettiin käyttäen DNA puhdistustarvikepakkausta (Tiangen, Peking, Kiina) mukaan valmistajan suositusten. Eristetty DNA käsiteltiin natriumbisulfiitin avulla CpGenome Fast DNA Modification Kit (Millipore) mukaisesti valmistajan suositusten mukaisesti. DNA käsiteltiin natriumbisulfiitin monistettiin GeneAmp 9600 PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Seuraavia alukkeita suunnitteli Primer Premier 5,0 käytettiin: 5′-GGTTAAGGTAGGAGTATTATTTGAGGT-3 ’(sense) ja 5′-AACCTAAATCATACTTACAAACCCAT-3’ (antisense) ja CpG-saarekkeen 1

SFRP1

promoottori; 5′-TTGTTTTTTAAGGGGTGTTGAGT-3 ’(sense) ja 5′-TACCACAAACTTCCAAAAACCTC-3’ (antisense) ja CpG-saarekkeen 2

SFRP1

promoottori. Seuraavat reaktio-olosuhteet suoritettiin 10 sykliä 95 ° C 5 min, 95 ° C: ssa 30 s, 60 ° C-50 ° C: ssa 45 s (alkaen 60 ° C: ssa ensimmäisen syklin, mutta lämpötila väheni 1 ° C: ssa kunkin myöhemmän jakson), ja 72 ° C: ssa 45 s; 33 sykliä 95 ° C 30 s, 50 ° C: ssa 45 s, ja 72 ° C: ssa 45 s; ja 60 ° C: ssa 30 minuutin ajan. PCR-tuotteet puhdistettiin käyttämällä DNA puhdistustarvikepakkausta (Tiangen, Peking, Kiina), ja kloonattiin PMD-19T vektorin (Takara, 6013). Sen jälkeen muutos, 10 positiivista kloonia kustakin BSP näytettä valittiin sekvensointiin käyttämällä 3730xl DNA-analysaattori (Applied Biosystems).

Tilastollinen analyysi

Chi-square (

χ

2) testiä käytettiin selvittämään korrelaatio SFRP1 ja β-kateniinin ilmaisun ja kliinisen patologisen ominaisuuksia PCA kudoksissa 71 potilasta. Potilaan eloonjäämisluvut analysoitiin Kaplan-Meier-menetelmällä. Spearmanin suoritettiin arvioimaan suhdetta SFRP1 ja β-kateniinin ilme. Data ilmaistiin keskiarvoina ± SDS. Erot keskiarvojen analysoitiin ANOVA seurasi monivertailu Student-Neuman-Keuls testejä ja bi-variantti suhde analyysit. Tilastollinen merkittävyys harkita

P

0,05 tasolla.

Tulokset

ilmentyminen SFRP1 ja β-kateniinin liittyy kliinisiä-pathologic piirteitä ihmisen PCa

Poikkeava ilmentyminen SFRP1 ja β-kateniinin on merkittäviä rooleja kehittämisessä erilaisia ​​syöpiä, kuten sappiteiden syöpä, limakalvon epidermaalista, lisämunuaiskuoren kasvaimet ja kohdunkaulan syöpä [16,37-39]. Kuitenkin rooli SFRP1 ja β-kateniinin PCa ei ole selvitetty. Tutkiakseen roolinsa PCA, tutkimme onko ilmaus SFRP1 ja β-kateniinin korreloi kliinisen patologisen ominaisuuksia joukossa 61 PCa näytteitä

χ

2 testiä. Tilastollisesti merkitseviä eroja ei havaittu Gleason pisteet, eloonjäämisaste ja reagointi hormonaalisen hoidon kahden proteiineja, kun taas tilastollisesti merkitsevää eroa havaittiin iässä, etäpesäke ennen leikkausta ja PSA (taulukko 1). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että ilmaisu SFRP1 ja β-kateniinin korreloi Gleason pisteet, eloonjäämisaste ja vastaus hormonaalisen hoidon Eturauhassyövän potilaista, kun taas ei korreloinut iän, etäpesäke ennen leikkausta ja PSA taso.

vaikutus SFRP1 ilmentymisen eloonjäämisaste PCA potilailla

edelleen määritellä suhde SFRP1 /β-kateniinin ilmaisun ja kokonaiselossaolo PCA, eloonjäämiskäyrien piirsi Kaplan-Meier menetelmä. Tulokset paljastivat, että SFRP1-negatiivinen potilailla esiintyi merkitsevästi huonompi yleistä eloonjäämisaste kuin SFRP1-positiivisilla potilailla (P = 0,016, Fig. 1A). Sen sijaan, β-kateniinin-positiiviset potilaat, oli huomattavasti huonompi yleistä eloonjäämisaste kuin P-kateniinin-negatiivisella potilaalla (P = 0,004, Fig. 1 B). Nämä tulokset viittaavat siihen, negatiivinen SFRP1 ilmaisun ja positiivinen β-kateniinin ilmaisu heikentänyt yleistä eloonjäämisaste potilaiden PCA.

A: n suhde SFRP1 ilmaisun kanssa kokonaiselossaoloaikaa potilailla PCA (P = 0,016). B, suhde on β-kateniinin ilmaisutapoja kokonaiselossaoloaikaa potilailla PCA (P = 0,004).

arvioimiseksi osuus kliinisen patologisen ominaisuuksia mahdollisina ennakoivaa sekä varoituksia biomarkkereita, analysoimme 6 kliinisen patologisen muuttujat 61 PCa potilaiden monimuuttujamenetelmin. Kuten taulukosta 2, Vain SFRP1 ilme oli tilastollisesti merkitsevä tekijä (P = 0,009), ja voitiin tunnistaa itsenäisenä ennakoivaa ja prognostinen indikaattori, joka osoittaa, että SFRP1 ekspressio voi olla paras ennakoiva sekä varoituksia biomarkkeri eloonjäämismahdollisuus PCA keskuudessa näistä muuttujista.

ilmentyminen SFRP1 ja β-kateniinin korreloi negatiivisesti PCA

Voit selvittää korrelaatio SFRP1 /β-kateniinin ilmentymistä ja esiintyminen PCA proteiinin ilmentymistä of SFRP1 ja β-kateniinin eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun ja eturauhassyövän näytteitä verrattiin immunohistokemiallinen (Fig. 2). Kaikkiaan 71 kudosnäytteistä (10 eturauhasen hyvänlaatuisen hyperpslasia ja 61 eturauhaskasvaimissa) analysoitiin. Mukaan luokituskriteereitä, 8 (80%) 10 eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun näytteet luokiteltiin positiivisiksi SFRP1 ilmaisun ja 2 (20%) luokiteltiin negatiiviseksi, kun taas Tuumorinäytteissä, SFRP1 ilmaisu laski merkittävästi 36 (59% ) positiivisia ja 25 (41%) negatiivinen. Sen sijaan, hyvänlaatuisen eturauhasen liikakasvun näytettä, 9 (90%) luokiteltiin negatiivinen β-kateniinin ilmaisun ja 1 (10%) oli luokiteltu positiivinen ilmaisu, kun taas β-kateniinin ilmaisu merkitsevästi lisääntynyt 29 (47,5%) positiivinen ja 32 (52,5%) negatiivinen tuumorinäytteissä (taulukko 3). Todistaakseen spesifisyyden β-kateniinin vasta-siRNA knockdown Koe suoritettiin käyttäen PC3-soluissa. Endogeeninen β-kateniinin ilmentymistä väheni 86% vuonna PC3 transfektoiduissa soluissa siβ-kateniinin allas verrattuna PC3 transfektoitujen solujen siControl (S1 Kuva). Nämä tulokset osoittivat, että SFRP1 ilmentyminen väheni, kun taas β-kateniinin ekspressio lisääntyi PCa.

, edustavat tulokset osoittavat immunohistokemiallisella värjäyksellä SFRP1 ja β-kateniinin osan ihmisen eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun kudoksiin. Vasemmassa paneelissa, nuolet osoittavat, että lokalisointi SFRP1 tasaisesti jakautuneena sytoplasmassa. Oikeanpuoleisessa paneelissa, nuolet osoittavat, että lokalisointi β-kateniinin oli pääosin solukalvon. B, The immunohistokemiallisella värjäyksellä SFRP1 ja β-kateniinin osa ihmisen eturauhassyövän kudosten (SFRP1 negatiivinen ja β-kateniinin positiivinen). Oikeanpuoleisessa paneelissa, nuolet osoittavat, että β-kateniinin pääasiassa lokalisoitu sekä sytoplasmassa ja tumassa. C, The immunohistokemiallisella värjäyksellä SFRP1 ja β-kateniinin osa ihmisen eturauhassyövän kudosten (SFRP1 positiivinen ja β-kateniinin negatiivinen). Vasemmassa paneelissa, nuolet osoittavat, että lokalisointi SFRP1 oli pääasiassa solulimassa.

tarkastella niiden suhdetta SFRP1 ja β-kateniinin PCA kudoksissa, proteiini tasot SFRP1 ja β-kateniinin eturauhaskasvainnäytteissä analysoitiin khi-neliö-testejä. Mukaan meidän luokituskriteereitä, 36 näytteet tunnistettiin SFRP1-positiivinen ilme, ja 25 tunnistettiin SFRP1-negatiivinen ilmaus in 61 PCa näytteitä. 23 (63,9%) ja SFRP1-positiiviset näytteet osoittivat negatiivista β-kateniinin ilmentymistä, kun taas vain 9 näytettä (36%) oli negatiivinen β-kateniinin ilmentymistä SFRP1-negatiiviset näytteet (taulukko 4). Nämä tulokset osoittivat, että oli negatiivinen korrelaatio SFRP1 ja β-kateniinin PCa (r = -0,275, p = 0,032).

edelleen määrittää muutoksen SFRP1 ja β-kateniinin ilmentymistä eri PCa solulinjat, proteiini- ja mRNA-tasojen SFRP1 ja β-kateniinin LNCaP, DU145 ja PC3-solut käsiteltiin tai ei 5Aza tutkittiin. Niistä, LNCaP on androgeeni-riippuvaisia ​​ihmisen eturauhassyövän solulinja, kun taas DU145 ja PC3 on androgeeni-riippumaton ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa, jotka ovat erittäin pahanlaatuisten kuin LNCaP-soluja. Kun pahanlaatuinen aste kasvoi vähitellen, proteiini ja mRNA tasot SFRP1 PCA soluissa hoitaa ilman 5Aza väheni merkittävästi, kun taas sekä proteiini ja mRNA tasot SFRP1 oli säädellään ylöspäin PCA soluissa käsitelty 5Aza (Fig. 3A 0,05. ns, ei ole merkittävä. Täyspitkän blot kuvion. 3A on esitetty S2 kuvassa.

Muutokset on

SFRP-1

geenin metylaatio PCA solulinjoissa

metylaatio

SFRP1

geeni promoottori on raportoitu johtavan alas-säätely SFRP1 proteiinin ja mRNA-tasoja, ja tärkeitä rooleja aloittamisen ja kehittämisen kasvaimia. Koska proteiini ja mRNA tasot SFRP1 merkittävästi, laskivat aste maligniteetin, ja 5Aza DNA metylaatio estäjä, säädelty sekä proteiini ja mRNA tasot SFRP1 PCA solulinjoissa, me arveltu, että SFRP1 hiljentäminen oli todennäköisesti aiheuttama by

SFRP1

geenin metylaatio. Tämän mahdollisuuden tutkimiseksi, metyloinnin

SFRP1

geenin promoottori LNCaP, DU145 ja PC3-solut käsiteltiin tai ilman 5Aza tutkittiin BSP määrityksessä. Metylointi esiintyy yleensä CpG-rikas promoottorialueille, nimeltään CpG saari saari koko 100, GC% 50, Obs /Exp 0,6. Bioinformatiikan analyysi osoitti, että 2 CpG-saarekkeiden saattaa metyloitavaa

SFRP1

geenin promoottori (Fig. 4A, sinisen alueet). BSP määritys osoitti, että sekä CpG saarilla

SFRP-1

promoottorin metyloitavaa LNCaP, DU145 ja PC3-soluissa. Metylointi hinnat CpG-saarekkeiden 1 ja 2 LNCaP-soluissa, joita käsiteltiin ilman 5Aza oli 32,5% ja 2,7% vastaavasti, kun taas molemmat metylaation hinnat laski 9,3% ja 1,1%, kun 5Aza hoidon (Fig. 4B). Vuonna DU145 soluissa metylaatio hinnat CpG-saarekkeiden 1 ja 2 väheni 36,7% ja 85,6%: sta 12,6% ja 47,9%, tässä järjestyksessä jälkeen 5Aza hoidon (Fig. 4C). PC3-soluissa, molemmat metylaation hinnat laskivat 85% ja 71%: sta 38,3% ja 44,1%, kun 5Aza hoidon (Fig. 4D). Nämä tulokset vastasivat saatuja tietoja Western blot analyysi (Fig. 3A kuitenkin ihmisen PCa näytteissä, β-kateniinin pääasiassa lokalisoitu sytoplasmassa ja tumassa korkeamman proteiinin ilmentymisen määrä verrattuna hyvänlaatuisen eturauhasen liikakasvun näytteitä (Fig. 2B oikea paneeli). On raportoitu, että β-kateniinin vuorovaikutuksessa AR ja parantaa androgen stimuloimaa transkriptionaalista aktiivisuutta AR, mikä viittaa siihen, että asema β-kateniinin eturauhasen syövän synnyssä ei voida rajoittaa transkription aktivoituminen TCF /LEF [56]. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että β-kateniinin ilmentymistä oli positiivinen 47,5% Eturauhassyövän näytteistä, kun taas vain 10% (1/10) positiivinen ilmentymistä havaittiin eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun näytteet (taulukko 2). Positiivinen ilmaus β-kateniinin PCA oli myös merkitsevästi korreloi Gleason pisteet, eloonjäämisaste ja reagointi hormonaalisen hoidon (taulukko 1). Olemme osoittaneet, että PCa potilaalla on positiivinen β-kateniinin ilme oli merkitsevästi huonompi yleistä eloonjäämisaste (Fig. 1 B). Lisäksi ilmaus β-kateniinin merkitsevästi ajan säädellä yhä enemmän maligniteetin (Fig. 3C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että ekspression β-kateniinin liittyy läheisesti heikompaan ennusteeseen, ja että poikkeava aktivaatio Wnt-signalointireitin edistää kehitystä PCa.

SFRP1 kykenee sen funktio Wnt-signalointireitin kuin tunnettu antagonisti frizzled-reseptorin, ja on ehdotettu olevan tuumorisuppressori useissa ihmisen syövissä [57,58]. Tiedot immunohistokemiallisella värjäyksellä osoitti, että lokalisoinnin SFRP1 tasaisesti sytoplasmassa (Fig. 2A vasen paneeli), mikä on yhdenmukaista sen ilmentymistä useissa muissa kudoksissa [34,59]. Kuitenkin SFRP1 lokalisointi on vallitsevasti sytoplasminen perinuclear sisään sappeen ja virtsarakon syöpien [16,60]. Ero jakelu SFRP1 voi johtua kudosspesifistä ilmentymistä.