Krooninen sairaus

tiivistelmä

Forkhead laatikko proteiinia O1 (FOXO1), keskeinen jäsen FOXO perheen transkriptiotekijöiden, toimii tuumorisuppressorina ja on liittynyt eri keskeisten solun toimintoja, kuten solun kasvussa, erilaistumiseen, apoptoosin ja angiogeneesin. Siksi on hämmentävä miksi FOXO proteiinin ekspressio vaimentua syöpäsoluissa. MikroRNA, ei-koodaavat 20~22 nukleotidin yksijuosteisia RNA: t, aiheuttaa translaation tukahduttamisen tai hajoamista ja geenien niiden kohdegeenien, ja merkittävästi lisää geenin ilmentymisen säätelyyn. Nykyisessä tutkimuksessa raportoimme, että miR-370 ilmentyminen oli merkittävästi voimistunut viidessä eturauhassyövän solulinjoissa, verrattuna normaaliin eturauhasen epiteelin (PrEC-solut). Ektooppinen ilmentyminen miR-370 indusoitua proliferaatiota ja lisäsi kiinnittämisestä riippumaton kasvu ja pesäkkeiden muodostuminen kyky DU145 ja LNCaP eturauhas- syöpäsolujen, kun taas inhibitiota miR-370 vähensi leviämisen ankkurista riippumattomaan kasvuun ja pesäkkeiden muodostumista kyky. Lisäksi säätelyä miR-370 edistää pääsyn DU145 ja LNCaP eturauhassyövän solut G1 /S solusyklin siirtymä, joka liittyy downregulation sykliini-riippuvaisen kinaasin (CDK) estäjät,

p27

Kip1

ja

p21

CIP1

ja säätelyä solu- syklin säädin sykliini D1 mRNA. Lisäksi osoitimme, että miR-370 voi downregulate ilmaus FOXO1 suoraan kohdistettu

FOXO1

3′-alue. Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että miR-370 on tärkeä rooli leviämisen ihmisen eturauhasen syöpäsolujen suoraan tukahduttamalla tuumorisuppressorigeenin FOXO1.

Citation: Wu Z, Sun H, Zeng W, hän J Mao X (2012) lisääntymisen merkkejä MircoRNA-370 indusoi in Human syöpäsolujen jonka downregulating transkriptiotekijä FOXO1. PLoS ONE 7 (9): e45825. doi: 10,1371 /journal.pone.0045825

Editor: Jindan Yu, Northwestern University, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 24, 2012; Hyväksytty: 24 elokuu 2012; Julkaistu: 18 syyskuu 2012

Copyright: © Wu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Nämä kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

Kilpailevat edut: Weixia Zeng työskentelee kaupallinen yhtiö Laura Biotech Co, Ltd. Tämä ei muuta meidän noudattamista kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Toinen kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on toiseksi yleinen maligniteetti miehillä, yli 0.780.000 uutta tapausta esiintyy maailmanlaajuisesti vuosittain [1]. Noin 190000 miehet ovat diagnosoitu eturauhasen syöpä ja yli 27360 eturauhassyöpä potilaista kuolee vuosittain Yhdysvalloissa [2]. Eturauhassyöpä on merkittävä kansanterveydellinen ongelma ja siihen liittyy merkittäviä terveydenhuollon kustannuksia. Seerumin prostataspesifisen antigeenin (PSA) seulonta on käyttökelpoinen varhaisen diagnoosin eturauhassyövän; kuitenkin, PSA on monia puutteita, esimerkiksi PSA-pitoisuudet ovat usein koholla miehillä, jotka kärsivät eturauhasen hyvänlaatuisen tulehdus. Hoito strategiat tällä hetkellä saatavilla eturauhassyövän, mukaan lukien kirurgisen kastraation ja kemoterapia ovat yleensä epäonnistuneet [3]. On tunnettua, että eturauhasen syöpä vauriot ovat heterogeenisiä ja usein vastata hyvin alkuperäiseen androgeenien puute hoitoa (ADT) [4]. Tällä hetkellä useimmat eturauhassyöpäpotilaalla valitsi gonadotropiinia vapauttavan hormonin (GnRH) agonistia /antagonisti sijaan kirurgisen kastraation, ja ADT on pääasiassa sovellettu kuin systeeminen hoito potilailla, joilla on etäpesäkkeitä. Kuitenkin monet eturauhassyöpäpotilaalla lopulta kokevat uusiutumisen ja androgeeniriippumattomuuteen, mikä johtaa nopeutetun taudin etenemistä ja kuolema [4], [5]. Siksi uudet tavoitteet tehokas eturauhassyövän hoidossa strategioita kiireellisesti tunnistettava.

Vaikka sekä geneettiset ja ympäristötekijät pidetään tärkeimmistä tekijöistä, molekyylimekanismeja eturauhassyövän kehittymisen ja etenemisen edelleen suureksi osaksi tuntemattomia. Pahanlaatuiset kasvaimet ovat tunnusomaista säädeltyyn aktiivisuus säätelyreittejä jotka säätelevät lisääntymistä ja /tai apoptoosin. Kyky inhiboida yhtä tai useampaa keskeisiä tavoitteita näiden signalointipolkujen voivat tarjota uusia läpimurtoja syövän hoidossa. Useita säätelyreittejä, kuten androgeenireseptorin (AR) signalointireitin ja Akt /proteiinikinaasi B (PKB) signalointireitin keskeisessä asemassa apoptoosin säätelyyn ja leviämisen eturauhasen syöpäsolujen 6-10. Siksi on tärkeää ymmärtää näitä reittejä, koska löytö avaimen viranomaisilla voi paitsi tuottaa tarkkoja varoituksia syntymässä olevista, mutta voi myös tarjota uusia hoidon strategioita eturauhassyövän.

Akt /PKB-reitin edistää solujen eloonjäämistä säätelemällä useita transkriptiotekijöitä, mukaan lukien forkhead transkriptiotekijä superperheen [11], kuten forkhead laatikko proteiini O1 (FoxO1, joka tunnetaan myös haarukan pään rabdomyosarkoomiin [FKHR]), FoxO3a (FKHRL1), FoxO4 (AFX) ja FoxO6 . Koska eristäminen forkhead geenin

Drosophila melanogaster

, yli 100 rakenteellisesti liittyviä forkhead transkriptiotekijöiden on tunnistettu [12]. Jäsenten FOXO alaperheen ovat evoluutiossa konservoituneen transkription aktivaattorit, tunnettu siitä, että erittäin konservoituneen forkhead domeenin, joka sisältää DNA: ta sitova motiivi [13]. FOXO1 tunnistettiin aikana tutkimus t (2,13) ​​(q35; q14) ja t (1,13) (P36, Q14) kromosomitranslokaation, joita esiintyy yleisesti keuhkorakkuloiden poikkijuovaislihassarkoomaa luuston ja lihasten kasvain esiintyy lapsilla [ ,,,0],14]. FOXO proteiinit on keskeinen asema erilaisissa biologisissa prosesseissa, kuten apoptoosin, solusyklin, erilaistuminen, stressistä, DNA-vaurioiden korjaus ja glukoosiaineenvaihdunnan [15]. Aktivointi FOXO alaperheen jäsenet voivat upregulate solusyklin estäjät p21

CIP1 ja p27

Kip1, ja downregulate solusyklin säädin sykliini D1 /2, näin ollen johtaa G1 /S solusyklin pidätyksen [16] – [ ,,,0],18]. Siksi FOXO transkriptiotekijät ovat keskeisiä tuumorisuppressoreilla. Kasvava todistusaineisto viittaa siihen, että aktivaatio FOXO1 indusoi apoptoosia eturauhassyövän soluissa [18] – [23]. Brunet et ai. osoittivat, että vuorovaikutuksessa 14-3-3 kaperoni proteiinien fosforylaatio voi aiheuttaa tumaansiirtymiseen on FOXO transkriptiotekijöiden [13]. Kuitenkin syy miksi FOXO on vaimentua syöpäsoluissa huonosti ominaista. Niinpä hypoteesi, että vaihtoehtoinen mekanismi voi säädellä FOXO proteiinin ilmentymistä syöpäsoluissa.

MikroRNA (miRNA) ovat luokan pieniä, ei-koodaus, yksijuosteisia RNA: ita, jotka voivat säädellä negatiivisesti geenin ilmentymisen post -transcriptional tasolla, pääasiassa sitoutumalla 3’alue (UTR) niiden kohde-mRNA: iden [24] – [26]. Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että poikkeava ekspressio miRNA liittyy läheisesti leviämisen, invaasio, metastaasin ja ennusteen erilaisten syöpien, mukaan lukien eturauhas- syöpä, rintasyöpä, gliooma ja keuhkosyöpä [27] – [30]. Poikkeava ilmentyminen miRNA aiheuttaa geeniekspression muutoksia, epigeneettiset muutokset ja muuttunut runsautta miRNA-käsittely entsyymin Dicer. Eturauhassyöpä etenemisen liittyy muuttunut ilmentyminen useiden onkogeenien ja tuumorisuppressoreilla, ja miRNA saattavat säädellä näitä geenejä; kuitenkin, suhdetta miRNA ja eturauhasen syöpä on vain alettu selvitetty viime vuosina [31]. Yli 50 miRNA raportoidaan olevan osallisena eturauhassyövän; kuitenkin, useimmat nykyiset tiedot osoittavat, että vain pieni määrä näitä koskevat eturauhassyövän. Mielenkiintoista on, että miRNA, joiden tiedetään muuttavan fenotyyppiä eturauhassyöpäsolujen, jotkut pidetään onkogeeniset (esim miR-221 /-222, miR-21 ja miR-125b), kun taas toiset pidetään tuumorisuppressoreilla (esim , miR-101, miR-126 *, miR-146a, miR-330, MIR-34 klusteri ja miR-200 perhettä). Näiden tulosten perusteella, miRNA uskotaan olevan useita mahdollisia kliinisiä sovelluksia eturauhassyövässä biomarkkereina ja terapeuttisina kohteina [27], [30], [32] – [38].

Nykyisessä tutkimuksessa julkisesti saatavilla algoritmeja (TargetScan, Pictar, Miranda) osoitti, että miR-370 voi suoraan kohdistaa 3`-UTR

FOXO1

. Olemme osoittaneet, että miR-370 edistää eturauhassyövän soluproliferaation suoraan kohdistamalla 3′-UTR

FOXO1

mRNA, joka pelkistetään ilmentymistä sykliiniriippuvaisen kinaasin (CDK) estäjät,

p27

Kip1

ja

p21

CIP1

ja upregulated solu- syklin säädin

sykliini D1

. Tuloksemme viittaavat siihen, että miR-370 voi olla tärkeä rooli kehityksen ja etenemisen eturauhassyöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Normaalit eturauhasen epiteelisolujen (PrEC ) saatiin Clonetics-Biowhittaker (Walkersville, MD, USA) ja niitä viljeltiin PrEMB väliaineessa (Clonetics-Biowhittaker). Eturauhassyöpäsolulinjoissa Tsu-Pr1, PC3, DU145, 22Rv1 ja LNCaP-solulinjat saatiin ATCC: ltä (Manassas, VA, USA). PC3 pidettiin F-12K-elatusaineessa (Invitrogen), DU145 viljeltiin Eaglen Minimum Essential Medium (Invitrogen), ja Tsu-Pr1,22Rv1 ja LNCaP-soluja viljeltiin RPMI-1640 Medium (Invitrogen), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (HyClone, Logan, UT, USA) ja 1% penisilliini /streptomysiiniä (Invitrogen).

Plasmidit ja transfektio

klooni sekvenssi

FOXO1

3’UTR on niin seurata: CTTCAGATTGTCTGACAGCAGGAACTGAGAGAAGCAGTCCAAAGATGTCTTTCACCAACTCCCTTTTAGTTTTCTTGGTTAAAAAAAAAAACAAAAAAAAAAACCCTCCTTTTTTCCTTTCGTCAGACTTGGCAGCAAAGACATTTTTCCTGTACAGGATGTTTGCCCAATGTGTGCAGGTTATGTGCTGCTGTAGATAAGGACTGTGCCAT.

This monistettiin PCR: llä PREC RNA ja kloonattiin

Sac

I /

Xmal

I kohtiin pGL3-kontrolli lusiferaasireportteriplasmidin (modifioitu lisäämällä

Sac

I /

Xmal

I auttaakseen plasmidit Promega, Madison, WI, USA) ja

Sac

I /

Xmal

I kohtiin pGFP-C3 (modifioitu lisäämällä

Sac

I /

Xmal

I auttaakseen plasmidit Clontech, Mountain View, CA, USA). Olemme muokannut alkuperäistä pGL3-kontrolli Vector pilkkomalla paikalle Xbal- 1934 ja tuhoamalla moninkertaistuvat kloonauskohdat (MCS), joka on ylävirtaan promoottori SV40, joten alkuperäinen sivustoja

Sac

I /

Xmal

I menetetään. Sitten olemme syntetisoitu osan sekvenssin mukaan lukien

Sac

I /

Xmal

I sivustoja. Myöhemmin lisäsimme ohjeiden mukaisesti paikalle Xbal- 1934. pGL3-kontrolli modifioitu sekvenssi on seuraava:

TCTAGA AA GAGCTC AACCAATGCATTGGTCC CCCGGG GGAGCTCTAGA

Kun kaikki nämä, FOXO1 3’UTR kloonataan osaksi 3’UTR luc + ei ylävirtaan promoottori SV40.

pGFP-C3 Plasmidi, MCS sijaitsee 3’UTR GFP, mukaan lukien seuraavat sequence:

TACAAGTACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGATCTAGATAACTGATCA.

The alukkeet olivat:

FOXO1

-3’UTR-wt-up: 5′-GCCCCGCGGCTTCAGATTGTCTGACAGCAGGAAC-3 ’;

FOXO1

-3’UTR-wt-dn: 5′-GCCCTGCAGATGGCACAGTCCTTATCTACAGC-3 ’;

FOXO1

-3’UTR-mu-up: 5′-GCCCCGCGGCTTCAGATTGTCTGACAGCACCAAC-3 ’ja

FOXO1

-3’UTR-mu-DN: 5′-GCC CTGCAGATGGCACAGTCCTTATCTACAGC-3′. P3X IRS-MLP-luc-plasmidi rakennettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla [19]. MIR-370 jäljittelee, negatiivinen kontrolli ja anti-miR-370 estäjä ostettiin RiboBio (Guangzhou, Guangdong, Kiina). Transfektion mikroRNA ja microRNA estäjä suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Western blotting

Western blot -analyysi suoritettiin standardimenetelmien mukaisesti käyttäen anti-FOXO1, anti -p21, anti-p27, anti-sykliini D1, anti-Ki-67-vasta-aineita (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), anti-Rb ja anti-fosforyloitu Rb-vasta-aineita (Abcam, Cambridge, MA, USA). Kalvot riisuttu ja uudelleen blotattiin anti-ß-tubuliinin monoklonaalista vasta-ainetta (Sigma, St. Louis, MO, USA) latauskontrollina.

RNA ja reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR

Yhteensä miRNA uutettiin viljellystä soluista käyttämällä Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX, USA) valmistajan ohjeita ja sitten cDNA syntetisoitiin 5 ng kokonais-RNA: sta käyttäen Taqman miRNA käänteistranskriptio-kittiä (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Ilmentymistasojen miR-370 kvantitoitiin käyttäen miRNA-spesifinen TaqMan miRNA Assay Kit (Applied Biosystems). Mirna ekspressiotasoja määriteltiin perustuen kynnyssykli (C

t), ja suhteellinen ekspressiotasoja laskettiin 2

– [(Ct Mir-370) – (Ct of U6)].

Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen Applied Biosystems 7500 Sequence Detection järjestelmä käyttäen seuraavia alukkeita

p21

CIP1

, (eteenpäin, 5′-CGATGCCAACCTCCTCAACGA-3 ’ja reverse, 5’ TCGCAGACCTCCAGCATCCA-3 ’);

p27

Kip1

(eteenpäin, 5′-TGCAACCGACGATTCTTCTACTCAA-3 ’ja reverse, 5′-CAAGCAGTGATGTATCTGATAAACAAGGA-3′), ja sykliini D1 mRNA (eteenpäin, 5’-AACTACCTGGACCGCTTCCT-3 ’ja reverse, 5 ”-CCACTTGAG CTTGTTCACCA-3 ’). Ilmaisu data normalisoitiin geometrinen keskiarvo ilmentymistason housekeeping-geenin

GAPDH

(eteenpäin, 5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3 ’; taaksepäin, 3′-AGAGGCAGGGATG ATGTTCTG -5’), ja se lasketaan käyttäen 2

– [(Ct on

p21, p27, tai sykliini D1

) – (Ct

on

GAPDH

)], jossa C

t edustaa kynnyssykli kunkin transkriptio .

3- (4, 5-dimetyyli-2-tiatsolyyli) -2, 5-difenyyli-2H-tetratsoliumbromidia (MTT)

Solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille. Osoitetuissa aikapisteissä, soluja inkuboitiin 100 ul: aan steriiliä MTT: tä (0,5 mg /ml, Sigma), 4 tuntia 37 ° C: ssa, sitten väliaine poistettiin ja korvattiin 150 ul: dimetyylisulfoksidi (DMSO, Sigma). Absorbanssi mitattiin 570 nm: ssä, 655 nm viitteenä aallonpituus. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Anchorage riippumattoman kasvun kyky määrityksessä

Viisisataa solut trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen 2 ml: aan täydellistä väliainetta, joka sisälsi 0,3% agaria (Sigma). Agar-solujen seosta maljattiin täydellistä väliainetta, joka sisälsi 1% agaria. Jälkeen 10 päivää, elinkykyisten pesäkkeet mitattiin käyttämällä silmän mikrometriä ja pesäkkeet, jotka sisältävät enemmän kuin 50 solua, ja pesäkkeitä suurempi kuin 0,1 mm halkaisijaltaan laskettiin. Koe suoritettiin kolmen riippumattoman kertaa kullekin solulinjan.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksissä

Solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille (0,5 x 10

3 solua levyä kohti), viljeltiin 10 päivää, kiinnitettiin 10% formaldehydillä 5 min, värjättiin 1,0% kristalliviolettia 30 s ja laskettiin.

bromideoksiuridiinia merkintöjä ja immunofluoresenssilla

kasvaneet solut coverslip (Fisher, Pittsburgh, PA , USA) inkuboitiin bromideoksiuridiinia (BrdU) 1 tunnin ajan, sitten värjättiin anti-BrdU-vasta-ainetta (Upstate, Temecula, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Harmaustason kuvat hankittiin käyttäen laserskannaus mikroskooppi (Axioskop 2 plus, Carl Zeiss Co Ltd, Jena, Saksa).

Lusiferaasimäärityksiä

Eturauhassyöpä soluja (3,5 x 10

4) ympättiin kolmena rinnakkaisena 24-kuoppalevyillä, annetaan laskeutua 24 tuntia ja sitten ko-transfektoitiin 100 ng P3X IRS-MLP lusiferaasi plasmidi-DNA, 100 ng pGL3-FOXO1-3’UTR (paino /mu) plasmidin DNA: ta tai 100 ng pGL3-ohjaus-lusiferaasi-plasmidia ja 1 ng ohjaus Renilla plasmidi PRL-TK (Promega) käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lusiferaasi ja Renilla aktiivisuus mitattiin 48 h transfektion jälkeen käyttäen Dual Luciferase Reporter Assay Kit (Promega) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kolme itsenäistä koetta suoritettiin, ja tulokset on esitetty keskiarvona ± SD. Lusiferaasiaktiivisuus arvot normalisoitu Renillaa toimintaan.

Virtaussytometrianalyysi

Solut kerättiin trypsinisaatiolla, pestiin jääkylmällä PBS: llä, kiinnitettiin jääkylmällä 80% etanolia PBS, sentrifugoitiin 4 ° C ja resuspendoitiin jäähdytetty PBS. Naudan haiman RNaasi (Sigma-Aldrich) lisättiin lopulliseen konsentraatioon 2 ug /ml, inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 min, sitten 20 ug /ml propidiumjodidia (Sigma-Aldrich) lisättiin ja inkuboitiin 20 minuuttia huoneen lämpötila. Jokaisessa ryhmässä, 50000 solut analysoitiin virtaussytometrialla (FACSCalibur; BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

Tilastollinen

kaksitahoiset Opiskelijan

t

-testi käytettiin arvioimaan olevien erojen merkitsevyys kahden ryhmän välillä;

P

arvojen 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

MiR-370 taso nousee eturauhassyövän solulinjoissa

Reaaliaikainen PCR-analyysi paljasti että miR-370-ekspressio lisääntyi merkittävästi kaikissa viidessä eturauhassyövän testatuissa solulinjoissa (Tsu-Pr1, PC3, DU145, 22Rv1 ja LNCaP), verrattuna normaaliin eturauhasen epiteelin (PrEC-solut) (kuvio 1A), mikä osoittaa, että miR-370 on yläreguloituja eturauhassyövän solulinjoissa.

A, Reaaliaikainen PCR-analyysi miR-370 ilmentymisen normaalissa eturauhasessa epiteelisoluissa (PrECs; esitetty N1 ja N2) ja eturauhassyövän solulinjoissa, mukaan lukien PC3, DU145, 22Rv1 ja LNCaP B, MTT määrityksiä osoittaa, että leviämisen miR-370-transfektoituja soluja kasvoi verrattuna negatiivisen kontrollin (NK) -transfected soluja. C, Pesäkkeenmuodostusta määritys miR-370 yliekspressoivia soluja; edustava micrographs (vasemmalla) ja kvantifiointi (oikealla) kristalliviolettia värjättyä solupesäkkeiden. D, kvantifiointi Ki-67 positiivisten solujen PC3 ja DU145 transfektoitujen solujen miR-370 matkivat tai negatiivinen kontrolli (NC) 48 tuntia transfektion jälkeen. E, lisääntymisen merkkejä miR-370 edistänyt eturauhasen syöpäsolun kasvainten muodostumiseen; edustava micrographs (vasemmalla) ja kvantifiointiin pesäkkeiden, jotka sisältävät yli 50 solua (keskellä) tai pesäkkeitä suurempi kuin 0,1 mm (oikealla) on kiinnikkeessä riippumattoman kasvun määrityksessä. Pylväät edustavat keskiarvoa ± SD arvoista kolmen erillisen kokeen; *

P

0,05.

yli-ilmentyminen miR-370 kasvaa leviämisen ja parantaa tuumorigeenisyystesti

Tutkiakseen toiminnan miR-370 eturauhassyövässä me transfektoimme HSA-miR-370 matkivat osaksi PC3 ja DU145 syöpäsolujen ja mitattiin solujen lisääntymistä. Käyttämällä MTT ja pesäkkeiden muodostumisen määritykset, havaitsimme, että kasvuvauhti miR-370 yliekspressoivia solujen lisääntynyt dramaattisesti verrattuna negatiivisen kontrollin (NK) -transfected syöpäsolujen (kuvio 1 B ja 1 C). Lisäksi osuus Ki-67-positiivisia soluja, joka on tunnettu indikaattori lisääntyvien solujen, oli merkittävästi lisääntynyt soluissa ektooppisesti ilmentävät miR-370, verrattuna NC-transfektoiduissa soluissa (kuvio 1 D). Nämä tulokset osoittivat, että ylössäätely miR-370 edistää proliferaatiota eturauhasen syöpäsoluja.

Lisäksi ektooppinen ilmentyminen miR-370 PC3 ja DU145 syöpäsolujen paransi merkittävästi kiinnittämisestä riippumaton kasvu kykyä ja johtaa lisääntyneeseen pesäkemäärät ja koko pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen määritys (kuvio 1 F), mikä viittaa siihen, että säätelyä miR-370 lisäsi eturauhasen syöpäsolun tuumorigeenisyystesti

in vitro

. Yhdessä nämä kokeet osoittivat, että ylössäätely miR-370 edistänyt leviämisen ja transformaatio syöpäsolujen.

yli-ilmentyminen miR-370 edistää G1 /S solusyklin siirtyminen eturauhassyöpäsoluissa

Tutkimme lisäksi vaikutusta miR-370 proliferaatioon virtaussytometriaa käyttämällä. MiR-370-yliekspressoivassa PC3 ja DU145-soluja oli huomattavasti alhaisempi prosenttiosuus soluja G1 /G0 vaiheen ja lisääntynyt prosenttiosuus soluja S-vaiheessa, kuin NC-transfektoiduissa soluissa (kuvio 2A). Lisäksi lisääntynyt määrä BrdU-, joissa soluja, havaittiin miR-370-transfektoituja soluja, verrattuna NC-transfektoiduissa soluissa (kuvio 2B). Yhdessä tämä tiedot osoittivat, että yli-ilmentyminen miR-370 voi parantaa leviämisen syöpäsolujen edistämällä G1 /S solusyklin siirtymistä.

, virtaussytometrinen analyysi PC3 ja DU145-soluja transfektoitiin miR-370 matkivat tai negatiivinen kontrolli (NC) 48 tuntia transfektion jälkeen. B, edustaja micrographs (vasemmalla) ja kvantifiointi (oikealle) BrdU PC3 ja DU145 transfektoitujen solujen miR-370 tai NC 48 tuntia transfektion jälkeen. C, Western blotting-analyysi osoittaa vähentynyttä ilmentymistä p21

CIP1, p27

Kip1 ja lisääntyneen ilmentymisen sykliini D1 ja fosforyloidun Rb (p-R b) PC3 ja DU145 transfektoitujen solujen miR-370 tai NC 48 tuntia transfektion jälkeen . α-tubuliinin käytettiin latauskontrollina. D, Reaaliaikainen PCR-analyysi

p21

CIP1, p27

Kip1

ja sykliini D1 mRNA PC3 ja DU145 transfektoitujen solujen miR-370 tai NC 48 tuntia transfektion jälkeen.

GAPDH

käytettiin latauskontrollina. Pylväät edustavat keskiarvoa ± SD arvoista kolmen erillisen kokeen; *

P

0,05.

MiR-370 vähentää ilmentymä solusyklin estäjät

p21

CIP1

ja

p27

Kip1

ja lisää ekspressiota solusyklin säätimen sykliini D1

miR-370 edistää solujen lisääntymistä, selvitimme vaikutus miR-370 geenien, jotka säätelevät G1 /S-siirtymä [4 ] – [6], mukaan lukien CDK-inhibiittorit p21

CIP1 ja p27

Kip1 ja CDK säädin sykliini D1. Käyttämällä Western blotting ja reaaliaikainen PCR-analyysi, havaitsimme, että p21

CIP1 ja p27

Kip1 proteiinia ja mRNA vaimentua ja sykliini D1-proteiinia ja mRNA yläreguloituja miR-370-transfektoituja soluja, verrattuna NC-transfektoitujen soluja (kuvio 2C ja 2D). Yhtenevä muuttunut ilmentyminen solun lukiertosäätelijöistä, fosforylaation tason Rb, alavirran kohdeproteiinin CDK, lisääntyi merkitsevästi miR-370-transfektoiduissa soluissa (kuvio 2C), mikä vahvistaa, että miR-370 voi vaikuttaa leviämisen eturauhasen syöpäsoluja.

inhibitio miR-370 vähentää leviämisen eturauhasen syöpäsolujen

Kuten edellä on kuvattu, miR-370: lla on kriittinen rooli leviämisen eturauhasen syöpäsoluja. Kuitenkin se pysyi tiedetä estämällä miR-370 vähentäisi solujen lisääntymistä. Kuten odotettua, inhibitio miR-370 lisääntynyt transkriptio

p21

CIP1

ja

p27

Kip1

ja vähentää ilmentymistä sykliini D1 mRNA: ta (kuvio 3A). Lisäksi esto miR-370 lisäsi merkittävästi solujen prosenttiosuus G0 /G1 vaiheeseen ja vähensi solujen prosenttiosuus, että S-vaiheeseen (kuvio 3B). Lisäksi, käyttäen MTT-määritystä, olemme havainneet, että ektooppinen ekspressio HSA-miR-370 estäjä vähensi kasvua PC3 ja DU145 eturauhasen syöpäsolujen, verrattuna NC-transfektoiduissa soluissa (kuvio 3C). Lisäksi, kuten on esitetty kuviossa 3D, inhibitio miR-370 vähensi pesäkkeiden lukumäärä ja pesäkkeiden koot PC3 ja DU145-solujen pesäkemuodostusta, ja myös merkittävästi vähentää kiinnittämisestä riippumaton kasvu kyky molemmissa solulinjoissa.

Reaaliaikainen PCR-analyysi

p21

CIP1, p27

Kip1

ja sykliini D1 mRNA PC3 ja DU145 transfektoitujen solujen miR-370 estäjän tai negatiivinen kontrolli (NC) 48 tuntia transfektion jälkeen .

GAPDH

käytettiin latauskontrollina. B, virtaussytometrinen analyysi PC3 ja DU145-soluja transfektoitiin miR-370-estäjän tai NC 48 tuntia transfektion jälkeen. C, MTT määrityksiä paljasti, että esto miR-370 vähensi solujen kasvua. D, edustaja micrographs (vasemmalla) ja kvantifiointiin pesäkkeiden, jotka sisältävät yli 50 solua (keskellä) tai pesäkkeitä suurempi kuin 0,1 mm (oikealla) on kiinnikkeessä riippumattoman kasvun määrityksissä. Pylväät edustavat keskiarvoa ± SD arvoista kolmen erillisen kokeen; *

P

0,05.

MiR-370 suoraan kohdistaa transkriptiotekijä

FOXO1

eturauhassyöpäsoluissa

Aiemmassa tutkimuksessa paljastui että FOXO1 voi säädellä useita geenejä, jotka liittyvät solusyklin on transkription tasolla, mukaan lukien

p21

CIP1

,

p27

Kip1

ja sykliini D1 mRNA. Samanaikaisesti, meidän analyysi käyttäen kolmea yleisesti saatavilla algoritmeja (TargetScan, Pictar, Miranda) osoittivat, että miR-370 voidaan kohdistaa suoraan 3′-UTR

FOXO1

(kuvio 4A). Tämä data osoitti, että miR-370 voi moduloida ilmentymistä p27

Kip1, p21

CIP1 ja sykliini D1 säätelemällä

FOXO1

. Kuten kuviossa 4B, kuviossa S2A ja kuviossa 4C, ektooppinen ilmentyminen miR-370 vähensi proteiinin ja mRNA: n ilmentymisen tasot FOXO1 PC3 ja DU145-soluissa, mikä osoittaa, että

FOXO1

on mahdollinen miR-370 kohdegeenin . FOXO1 on vaimentua eturauhassyöpäsoluissa (kuvio S1A ja kuvio 1A); joka on todennäköisesti liittyy ylössäätely miR-370 eturauhassyöpäsoluissa (kuvio 1), mikä vähentää ilmentymistä miR-370 kohdegeenin

FOXO1

.

A, sekvenssi

FOXO1

3’UTR miR-370 sitovia siemenen alueen ja mutaatio

FOXO1

3′-UTR siemenen alueen luomiseksi FOXO1-mU. B, Western blotting-analyysi FOXO1 ilmentymisen miR-370 tai negatiivinen kontrolli (NC) -transfected PC3 ja DU145 soluja 48 tuntia transfektion jälkeen. C, suhteellinen FOXO1 toimittaja toimintaa miR-370 tai NC-transfektoiduissa soluissa 48 tuntia transfektion jälkeen. D, Western blotting-analyysi GFP-reportterigeenin ilmentyminen miR-370 tai NC-transfektoiduissa soluissa 48 tuntia transfektion jälkeen. E, suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus PC3 tai DU145 syöpäsolujen kotransfektoitiin kasvavia määriä miR-370 matkivat oligonukleotidit (20, 50 nM), ja pGL3 ohjaus reportteri, pGL3-FOXO1-3’UTR toimittaja, tai pGL3-FOXO1 -3’UTR-mu reportteri, 48 tuntia transfektion jälkeen, vastaavasti. Pylväät edustavat keskiarvoa ± SD arvoista kolmen erillisen kokeen; *

P

0,05.

Vahvista toiminto oletetun miR-370 sitoutumiskohta

FOXO1

3′-UTR, kloonasimme

FOXO1

3′-UTR osaksi reportteri plasmidit pEGFP-C3 ja pGL3. GFP-proteiinin ekspressio oli dramaattisesti inhiboitui ektooppinen ilmentyminen miR-370 PC3 ja DU145-soluissa, verrattuna kontrolliryhmään plasmidi GFP-γ-tubuliinin, viittaa siihen, että miR-370 kohteena on erityisesti

FOXO1

3 ’UTR. Transfektio miR-370 johdonmukaisesti ja annoksesta riippuen vähensi lusiferaasiaktiivisuutta

FOXO1

3′-UTR lusiferaasireportteriplasmidi PC3 ja DU145 syöpäsolujen (kuvio 4E). Lisäksi tukahduttava vaikutus miR-370 on

FOXO1

3′-UTR kumottiin pistemutaatioiden miR-370-sitoutumisen siemenen alueen

FOXO1

3′-UTR ( Kuva 4E). Nämä tulokset osoittivat, että

FOXO1

on

bona fide

tavoite miR-370.

transfektio on miR-370-estäjän palautettu lusiferaasin aktiivisuus pGL3-FOXO1- 3’UTR reportteriplasmidilla PC3 ja DU145 syöpäsolujen (kuvio 5A), ja upregulated FOXO1 proteiinin ekspressio (kuvio 5B). Lisäksi esto miR-370 johdonmukaisesti ja annosriippuvaisesti lisäsi lusiferaasiaktiivisuus pGL3-FOXO1-3’UTR sekä eturauhasen syöpäsolulinjoissa (kuvio 5C). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että inhibitio miR-370 voimistunut FOXO1.

Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuuden määritys PC3 ja DU145-solut ko-transfektoitiin pGL3-FOXO1-3’UTR plasmidi ja kasvavia määriä (20, 50 nM) miR-370 mimic- tai miR-370-inhibiittori-oligonukleotidit, 48 tuntia transfektion jälkeen, vastaavasti. B, Western blotting-analyysi FOXO1 ilmentymisen miR-370 tai negatiivinen kontrolli (NC) -transfected PC3 ja DU145 soluja 48 tuntia transfektion jälkeen. C, Lusiferaasiaktiivisuus määritystä PC3 ja DU145-solut transfektoitiin pGL3-FOXO1-3’UTR plasmidi ja kasvavia määriä (20, 50 nM) miR-370-inhibiittori-oligonukleotideja 48 tuntia transfektion jälkeen. Pylväät edustavat keskiarvoa ± SD arvoista kolmen erillisen kokeen; *

P

0,05.

Vahvista vaikutuksen miR-370 yli-ilmentymisen eturauhassyöpäsoluissa (kuvio 1), me määrällisesti ilmaus FOXO1 eturauhasen syöpäsoluja. Havaitsimme, että FOXO1 on vaimentua eturauhassyöpäsoluissa (kuvio S1A ja kuvio 1A); vahvistetaan, että yli-ilmentyminen miR-370 downregulates MIR-370 kohdegeenin

FOXO1

eturauhassyöpäsoluissa.

MiR-370 aiheuttama eturauhassyövän soluproliferaatiota moduloidaan FOXO1

Sen tutkimiseksi, FOXO1 voisi tukahduttaa miR-370-indusoitua proliferaatiota,

FOXO1

(ilman 3′-UTR) ja

FOXO1

-3′- UTR (jossa 3′-UTR) transfektoitiin miR-370-yli-ilmentäviä eturauhassyöpäsoluja. Kuten odotettua, ektooppinen ilmentyminen FOXO1 lukemiin merkittävästi suurempia muutoksia ilmaus

p27

Kip1

,

p21

CIP1

ja sykliini D1 mRNA kuin FOXO1-3’UTR (kuva 6A). Erityisesti sen jälkeen, kun transfektio on FOXO1 reportterigeenin ja miR-370 osaksi PC3 ja DU145 eturauhasen syöpäsolujen lusiferaasiaktiivisuus voidaan palauttaa yliekspressio FOXO1 ja osittain pelastaa transfektoimalla FOXO1-3′-UTR (kuvio 6B). Lisäksi kasvuvauhti sekä PC3 ja DU145 syöpäsolujen estyi on huomattavasti suuremmassa määrin kotransfektoimalla miR-370 ja FOXO1 kuin kotransfektoimalla FOXO1-3′-UTR ja miR-370 (kuvio 6C). Yhteenvetona, nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-370 aiheuttama eturauhasen syöpäsolujen proliferaatiota suoraan välittävät tukahduttaminen

FOXO1

.

Reaaliaikainen PCR-analyysi

p21

CIP1 , P27

Kip1

ja sykliini D1 mRNA ilmaisun osoitettu soluissa.

GAPDH

käytettiin latauskontrollina 48 tuntia transfektion jälkeen. B, Lusiferaasiaktiivisuus-määritys osoitti transfektoitujen solujen kanssa FOXO1 toimittaja 48 tuntia transfektion jälkeen. C, MTT-määritystä eturauhassyövän transfektoitujen solujen miR-370 jäljittelevät, ko-transfektoitiin miR-370 ja FOXO1, tai ko-transfektoitiin miR-370 ja FOXO1-3′-UTR.

keskustelu

tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että miR-370 on yliaktiivista eturauhassyövän solulinjoissa, kun ensisijainen normaalin eturauhasen epiteelisolujen. Ylössäätely miR-370 edistänyt G1 /S solusyklin siirtyminen eturauhassyöpäsoluissa, joka korreloi downregulation sykliiniriippuvaisen kinaasin (CDK) estäjät p27

Kip1 ja p21

CIP1. Kääntäen, esto miR-370 vähensi eturauhassyöpä solujen lisääntymistä, upregulated p27

Kip1 ja p21

CIP1, ja viivytti G1 /S siirtyminen. MiR-370 voimistunut solu-syklin säädin sykliini D1 suoraan kohdistamalla

FOXO1

3′-UTR: n, joka osoittaa, että FOXO1 säädetään miR-370 eturauhassyöpäsoluissa. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että ylössäätely miR-370 voi edistää taudin alkamisen ja etenemisen eturauhasen syöpä.

On osoitettu, että FOXO1 ilmentymistä säätelevät useat MikroRNA, kuten miR-223, miR-182, miR-27a, miR-139 ja miR-96 [39] – [43]. Näistä noin MikroRNA voidaan väärin säädellystä eturauhassyövässä, kuten miR-27a, miR-182 [41], [44].