Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Krooninen UV ihon altistuminen aiheuttaa orvaskeden erilaistumiseen epämuodostumia, jotka voivat olla suurelta osin palautettu farmakologisin nikotiinihappoannosten. Nikotiinihappo on tunnistettu ligandi ihmisen G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien GPR109A ja GPR109B että signaali läpi G

i-inhibitiota adenylyylisyklaasin. Olemme tutkineet ilmaisua, solu jakelu, ja toimivuus GPR109A /B ihmisen ihon ja ihon peräisin orvaskeden solujen.

Tulokset

Nikotiinihappo lisää orvaskeden erilaistumista vät valon ihmisen ihon tuomitaan terminaali differentiaatiomarkkerien kaspaasi 14 ja filaggriinista. Sekä GPR109A ja GPR109B geenit transkriptoidaan ihmisen ihon ja orvaskeden keratinosyyteissä, mutta ilmentyminen ihon fibroblasteista on alle toteamisrajat. Reseptorin selostukset ovat suuresti yliekspressoitu levyepiteeliperäinen syöpiä. Reseptoriproteiinin normaalissa ihossa on erottuva pohjapinta kautta rakeinen orvaskeden, jossa sijainti solussa enemmän leviäviin Tyvisolukerroksessa mutta pääasiassa paikallistaa solukalvon sisään eriytetympää epidermikerroksissa. Normaalissa ihmisen ensisijainen ja kuolemattomaksi keratinosyytit, nikotiinihappo reseptorit osoittavat solukalvon lokalisointi ja toiminnallinen G

i-välitteistä signalointia. Sen sijaan on okasolusyöpä peräisin oleva solulinja, reseptoriproteiini esittää enemmän diffuusi sijainti solussa ja reseptorit ovat lähes ei-funktionaalisia.

Päätelmät

Näiden tutkimusten tulokset perustella tulevaisuudessa geneettisen ja farmakologinen interventio tutkimuksia määritellä mahdolliset erityinen asema (t) nikotiinihappoa reseptoreihin ihmisen ihon homeostaasiin.

Citation: Bermudez Y, Benavente CA, Meyer RG, Coyle WR, Jacobson MK, Jacobson EL (2011) nikotiinihappo acid Receptor poikkeavuudet Human Skin Cancer: vaikutukset rooli epidermaalinen Differentiation. PLoS ONE 6 (5): e20487. doi: 10,1371 /journal.pone.0020487

Editor: Christophe Egles, Université de Technologie de Compiègne, Ranska

vastaanotettu: 9. maaliskuuta, 2011; Hyväksytty: 27 huhtikuu 2011; Julkaistu: 31 toukokuu 2011

Copyright: © 2011 Bermudez et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain National Institutes of Health myöntää CA43894, CA106677, CA78447, CA027502, ES06694, ja HD048837. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: MKJ ja ELJ ovat rehtorien NiadynePharma, Inc., jonka sponsoroi tutkimusta hallinnoidaan mukaisesti Arizonan yliopiston konfliktien kiinnostuksen politiikkaa.

Johdanto

iho toimii metabolisesti aktiivinen biologinen este suojaamaan ulkoisia ympäristön loukkauksia. Ylläpito iho este on kriittinen niin monta ihosairauksien hoitoon on tunnusomaista puutteellinen esteen eheyden tuloksena on vähentynyt suojaavan vaikutuksen iholle. Ihon este muodostuminen on ominaista prosessi homeostaasin jossa jakautuvien solujen Tyvisolukerroksessa jatkuvasti vaeltavat kohti ihon pintaa ja läpikäyvät terminaali erilaistumista ja lopulta suunnitellut solukuolemaa muodostamiseksi sarveiskerros koostuu lopullisesti erilaistuneita keratinosyyttejä ja muita aineita, jotka muodostavat esteen [ ,,,0],1]. Kuitenkin orvaskeden lisääntyminen ja erilaistuminen on löydettävä tasapaino, koska riittämätön leviämisen johtaa harvennus, epidermaalinen kerros ihoa ja menetys este suojelua ja samalla lisääntyvän leviämisen ilman koordinoida kasvoi erilaistumista johtaa sairaudet kuten psoriasiksen ja ihosyöpiä [1].

merkittävä ympäristöuhka jolloin niissä on useita muutoksia ihon rakennetta ja toimintaa on altistuminen ultraviolettivalolle auringon [2]. Krooninen aurinko altistuminen valolle voi lopulta johtaa orvaskeden hyperproliferaatiota kanssa heikentynyt erilaistuminen johtaa Aurinkokeratoosin (AK) leesioita ja okasolusyöpä (SCC) ihon. Tärkein histologinen ominaisuus SCC on korvata normaalia kypsynyt orvaskeden keratinosyyttejä huonosti eriytetty epätyypillinen okasolujen [3]. Mudgil et ai. ovat osoittaneet ihon orvaskeden vastineet, joka muutti, huonosti eriytetty keratinosyytit voidaan ajaa erottamaan läsnäollessa riittävästi normaalin keratinosyyttien [4]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että hoidot, jotka voisivat edistää orvaskeden erilaistumista vät valon iho on potentiaalia palauttaa tasapaino lisääntymistä ja erilaistumista ylläpitoon tarvittavat ihon homeostaasiin ja näin voitaisiin torjua kehittymistä AK vaurioita ja SCC.

Yksi farmakologiset vaikutukset nikotiinihapon vät valon iho on edistää epidermaalinen erilaistumista [5], nostamalla mahdollisuus, että nikotiinihapporeseptoria voi olla mukana. Reseptori nimeltään GPR109A (HM74A ihmisillä ja PUMA-G hiirillä), äskettäin antanut HGNC nimeämistä NIACR1, havaittiin hyvin eriytynyt rasvasolut, perna, ja immuunijärjestelmän solut [6], [7], [8]. GPR109A parit G-proteiinit G

i perheen inhibitorinen G-proteiini, joka ligandin sitoutumisen signaalit lasku adenosiini-3 ’, 5’-syklisen monofosfaatin (cAMP) tuotannon kautta inhibition adenylyylisyklaasin on pertussistoksiini -sensitive tavalla [6], [7], [8]. GPR109A kuuluu alaryhmään G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (GPCR), joka koostuu GPR109A ja GPR81 molemmat, joita esiintyy ihmisillä ja jyrsijöillä. GPR109B (myös kutsutaan HM74) on toinen jäsen tässä reseptoriperheen, joka sitoutuu vaikkakin matalalla affiniteetilla nikotiinihappo ja on läsnä vain ihmisillä. Nikotiinihappo aktivoi sekä GPR109A ja GPR109B EC

50-arvot 0,1 uM ja 100 uM, vastaavasti [9]. Vaikka on epätodennäköistä, että nikotiinihappo on endogeeninen ligandi näiden reseptorien farmakologinen nikotiinihappoannosten välityksellä toimivien GPR109A välittävän sekä haluttu antilipolyyttisestä vaikutuksia sekä toivottuja ihon vasodilataatiota vaikutuksia, jotka liittyvät suun kautta nikotiinihapon hoito [6], [7 ], [8], [10], [11]. Koska nikotiinihapon aiheuttamaa prostanoidi- muodostuminen vastaa ihon punoitusta on ehdotettu tapahtuvan ihon dendriittisten Langerhansin solut, ilmaus GPR109A ihossa on tutkittu tässä yhteydessä [10], [12], [13], [14] ; kuitenkin, tiedetään vähän toimintoja nikotiinihapon reseptorien muita näkökohtia ihon biologiassa. Tässä tarkastellaan ilmaisua, solu jakelu, ja toimivuus GPR109A ja GPR109B ihon ja ihon peräisin olevien solujen. Tuloksemme osoittavat, että levyepiteelisyöpä syövät epänormaaleja GPR109A /B ilmentymisen, solujen jakautuminen, ja toiminta, mikä osoittaa, että nämä reseptorit ovat mukana ihon homeostaasiin.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Normaalit ihmisen orvaskeden keratinosyyttejä (NHEK, Lonza, Sveitsi) viljeltiin rutiininomaisesti EpiLife (GIBCO /Invitrogen), joka sisälsi ihmisen keratinosyyttien kasvua täydentää alle 10 populaation kaksinkertaistumista. Normaalit ihmisen diploidi fibroblastit, CF3, (populaation kaksinkertaistumista alle 30, Oklahoma Medical Research Foundation, Oklahoma City, OK), vakiintuneita solulinja immortalisoitujen ihmisen orvaskeden keratinosyyttejä, HaCaT, ja Ras transformoitujen HaCaT, lahjoja Dr. Norbert Fusenig ( Saksan Cancer Research Center, Heidelberg, Saksa) [15], ihmisen epidermoidikarsinooma solulinja, A-431 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA), ja levyepiteelikarsinooma solulinja, SCC-25 (ATCC ) viljeltiin rutiininomaisesti Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM, Sigma Aldrich, St. Louis, MO), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Hyclone /Fisher Scientific). Kaikki soluja pidettiin kosteutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2 37 ° C: ssa.

RT-PCR (RT-PCR) B

Kokonais-RNA rasvakudoksessa, istukka , keuhkoissa ja iholla hankittiin Stratagene (Cedar Creek, TX) ja 1 ug kutakin RNA: ta käytetään suorittamaan cDNA synteesejä käyttäen TaqMan Reverse Transcription kit Applied Biosystems (Foster City, CA). PCR suoritettiin käyttämällä seuraavia alukkeita GPR109A ja GPR109B: GPR109A – eteenpäin – 5 ’CACCACACAGACACACACCTCCTTGCTGG 3’, GPR109B – eteenpäin – 5 ’CACCATACAGACACACGCCACTTTGCTGG 3’, ja reverse-aluketta sekä geenien – 5 ’CAGTGACATTACTCGATGCAACAGCCCAAC 3’ syntetisoitiin Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, IA). Lämpökäsittelyyn-olosuhteet olivat seuraavat: aktivointi-DNA-polymeraasia 94 ° C: ssa 1 min, jota seurasi 25 monistussykliä 94 ° C: ssa 1 min ja 62 ° C: ssa ja 68 ° C 1 min.

Kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR) B

kokonais-RNA viljellyistä soluista valmistettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit puhdistus järjestelmä (Qiagen, Valencia, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Frozen saavuttaa ihmisen normaalin ihon biopsiat, AKs, ja SCC saatiin hankkeen ”kemopreventioon ihosyövän Program Project arkistoituja näytteitä Additional analyysit, tarkistaa Arizonan yliopisto IRB (Tucson, AZ), Project Number 08-0201-04 . Tutkimuksessa, josta näytteet otettiin suoritettiin mukaan Helsingin julistuksen periaatteita. Kirjallinen suostumus saatiin kaikissa aineissa. Kokonais-RNA ihon kudosnäytteistä valmistettiin käyttäen RNeasy sidekudoksen Mini Kit (Qiagen) seuraten valmistajan protokollaa. cDNA-synteesi suoritettiin käyttäen TaqMan Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) valmistajan ohjeiden käyttämällä satunnaisia ​​heksameerejä ja 1 ug kokonais-RNA: ta. Sillä TaqMan-pohjainen qRT-PCR ilmentymisen profilointi, 25 ng kutakin cDNA, mukaan lukien kokonais-RNA okasolusyöpä näytteitä (Asterand, Detroit, MI) lisättiin iTaq Supermix (BioRad, Hercules, CA) yhdessä TaqMan MGB-koettimia mukaan valmistajan protokollan (Applied Biosystems, Foster City, CA). qRT-PCR suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [16]. Koettimet on suunniteltu erityisesti havaitsemaan ihmisen GPR109A (TaqMan Gene Expression Assay Hs02341584_s1) ja GPR109B (TaqMan Gene Expression Assay Hs02341102_s1) selostukset hankittiin Applied Biosystems. Reaaliaikainen fluoresenssiseurantatekniikan suoritettiin ABI Prism 7000 (Applied Biosystems). Ihmisen ihon kudoksia, glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) ja β-aktiini-geenin ilmentymisen muuttunut asteen maligniteetin verrattuna 18s rRNA, joka pysyi vakiona. Viljellyissä soluissa, GAPDH ja β-aktiini ilme pysyi vakiona verrattuna 18s rRNA; Näin ollen suhteellisten ekspressiotasojen eri transkriptien määritettiin vertaamalla vastaan ​​siivous geenit, 18s rRNA kudoksia ja GAPDH varten viljellyt solut. Kaikki ilmentymisen mittaukset suoritettiin kolmena rinnakkaisena käyttäen vähintään kolmea itsenäisesti luotu cDNA näytteitä. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM). Suhteellinen geenin ilmentyminen laskettiin kuten aiemmin on kuvattu [17]. Muutokset geenien ilmentyminen pidettiin merkittävinä 1,5-kertainen muutos ja p≤0.05.

Vasta Generation ja puhdistaminen

analyysi ihmisen GPR109A ja GPR109B, mukautetun, kaupallinen vasta-aine tuotettu kaneissa käyttämällä synteettistä peptidiä (RHHLQDHFLEIDKKNC) tuottaa antiseerumien tunnistamaan N-pään GPR109A ja GPR109B (Sigma-Genosys, Woodlands, TX). Eläinten ylläpito ja vasta-ainetuotanto suoritettiin Sigma-Genosys protokollan mukaisesti tarkistaa ja hyväksyä Sigma-Genosys Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC), OPRR Assurance A4182-01; USDA rekisterinumero 93-R-283. Antiseerumit affiniteettipuh- puhdistettiin käyttäen Piercen aminolink mukainen kitti valmistajan protokollan (Rockford, IL). Vasta-aineet todensi osoittavat tiedot otteita HeLa-solujen, jotka eivät ilmennä reseptoria, eivät osoittaneet positiivista immunobloteilla mutta otteita HeLa-soluista (American Type Culture Collection, Manassas, VA) transfektoitu nikotiinihapporeseptoria ei positiivisia bändejä odotettu muuttoliike asentoon. Lisäksi CF3 soluja, jotka eivät osoittaneet reseptorin ilmentymisen qRT-PCR ei myöskään osoittanut positiivisia immunobloteista. Myös kaikki immunoblot-analyysit sisälsi ohjaus, joka osoitti, että peptidi, jota vastaan ​​vasta-aineet synnytetään kilpaili ulos signaalin.

immunoblottauksella

SDS-PAGE ja Western blot -analyysit suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],18]. Kiinnittyneet solupopulaatiot hajotettiin jääkylmässä lyysipuskuria (150 mM natriumkloridia, 50 mM natriumfluoridi, 50 mM kaliumfosfaattia, 40 mM natriumpyrofosfaatti, 500 ui Triton X-100, 100 ui SDS: ää, 200 ui 1 M Tris-HCl pH 7,4 vedessä ja 1 tabletti täydellinen mini proteaasiestäjäseostabletit, Roche Diagnostics, Indianapolis, iN) 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Lysaatit sentrifugoitiin 12000 rpm 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Proteiinikonsentraatio lysaatit määritettiin käyttämällä BCA ™ Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaksikymmentä mikrogrammaa proteiinia lisättiin 4 x latauspuskuria (250 mM Tris, pH 6,8, 8% SDS, 20% glyseroli, 0,012% bromifenolisininen, 4% β-merkaptoetanolia), kuumennettiin 95 ° C: ssa 5 minuutin ajan, suoritettiin elektroforeesi 12,5 % SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin PVDF-kalvoille (Amersham, Piscataway, NJ). Kaikki membraanit blokattiin 1 tunnin ajan 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidulla suolaliuoksella (TBS) plus 0,1% Tween-20 (10 mM TBS-T, pH 7,4) ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaarisen vasta-aineen tai ensisijainen vasta-aine plus 1000 mooliylimäärä peptidi (käytetään tuottamaan vasta-aine) suhteen vasta-ainetta, inkuboitiin 5% rasvatonta maitoa TBS-T 24 h ennen käyttöä. Kalvot inkuboitiin ja kehitettiin Immobilon ™ Western Kemiluminesenssiin HRP Substrate (Millipore, Billerica, MA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Alkuvaiheen blotting, membraanit varten β-aktiini (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) varmistaa tasainen kuormitus. Blotit skannattu ja analysoitu ImageJ versio 1.39u ohjelmisto (NIH, Bethesda, MD). Raportoidut arvot kohdeproteiinien normalisoitiin blotit ”vastaavan β-aktiini tasot ainakin kolmessa riippumattomassa kokeessa.

Immunosytokemia (ICC) B

CF3, NHEK, HaCaT, Ras-transformoitujen HaCaT, A-431, ja SCC-25-soluja kasvatettiin coverslip. Kiinnitykseen, solut huuhdeltiin kahdesti TBS: llä, inkuboitiin 4% formaldehydiä TBS: ssa 30 minuuttia, ja huuhdottiin kahdesti TBS: llä. Merkitä GPR109A /B-reseptoreihin, endogeenisen biotiinin esto suoritettiin käyttämällä NeutrAvidin ™ Biotiini-sitova proteiini (Pierce) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Välittömästi sen jälkeen, soluja inkuboitiin 3% naudan seerumin albumiinia liuotettiin TBS: ää (BSA-TBS) estopuskurissa 1 tunti ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-ainetta laimennettuna blokkauspuskuriin (01:10). Peptidin kilpailun kokeissa, 1000-kertainen ylimäärä peptidin mukana. Seuraavana päivänä solut pestiin 3 kertaa 5 minuuttia kullakin TBS: llä. Takertumisen vaihe toistettiin, ja soluja inkuboitiin 01:25 biotiini-SP-konjugoidulla AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) 30 min 37 ° C: ssa. Objektilasit pestiin TBS ja inkuboitiin 01:25 streptavidiini Quantum Dot 605 konjugaatteja (Millipore) ja 45 min 37 ° C: ssa. Huolellisen pesun TBS, peitelaseja asennetaan käyttäen kiinnitys alustalla, joka sisälsi 90% glyserolia ja 10% TBS. Immunovärjättiin levyt pantiin 4 ° C: ssa ja visualisoitiin seuraavana päivänä fluoresenssimikroskoopilla.

immunohistokemia (IHC) B

immunohistokemiallinen tunnistus GPR109A /B suoritettiin parafiiniin upotetut leikkeet normaalista ihmisen ihon koepaloja. Arkistoitu materiaalia tehdyssä tutkimuksessa mukaisesti Helsingin julistuksen periaatteita tarkastelleet INTEG Review Ethical Review Board, Austin, TX. Kaikki koehenkilöt lukea ja allekirjoittivat IRB-hyväksytty suostumuslomakkeen. Kaikki osallistujat, ne annetaan tukitoimien, ja ne arvioidaan tuloksia sokaisi ryhmään tehtävän. Parafiiniin upotetut leikkeet poistettiin parafiini ksyleenillä ja hydratoidaan luokiteltujen sarjojen alkoholia, leikkeet upotettiin sitruunahappoa vesihauteessa 87 ° C: ssa 20 min tehostamiseksi antigeeniä haku. Sitten leikkeitä huuhdeltiin TBS ja estetty 3% BSA-TBS 20 min. Välittömästi sen jälkeen estää, leikkeitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen 3% BSA-TBS: ää (1:10) yön yli 4 ° C: ssa. Peptidin kilpailun kokeissa, 1000-kertainen ylimäärä peptidin mukana. Seuraavana päivänä leikkeitä pestiin TBS, estetty taas kerran, ja inkuboitiin 01:25 biotiini-SP-konjugoidulla AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) 30 min 37 ° C: ssa. Leikkeet huuhdeltiin TBS: llä ja inkuboitiin 01:25 streptavidiini Quantum Dot 605 konjugaatteja (Millipore) ja 45 min 37 ° C: ssa. Huolellisen pesun TBS, peitelaseja asennetaan käyttäen kiinnitys alustalla, joka sisälsi 90% glyserolia ja 10% TBS. Peptidin kilpailun kokeissa, leikkeitä pestiin TBS ja inkuboitiin 1:1000 FITC vuohen anti-kani-lgG: tä (Jackson ImmunoResearch Laboratories) 1 tunnin ajan RT: ssä.

IHC-analyysi kaspaasi 14 ja filaggriinin mukana analogisia menettelyjä käyttäen vasta-SC5628 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) kaspaasi 14 ja 3137-500 (Abcam, Cambridge, MA) ja filaggriinista. Kvantifiointi vasta-aineen värjäys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [5].

cAMP-määritys

NHEK, HaCaT, Ras-transformoitujen HaCaT, A-431, SCC-25, ja CF3-solut ympättiin tiheydellä 25000 solua 35 mm: n viljelymaljoilla. Kaksi päivää myöhemmin, viljelyalusta poistettiin ja korvattiin viljelyalustalla, joka sisältää ± 100 ng /ml hinkuyskätoksiinilla (inkuboitiin yön yli), ± 10 uM forskoliinia läsnä ollessa tai poissa ollessa nikotiinihappoa eri konsentraatioissa 1 h ennen testausta. Lukuun ottamatta annosvastekokeessa lopullinen pitoisuus nikotiinihapon käytettiin 100 uM. Mittaus solunsisäisiä cAMP-tasoja suoritettiin käyttäen syklisen AMP Complete EIA Kit (Pitoisuus mallit, Ann Arbor, MI) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kokeet toistettiin kolme kertaa itsenäistä soluviljelmissä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta.

Tulokset

Nikotiinihappo edistää orvaskeden erilaistumista vät valon ihmisen ihon

Krooninen UV altistuminen aiheuttaa heikentynyt orvaskeden erilaistumista ja lisääntynyt epidermaalinen proliferaatio, joka voi aiheuttaa aktiininen keratoosi vauriot ja squamous cell ihon syövät [19]. Olemme aiemmin todennut, että myristyylialko- nikotinaatti (MN), aihiolääke, joka tuottaa nikotiinihappo ihoa, edistää epidermaalinen erilaistumista liittyvine parantaa ihon este toiminto kroonisesti vät valon ihon arvioituna muutokset orvaskeden ja marraskeden paksuuden, vähentynyt hinnat transepidermaalista nestehukka ja lisäykset minimaalinen erythemal annoksena [5]. Tutkia vaikutuksia MN eriyttäminen suoremmin kaksi orvaskeden Differentiaatiomarkkerien, kaspaasi 14 ja filaggriinista [20] arvioitiin henkilöillä, joilla ihon valon aiheuttaman vaurion plasebokontrolloidussa kliinisessä tutkimuksessa [5]. Kuva. 1A esittää esimerkkiä koepalojen värjättiin lähtötilanteessa ja 12 viikon paikallisen käytön formulaatiota, joka sisältää 5% MN ja kuvio. 1B esittää määrällisesti kaspaasi 14 ja filaggriinista potilailla lumelääkettä tai MN muotoiluja. Läsnäolo MN johtaa kasvuun verrattuna lumelääkkeeseen noin 30% kaspaasi 14 ja 20% filaggriinista. Plasebo muotoilu substituoidut myristyylimyristaatti MN, sulkea pois kaikki vaikutukset myristyylialkoholi joka syntyy nikotiinihapon vapautuu aihiolääke.

kudosmatriisien ihon biopsianäytteissä kliinisestä tutkimuksesta vaikutuksista myristyyli- nikotinaatti (MN) ihmisillä, joilla vät valon ihon [5] värjättiin terminaalin differentiaatiomarkkerien kaspaasi 14 ja filaggriinista. Paneeli A: Esimerkki biopsianäytteen lähtötilanteessa ja 12 viikon MN hoidon värjättiin H Methods). Tämä vasta-aine on suunnattu sekvenssin lähellä N-päätä yhteinen sekä reseptorit ja ei erotella erittäin homologisia GPR109A ja GPR109B proteiineja. Western blot -analyysit osoittavat, että nikotiinihapporeseptoria proteiini havaittiin kaikissa solulinjoissa tutkittiin odotettua kokoa kahden nikotiinihapon reseptorit (~42 kDa) (Fig. 3B). Peptidi käyttää tuottamaan vasta-aine kilpailivat tehokkaasti vasta-signaalin, joka osoittaa vasta-aineen selektiivisyys (Fig. 3C). Proteiinin määrä suhteessa p-aktiini on suurempi kuolemattomaksi, muunnettava, ja pahanlaatuisten solulinjojen tutkittujen verrattuna NHEK.

Nikotiinihappo reseptoreihin ihmisen ihon ovat läsnä orvaskeden karvatupen

määrittämiseksi sijainti solun GPR109A /B ihmisen ihon immunovärjäyty- analyysit suoritettiin. Havaitsimme, että GPR109A /B ilmentyvät Tyvisolukerroksessa kautta spinous ja rakeinen orvaskeden ja karvatupet normaalin ihmisen ihon (Fig. 4A). Korkeampi suurennos (Fig. 4B) paljastaa, että GPR109A /B ilmaisu näyttää jakautuu tasaisemmin koko solun tyvisolusyöpä orvaskeden ja osoittaa enemmän reuna-jakelu spinous ja rakeinen kerrokset missä keratinosyytit ovat myöhemmissä vaiheissa terminaalin erilaistumista. Vaihtoehtoinen loisteputki tag, fluoreskeiini isotiosyanaatti (FITC), havaitsemiseksi anti-peptidi-vasta sitova käytetään kuvassa. 4C osoittaa, että peptidi käyttää tuottamaan vasta-aine esti tehokkaasti sitovan näissä kudoksissa (Fig. 4D).

immunohistokemia (IHC) analyysit suoritettiin parafiiniin upotetut ihmisen ihon kohdat käyttäen vasta-ainetta vastaan ​​GPR109A /B. Paneelit A ja B käytettiin streptavidiini Quantum Dot 605 konjugaatit havaitsemiseen. Paneelit C ja D käytettiin FITC vuohen anti-kani IgG havaitsemiseen. Paneeli A: Havainnollinen immuunivärjäysmenetelmällä osoittama näytteen 200-kertainen suurennus. Paneeli B: Havainnollinen IHC osoittama näytteen 400-kertainen suurennus. Paneelit C ja D: Havainnollinen IHC näytteet on esitetty 400-kertaisella suurennuksella puuttuessa (paneeli C) tai läsnä ollessa (paneeli D) kilpailun peptidin käyttää tuottamaan vasta-aineeseen. Lyhenteet: SC, sarveiskerros; SG, jyväiskerroksen; SS, stratum spinousum; SB, stratum basale. Koko merkki edustaa 2 mikronia.

Nikotiinihappo reseptorin sijainnista solussa vaihtelee viljellyt epidermaaliset solut

NHEK-solut värjättiin käyttäen anti-peptidi-vasta-aine (Fig. 5A) ja peptidi kilpailu estetty värjäytymisen (kuvio. 5B). Värjäys näkyy reuna aggregaattien muodostavat solut ”mukulakivi rakenteita”, kun taas eristetyt solut näyttävät olevan hajanaisempi mallia merkintöjä (Kuva. 5A). Vuonna HaCaT-soluissa, GPR109A /B ilmentyminen on pääasiassa lokalisoitu reuna (Fig. 5C). Sen sijaan, Ras-transformoitujen HaCaT (Fig. 5D), A-431 (Fig. 5E) ja SCC-25 (Fig. 5F) solukalvon lokalisointi on mukana merkintöjä koko sytoplasmassa. Reseptorin ilmentyminen ihon fibroblasteissa, CF3, on havaittavissa (tuloksia ei ole esitetty).

paneelit A ja B: Immunosytokemia (ICC) analyysit käyttämällä vasta-ainetta vastaan ​​GPR109A /B tehtiin NHEK punaisella ja sulautui ydin- DAPI värjäys sinisellä. Paneeli A osoittaa värjäämällä käyttämällä GPR109A /B-vasta-aineen ja Paneeli B esittää värjäystä läsnä ollessa 1000-kertainen ylimäärä peptidejä käytetään nostamaan vasta-aineen. Paneeli C: HaCaT, paneeli D: Ras-transformoitujen HaCaT, Paneeli E: A-431, paneeli F: SCC-25. Kaikkien paneelien, suurennus on 400 × ja Kokomarkkerina edustaa 10 mikronia.

Normal keratinosyytit osoittaa toiminnallinen G-proteiiniin kytketyn nikotiinihapporeseptoria signalointia G

i, jonka tehtävänä on vähentynyt ihosyöpä solut

Suurin characterizations toiminnallisuuden nikotiinihapon reseptoreita on tutkittu solut, jotka eivät ole luonnostaan ​​ilmentävät reseptoreita, mutta johon reseptorin geenit transfektoidaan ja yli-ilmentyy. Tutkimuksissamme, tutkimme luontainen reseptorin toiminnallisuutta mittaamalla sen kyky nikotiinihapon estää forskoliinin stimuloimaa cAMP: n muodostumisen puuttuessa heterologisten ilmentymisen. Näissä olosuhteissa, suhteellinen osuus nikotiinihapon herkkiä cAMP: n muodostumisen, on pienempi kuin transfektoiduissa soluissa. Forskoliinikäsittelylle esiin cAMP: n muodostumisen kaikissa soluissa tutkittu kertyminen 170-200 pmol cAMP per mg proteiinia 1 tunnin inkuboinnin ja läsnäolo 100gM nikotiinihapon esti forskoliinin aiheuttamaa cAMP tuotanto differentiaalisesti eri solutyypeissä ( kuva 6A). Suhteellisesta inhibition eri solulinjoissa nikotiinihapon on esitetty kuviossa. 6B. Inhibitio cAMP: n muodostumisen nikotiinihapon kautta luontainen reseptorien oli noin 44% vuonna NHEK soluissa, 43% HaCaT ja 39% Ras-transformoitujen HaCaT soluja. Sen sijaan, cAMP stimuloi forskoliinilla väheni merkittävästi kasvain- soluihin. Nikotiinihappo esti vain 23% A-431-soluissa ja 13% SCC-25-soluissa.