Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

epiteelisolujen adheesiomolekyyli (EpCAM) -pohjaisen luettelointi kiertävien tuumorisolujen (CTC) on ennusteen arvioinnissa potilailla, joilla on kiinteitä kasvaimia, kuten kehittyneitä rinta-, paksusuoli-, ja eturauhasen syöpä. Kuitenkin huono herkkyys on raportoitu ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Tämän ongelman, kehitimme microcavity array (MCA) integroitu pienikokoinen laite CTC eristäminen turvautumatta EpCAM ilme. Täällä raportoimme tuloksista kliinisen tutkimuksen CTC kehittyneiden keuhkosyöpäpotilaita jossa vertasimme MCA-järjestelmään CellSearch järjestelmä, joka käyttää perinteistä EpCAM perustuva menetelmä.

Methods

Pariksi ääreisveren kerättiin 43 metastaattisen keuhkosyöpäpotilaita luetella CTC käyttäen CellSearch mukaista järjestelmää valmistajan protokollan ja MCA järjestelmän immunoleimaus ja cytomorphological analyysi. Läsnäolo CTC arvioitiin sokeasti ja itsenäisesti molempia järjestelmiä.

Tulokset

CTC havaittiin 17 22 NSCLC käyttävän potilaan MCA järjestelmä versus 7 22 potilasta käyttäen CellSearch järjestelmää. Toisaalta, CTC havaittiin 20 21 pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) käyttävien potilaiden MCA järjestelmä versus 12 21 potilaasta käyttäen CellSearch järjestelmää. Huomattavasti enemmän CTC NSCLC potilailla havaittiin MCA-järjestelmän (mediaani 13, vaihteluväli 0-291 solua /7,5 ml) kuin jota CellSearch järjestelmän (mediaani 0, alue 0-37 solua /7,5 ml), mikä osoittaa tilastollisesti merkitsevästi parempi (p = 0.0015 ). Tilastollista merkitsevyyttä ei saavutettu SCLC, vaikka trendi suosii MCA-järjestelmän yli CellSearch järjestelmän havaittiin (p = 0,2888). MCA järjestelmä myös eristetty CTC klusterit potilasta, joita oli todettu CTC negatiivinen käyttäen CellSearch järjestelmää.

Johtopäätökset

MCA järjestelmä on mahdollista eristää merkittävästi enemmän CTC ja CTC klustereita kehittyneissä keuhkosyöpäpotilaita verrattuna CellSearch järjestelmään.

Citation: Hosokawa M, Kenmotsu H, Koh Y, Yoshino T, Yoshikawa T, Naito T, et ai. (2013) Koko-Based eristäminen Kiertävä kasvainsolujen keuhkosyöpäpotilaiden käyttäminen microcavity Array System. PLoS ONE 8 (6): e67466. doi: 10,1371 /journal.pone.0067466

Editor: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong

vastaanotettu: 18 tammikuu 2013; Hyväksytty: 17 toukokuu 2013; Julkaistu: 28 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Hosokawa et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ osittain tukea alueellisen Innovation tutkimusohjelmaa ja Grant-in-tuki Research Fellowship nuorten tutkijoiden (11J11150) alkaen opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science and Technology of Japan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: MH, TYoshino, HKanbara, ja TM on hakenut patenttia liittyvät MCA järjestelmään . HKanbara työskentelee Hitachi Chemical Co., Ltd. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpään liittyvän kuoleman useimmissa teollisuusmaissa. Pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) osuus noin 15% keuhkosyöpää, ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), joka sisältää adenokarsinooma (ADC) ja okasolusyöpä (SCC), osuus 85% keuhkosyöpää . Se on äskettäin osoitettu, että tunnistaminen pienisoluista keuhkosyöpää havaitsemaan geneettisiä poikkeavuuksia, erityisesti

EGFR

-activating mutaatioita ja

EML4-ALK

fuusio geenin, mahdollistaa paremman ennusteen vaste EGFR tyrosiinikinaasin kinaasi-inhibiittorit ja ALK-estäjien, vastaavasti [1], [2]. Edistysaskelista huolimatta ehkäisyyn ja hoitoon, NSCLC potilaat ovat usein diagnosoitu pitkälle edenneessä ja on huono ennuste, koska taudin taipumusta kaukainen etäpesäke, ensisijainen syy kuolleisuus NSCLC potilaiden. Ominaista aggressiivinen kasvaimen kasvua ja usein joilla esiintyy etäpesäkkeitä aluesolmujen ja etäinen elimiin, SCLC on aluksi erittäin herkkä kemoterapia mutta yleensä hankkia chemoresistance, mikä väistämättä uusiutumisen.

Kiertävä kasvainsolujen (CTC) on määritelty kuten kasvainsoluja kiertävät perifeerisessä veressä potilaista, joilla oli metastaattinen syöpä. Kun mitataan Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkevirasto (FDA) -hyväksytty CellSearch järjestelmä (Veridex, Raritan, NJ, USA), määrä CTC ääreisverenkierrossa voidaan käyttää ennustamaan ennuste metastasoituneen rintasyövän [3], kolorektaalisyöpä [4], eturauhassyöpä [5], NSCLC [6], ja SCLC [7]. CellSearch järjestelmä rikastaa CTC käyttäen magneettisia helmiä, joka on päällystetty monoklonaalisella vasta-aineella kohdistaminen epiteelisolujen markkeri, kuten epiteelisolujen-adheesiomolekyyli (EpCAM) [8], [9]. Kuitenkin, useat tutkimukset ovat osoittaneet, että kun läsnä on EpCAM kasvainsoluihin vaihtelee kasvaimen tyypin [10], [11]. Ilmaisu epiteelisolujen markkereita, kuten EpCAM, on vaimentua lisätä invasiivisuus ja metastaattisen potentiaalin epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) [12] – [16]. On ehdotettu, että alhainen esiintyvyys CTC havaittu potilailla, joilla on pitkälle edennyt NSCLC käyttäen CellSearch järjestelmä voi johtua menetys EpCAM ilmaisun [17], mikä osoittaa, että EpCAM perustuva CTC eristämismenetelmää voi saavuttaa vakaa ja toistettavissa CTC toipuminen kaikki kasvaintyypeille.

Muut CTC eristämismenetelmää perustuvat pääasiassa kokoerot ja muovattavuuden välillä CTC ja verenkierron solujen. Koska kasvainsolut ( 8 um) ovat suurempia kuin leukosyytit [18] – [21], eristämistä koko epiteelikasvainsolut (ISET) voidaan saavuttaa käyttämällä suodatusta erottamaan yksittäisiä soluja. ISET käyttäen polykarbonaattia suodatinta, edullinen, käyttäjäystävällinen menetelmä rikastaa CTC, mahdollistaa elpyminen ja havaitseminen epiteelin-markkeri-negatiiviset CTC perusteella koko riippuvan CTC eristäminen. Kliinisissä kokeissa, käyttämällä ISET-pohjainen järjestelmä on todettu saavuttaa korkeampi CTC herkkyys metastasoituneen keuhkosyöpä verrattuna käytön CellSearch järjestelmän [22] – [24].

Äskettäin mikrovalmistettu laitteet kokoon perustuva erottaminen kasvainsolujen on laajasti kehitetty mahdollistamaan tarkan ja tehokkaan rikastaminen CTC kokoverestä [25] – [28]. Näitä laitteita ovat pienoiskoossa microcavity array (MCA), joka me kehitetty erittäin tehokas loukkuun yksittäisten solujen suodattamalla erojen perusteella koot solujen [29], [30]. Aikaisemmassa tutkimuksessa selvitimme soveltamista meidän MCA järjestelmän havaitsemista spiked kasvainsolujen käsittelemättömien ihmisen kokoverestä perustuu kokoerot ja muovattavuuden välillä kasvainsolujen ja muiden verisolujen [31]. Käyttämällä laitetta, pystyimme ansaan kasvainsoluihin päälle koko- ja geometria-ohjattu microcavity paneelit koostuu 10000 aukkojen kohdistamalla alipaine, jolloin sulkeutuneen solut voidaan helposti luetella ja analysoitiin mikroskooppinen kuvantaminen tietyillä aloilla. Lisäksi olemme havainneet, että käyttämällä pienennetty laitteen sallittu käyttöön sarja reagenssien havaitsemiseksi kasvainsolujen kautta mikrofluidistiikkaan rakenteen. Tuloksemme osoittavat, että järjestelmä on yksinkertainen mutta tarkka järjestelmä havaitsemiseen kasvainsolujen sisällä kokoverta. Vahvista ja rakentaa meidän aiempien havaintojen vertasimme kapasiteettia ja tehokkuutta uusia MCA järjestelmä ja nykyinen kultakanta CellSearch järjestelmä suorittamisessa CTC toteamiseen ja laskemiseen kokoveressä otetuista näytteistä kohortin NSCLC ja SCLC potilaita.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimusasetelma ja eettinen lausunto

Tämä ennakoiva tutkimus tehtiin arvioimaan CTC luettelointi käyttäen CellSearch järjestelmää ja MCA järjestelmä metastasoituneen keuhkosyöpä pidennetyn kokeessa (Umin kliininen tutkimus rekisterin, numero UMIN000005189). Läsnäolo CTC arvioitiin erikseen niiden kriteerien ennen tietäen mitään tuloksia toisistaan. Tutkimuksessa kriteereillä oli diagnoosi patologisesti todistettu keuhkosyöpä kanssa radiologisesti selvää etäpesäkeleesioita eli histologisesti tai sytologisesti vahvistettu metastasoitunut NSCLC tai SCLC ja ilmoittautuminen klo Shizuoka Cancer Center. Institutionaalinen tarkastuslautakunta on Shizuoka Cancer Center hyväksynyt tutkimussuunnitelman, ja kaikille potilaille tarjotaan kirjallinen lupa. Jokaisesta 43 potilasta, jotka oli otettu, joiden joukossa 22 oli diagnosoitu NSCLC ja 21 kanssa SCLC, 10-15 ml verta kerättiin EDTA putkissa CTC luettelointi MCA järjestelmä laboratoriossamme (Shizuoka Cancer Center, Shizuoka , Japani) ja 20 ml kerättiin CellSave keräysputkiloita CTC luettelointi, joita CellSearch järjestelmän laboratoriossa SRL Inc. (Tokio, Japani).

Soluviljely ja Leimaus

HCC827, NCI-H358, NCI-H441, DMS79, NCI-H69, ja NCI-H82 solulinjoja ostettiin American Type Culture Collection ilman lisätestejä tai todennus. A549 (riken Bioresource Center, Tsukuba, Japani) ja PC-14 [32] ystävällisesti Dr. Fumiaki Koizumi (National Cancer Center, Tokio, Japani). A549, HCC827, NCI-H358, NCI-H441, PC-14, DMS79, NCI-H69, ja NCI-H82-pienisoluisen keuhkosyövän ja SCLC solulinjoja viljeltiin RPMI 1640 -elatusaineessa, joka sisälsi 2 mM L-glutamiinia (Sigma-Aldrich, Irvine, UK), 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (FBS, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA), ja 1% (v /v) penisilliiniä /streptomysiiniä (Invitrogen Corp.) ja 3-4 päivää 37 ° C: ssa 5% CO

2 täydentämistä. Välittömästi ennen kutakin koetta solut kasvatettiin konfluenssiin trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen fosfaatilla puskuroituun suolaliuokseen (PBS). Koska mittaus kasvaimen solun koko, solun kokojakauma määritettiin käyttäen CASY® Cell Counter + Analyzer System Model TTC (Scharfe System GmbH, Reutlingen, Saksa). Arvioida laitteen suorituskykyä, kasvaimen solulinjojen leimattiin CellTracker Red CMTPX (Molecular Probes, Eugene, OR, USA), jossa on merkinnät saavuttaa inkuboimalla soluja seuranta-väriainetta (5 uM) 30 minuutin ajan. Sen jälkeen, kun solut oli pelletoitiin sentrifugoimalla (200 g 5 min), supernatantti dekantoitiin. Sitten solut pestiin kahdesti PBS: llä poistaa kaikki ylimääräinen väriaine ennen suspendoitiin uudelleen PBS: ään, joka sisälsi 2 mM EDTA: ta ja 0,5% naudan seerumin albumiinia (BSA).

Fabrication of MCA System

MCA-järjestelmä valmistettiin samalla tavalla, kuten aiemmin on raportoitu [29], [31]. CTC luettelointi kanssa fluoresenssimikroskoopilla havainto, MCA, joka oli valmistanut sähkömuovauksessa nikkeliä käytettiin. CTC morfologinen analyysi Giemsa-värjäys, läpinäkyvä MCA, joka oli valmistettu laser-säteilytys poly (eteenitereftalaatti) (PET) on käytetty. Kukin 10000 onteloita järjestetty kuhunkin 100 x 100 matriisi valmistettiin olla halkaisijaltaan 8-9 um yläpinnan ja 60 um etäällä viereisen microcavity. Poly (dimetyylisiloksaani) (PDMS) rakenteet valmistettiin ja sitten integroitu MCA siten, että ylemmän substraatin koostui mikrokammion, näytteen syötössä, ja ulostulo, kun taas alemman alustan alapuolella MCA sisälsi tyhjöputkella tuottaa negatiivisen paineen, mahdollistavat solujen loukkuun. CTC eristäminen laite on rakennettu kokoamalla MCA, kun ylempi ja alempi PDMS kerrokset muodostettiin käyttäen spacer nauhat (kuva 1a). Näyte tulo on yhdistetty säiliöön, kun taas alipaine mikrokanavan on kytketty peristalttisen pumpun.

(a) Kaavamainen esitys rakenteesta MCA-järjestelmän. (B) Pyyhkäisyelektronimikroskoopilla kuva viljeltyjen kasvainsolujen solulinja loukkuun MCA-järjestelmän. (C-f) solut eristetään SCLC potilaan verestä värjättiin Hoechst 33342 (c) ja fluoresoivasti leimattuja vasta-aineita, jotka on kohdistettu sytokeratiini (d) ja CD45 (e). Sulauttaminen kuvien (f) sallitaan tunnistamiseen CTC ja verenkierron solujen. Asteikko bar = 60 pm.

CTC Enumeration käyttäen MCA System

Ihmisen verinäytteitä kerättiin keräysputki EDTA hyytymisen estämiseksi ja käyttää 2 tuntia. Keskimääräinen veren määrä analysoitu oli 4,0 ml näytettä kohti (vaihteluväli 3,0-7,5 ml). Kaikki CTC luettelointi käyttäen MCA järjestelmä tehtiin ilman tietoa potilaan kliinisen tilan laboratoriossa Shizuokan Cancer Centerin Research Institute. Käyttöönoton jälkeen verinäytettä säiliöön alipaine levitettiin solususpensio käyttäen peristalttista pumppua liitetty alipaine, minkä avulla näytteen läpi mikro-onkaloihin virtausnopeudella 200 ul /min. Poistaa verisolujen jäljellä array, PBS, joka sisältää 2 mM EDTA: ta ja 0,5% BSA: ta (1 ml), lisättiin säiliöön ja johdettiin mikro-onkaloihin virtausnopeudella 200 ul /min 5 min.

värjää CTC anti-pancytokeratin vasta-aineen loukkuun solut kiinnitettiin juoksuttamalla 400 ui 1% paraformaldehydiä (PFA) PBS läpi MCA virtausnopeudella 20 ul /min 20 minuutin ajan. Pesun jälkeen 100 ul: lla PBS: ää, solut käsiteltiin 300 ui 0,2% Triton X-100 PBS: ssa virtausnopeudella 20 ul /min 15 minuutin ajan. Läpäiseväksi tekemisen jälkeen, soluja käsiteltiin 3% BSA: ta PBS: ssa virtausnopeudella 20 ul /min 30 minuutin ajan. Tunnistaa CTC ja leukosyytit, 600 ui solu-värjäys, joka sisälsi 1 ug /ml Hoechst 33342 (Molecular Probes); cocktail anti-pancytokeratin vasta-aineita (Alexa488-AE1 /AE3 (1:100 laimennus; eBioscience, San Diego, CA, USA) ja FITC-CK3-6H5 (1:60 laimennos, Miltenyi Biotec, Auburn, Kalifornia CA USA); ja PE-leimattua anti-CD45-vasta-ainetta (1:120 laimennus, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) läpi johdettiin mikro-onkaloihin virtausnopeudella 20 ul /min 30 minuutin ajan. Lopuksi, matriisi pestiin 400 ui PBS: ää, joka sisälsi 2 mM EDTA: ta ja 0,5% BSA: ta poistaa kaikki ylimääräinen väriaine. talteenoton jälkeen kasvainsolujen, kuvan koko kennoston pinta-ala saatiin käyttämällä fluoresenssimikroskooppia (BX61, Olympus, Tokio, Japani) integroitu 10 x objektiivin linssin ja tietokoneella toimiva moottorivaihetta; WU, NIBA, ja WIG suodinsarjat, jäähdytettyä digitaalikamera (DP-70, Olympus) ja Lumina Vision hankinta ohjelmisto (Mitani Corporation, Tokio, Japani).

kliinisissä tutkimuksissa, koko kuvan solun array alue oli saatu käyttämällä fluoresenssimikroskooppia (Axio Imager Z1, Carl Zeiss, Oberkochen, Saksa) integroitu 10 × tai 20 × objektiivilinssi ja tietokoneella toimivat moottoroidut vaiheessa; WU, FITC, ja Texas Red suodinsarjat; digitaalikameran (AxioCam HRc; Carl Zeiss); ja AxioVision hankinta ohjelmisto (Carl Zeiss). Myöhemmin kuva-analyysi oli tehty, ja esineitä, jotka tyytyväisiä ennalta määrättyjen kriteerien oli laskettu. Fluoresoiva intensiteettiä ja morfometrista ominaisuuksia, kuten solujen koon, muodon, ja ydinvoiman koko, katsottiin suoritettaessa CTC tunnistamista ja ei-kasvainsolujen syrjäytymisen solujen ominaista kierroksen soikea morfologia ja näkyvä ydin (eli kun Hoechst-33342 positiivinen), jotka olivat positiivisia sytokeratiinia ja negatiivisia CD45 tunnistettu CTC. Eristetty CTC läpinäkyvälle MCA värjättiin myös käyttäen May-Grünwald-Giemsa (MGG) värjäys menetelmä koostuu kiinnityksen kanssa 4% PFA, laimentamaton May-Grünwald tahra 2 min, May-Grünwald tahra laimennettuna 50% PBS: ssä 1 min ja Giemsa tahra 18 min, mitä seurasi huuhtelu PBS: ssä 1 minuutin ajan.

CTC leimaus käyttäen CellSearch System

Kokoverinäytteet pidettiin huoneen lämpötilassa, lähetetään yön laboratorioon SRL Inc., ja sitä käsitellä 96 tunnin keräyksestä. Kaikki CTC arvioinnit tehtiin ilman tietoa potilaan kliinisen tilan laboratoriossa ja tulokset raportoitiin kvantitatiivisesti määrä CTC /7,5 ml verta. CTC määriteltiin EpCAM-eristetty ehjät solut positiivisia värjäytymistä sytokeratiinia ja negatiivisesti värjätty CD45. Aikaisempien arviointien CellSearch järjestelmän [8], potilaan katsottiin CTC positiivinen jos ≥2 CTC /7,5 ml verta havaittiin potilaan näytteestä.

Tulokset

CTC eristäminen ja kuva-analyysi käyttäen MCA System

eristäminen ja värjäys kasvainsolujen kokoverta päätökseen 120-180 min, ja kuva skannaus MCA suoritettiin 3 fluoresenssi aallonpituuksilla käyttäen 10 x tai 20 x objektiivilinssi ja moottoroitu vaiheessa. Kuvio 1 b-f näkyy skannaus electroscope (SEM) ja fluoresenssi kuvia värjättyjen solujen jotka on otettu talteen sen MCA. Kuten voidaan havaita, yksinäinen solut ja soluklusterien yksitellen loukussa ja pitää mikro-onkaloihin, jotka voitaisiin helposti luetella. Talteen solut, jotka oli kierroksen soikea morfologia ja näkyvä ydin (ts olivat Hoechst 33342 positiivinen) ja olivat positiivisia pancytokeratin ja negatiivisia CD45: n suhteen havaittiin kasvainsoluja, kun taas CD45-positiiviset solut tunnistettiin kontaminoivat normaalit hematologiset solut. Kuvat osoittavat, että on olemassa selvä immunofenotyyppi epiteelisolujen marker-positiivisia kasvainsoluja. Vaikka useat leukosyyttejä pidettyjen array, kasvainsolulyysiksestä leimaus on verrattain helppo, koska yksittäiset solut oli loukkuun tarkasti kohdistettu mikro-onteloita.

herkkyys MCA System CTC havaitseminen Keuhkosyöpä Cell Lines

meidän edellisessä tutkimuksessa vaihteleva määrä solujen keuhkosyövän solulinjaa NCI-H358 terästettiin vereen, ja kasvainsolujen eristäminen arvioitiin käyttämällä MCA-järjestelmän [31]. Laskettu havaitseminen tehokkuus oli vakio ja yli 90%, kun 10-100 kasvainsolut olivat läsnä millilitrassa verta. Tässä tutkimuksessa arvioidakseen elpymisen tehokkuutta eri keuhkosyövän solulinjoja käyttäen MCA järjestelmä, 100 solua kutakin 8 keuhkosyövän solulinjat (A549, HCC-827, NCI-H358, NCI-H441, PC-14 DMS-72, NCI-H69, ja NCI-H82) terästettiin terveitä luovuttajan verinäytteitä ja käsitellään sitten MCA määrityksessä. Taulukossa 1 on esitetty keskimääräinen hyötysuhde ja tyypillinen halkaisija solulinjoissa. Kuten voidaan havaita, korkea hyötykäyttöaste saatiin, riippumatta kasvaimen tyyppi, vaihdellen 68%: sta 100%: in solulinjassa piikki-kokeissa. Suurin osa talteen soluista oli toimintakykyinen ja pystyy lisääntymään vielä kun niitä eristysprosessissa, mikä viittaa mahdolliseen edelleen biologisten ja molekyylitason analyysi CTC.

Seuraavaksi, jotta voidaan arvioida spesifisyys ja herkkyys CTC havaitsemisen herkkyys testit tehtiin keinotekoinen näytteistä valmistetaan lisäämällä 1 ja 3 viljeltiin NCI-H358-solujen terveen luovuttajan verinäytteistä, kuten aiemmin raportoineet Vona et al. [20]. Yksi ja 3 viljeltiin NCI-H358-soluja piikkeinä erillisiin 7,5 ml: n erillä verta. Nämä 7,5 ml verinäytteitä prosessoitiin MCA järjestelmä 3 riippumattomissa testeissä (taulukko S1). Tulokset osoittivat kynnysarvo MCA järjestelmä lähes 1 kasvainsolun kohden 7,5 ml verta. Lisäksi, CTC ei havaittavissa 6 terveestä luovuttajasta vereen käyttäen MCA (kuva 2). Näin ollen potilas, joka pidettiin CTC positiiviseksi, jos ≥1 CTC per 7,5 ml verta havaittiin MCA-järjestelmän.

CTC count /7,5 ml verta on esitetty 6 terveeltä luovuttajalta, 22 pienisoluista keuhkosyöpää ja 20 SCLC potilaiden .

lisäksi, tuumorisolun talteentottotehoa MCA järjestelmän verrattiin ISET (kuva S1). Tässä vertailussa 100 solua NSCLC solulinjan NCI-H358 terästettiin terveitä luovuttajan verinäytteitä ja käsittelee sitten MCA järjestelmä ja rata-kaiverrettu polykarbonaatti 8 um huokosia kalvo (Nucleopore; Whatman Ltd, Kent, UK). Tulokset paljastivat takaisinperintäastetta käyttäen MCA-järjestelmän (100% ± 5%) on huomattavasti suurempi kuin käyttäen ISET järjestelmää (91% ± 2%) (p 0,05, t-testi), mikä osoittaa, että käyttö MCA järjestelmä mahdollistaa CTC eristäminen, joiden hyötysuhde on sama tai suurempi kuin ISET järjestelmän.

CTC Enumeration käyttäen CellSearch järjestelmä ja MCA System

Tehdään sokea vertailun havaitsemisen herkkyyden CellSearch ja MCA järjestelmät, verinäytteet kerättiin 22 metastasoitunut NSCLC ja 21 SCLC potilaiden välillä huhtikuussa 2011 ja helmikuu 2012 ja analysoitiin määrittämiseksi määrä potilaita tunnistettiin CTC positiivinen kukin järjestelmä (taulukko 2). Näiden näytteiden, 1 kerätystä näytteestä 1 SCLC potilas ei arvioitu MCA järjestelmää, koska riittämätön määrä verta oli kerätty käsittelyä varten molemmissa järjestelmissä. Tämän seurauksena 17 22 (77%) pienisoluista keuhkosyöpää tunnistettiin CTC positiivinen käyttäen MCA järjestelmää, mutta vain 7 22 (32%) pienisoluista keuhkosyöpää käyttäen CellSearch järjestelmän (taulukko 3). Näistä potilaista 8 tunnistettiin CTC positiivinen sekä CellSearch järjestelmän ja MCA järjestelmä, 1 tunnistettiin CTC positiiviseksi CellSearch järjestelmään vain, ja 9 tunnistettiin CTC positiivinen MCA järjestelmään vain. Ottaen huomioon saadut tulokset molempien järjestelmien yhteen, 18 (82%) NSCLC potilaiden todettiin CTC positiivinen. Analyysi Näiden havaintojen kävi ilmi, että huomattavasti suurempi määrä NSCLC potilaiden havaittiin CTC positiivinen MCA-järjestelmän (mediaani solumäärä 13, alue 0-291 solua /7,5 ml; kuva 2) kuin jota CellSearch järjestelmän (mediaani solumäärä 0 , alue 0-37 solua /7,5 ml), mikä osoittaa tilastollinen paremmuus MCA järjestelmän CTC luettelointi (p = 0,0015, Wilcoxonin testi, taulukko 3).

Sen sijaan 20 20 (100%) SCLC potilailla todettiin CTC positiivinen käyttäen MCA-järjestelmän versus 12 21 (57%) potilaalla käyttäen CellSearch järjestelmää. Mediaani CTC määrä havaittiin olevan 2 solua /7,5 ml (vaihteluväli 0-325) käyttämällä CellSearch järjestelmää ja 23 solua /7,5 ml (vaihteluväli 2-2329) käyttämällä MCA (kuva 2). Vaikka ei saavutti tilastollisen merkityksen havaitseminen herkkyys MCA järjestelmän CTC luettelointi osoitti suuntaus on suurempi kuin CellSearch järjestelmän (p = 0,2888, Wilcoxonin testi, taulukko 3). Kunkin tulos, välinen sopimus testitulokset järjestelmistä arvioitiin Bland-Altman tonttien [33]. Analyysissä koskevan sopimuksen CTC luettelointi NSCLC potilaiden keskimääräinen ero oli 50,1 (95% CI, alue 11,1-89,1), jossa rajat sopimuksen vaihtelevat -125,8-+226,0. MCA järjestelmä tuotti suhteettoman korkeampi CTC laskee suuremmilla keskiarvoja verrattuna CellSearch (kuva S2a). Sen sijaan analysoinnissa koskevan sopimuksen CTC puuston SCLC potilailla, keskimääräinen ero oli 202,6 (95% CI, alue -116,7-521,9), jossa rajat sopimuksen vaihtelevat -1162,0-+1567,2. Toisin analyysin kanssa NSCLC verinäytteiden, ei bias välillä havaittiin järjestelmien analysointiin SCLC näytteiden paitsi, kovasti CTC tiitterin (kuvio S2b). Tilastollinen analyysi paljasti myös ei yhdistyksen välillä sivusto etäpesäke ja CTC lasken keuhkosyöpäpotilaita käyttämällä joko järjestelmän (tuloksia ei ole esitetty).

morfologinen Ominaisuudet CTC eristetty käyttäen MCA System

CTC oli lasketaan, tunnistetaan olevan sytokeratiinia positiiviset ja CD45 negatiivinen, ja sillä on näkyvä ydin pohjalta analyysin loisteputki kuvia. Kuten voidaan havaita kuviossa 3, joka esittää edustavan galleria CTC tunnistaa kuva-analyysi, CTC ovat suurempia kuin ympäröivä leukosyyttien ja esiintyvät usein klustereita, määritellään tässä vierekkäisiä ryhmiä, jotka sisältävät 3 tai enemmän ytimiä. Kuvio 4 esittää yksinäinen CTC ja CTC klusterin havaittiin yhdessä SCLC potilas käyttää MCA-järjestelmän. Käyttämällä MCA järjestelmä, CTC klustereita havaittiin 2 22 NSCLC potilaat (Patient nro 13 ja 21) ja 4 21 SCLC potilaat (Patient nro 31, 33, 34, ja 43). May-Grünwald-Giemsa värjäys CTC eristettiin käyttämällä MCA järjestelmä osoitti, että niille on ominaista korkea N /C-suhde, ydin- laudaksi, ja morfologiset samankaltaisuutta ensisijainen kasvainsoluihin.

Solut värjättiin Hoechst 33342 , FITC-leimattu anti-sytokeratiini-vasta, ja PE-leimattua anti-CD45-vasta-aine.

Voi-Grünwald-Giemsa-värjättyjen solujen osoitti korkeaa tuma-sytoplasma-suhde ja ydin- laudaksi (x 40). Musta nuoli osoittaa 9-pm microcavity. Asteikko bar = 60 um.

Keskustelu

ISET järjestelmien on havaittu olevan suurempi CTC herkkyys kuin CellSearch järjestelmän useissa syövissä, mukaan lukien NSCLC [17], [22] kuitenkin huokoset ISET suodattimia, jotka on valmistettu polykarbonaatista raidan etsaus, sijoitetaan satunnaisesti järjestelmien puitteissa klo epäyhtenäinen tiheys. Toisin kuten rata-syövytetty polykarbonaattisuodattimille, koko, geometria, ja tiheys mikro-onteloita, että MCA-järjestelmän arvioidaan nykyisen tutkimuksessa on tarkasti ohjattu saavuttaa tietyn solun erottaminen mukaan eroja solujen koon ja muovattavuuden. Kohdistaminen solujen MCA paitsi helpottaa solukuvauksessa mahdollistamalla skannauksen tietyillä aloilla, joilla on automatisoitu fluoresenssimikroskoopilla mutta mahdollistaa myös väheneminen työvoiman tarvitaan CTC laskenta [29], [31]. Sinänsä MCA järjestelmä tarjoaa alustan käytön suurikapasiteettisten kuvantamisen tekniikoita, jotka tarjoavat nopeampia ja vähemmän kalliita tiedonkeruu sekä CTC luettelointi ja edistyksellisen molekyylitason ilmiöitä, myös fluoresenssi in situ -hybridisaatio havaitsemiseen kasvainspesifisten genomista muuttuu. Lisäksi MCA on integroitu pienikokoinen laite niin, että rikastamista CTC verestä sekä värjäystä ja pesun mikrofluidinen määrityksessä, voidaan suorittaa yhden integroidun laite.

Tässä tutkimuksessa, CTC eristetty on MCA onnistuneesti värjättiin fluoresenssileimattua aineita, jotka kohdistuvat tuumorisolun markkereita, ja värjäys ja pesu havaittiin olevan vähän tai ei lainkaan vaikutusta säilyttämisestä kasvain solujen mikro-onkaloihin. Koska sen erittäin pieni koko, MCA järjestelmä on kannettava, joka mahdollistamalla point-of-care CTC laskenta, poistaa tarpeen lähettää veren testaukseen epäsuotuisissa lähetys olosuhteissa ja nopeuttaa kliinistä päätöksentekoa. Nämä ominaisuudet, lisäksi meidän äskettäin kehitetty menettely eristämiseksi single soluja MCA käyttää microcapillaries, anna syöpäsolujen ottaa talteen MCA myöhempää molekyylitason analyysi CTC [29].

Tässä sokea vertailussa käyttö MCA-järjestelmän tavanomaisen CellSearch järjestelmä CTC puuston keuhkosyöpäpotilaita MCA järjestelmä todettiin pystyy eristämään eri keuhkosyövän solulinjoja piikkeinä sisällä kokoveri korkea hyötysuhde. Kuitenkin MCA järjestelmä suorittaa eristämällä SCLC solulinjojen hieman tehottomammin verrattuna NSCLC solulinjojen, mikä osoittaa, että pienet (alle 8 um halkaisijaltaan) soluissa SCLC solulinjojen voisi kulkea mikro-onkaloihin aikana veren suodattamiseksi. Aikaisemmassa tutkimuksessa [31], huomasimme, että rinta (MCF-7 ja Hs578T), mahalaukun (AGS ja SNU-1), ja paksusuolen (SW620) kasvainsolut linjat, jotka sisältävät EpCAM-negatiivisia kasvainsoluja voidaan onnistuneesti talteen käyttämällä MCA-järjestelmä, jossa on yli 80%: n hyötysuhde. Olemme kuitenkin myös, että tehokkuus elpyminen pieniä soluja (keskimääräinen halkaisija 11,6 pm) kasvaimen solulinja SW620 olevan hieman pienempi kuin muut solulinjat, kuten teimme että SCLC solulinjojen tutkittu tässä tutkimuksessa.

MCA järjestelmä arvioitiin tässä tutkimuksessa havaittiin omaavan korkeamman herkkyys kuin CellSearch järjestelmän NSCLC CTC luettelointi, mikä viittaa paremmuus koko- ja muovattavuuden perustuva eristämistekniikoista verrattuna immunomagneettisia perustuvia tekniikoita. Huono herkkyys CellSearch syyksi on alhainen EpCAM ilmaisun kehittynyt NSCLC. Kuitenkin yksi NSCLC potilaiden arvioitu tässä tutkimuksessa havaittiin olevan CTC positiivinen käyttäen CellSearch järjestelmää, mutta CTC negatiivinen käyttäen MCA-järjestelmän, mikä osoittaa, että muutokset EpCAM ilmaisua ei ainoastaan ​​selittää havaitut erot kahden järjestelmän NSCLC luettelointi .

CTC havaitsemismäärä käyttäen CellSearch järjestelmää SCLC potilailla oli 67%, huomattavasti korkeampi kuin NSCLC potilaiden ja yhdenmukaisia, että aiemmissa tutkimuksissa [7], [34] – [36]. Vaikka MCA järjestelmä ei perustu EpCAM ilmaisun, joka verenkierrossa SCLC solut on ilmoitettu osoittavan korkeita [37], suorittaessaan CTC eristyksissä, sen käyttö todettiin tuottavat korkean havaitsemismäärä, mikä osoittaa, että se voitaisiin hyödyntää CTC havaitseminen paitsi NSCLC vaan myös SCLC potilaita. Kuitenkin, CTC laskee useiden potilaista oli suurempi, kun analysoitiin käyttämällä CellSearch System verrattuna MCA-järjestelmän, joka osoittaa, että pieniä kasvainsolujen potilaan verelle voi virrata mikro-onteloita, kuten edellä on kuvattu. Aiempi tutkimus on ehdottanut, että immunomagneettisia erotusmenetelmillä puuttuu kyky eristää suuria klustereita, kun taas käyttö kokoon perustuva erottaminen tekniikoita johtaa menetys pieniä CTC [17]. Näiden ongelmien, muoto mikro-onteloita, että MCA oli muunnettu parantamaan niiden tehokkuutta eristetään pieniä soluja kasvainsoluista kokoveren meidän tuoreessa tutkimuksessa [38].

Havainnointi CTC klustereiden on raportoitu erilaisissa syövissä, mukaan lukien keuhkosyöpä [23], [24], [39] – [42]. On arveltu, että muodostamalla klustereita antaa CTC solujen etuja jäljellä yksinäinen kannalta selviytymisen, proliferatiivisen kapasiteetin ja kyky muodostaa micrometastases. Tässä tutkimuksessa CTC klusterit eristettiin sekä NSCLC ja SCLC käyttävän potilaan MCA-järjestelmän. Mielenkiintoista on, että CTC-positiiviset klustereita todettiin olevan pieni määrä CTC-solujen CellSearch järjestelmään, mutta suuri määrä MCA-järjestelmän. Yksi syy siihen, miksi useita SCLC potilailla havaittiin suuri CTC määrä, kun arvioidaan MCA-järjestelmä voi olla, että tämä järjestelmä mahdollistaa eristyksen suurempi CTC klustereita, joita ei voida eristää immunomagneettisella erottaminen. Tarkastelu Tämän hypoteesin vaatii vielä yksityiskohtaisen analyysin ominaisuudet CTC klustereita, kuten ilmaus epiteelin markkereita ja läsnäolo apoptoottisten solujen CTC klustereita, jotka voitaisiin suorittaa käyttämällä MCA-järjestelmän.

Yhteenvetona meidän