Krooninen sairaus

tiivistelmä

Genome-laajuinen yhdistys tutkimukset (GWAS) paksusuolen syövän (CRC) ovat johtaneet tunnistamiseen useita yhteisiä liittyvät muunnelmat vaatimaton riski. Useat riski variantteja kartan sisällä läheisyydessä TGFp /BMP-signalointireitin geenejä, mukaan lukien rs4939827 sisällä introni

Smad7

klo 18q21.1. Aiemmassa tutkimuksessa on sekaantunut uusi SNP (novel 1 tai rs58920878) toiminnallisena varianttia vahvistajaelementti in

Smad7

introni 4. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että neljä SNP luettuina uudet 1 (rs6507874, rs6507875, rs8085824 ja rs58920878) kytkentäepätasapainossa (LD) indeksistä SNP rs4939827 osoittaa alleelispesifinen tehostajana vaikutuksia suuressa, usean komponentin tehostajana

Smad7

. Kaikki neljä SNP osoittaa alleeli-spesifinen proteiinin sitoutumista ydinaseiden otteita CRC solulinjoissa. Lisäksi jotkin riskin liittyvän alleeleja korreloi lisääntyneen ilmentymisen

Smad7

normaaleissa paksusuolen kudoksiin. Lopuksi osoitamme, että tehostajana reagoi BMP4 stimulaatiota. Yhdessä ehdotamme, että siihen liittyvä CRC riskin 18q21.1 johtuu neljä toiminnallisia variantteja, jotka säätelevät

Smad7

ilmaisun ja mahdollisesti häiritä BMP negatiivinen kierre in TGFli /BMP signalointireittejä.

Citation: Fortini BK, Tring S, Plummer SJ, Edlund CK, Moreno V, Bresalier RS, et al. (2014) Multiple Toiminnallinen riski Versiot on Smad7 Enhancer sotkea peräsuolen syövän riskihaplotyypin. PLoS ONE 9 (11): e111914. doi: 10,1371 /journal.pone.0111914

Editor: Ludmila Prokunina-Olsson, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 16, 2014; Hyväksytty: 01 lokakuu 2014; Julkaistu: 06 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 Fortini et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tuki National Institutes of Health (R01 CA143237, U19 CA148107 GC). Tieteellistä kehitystä ja rahoitusta tämän hankkeen osittain tukevat Genetic Yhdistykset ja mekanismit onkologian (GAME-ON), joka on NCI Cancer Post-GWAS aloitteen. Sisältö on ainoastaan ​​vastuulla kirjoittajien ja ei välttämättä edusta näkemyksiä National Cancer Institute tai National Institutes of Health, joka ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelu käsikirjoitus.

kilpailevat edut: kirjoittajat ilmoittavat, että ei kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

TGFli signalointi on pitkään liitetty peräsuolen syöpä (CRC). Sen lisäksi, että kanoninen rooleja apoptoosin säätelyyn, solujen erilaistumista ja solujen kasvua suoliepiteeliin, TGFli signalointi on tärkeä toimija immuunivastetta ja tulehduksellinen suolistosairaus, riskitekijä CRC (arviot [1] – [3] ). TGF ja BMP signalointi määritellä kaksi suurta haarat TGFp reitin. Aktivointi jompikumpi johtaa rekrytointiin R-Smad: ien, Smad2 /3, kun kyseessä on TGFp tai SMAD1 /5/8 tapauksessa BMP, joka muodostaa kompleksin Smad4. Tämä kompleksi ohjaa transkription monien kohdegeenien, kuten

Smad7

. Smad7 inhibitorinen Smad kuten SMAD6 puolestaan ​​toimii negatiivisena palautetta säätelijä TGFp ja BMP signalointi, lisäksi toimii ylikuulumisen solmu muiden reittien mukaan lukien TNF [4], [5].

Smad7 soittaa myös muita tärkeitä rooleja etiologiassa CRC, kuten vuorovaikutuksessa β-kateniinin säädellä

MYC

ilmaisun ja WNT signalointi [6].

Smad7

yli-ilmentyminen on havaittu joillakin CRC soluissa, ja vähentäminen

Smad7

ilmaisua käyttäen anti-sense-RNA johtaa vähentyneeseen leviämisen estämistä HCT-116 CRC solulinjassa ja ihmisen CRC neoplastisten eksplantaateissa, ja vähensi kasvaimen kehittymisen APC

min /- hiiri [7].

CRC GWAS ovat johtaneet esille useita genomialueiden liittyvä riski, jotka sisältävät geenit TGFp signalointireitin lukien

Smad7

,

BMP2

,

BMP4

, ja

GREM1

[8] – [14]. Tämä sisältää yhden emäksen monimuotoisuus (SNP) rs4939827, joka sijaitsee

Smad7

intronin 4, joka on raportoitu useita tutkimuksia. Pittman et ai. raportoitu, että uusi SNP (kutsutaan novel 1, joka myöhemmin nimettiin rs58920878) kartoitettu tehostaja, joka ajoi GFP: n ilmentymisen in

Xenopus

tadpole lihaksia ja colorectum in alleeli erityisellä tavalla, syytetään rs58920878 toiminnallisena variantti tämän alueen [15].

herättämänä löytö useita toiminnallisia variantteja sisällä 11q23 CRC GWAS alueella [16], me kattavasti tutkineet genomin alueella, joka ympäröi CRC tagSNP rs4939827 on 18q21.1 muut mahdolliset toiminnalliset SNP: itä. Havaitsimme 4 SNP, rs6507874, rs6507875, rs8085824 ja rs58920878 (novel 1), alueella noin 2 kb, kukin osoittavat alleelispesifisillä tehostajana aktiivisuutta. Olemme lisäksi todenneet, että alleelit vastaavat riskihaplotyypin korreloi lisääntyneen ilmentymisen

Smad7

normaaleissa paksusuolessa epiteelikudoksissa. Sekvenssit, jotka kattavat kaikki neljä SNP myös sitoutunut ydinaseiden proteiinien CRC solulinjoilla alleelispesifisen tavalla elektroforeettisen liikkuvuuden shift määritykset (EMSAs). Lopuksi osoitimme että tehostajana oli reagoi BMP4 aiheuttaman signaloinnin Lusiferaasimäärityksiä kun kumpikaan haplotyyppi oli herkkä TGFp 1. Yhdessä ehdotamme, että CRC riski kromosomissa 18q21.1 johtuu osuudet 4 toiminnallisten varianttien tehostaja vaikuttaa ilmaus

Smad7

, mikä saattaa johtaa häiritsi sääntelyä BMP negatiivinen kierre vuonna BMP /TGF signalointireittejä.

tulokset

Region Analysis

indeksi SNP rs4939827 liittyy CRC kromosomissa 18q21.1 sijoittuu intronin 4

Smad7

geeni. On 20 SNP LD kanssa rs4939827 jossa r

2≥0.2 vuonna CEU väestöstä (1000 Genomes Project, kesäkuu 2011 release), meidän valittu LD kynnys mahdollisten toiminnallisten ehdokkaat (kuva 1A ja 1C). 21 SNP sijaitsevat sisällä 16 kb alueella

Smad7

introni 4. Jotta tunnistaa mahdolliset genomisten säätelysekvenssejä tältä alueelta, SNP LD kanssa rs4939827 oli linjassa kromatiinin immunosaostuksella ja sekvensointi (chip seq ) telat histoni metylaation ja asetylointi merkit liittyvät parantajia, H3K4me1 ja H3K27ac (kuvio 1 B). Tätä tutkimusta varten me viitattu sigmasuolessa H3K27 asetylointi alkaen tiekartan Epigenomics Consortium [17], ja CRC solulinjat SW480 ja HCT-116 H3K4 monomethylation syntyy laboratoriossamme ja päässä ENCODE projekti, vastaavasti [16], [18], [ ,,,0],19]. Useita mahdollisia tehostajana huiput, jotka sisältävät SNP LD kanssa rs4939827 todettiin sigmasuolessa, SW480 tai HCT-116-solut, kuten 2kb sisältävän alueen rs58920878 (vihreä raita, kuvio 1 B). Karakterisoimiseksi alueen kattavasti, pienemmät piikit alittavia huippu soittamalla ohjelmisto kloonattiin myös ja testattiin aktiivisuuden jos ne sisälsivät SNP täyttäminen LD cut-off. DNaasi I hypersenstitivity kappaleita ENCODE hanke myös linjassa, mutta ei huiput päällekkäin minkään ehdokkaan SNP LD kanssa rs4939827 [20], [21].

(A)

Smad7

geeni kuvattu perimän koordinaatit (hg19) ja aseman SNP LD (r

2≥0.2, CEU väestö) kanssa tagSNP rs4939827. (B) UCSC Genome selainikkunaan Smad7 kanssa SNP LD kanssa rs4939827 ilmoitettu. ChIP-seq kappaleita tehostajana histonimerkkien ovat Sigmoid Colon (SC) H3K27ac alkaen REMC /UCSD Tiekarttaehdotus Epigenomics Consortium, SW480 (SW) H3K4me1, ja HCT-116 (HCT) H3K4me1 päässä ENCODE konsortio. DNaasi I yliherkkyys seuraa HCT-116 (HCT) ja CaCo-2 alla ovat UW ENCODE aineisto. Vihreä raita edustaa tehostajana fragmentti A. Punainen raidat osoittavat kloonattujen fragmenttien B-G (vasemmalta oikealle), joka osoitettiin puuttuvan tehostajana toimintaa. Koordinaatit kutakin fragmenttia annetaan File S1. (C) Kytkentäepätasapaino kuvaaja rs4939827 lukien kaikki SNP-kohdat 1KG projektin r

2≥0.2, luotu Haploview. r

2 = 1 musta, 1 r

2 0,2 – harmaasävyjen. (D) Zoomattu näkymä fragmentti A Näytä sub-fragmentit A1-A4. Koodata Layered H3K4me1 kirjaa 7 solulinjojen on osoitettu tunnistamaan solutyyppispesifisten huiput. (E) Haplotyypit ja prosenttiosuudet (CEU väestö) varten 4 SNP fragmentti A ja rs4939827. Haplotypes liittyvä rs4939827 riski alleeli T ovat vaaleavioletti.

Enhancer -aktiivisuusmäärityksiä

Seven otaksuttu tehostajana alueet kloonattiin lusiferaasianalyysissä vektorin määrittämiseksi tehostajana aktiivisuutta CRC solulinjoissa HCT-116 ja SW480. Vain 2 kb fragmentti (vihreä raita kuvassa 1 B) 3’loppuun

Smad7

intronin 4 osoitti aktiivisuutta meidän määrityksissä, mutta vain päinvastaisessa suunta (kuvio 2A). Alueet testattu kuitenkaan ole aktiivisuutta tässä määrityksessä on merkitty punaisella raidat Kuva 1B (kuvio 2B). 2 kb tehostaja-alue, olemme termi fragmentti A, sisältää 4 SNP LD kanssa rs4939827: rs6507874, rs6507875, rs8085824, ja rs58920878 (novel 1). Laajennettu näkymä fragmentti A kuvassa 1D. Kuten kuviossa 1C, nämä neljä SNP ovat LD (r

2 = 1-+0,494) keskenään ja määrittelevät 5 haplotyyppien CEU väestöstä. Nämä haplotypes esitetään suhteessa rs4939827 variantin (riski alleeli T) kuviossa 1E [22], [23].

(A) Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuutta varten positiivisen kontrollin, fragmentti A eteenpäin, ja fragmentti A päinvastaisessa suunnassa. Vaaleat pylväät osoittavat aktiivisuutta HCT-116, tummat pylväät osoittavat aktiivisuutta SW480. (B) Fragments B kautta G, kuvassa 1B punaisia ​​raitoja ei näytä tehostajana aktiivisuutta joko suuntautumiseen HCT-116. Positiiviset kontrollit on esitetty kullekin ryhmälle konstruktioita analysoitu samalla levyllä. Fragmentti E sisältää tagSNP rs4939827. (C) aktiivisuus fragmentti A päinvastaisessa suunta kaikkien SNP fragmentti niiden C-alleeli, jossa kukin alleeli muuttui itsenäisesti vaihtoehtoiseen alleelin, näkyy kertainen muutos suhteessa konstruktin sisältävä neljä C alleelit. Kaikki neljä alleelit johtanut tilastollisesti merkittävä väheneminen aktiivisuudessa: rs6507874 T

p

= 8,25 x 10

-3 (HTC-116),

p

= 3,30 x 10

-2 (SW480); rs6507875 G

p

= 3.40 x 10

-2 (HCT-116),

p =

6,79 x 10

-3 (SW480); rs8085824 T

p =

1,20 x 10

-2 (HCT-116),

p =

3,12 x 10

-3 (SW480); rs58920878 G

p =

2,09 x 10

-3 (HCT-116),

p =

3.05 x 10

-3 (SW480).

testattiin ensin, oliko alleeli liittyviä eroja tehostajana aktiivisuuden kullekin SNP erikseen aloittaen 2 kb fragmentti kaikki 4 SNP sisältäviä C alleeleja. Vaikka tämä haplotyypin ei näy CEU väestön, tämä alleeli yhdistelmä oli suurinta tehostajana toimintaa kaikkien fragmenttien testattu. Havaitsimme alleelispesifisen muutokset edistäjän aktiivisuutta kunkin neljän variantteja, kun alleelit ovat muuttuneet kohdennetulla mutageneesillä (kuvio 2C). Kaikki 4 SNP väheni tehostajana aktiivisuutta alleelien muutettiin vaihtoehtoisen muodon. Suurin lasku oli vilkasta, kun rs58920878 muutettiin C G. Vaikka vähäinen alleelit SNP rs6507874 (t, pienet alleelin taajuus (MMM) = 0,44) ja rs58920878 (G, MMM = 0,34) osoitti alempaa tehostajana toimintaa, alaikäisen alleelit SNP rs8085824 (C, MMM = 0,34) ja rs6507875 (C, MMM = 0,49) oli suurempi tehostajana aktiivisuus näissä määrityksissä.

fragmentin A käsittää useita pienempiä erillisiä HCT-116 H3K4me1 huiput, joissa äärimmäisenä vasemmalla ominaisen piikin HCT-116 verrattuna kerroksellinen H3K4me1 super-kirjaa 7 ENCODE Taso 1 solulinjat [19] (kuvio 1 D). Testaamiseksi suhteelliset panokset näiden alueiden ja SNP yksilöllisesti yleiseen tehostajana toimintaa, 4 pienempää konstruktioita, A1-A4, suunniteltiin (kuvio 1 D). A1 fragmentti sisältää SNP rs6507874 ja rs6507875 ja käsittää HCT-116 piikkiä. Nämä kaksi SNP on vain erotettu 13 emäsparin, ja ovat LD toistensa kanssa r

2 = 0,794, D ’= 1. Kuten kuvassa 3A, A1 fragmentti osoitti tehostajana aktiivisuutta. Suurimmat haplotyyppi rs6507874 ja rs6507875 alleelien CEU väestöstä, CG, osoitti alimman tason tehostajana aktiivisuus verrattuna muihin kolme mahdollista alleelin yhdistelmiä (kuva 3B). TC ja CC pieniä haplotypes osoitti noin 1,3-1,5 kertaiseksi ja 2-2,5 kertaa suurempi aktiivisuus molemmissa solulinjoissa, HCT-116 ja SW480, vastaavasti (kuvio 3B). TG-alleelin yhdistelmä, vaikka ei ole tiedossa CEU haplotyypin, osoitti pienempi aktiivisuus kuin TC haplotyyppi. Yhdessä voimme päätellä, että vaikka molemmat SNP, rs6507874 ja rs6507875, edistää yleistä tehostajana aktiivisuuden taso A1 fragmentti, rs6507875 alleelit osoittavat suuremman alleeli-spesifinen vaikutus kuin rs6507874, suuntaan sopusoinnussa 2 kb fragmentti (kuvio 2C ). Sen sijaan vaikutus rs6507874 alleelin edistäjän aktiivisuus oli riippuvainen joka rs6507875 alleeli oli läsnä, mikä viittaa siihen, asiayhteyteen vaikutus sisällä tehostajana komponentteja. Nämä tiedot merkitsevät monimutkainen toiminnallinen suhde välillä vierekkäisten SNP.

(A) fragmentin A jaettiin 4 pienempää DNA-fragmentit, A1-A4, kuviossa 1D. Kukin pienempi fragmentti osoitti tehostajana aktiivisuutta sekä HCT-116 (valokeilat) ja SW480 (tumma palkit). Esitettyä koetta, kaikki SNP sisälsi niiden C alleelit. (B) aktiivisuus Fragmentti A1 sisältävien rs6507874 ja rs6507875, esitetään kertainen muutos suhteessa suuria haplotyyppi CG varten HCT-116 (valokeilat) ja SW480 (tumma palkit). Vähäinen haplotyyppi TC (

p

= 2,25 x 10

-2 (HCT-116),

p

= 8,59 x 10

-2 (SW480)), ja yhdistelmä CC (

p

= 5.06 x 10

-5 (HCT-116),

p

= 1,75 x 10

-5 (SW480)) ei nähty CEU väestön osoittavat suurempaa aktiivisuutta kuin suuret haplotyyppi. Yhdistelmä TG (

p

= 0,450 (HCT-116),

p

= 0,287 (SW480)) osoittaa aktiivisuus kuin CG. (C) fragmentti A2 sisältävä rs8085824 osoittaa 2 kertaa suurempi tehostajana aktiivisuus alaikäisen C alleelin kuin pääalleelille T (

p =

4.75 x 10

-3 (HCT-116),

p =

3,61 x 10

-4 (SW480)). (D) aktiivisuus fragmentti A3 sisältävien rs8085824 ja rs58920878 suhteessa suuria haplotyypin TC. Vähäinen haplotyypin CG osoittaa suurempaa aktiivisuutta kuin TC (

p =

2,49 x 10

-2 (HCT-116),

p =

6,32 x 10

-3 (SW480 )). T (major) alleelin rs8085824 aktiviteetti on matalammalla tasolla kuin C (vähäinen) alleeli riippumatta rs58920878 alleelin. Korkeimmat aktiivisuus näkyy haplotyypin CC, jota ei ole raportoitu CEU väestöstä (

p =

6,35 x 10

-7 (HCT-116),

p =

1,47 x 10

-6 (SW480)). (E) aktiivisuus fragmentti A4 kattaa huipun sisältävä rs58920878. Vähäinen alleeli G rs58920878 näkyy dramaattisesti vähemmän aktiivisuutta kuin suuret C-alleelin (

p =

1,92 x 10

-4 (HCT-116),

p =

1,52 x 10

-5 (SW480)). (F) fragmentin A testattiin aktiivisuus kaksi yleisintä haplotyyppien (kuvio 1 E) on CEU väestöstä. CGTC haplotyypin arvo on suurempi aktiivisuus HCT-116 (valokeilat,

p

= 1,04 x 10

-11) ja SW480 (medium baareja,

p

= 8,60 x 10

-11), mutta ei merkittävää eroa aktiivisuutta RKO (tumma palkit).

A2 fragmentti sisältää SNP rs8085824 ja yhdistyy alueen välissä kaksi merkittävintä HCT-116 H3K4me1 huiput lisääjinä (Kuva 1 D). Vaikka fragmentti A2 oli aktiivisuutta omasta, se osoitti alin aktiivisuus 4 seutukuntien testattu (kuvio 3A). Kun rs8085824 alleeli muutettiin T (pääalleelille) C (pienet alleeli), aktiivisuus kasvoi kaksinkertaiseksi (kuvio 3C) yhdenmukaisia ​​tuloksia suurempi fragmentti (kuvio 2C). A3 fragmentti käsittää A2 alueen (mukaan lukien rs8085824) ja edelleen 160 emäsparin sisällyttää rs58920878. Tämä fragmentti osoitti 2-kertaisesti enemmän aktiivisuutta kuin A2 fragmentti. Suurimmat haplotyyppi rs8085824 ja rs58920878 (r

2 = 1, D ’= 1, CEU) on TC. Vähäinen haplotyypin CG osoitettiin 1,3-1,6 kertaa korkeampi aktiivisuus kuin suuret haplotyypin HTC-116 ja SW480-soluissa, vastaavasti. Keinotekoisesti rakennettu CC-alleelin yhdistelmä oli korkein aktiivisuustaso testattiin A3 fragmentti. Vertaamalla CC fragmentti TC ja CG haplotyyppi fragmentteja, havaitsimme, että suurempi lasku aktiivisuus johtui muuttamalla rs8085824 alleelin kuin rs58920878. Toisaalta muuttuvat rs58920878 TC haplotyyppi TG ei johtanut huomattava ero tehostajana toimintaa. Kuten A2 fragmentti, SNP rs8085824 nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​alleelispesifisillä vaikutukset nähdään käyttämällä suurempi fragmentti (kuvio 2C). Kuitenkin SNP rs58920878, vaikutus ennusti 2 kb: n kappale riippuvainen joka rs8085824 alleeli oli läsnä, jälleen, mikä viittaa siihen, että monimutkainen toiminnallinen suhde välillä vierekkäisten SNP.

Lopuksi fragmentti A4, johon kuuluu toinen pienempi HCT-116 H3K4me1 huippu, sisälsi vain SNP rs58920878 ja osoitettiin samanlainen aktiivisuus kuin fragmentit A1 ja A3 (kuvio 3A). Tämä fragmentti osoitti tehostajana aktiivisuus aleni 3-kertaiseksi, kun pääalleelille C muutettiin alaikäisen alleeli G (kuvio 3E). A4 fragmentti, joka sisälsi rs58920878 oli ainoa pienempien fragmenttien jossa alaikäinen alleeli tai haplotyypin osoitti pienempi aktiivisuus kuin pääalleelille /haplotyyppi.

Kaksi yleisintä haplotyyppien CEU tämän ryhmän 4 SNP: t ovat CGTC (49,9%) ja TCCG (33,4%) (kuvio 1 E). Nämä yhdistelmät testattiin yhteydessä 2 kb tehostajana konstruktio. Kuten kuviossa 3F, yleinen suuret CGTC haplotyyppi osoittivat korkeampia tehostajana aktiivisuus kuin vähäistä TCCG haplotyypin HCT-116 ja SW480. Mielenkiintoista, kun testasimme kaksi haplotyyppien CRC solulinjassa RKO, CGTC ollut merkittävästi aktiivisempi kuin TCCG haplotyyppi, mikä osoittaa, oli jonkin verran spesifisyys hajottamatta aktiviteetti jopa keskuudessa CRC solulinjoissa. Kumpikaan haplotyyppi fragmentti A oli aktiivinen kuin CRC solulinjaa HEK293 joka toimi negatiivisena kontrollina (kuvio S1A). Fragmentteja, jotka sisältävät haplotypes TCTC (9,5% CEU väestöstä) ja CCTC (5,9% CEU väestöstä) osoittivat aktiivisuuden tasot välisten haplotyyppien CGTC ja TCCG (kuvio S1B).

elektroforeettinen liikkuvuus Shift Analyysit

jotta voitaisiin paremmin ymmärtää näitä alleeli-spesifinen tehostaja vaikutuksia, tutkimme seuraavaksi ydin- proteiinin sitoutumista sekvenssit, jotka sisältävät kukin 4-SNP: iden, rs6507874, rs6507875, rs8085824, ja rs58920878. Oletimme, että transkriptiotekijät selektiivisesti sitoutua C alleeleja suuremmalla affiniteetilla, kun 2 kb fragmentti ja fragmentit A1-A4 C alleelien osoitti korkeinta tehostajana toimintaa. Toisaalta estävä proteiinit voivat sitoutua T tai G-alleelien suosivasti säätelemään negatiivisesti tehostajana aktiivisuutta. Tätä varten 33 emäsparin kaksijuosteinen oligonukleotidit keskitetään kunkin SNP, syntetisoitiin. Kussakin tapauksessa, C-alleeli leimattiin punaisella (700) IR-väri. Vaihtoehtoinen alleelit, joko T tai G leimattiin vihreällä (800) IR-väriä (yksittäisten kanavien esitetään mustavalkoisia kuvia kuvioissa S2-S5 helpottamiseksi lisääntymisen ja analyysi). Tumauutteita valmistettiin SW480, HCT-116 ja RKO CRC solulinjoja, ja niitä inkuboitiin ei-spesifisiä ja erityiset leimaamatonta kilpailijaa DNA kuten on esitetty kuviossa 4. kahden alleelin kunkin SNP on merkitty eri väreillä, mikä mahdollistaa suoran vertailun sitovat kunkin alleelin tumaproteiinien samassa reaktiossa. Kuten kuviossa 4 on esitetty, kunkin koettimen sarjan testattu, on bändejä erityisiä yhden alleelin verrattuna muihin alleelin.

(A) Nuclear poimii SW480, HCT-116, ja RKO solulinjoja inkuboitiin IR -dye merkitty 33mers keskitetty rs6507874 C (punainen merkki) ja T (vihreät merkinnät) ennen native EMSA. Kaistat 1 ja 2 esittävät koetin ilman tumauutteesta. Kaistat 3, 4, 9, 10, 15, ja 16 esittävät kukin leimattu koetin sitoutumisesta tumaproteiinien yksilöllisesti solulinjan, kuten edellä mainittiin. Kaistat 5-8, 11-14 ja 17-20 ovat 01:01 kilpailu merkintä C ja T-alleelin antureista. Kaistat 6, 12 ja 18 sisältävät 200-kertainen ylimäärä leimaamatonta C-alleelin kilpailija. Kaistat 7, 13, ja 19 sisältävät 200-kertainen ylimäärä leimaamatonta T-alleelin kilpailija. Kaistat 8, 14, ja 20 sisältävät 200-kertainen ylimäärä kilpailija olevan unmatching sekvenssin samankaltaisia ​​nukleotidin sisältöä. Bändit spesifinen yhden alleelin ja katoavat kilpailu on merkitty nuolilla. Katso kuva S2 punaisen (700) kanavan kuva C anturin ja vihreän (800) kanavan lämpötilamittapää mustavalkoisena. (B) Kuten paneeli A, jossa rs6507875 C-alleeli (punainen koetin) ja G-alleelin (vihreä). Katso kuva S3 punaisen (700) kanavan kuva C anturin ja vihreän (800) kanava G koetin mustavalkoisena. (C) Kuten paneeli A, jossa rs8085824 C-alleelin (punainen) ja T-alleelin (vihreä). Katso kuva S4 punaisen (700) kanavan kuva C anturin ja vihreän (800) kanavan lämpötilamittapää mustavalkoisena. (D) Kuten paneeli A, jossa rs58920878 C-alleelin (punainen) ja G-alleelin (vihreä). Katso kuva S5 punaisen (700) kanavan kuva C anturin ja vihreän (800) kanava G koetin mustavalkoisena.

Kunkin alleeli setti, kaistat 3, 4, 9 , 10, 15 ja 16 esittävät yhden alleelin koetin inkuboidaan tumaekstrakti. Kaistat 5-8, 11-14 ja 17-20 sisältävät reaktioita 01:01 määriä kunkin merkityn alleelin. Voit selvittää spesifisyys siirtynyt komplekseja, leimaamatonta kilpailukykyinen oligonukleotideja kunkin alleelin lisättiin 200-kertainen ylimäärä. Kaistat 6, 12, ja 18 sisältävät merkitsemätön C alleelit ja kaistat 7, 13 ja 19 sisältävät merkitsemätön T tai G-alleelien. Kaistojen 8, 14, ja 20, leimaamatonta kilpailijaa vastaavan emäksen koostumuksen, mutta ei sovi yhteen minkään sekvenssien lisättiin sama määrä. Bändejä, jotka hävisivät, kun kilpailivat joko SNP-alleelin, mutta läsnä Etuyhteydettömiin (epäspesifinen) kilpailijaa katsottiin spesifinen SNP järjestyksessä. Näkyvin erityisten bändejä on merkitty marginaaleissa nuolilla.

Kun kyseessä on rs6507874 ja rs58920878 (kuvio 4A, 4D), oli komplekseja löytyy HCT-116 ja SW480, joita ei ole nähty in RKO. Tämä saattaa selittää, miksi haplotyyppi ominaisaktiivisuus ei nähty RKO lusiferaasiaktiivisuuden kokeilu. Kuvioissa 4A ja S2, bändi nuolella oli nimenomaan rs6507874 C-alleelin kohdalla. Huomaa, että HCT-116 ja RKO otteita, jopa 200-kertainen ylimäärä leimaamatonta T-alleelin oligonukleotidin ei out-kilpailla C-alleelin sitovia. Sillä rs6507875 antureista (kuva 4B ja S3), kun taas oli erityisiä kaistoja molemmissa alleeleissa (nuolet), G-alleelin sidottu enemmän affiniteetilla kuin C-alleelin. Mielenkiintoista on, rs6507875 koettimet sitoutui voimakkaasti komponenttien RKO uutetta, jopa kun läsnä on ylimäärä leimaamatonta DNA: ta (kuvio 4B).

rs8085824 koettimet, meillä on jälleen löydetty useita erityisiä komplekseja kunkin alleelin. Yksi merkittävä monimutkainen, merkitty pohja nuoli, osoitti, että C-alleeli koetin ei ole täysin outcompeted 200-kertainen ylimäärä T-alleelin. Näyttää siltä, ​​että sitoutuneiden proteiinien tämän monimutkaisen löytyy suurempia määriä SW480 ja HCT-116 kuin RKO tumaekstraktien. Siinä tapauksessa rs58920878 koettimien, löydettiin useita juovia, jotka ovat spesifisiä C-alleelin, kun taas G-alleelin havaittiin pääasiassa suurempia komplekseja (korkeampi nauhat) kuin C-alleeli.

identiteetin määrittämiseksi näiden allele- erityisiä sitovia proteiineja tarvitaan ymmärtää täysin toimintaa Smad7 tehostajana. Proteiini sitova ennustaminen ohjelmisto Biobase Match, joka perustuu Transfac motiivi tietokantaan, käytettiin tunnistamaan ehdokkaita kullekin SNP alueelle [24]. Tämän analyysin tulokset esitetään taulukoissa S1, S2 ja S3 File S1. DNA sitova proteiini alkuun ero ennustetun sitoutumisen tulokset välillä alleelit rs6507874 /rs6507875 (analysoitu yhdessä läheisyydestä johtuen) oli NF-1A, sillä rs8085824 oli Churchill, ja rs58920878 oli ZF5. Kuitenkin kunkin lokuksen, yksikään proteiineista, joilla on suurimmat ennustettu alleelin erot olivat proteiineja, joilla on korkein ytimen tai matriisin tulokset kunkin sekvenssin.

eQTL Analysis Normaali Colon Tissue

seuraavalle kysyi genotyyppi näitä SNP korreloi geeniekspressiotasot normaaleissa paksusuolen kudoksiin. Koska tehostajana sijaitsee introni 4

Smad7

geeni,

Smad7

oli ilmeinen ehdokas kohdegeenin. Lisäksi rs6507874, rs6507875 ja rs8085824, myös genotyyppi tagSNP rs4939827 vuonna patologisesti normaalissa ihmisen kudosnäytteitä saatu seurantaa colonoscopy kautta Aspirin /Folaatti polyyppi Prevention Study [25] – [27]. Emme voineet suunnitella TaqMan määritys rs58920878 kuitenkin SNP rs8085824 ja rs58920878 ovat täydellisessä LD (r

2 = 1, D ’= 1); Siksi rs8085824 edustaa myös välityspalvelinta rs58920878. Mitään tilastollisesti merkittävä korrelaatio ilmaisu kahden muiden geenien 0,5 Mt rs4939827,

CTIF

tai

DYM

, ja mikä tahansa genotyyppi SNP: iden nähtiin (tuloksia ei ole esitetty).

Huomasimme, että tagSNP rs4939827 ei osoittanut tilastollisesti merkitsevä assosiaatio, jossa

Smad7

ekspressiotasot, vaikka suurempi ekspressio tiettyjä kehityssuuntia kanssa T GWAS Riskimuodon (p = 0,1130) (kuvio 5). Kuitenkin SNP rs8085824 C (minor) alleeli oli tilastollisesti merkitsevä korrelaatio (

p

= 0,01197) ja lisääntynyt

Smad7

ilme. Koska SNP rs8085824 ja rs58920878 ovat täydellisessä LD, tämä tulos voidaan ekstrapoloida merkitsevän korrelaation rs58920878 G (minor) alleeli ja korkeamman

Smad7

ilme. Rs6507874 T (vähäinen) alleeli (p = 0,07531) ja rs6507875 C (vähäinen) alleeli (

p

= 0,1337) ei osoittanut tilastollisesti merkittävää korrelaatiota lisääntynyt

Smad7

ilme. Huomaa, että yleisesti ottaen TCCG haplotyyppi (vähäinen haplotyyppi) korreloi korkeamman

Smad7

ilmentymistä kudoksissa ja Lusiferaasimäärityksiä yhteydessä fragmenttien A1, A2, ja A3, mutta vastakkainen vaikutus nähty tehostajana aktiivisuuden 2 kb: n fragmentti lusiferaasin kokeissa, joissa fragmentti, joka sisälsi TCCG haplotyyppi (pienet haplotyyppi) korreloi vähentynyt edistäjän aktiivisuutta verrattuna fragmentti, joka sisälsi CGTC haplotyyppi.

Käännä muutos (FC) ja Smad7-ekspression mitattiin normaaleissa paksusuolen kudosnäytteitä valvonta colonoscopies. Rank-pohjainen ei-parametrinen analyysi käytettiin arvioitaessa vaikutus jokainen ylimääräinen pieniä alleeli rs6507874, rs6507875, rs8085824, ja rs4939827 (lisäaine malli) geenien ilmentymisen säätämisen sukupuoli, ikä ja etninen tausta. Kaksipuolinen

p

-arvot saatiin tietojen uskottavuusosamäärä. Log

2 (ΔΔCt) piirrettiin funktiona genotyyppien käyttäen rasiakuvaaja – dot plot overlay. Näytteiden määrä on huomattava kunkin genotyypin. Tilastollisesti merkitsevä yhteys todettiin rs8085824.

Lisätutkimuksia tarvitaan sen määrittämiseksi, miten tämä monikomponenttijärjestelmän tehostajana valvonta

Smad7

geeniekspression aikana paksusuolen kehitystä ja solujen kasvua, ja onko vai ei yksittäisiä komponentteja tehostajana teko toisistaan ​​riippumatta.

asetus Smad7 Enhancer

vieressä halusimme määritellä suhde tehostajana aktiivisuuden ja BMP /TGF signalointi. Kuten johdannossa mainittiin, Smad7 toimii keskeisenä välittäjänä negatiivinen kierre sekä TGFp ja BMP signalointireitteihin. Olimme kiinnostuneita siis onko tehostajana A oli osa silmukka, yhä aktiivisempi vastauksena joko TGFp 1 tai BMP4 signalointi. HCT-116 ja SW480-soluja seerumia yön yli ennen 6 tuntia hoidon 100 pmol TGFp 1 tai BMP4, ja 2 kb fragmentti A käytettiin testaamaan lusiferaasiaktiivisuuden. Hoidon jälkeen TGFp 1, fragmentit, jotka sisältävät joko CGTC (major) haplotyyppi tai TCCG (vähäinen) haplotyyppi osoittivat tilastollisesti merkitsevää muutosta aktiivisuutta joko solulinjassa (kuvio 6A). Sitä vastoin käsittelyn jälkeen BMP4, tehostaja aktiivisuus fragmentti, joka sisältää CGTC suuri haplotyyppi kasvoi 1,2-kertaisesti HCT-116-soluissa ja 1,5-kertaisesti SW480-soluissa (kuvio 6B). Nostamalla tehostajana aktiivisuus havaittu myös sisältävä fragmentti TCCG vähäinen haplotyypin SW480-soluissa, joissa BMP käsittely johti 1,4 kertainen nousu tehostajana aktiivisuutta, mutta ei HCT-116-solut, joissa ei tapahtunut merkittävää kasvua havaittiin (

p

= 0,38) (kuvio 6B). Koska DNA-fragmentteja, jotka sisältävät sekä haplotypes stimuloitiin BMP4 vuonna SW480 samassa laajuudessa (fold muutos), me olettaa, että 4 SNP riskihaplotyypin eivät häiritse varsinaista BMP reagoiva osia tehostajana. Kuitenkin johtuen alijäämä toimintaa alaikäisen haplotyyppi jälkeen BMP4 stimulaation TCCG haplotyyppi konstruktio edelleen osoittaa alempi tehostajana aktiivisuus kuin CGTC haplotyyppi ilman BMP4 stimulaatiota (kuvio 6C). Yhteensä nämä tiedot sotkemaan tehostajan negatiivisen takaisinkytkentäsilmukan vasteena BMP signalointia, mutta ei TGF varsi signalointiryöpyn.

(A) Enhancer aktiivisuus mitattiin lusiferaasin määritys, fragmentti A, joka sisälsi suuret (CGTC) ja pienet (TCCG) haplotyyppien seerumin nälkään HCT-116 ja SW480 soluja inkuboitiin TGFp 1 6 tuntia. Näytteet piirretään kertainen aktiivisuuden muutos suhteessa ei-käsiteltyjen solujen samalla levyllä. (B) Enhancer aktiivisuus stimuloitiin 6 tunnin BMP4 kohtelun CGTC haplotyypin HCT-116 (

p

= 4,14 x 10

-3) ja SW480-solut (

p

= 1.22 x 10

-10). TCCG haplotyypin fragmentti A esittää alhaisempi stimulaatiota, ja vain SW480 (

p

= 1,61 x 10

-6). (HCT-116

p

= 0,38). Vaikutus BMP on piirretty kertainen muutos käsittelemättömiin näytettä kutakin haplotyypin samalla levyllä. (C) Enhancer aktiivisuuden vertailu CGTC ja TCCG haplotypes seuraava BMP4 hoitoa. Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus piirrettiin kunkin haplotyypin HCT-116 ja SW480 käyttämällä samaa kokeellista aineisto kuin (B).

Keskustelu

Äskettäin meidän lab ja muut ovat alkaneet pohtia vaikutukset useiden toiminnallisten varianttien kytkentäepätasapainossa (LD) edistetään sairauden riskin tunnistetut GWAS sijasta toiminnallisina variantti [28]. Esimerkiksi kromosomissa 11q23.1, meidän lab tunnistettu kaksi SNP LD (r

2 = 1), joka liittyy CRC riski, yksi tehostajaa ja yksi kaksisuuntainen promoottori, joka osoitti alleeli-spesifinen aktiivisuus korreloi ekspressiotasoja kolmesta aiemmin tuntemattomia geenikohteet [16].