Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

MikroRNA (miRNA) ovat luokka lyhyitä ei-koodaavat RNA: t, jotka säätelevät solujen homeostaasin estämällä käännös tai hajottavien mRNA kohdegeenien, ja siten voivat toimia kasvaimen synnyssä tai onkogeenien. Rooli MikroRNA vuonna medulloblastoma on vasta hiljattain osoitettu. Oletimme, että MikroRNA ilmentyvät eri normaalissa CNS kehitys saattaa olla epätavallisen säänneltävä medulloblastoma ja ovat toiminnallisesti tärkeitä medulloblastoma solujen kasvua.

Menetelmät ja tärkeimmät havainnot

tarkasteltiin ilmentymisen MikroRNA vuonna medulloblastoma ja sitten tutkittiin toiminnallista roolia yhden tietyn yhden, miR-128a, säätelyssä medulloblastoma solujen kasvua. Olemme huomanneet, että monet MikroRNA liittyy normaaliin hermosolujen erilaistumista merkittävästi alaspäin säännellään medulloblastoma. Yksi näistä, miR-128a, inhiboi medulloblastoma solujen kohdistamalla BMI-1 onkogeeni. Lisäksi miR-128a muuttaa solunsisäisiä redoksitilassa kasvainsolujen ja edistää solujen vanhenemista.

Päätelmät ja merkitys

Kirjoittajat raportoivat uuden sääntelyn reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) by microRNA 128a kautta spesifinen esto BMI-1 onkogeeni. Osoitamme, että miR-128a on kasvua suppressiivinen aktiivisuus medulloblastoma ja että kyseinen toiminta on osittain välittyy kohdentamalla BMI-1. Nämä tiedot on vaikutuksia modulaatio redox valtioiden syövän kantasoluja, joiden arvellaan olevan resistenttejä johtuen niiden alhaisen ROS valtioissa.

Citation: Venkataraman S, Alimova I, Tuuletin R, Harris P, Foreman N, Vibhakar R (2010) MicroRNA 128a Lisäykset Solunsisäinen ROS Level by Targeting BMI-1 ja Estää Medulloblastoma syöpäsolujen kasvua edistämällä Vanheneminen. PLoS ONE 5 (6): e10748. doi: 10,1371 /journal.pone.0010748

Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 helmikuu 2010; Hyväksytty: 30 huhtikuu 2010; Julkaistu: 21 kesäkuu 2010

Copyright: © 2010 Venkataraman et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Pediatric aivosyövän Foundation (https://www.pbtfus.org/), Bear välttämättömyystarvikkeita Pediatric Cancer Foundation (https://www.bearnecessities.org), ja National Institutes of Health-National Institute of neurologiset häiriöt ja Stroke (NIH-NINDS) avustuksen K08NS059790. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Medulloblastoma on yleisin pahanlaatuinen aivokasvain lapsuuden. Vaikka tulokset ovat parantuneet, on merkittävä hoito liittyvien sairauksien [1], [2]. Lisäksi potilailla, joilla on korkean riskin ominaisuuksia edelleen huono ennuste. Viimeaikaiset edistysaskeleet osoittavat, että medulloblastoma syntyy pikkuaivojen rae soluprekursorit tai hermo kantasoluja sijaitsee pikkuaivoissa [3], [4], [5], [6]. Vaikka molekyylitason mekanismeja medulloblastoma kasvainten synnyssä ei ole määritelty, on selvää, että on olemassa poikkeava valvonta normaalin kehityshäiriöitä mekanismien [7].

Äskettäin työskennellä meidän lab ja muut ovat sekaantuneet MikroRNA tärkeitä säätelijöitä medulloblastoma solujen kasvua [8], [9], [10]. MikroRNA koostuvat 18-22 nukleotidin RNA-molekyylejä, joilla on posttranskriptionaalisen geenien toimintaa [11]. Yleisimmin ne geeniekspression säätelemiseksi yhdessä 3′-alueen (3 ’UTR) geenien ja estävät proteiinin translaation [12]. MikroRNA voivat myös epävakautta ja välittävät hajoaminen RNA-transkriptien [13]. Lisäksi niiden merkitys normaalin kehityksen, MikroRNA liittyy myös syövän synnyn [14], [15]. Monet MikroRNA alle ilmaistuna ihmisen kasvaimissa verrattuna normaaleihin kudoksiin, kun taas jotkut ovat yli ilmaistaan ​​[16]. Tärkeää on, häiriöstä mikroRNA käsittelyn tulokset tiiviimpään kasvainten synnyssä [17]. Lisäksi yhä useammat MikroRNA liittyy tiettyyn ihmisen syövissä. Esimerkiksi microRNA 21 (miR-21) on yli ilmaistaan ​​glioblastooma, ja esto miR-21 estää glioblastoma kasvu

in vitro

ja

in vivo

[18]. Muut ovat osoittaneet, että miR-137 ja miR-124 indusoi erilaistumista gliooma kantasolujen [19]. Olemme aiemmin osoittaneet, että miR-124 toimii myös tuumorisuppressori medulloblastoma soluissa, kun taas muut viimeaikaiset tutkimukset ovat sekaantuneet MIR 17-92 polykistronisesta kuten onkogeenin Sonic Hedgehog välittämää medulloblastoma [9], [10], [20].

Nämä ja muut viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että MikroRNA ovat kriittisiä säätelijöitä kasvaimen kehittymisen ja että niiden osuus medulloblastoma kasvaimien syntyyn on tärkeää. Siksi päätimme tutkia microRNA toiminnon medulloblastoma. Olemme tutkineet mahdollisuutta, että ilmentymistä aivojen rikastetun MikroRNA on muuttunut medulloblastoma ja että jotkut näistä MikroRNA voi olla kriittinen säätelevä rooli tässä kasvain. Olemme havainneet, että useat MikroRNA liittyvä normaali hermosolujen erilaistumista merkittävästi alaspäin säännellään medulloblastoma. Näistä microRNA 128a (miR-128a) voimakkaasti alaspäin säännelty. Vaikka rooli miR-128a on tutkittu astrocytic kasvaimia, kuten glioblastooma, sen roolia hermosolujen kasvaimia, kuten medulloblastoma ei tiedetä. Tässä kuvaamme toiminnallista roolia miR-128a in medulloblastoma ensimmäistä kertaa. Huomasimme, että miR-128a inhiboi medulloblastoma solujen kohdistamalla BMI-1 onkogeeni ja siten lisätä vakaan tason superoksidi ja edistää solujen vanhenemista.

Tulokset

Brain rikastettu MikroRNA ovat differentiaalisesti ilmaistut medulloblastoma

ensimmäinen askel käsittelemään roolin mikroRNA vuonna medulloblastoma suoritimme microarray perustuva analyysi mikroRNA vuonna medulloblastoma solujen ja vertasi sitä normaalin aikuisen ihmisen pikkuaivot. Päätimme tutkia ensisijainen medulloblastoma solu eksplanttien klo passage 2 kulttuurin hälyn saastuttamaan elementtejä normaalia aivojen biopsianäytteissä. Niistä 385 ihmisen MikroRNA analysoitiin, 167 ilmaistiin alemmilla tasoilla medulloblastoma verrattuna normaaliin pikkuaivot. Hierarkkinen ryhmittely mikroRNA ilmaisun oikein erottaa normaalin pikkuaivot päässä medulloblastoma näytteistä (kuva S1-A). Tarkempi analyysi paljasti, että vähentynyt ilmentyminen 90 MikroRNA on medulloblastooma olivat tilastollisesti merkitseviä (p 0,05). Tätä luetteloa jälkeen tutkittiin erottaa MikroRNA joka ilmaistiin kaikissa kolmessa pikkuaivojen näytteet ja tilastollisesti laski kaikissa kolmessa medulloblastoma näytettä. Tämä kaventuneet luettelo tilastollisesti merkitsevä ihmisen MikroRNA kanssa vähentynyt ilmentyminen kaikissa kolmessa medulloblastoma näytteet 30 MikroRNA (kuva S1-B). Huomattavaa on, että monet MikroRNA oli aikaisemmin todettu olevan rikastunut normaaleissa aivoissa [21]. Jotkin, mutta eivät kaikki nämä MikroRNA raportoitiin myös aiemmin olevan vähentynyt medulloblastooma verrattuna normaaliin pikkuaivot [8], [9]. Tietojen vertailu sarjaa laski MikroRNA raportoitu aiemmin ja myös paljastivat, että vain viisi MikroRNA havaittiin kaikissa kolmessa ryhmässä (kuvio S2). Nämä ovat miR-124, miR-129, miR-138, miR-150 ja miR-323. Olemme aiemmin osoittaneet, että miR-124 on toiminnallisesti tärkeä medulloblastoma kun biologian muiden neljän yhteisen MIRS ei ole vielä selvä [10]. Ferretti

et al

oli vielä 12 MikroRNA yhteistä meidän tietokokonaisuus jos sillä Northcottin

et al

oli vain 3 ylimääräistä MikroRNA yhteistä meihin (kuva S2). Lisäksi oli 10 ylimääräistä MikroRNA että vasta tunnistettiin meitä olevan merkittävästi vähentynyt medulloblastoma (kuva S2).

ensi suoritetaan reaaliaikaisesti RT-PCR kohortin näiden miRNA vuonna lisänäytteitä vahvistamaan meidän microarray Tulostiedot (kuvio 1A). Vertaamalla ensisijainen medulloblastoma solujen sekä aikuisten ja lasten normaalia pikkuaivot paljastui huomattava alas säätely aivoissa rikastettu MikroRNA in medulloblastoma. On neljä erittäin säädeltiin MikroRNA nimittäin miR-125, miR-128a, miR -139 ja anna-7g. Näistä neljästä MikroRNA, miR-139 tunnistettiin meille, mutta ei kahden aiemmissa raporteissa [8], [9]. Lisäksi me sekä Ferretti

et al

mutta ei Northcottin

et al

havaittu miR-128a kuten väheni medulloblastoma. Mielenkiintoista aikuisten pikkuaivot oli korkeampi ilmentyminen monet näistä MikroRNA verrattuna lapsipotilailla pikkuaivot. Ilmaisu on erittäin tukahdutettu MikroRNA edelleen validoitu paneelia medulloblastoma solulinjoissa. Samanlaisia ​​ensisijaisen eksplantaatteja kaikki neljä MikroRNA laskivat solulinjoissa verrattuna normaaliin pikkuaivot (kuvio 1 B). Yhdenmukainen aiemmin julkaistu tietoja löysimme myös miR17-5p olevan yli-ilmentynyt medulloblastoma [9].

A) MicroRNA lämpöä kartta profilointi medulloblastoma potilaan näytteitä ja verrattuna normaaleihin pikkuaivot. B) tukahduttaminen miR-125, miR-128, miR-139, anna-7g ja lisääntyneen ilmentymisen miR17-5p vuonna medulloblastoma solulinjoissa. C) Suhteellinen ilmentyminen MikroRNA vuonna medulloblastoma potilasnäytteistä.

Seuraavaksi tutkimme ilmaus let-7 g, miR-125 ja miR-128a perusterveydenhuollossa medulloblastoma kasvaimia ja normaali pikkuaivojen kudosta. Käyttämällä qRT- PCR huomasimme, että kaikki kolme miRNA merkittävästi vähentynyt ilmentyminen 10 arkistoitu medulloblastoma potilaan näytteitä (ANOVA, p 0,001, kuvio 1C). Koska pieni näyte joukko, se on vaikea kehittää korrelaatiosta kasvain alatyyppi tai hoitotuloksia. Kuitenkin näytteitä ei Gli1 korkea ja siksi ole SHH alaluokkaan [9], [22]. Nämä tiedot osoittavat, että nämä MikroRNA voi olla tärkeä biologinen rooli medulloblastoma. Perustuen laajuudesta miR-128a tukahdutettu medulloblastoma toisin kuin sen voimakasta ilmentymistä normaalissa pikkuaivot, päätimme tutkia tarkemmin toiminnallista roolia miR-128a in medulloblastoma.

Re-ilmentyminen miR-128a pienenee Daoy medulloblastoma solujen kasvua

Voit selvittää uudelleen ilmentyminen MikroRNA muuttaa kasvainsolujen kasvua, transfektoimme Daoy medulloblastoma soluja microRNA esiasteen oligonukleotidien. Nämä microRNA prekursorimolekyylit on suunniteltu jäljittelemään endogeenisen MikroRNA. Re-ilmentyminen miR-128a laski medulloblastooma solujen kasvua, mitattuna MTT-määrityksellä (kuvio 2A). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin, että D283 medulloblastooma solulinja (tietoja ei esitetty). Arvioitava edelleen kasvua estävää vaikutusta miR-128a, transfektoimme Daoy soluja ohjaus miR tai miR-128a oligonukleotidit ja laskettiin solut 5 päivää käyttäen trypaanisinivärin sulkemismenetelmällä. Yhdenmukainen MTT tietojen miR-128a laski Daoy solun kasvun annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 2B).

A) MiR-128a inhiboi medulloblastooma soluproliferaatiota mitattuna MTT-määrityksellä. (P 01) B) lukumäärä Daoy solujen mitattuna trypaanisinivärin syrjäytymistä määrityksessä. C) Vähentynyt pesäkkeenmuodostusta miR-128a transfektoiduissa soluissa (ylärivi on miR-128a vektori, alarivi on ohjattu vektori). D) Colony laskee kolmena kappaleena 2 riippumattoman kokeen. (P 0,001)

Paremmin vaikutusten arvioimiseksi MikroRNA on medulloblastoma soluihin käytimme lentivirus plasmidi, joka ilmentää miR-128a kasetti ja suorittaa pesäkemuodostusta määrityksiä. Kuten kuviossa 2C on esitetty, ja D, transfektion miR-128a esti voimakkaasti pesäkemuodostusta medulloblastooma solujen osoittaa, että miR-128a on oletettu tuumorisuppressori medulloblastoma. Lisäksi miR-128a voimakkaasti vähentynyt kyky Daoy solut voivat kasvaa pehmeässä agarissa edelleen viittaa kasvaimen tukahduttava rooli miR-128a in medulloblastoma (kuva S3).

MicroRNA 128a alas säätelee BMI-1 medulloblastoma soluissa

seuraavaksi suoritettu selvitys mahdollisista mikroRNA kohdepaikkojen kahdella yleisesti käytetty ennustaminen algoritmeja, TargetSCAN (https://www.targetscan.org) ja PicTar (https://pictar.bio.nyu.edu) [23], [24]. Molemmat algoritmit ennustivat Polycomb- geeni BMI-1 olla tavoite miR-128a. Kohdesivusto täyttää siemen ottelu kriteerit (kuvio 3A). Kokeellisesti testata, onko meidän ennustaa tavoitteet säätelee miR-128a, BMI-1 kohdepaikkaan kloonattiin 3’UTR Renilla lusiferaasin geenin siCHECK vektorin. Daoy solut transfektoitiin kontrolli tai miR-128a oligonukleotidejä. Kotransfektion miR-128a merkittävästi vähentynyt Renilla lusiferaasiaktiivisuuden BMI-1 kohdesivustoa vektorit mutta ei mutatoitunut sivuston vektorit (kuvio 3B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että BMI-1 on kohteena miR-128a. Eräs toinen tuoreessa tutkimuksessa miR-128a in gliooma kertoi myös, että BMI-1 on kohde miR-128a [25]. Tämä on erityisen jännittävä, koska Polycomb geenit ovat keskeisessä asemassa kantasolujen uudistamista alkionkehityksen aikana ja ovat myös tiedetään olevan biologisesti tärkeä hermosolujen lisääntymistä ja varhaissolukasvaimesta synnyssä [26] – [27].

A) asennuspalveli- 128a kohdepaikkaan BMI-1 3’UTR. B) lusiferaasireporttiterilla määritykset osoittavat, että miR-128a toiminnallisesti kohdistuu paino- Bmi-1 3′-UTR, * p 0,01 C) Western blot-analyysi vahvistaa, että miR-128a, mutta ei kontrolli miR (CM), estää proteiinin ilmentymistä Bmi -1 medulloblastoma soluissa. D) määrän määritys Western blot bändejä. (P 0,01)

Edelleen vahvistaa BMI-1 tavoitteeksi asetettiin miR-128a, suoritimme immunoblottausanalyysillä valvonta- tai miR-128a transfektoiduissa soluissa. Daoy solut transfektoitiin kontrolli tai miR-128a oligonukleotidien ja kerättiin 48 tuntia myöhemmin. Western blot -analyysi suoritettiin käyttäen anti-Bmi-1-vasta-aine. MiR-128a laski BMI-1-proteiinin tasot Daoy soluissa yhdenmukainen lusiferaasin tiedot. (Kuvio 3C, D).

MicroRNA 128a estää Bmi-1-välitteistä signalointia

Bmi-1 tiedetään tukahduttaa p16 ilmentymistä [28]. Koska Bmi-1, p16 on jopa säädellään hermosolujen kantasoluja vähentää solujen lisääntymistä [26]. Lisäksi on osoitettu, että BMI-1 välitteistä tukahduttamisesta p16 voi lisätä aggressiivista käyttäytymistä melanoomasolujen kantasolujen [29]. Daoy ja ONS76 varhaissolukasvaimesta transfektoitujen solujen miR-128a sääteli p16 havaittuna western blottauksella (kuvio 4A). Sama solulinjat kun transfektoitu BMI-1 kokonaan tukahdutettu p16 ilme. Edelleen vahvistaa, että miR-128a estää tukahduttaminen p16 estämällä BMI-1, sekä Daoy ja ONS76 solulinjoja kotransfektoitiin miR-128a ja BMI-1. Tämä johti vähäiseen nousuun p16-proteiinin taso verrattuna soluihin transfektoitu vain BMI-1.

A) Western blot-analyysi osoitti lisääntynyt p16 ilmentymistä Daoy transfektoiduissa soluissa miR-128a verrattuna kuin kontrollivektorilla, pVETL. Taso p16: n ilmentyminen oli täysin inhiboitu Daoy soluissa, jotka transfektoitiin Bmi-1 vektorin yksin, kun taas vähäinen inhibitio soluissa havaittiin kotransfektoitiin miR-128a. B) Vähentynyt E2F1 aktiivisuus Daoy transfektoiduissa soluissa miR-128a mitattuna lusiferaasireportterilla määrityksiä. (P 0,01)

Aiemmat tutkimukset osoittavat, että BMI-1 estää p16 ja siten lisää E2F1 toimintaa [30]. E2F transkriptiotekijöiden keskeinen rooli sääntelyn solujen lisääntymistä ja terminaali erilaistumista. Siksi vaikutus miR-128a on E2F1 transkriptionaalista aktiivisuutta tutkittiin. Havaittiin, että transfektio miR-128a osaksi Daoy soluihin väheni merkittävästi E2F1 aktiivisuus mitattuna lusiferaasireportteri- aktiivisuus, p 0,05 (kuvio 4B). Tämä on johdonmukainen havaintojen että miR-128a pienenee BMI-1 ja lisää p16.

BMI-1 on toiminnallinen osa miR-128a välittämä medulloblastoma solujen kasvun pysähtymisen

edelleen arvioimiseksi, bMI-1 tukahduttaminen on toiminnallinen osa miR-128a kasvun pysähtymisen fenotyyppiin, tutkimme bMI-1 voisi pelastaa miR-128a kasvun pysähtymisen medulloblastoma soluissa. Medulloblastooma solut transfektoitiin miR-128a, miR-128a ja Bmi-1 tai vastaava valvontaa ja solut altistettiin pesäkkeiden painopiste määrityksessä. Kotransfektoimalla miR-128a BMI-1 johti vaimennus miR-128a välitteistä kasvun pysähtymistä sekä Daoy soluissa (kuvio 5A ja B). Daoy solut kotransfektoitiin BMI-1 puuttuu sen 3’UTR ja miR-128a pelasti myös leviämisen solujen estettiin miR-128a yksinään (kuvio S4A). Tämä viittaa selvästi siihen, että miR-128a tavoitteet BMI-1 ja vähentävät solujen eloonjäämistä. Toinen medulloblastoma solulinjan ONS76 soluissa osoitti myös sama suuntaus maljaustehokkuus kun transfektoitu miR-128a ja BMI-1 (kuvio S4b). Tämä data toiminnallisesti asettaa BMI-1 miR-128a kaskadi.

) Co-transfektion Daoy solujen miR-128a ja BMI-1 lisäsi muodostuneiden pesäkkeiden määrästä verrattuna miR-128a yksin . B) kvantitatiivinen analyysi pesäkkeiden määrästä muodostuu Daoy solujen jälkeen eri transfektioiden lukien BMI-1, josta puuttuu sen 3’UTR. pBabe-puro on ohjattu vektori täyspitkä Bmi-1. * P 0,05 miR-128a vs. pVETL ja ** p 0,001 miR-128a vs. miR-128a + BMI-1.

MicroRNA 128a lisää vakaan tilan tason superoksidi in Daoy soluissa

Äskettäin on osoitettu, että ilman Bmi-1 estäminen johtaa lisääntyneeseen reaktiivisen hapen (ROS) tasot soluissa, jotka ovat peräisin Bmi-1 hiirten [31]. ROS ovat hyvin tunnettuja moduloimaan erilaisia ​​solutoimintoja, mukaan lukien syöpä solubiologian [32]. Koska miR-128a laski BMI-1-proteiinin tasot, halusimme testata, onko vastaavaa nousua ROS tasoilla näkyi Daoy soluissa käsitelty miR-128a. Suoritimme spin pyydystäminen vapaiden radikaalien ja elektronien paramagneettinen resonanssi (EPR) spektroskopia tunnistaa oliko lisäys ROS taso soluissa uudelleen ilmentävät miR-128a. Spin trap, DMPO valittiin, koska sen sytotoksisuus, saavutettavuus soluun, ja reaktio hydroksyyliradikaalien (· OH), jolloin saadaan erottuva DMPO-OH spin additiotuote [33]. Reaktio DMPO kanssa superoksidi saadaan tuote (DMPO-OOH), joka muunnetaan DMPO-OH by GPX soluissa. Siksi DMPO on hyödyllinen koetin havaitsemiseksi happi-radikaalien johtuvat superoksidi ja H

2O

2. EPR-spektrit osoittavat tyypillisen 1:2:2:1 DMPO-OH kvartetti (umpinaiset ympyrät, kuva 6A-ii). EPR tulokset osoittavat selvästi, kasvuun DMPO-OH kvartetti intensiteetti Daoy soluissa, jotka ilmentävät miR-128a verrattuna tyhjän vektorin (kuvio 6A-i). Täsmällisesti yksilöidä onko DMPO-OH kvartetti signaali voi johtua suoraan superoksidi tai H

2O

2, Daoy transfektoitujen solujen miR-128a inkuboitiin CuZnSOD 30 minuuttia ennen lisäämistä DMPO. Lisäksi SOD merkittävästi vähentynyt EPR signaali korkeus viittaa siihen, että DMPO-OH-signaali on suoraan johtuu superoksidi (Kuva 6A-iii). Kvantitatiivinen analyysi kvartetti signaalin korkeus (kuvio 6B) osoittivat merkittävää kasvua (p 0,05) superoksidi soluissa ohimenevästi transfektoitu miR-128a verrattuna soluihin käsitelty kontrollivektorilla. Tämä voimistaa signaalia estyi lisäämällä SOD. Näin ollen on selvää, että miR-128a lisää vakaan tilan tason superoksidia medulloblastoma soluissa. Edelleen vahvistaa, että kasvu ROS johtuu eston Bmi-1, Daoy solut kotransfektoitiin Bmi-1 ja miR-128a. Tämä johti vähentynyt ROS taso soluissa verrattuna miR-128a yksinään (kuvio 6A-iv). Rescue kokeiluja BMI-1 puuttuu sen 3’UTR paljasti myös, että miR-128a tavoitteet BMI-1 ja johtaa näin ollen lisätä oksidatiivista tasoa soluissa (kuvio S5) B

A) Lisääntynyt superoksidiradikaalia muodostumista Daoy soluissa , jotka transfektoitiin miR-128a, kuten havaittiin käyttäen EPR-spektrit DMPO-OH spin-additiotuote (suljetut ympyrät (ii)). Spektrit kerättiin ovat signaali keskimäärin 15 skannaa. 1:2:2:1 (umpinaiset ympyrät) kvartetti signaali nähdään johtuu muodostumista DMPO-OH. Soluja käsiteltiin miR-128a on ~ 3-kertainen kasvu ROS signaalin voimakkuus (ii) verrattuna tyhjän vektorin (i). Co-solujen transfektio miR-128a ja BMI-1 johti vähentynyt ROS taso verrattuna miR-128a yksinään (iii). Hoito SOD miR-128a-transfektoiduissa soluissa poisti signaalit osoittavat, että radikaali muodostunut lähinnä superoksidi (iv). B) määrällinen analyysi EPR piikin korkeuden normalisoitu solujen määrä. * P 0,05 miR128a vs. pVETL ja miR-128a + SOD.

MicroRNA 128a indusoi solujen vanhenemista vuonna Daoy soluissa

reaktiivisia happiradikaaleja, sivutuotteena oksidatiivisen stressin voi aiheuttaa peruuttamattomia solujen kasvun pysähtymisen ja vanhenemista [34]. Lisäksi senescing soluilla on merkittävästi enemmän ROS verrattuna apoptoottisten solujen [35]. Lisäksi p16 ilmaus on yksi sali merkkien solujen vanhenemista [36]. Koska löysimme miR-128a transfektoitujen Daoy soluista osoitti lisääntynyt vakiotasolleen ROS, lisääntynyt p16-proteiinin tason ja osoittivat solujen kasvun pysähtymisen, teimme määritys vanhenemista. Viisi vuorokautta transfektion jälkeen, jossa miR-128a, lisääntynyt määrä vanhenemista liittyvän β-galaktosidaasi (SA-β-Gal) positiivisia soluja havaittiin (kuvio 7A). Oli viisi-kertainen senescent soluissa sen jälkeen, kun miR-128a solujen transfektio verrattuna tyhjän vektorin transfektoidut solut (kuvio 7B) Samankaltaisia ​​tuloksia havaittiin ONS 76 medulloblastooma soluja (kuvio S6).

) MiR-128a indusoi vanhenemista vuonna medulloblastoma soluissa havaittuna SA-beeta galaktosidaasi värjäytymistä (tummansininen solut, esimerkit osoittavat punaiset nuolet). B) Solujen lukumäärät per korkea Powered ala β-gal-positiivisten solujen kontrolli -vektoriin (pVETL) tai miR-128a transfektoituja soluja, * p = 0,003. C) Western blot-analyysi oli lisääntynyt taso H3K9me2 proteiinin Daoy transfektoiduissa soluissa miR-128a verrattuna tyhjän vektorin. Aktiini käytetään sisäisenä kontrollina.

edelleen tukevat päätelmää, että miR-128a transfektio johtaa solun vanhenemista, tutkimme metylaatiotasoilla histonien 3, lysiini 9 (H3K9) western-blottauksella. Vanheneminen liittyvä heterochromatin pesäkkeitä liittyy metyloinnin histoni 3 lysiinin 9 (H3K9me2). Mielenkiintoista, uudelleen ilmentäminen miR-128a lisännyt metylaatio histoni 3 lysiinin 9 (H3K9me2), toinen merkki tukahdutettua geeniekspression välittämien BMI-1 Polycomb repressori kompleksi (kuvio 7C). Kaikki nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että kasvua estävää vaikutusta miR-128a johtuu vanhenemista-signalointireittiä laukaisemana kasvu ROS

Keskustelu

Kirjoittajat raportoivat uuden sääntelyn reaktiivisen happiradikaaleja by microRNA 128a kautta spesifinen esto BMI-1 onkogeeni. Toiminnallista roolia mikroRNA 128a vuonna medulloblastoma ei ole aiemmin kuvattu.

Olemme löytäneet merkittävän säätelyä alaspäin useiden MikroRNA tiedetään olevan osallisena keskushermoston kehitykseen medulloblastoma ,. Tuloksemme on linjassa aiempien tutkimusten kanssa, jotka ovat kuvanneet vähentynyt ilmentyminen MikroRNA vuonna medulloblastoma [8], [9]. Ferretti

et al

löytyi 55 MikroRNA olevan alaspäin säänneltävä medulloblastoma eroihin ilme tärkeimpiä histologinen alatyyppi [8]. Samoin Northcott

et al

löytyi 61 MikroRNA olevan vähentynyt medulloblastoma verrattuna normaaliin pikkuaivot [9]. Mielenkiintoista kun luokitellaan edelleen 4 molekyyli- ryhmään oli merkittäviä eroja microRNA ilme. Esimerkiksi Sonic Hedge Hog (SHH) ajettu kasvaimet oli laskenut ilmentyminen 10 MikroRNA mutta mikään että päällekkäin MikroRNA tunnistaa meidän tai Ferretti

et al

. Itse vertailu analyysi paljasti huomattavia eroja MikroRNA havaitsema kolmeen ryhmään (kuva S2). Nämä erot ovat todennäköisesti liittyvät alustojen, joita kukin ryhmä, kasvaimen lähde ja lähde ja ikä normaalin pikkuaivot käytetty. Käytimme ensisijaisen solun eksplanttien viljelmässä passage 2, kun taas kaksi muuta ryhmää käytetään biopsialaitteet. Lisäksi meidän potilas kudokset olivat kaikki klassisen histologian, ja ei ollut geenien ilmentyminen allekirjoitus SHH. Huomionarvoista sekä tutkimuksemme ja raportin Ferretti

et al.

Havaittu, että miR-128a oli merkittävästi vähentynyt ilmentyminen medulloblastoma verrattuna normaaliin pikkuaivot.

Osoitamme, että tämä vähentynyt ilmentyminen on ominaisuus primaarituumorin näytteitä sekä paneelin yleisesti käytetty medulloblastoma solulinjoja. Tämä tieto on erityisen käyttö microRNA toiminto edelleen tutkittiin in medulloblastoma. Niistä huomaa miR17-5p klusterin yli ilmaistu meidän näytteitä, mikä on aikaisempien raporttien kanssa yhtäpitävä [9].

analyysi uudelleen ilmentävien miR-128a in medulloblastoma solut osoittivat, että miR-128a esti kasvua of medulloblastoma solujen todennäköisimmin vähentämällä leviämisen. MiR-128a osoitti kasvain tukahduttava vaikutuksia voimakkaasti estämällä pesäkkeiden muodostumista medulloblastoma soluja. Lisäanalyysi mahdollisia mekanismeja paljasti, että BMI-1 onkogeeni oli otaksuttu kohteena miR-128a. Olemme osoittaneet, että BMI-1 proteiinia alas säätelee miR-128a, mikä puolestaan ​​johtaa kasvuun p16 solusykliä estäjä. Asetus BMI-1 MikroRNA on jännittävä, koska BMI-1 on yliekspressoitu medulloblastoma ja kriittinen normaalille pikkuaivojen kehittämiseen [27]. BMI-1 on myös kriittinen hermo kantasolujen itseuudistumisen [26]. BMI-1 oli myös hiljattain osoitettu olevan tavoitteeksi miR-128a glioblastoma [25]. Tuloksemme laajennetaan tämän havainnon osoittamalla, että esto BMI-1 on toiminnallisesti kriittinen miR-128a kasvua ehkäisevästä toiminto. Palauttaminen BMI-1 ilmentymisen miR-128a ilmentävien solujen pelastaa medulloblastoma solujen kasvun pysähtymistä. Sitten pyrittiin tutkimaan edelleen mekanismia miR-128a-BMI-1 väylän medulloblastoma.

Tuoreiden tietojen mukaan BMI-1 säätelee reaktiivisia happiradikaaleja [31]. Osoitamme, että microRNA 128a indusoi solunsisäistä superoksidi sukupolvi, mahdollisesti säätelemällä BMI-1 tasot ja että BMI-1 re-ilmentymisen kääntää superoksidiradikaalista sukupolvi. Viimeaikaiset todisteet osoittavat, että syöpä kantasolut ovat resistenttejä alentuneen yleisen redoksitilassa [37]. Siten muokataan sääntelymekanismit ROS sukupolvi syövän kantasoluja ehkä hyödyllinen strategia tuhota näitä soluja. Me kuvitella skenaario, jossa microRNA 128a voidaan käyttää indusoimaan ROS medulloblastoma kantasoluja ja siten tehdä niistä säteilylle. Tärkeintä on moduloida homeostaasiin ROS. Normaalilla pitoisuuksina, ROS osansa solutoiminnoille liittyy signaalitransduktion. Kuitenkin epätasapainossa sukupolven ROS ja kapasiteetin antioksidantteja neutraloida ROS voi aiheuttaa häiriöitä solun redox tilan, mikä johtaa oksidatiivista stressiä. Havaintomme lisääntyneen vakaan tilan tason ROS, ja induktio p16 voi edistää ennenaikaista-vanhenemista soluissa, jotka ilmentävät miR-128a (kuvio S7).

Yhteenvetona kuvataan toiminnallista roolia microRNA 128a in medulloblastoma. Osoitamme, että microRNA 128a vähenee medulloblastoma solujen kasvua mekanismeja käsittäen ROS ja vanhenemista. Olemme nyt tutkii rooli mikroRNA 128a radio-herkistävä medulloblastoma käyttämällä

in vivo

potilaalle tehdä ksenograftimalleja.

Materiaalit ja menetelmät

solujen, kudosten ja kulttuuri

Daoy ja D283 varhaissolukasvaimesta-solut saatiin American Type Culture Collection (Rockville, Md.) ja niitä viljeltiin DMEM-väliaineessa (Gibco, Grand Island, NY) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (Gibco), mukaan toimittajan suositusten . Solulinja ONS76 luovutti ystävällisesti Dr. James T. Rutka (University of Toronto, Kanada) ja viljeltiin DMEM, joka sisälsi 10% FBS. D341 saatiin ATCC ja viljeltiin DMEM: ssä, jossa on 20% FBS: ää ja 1% natriumpyruvaattia ja L-glutamiinia. Ensisijainen soluviljelmät olivat peräisin kudosnäytteistä medulloblastoma potilaita protokolla hyväksymä Institutional Review Board yliopiston Iowa sairaaloita ja klinikoita. Kirjallinen suostumus kaikilta potilailta saatiin valtuuttanut Iowan yliopistossa IRB. Viljelmiä pidettiin varhainen numeroita (p2-p4) DMEM-väliaineessa, jota täydensi 20% naudan sikiön seerumia. Normaalit ihmisen pikkuaivot ja varhaissolukasvaimesta potilaan näytteitä saatiin Pediatric Co-operative Human Tissue Network (Columbus, Ohio) alla Iowan yliopistossa IRB hyväksytty protokolla. Kaikki näytteet on saatu toimintaan anonyyminä toimeksiannon mukaisesti IRB. Näytteitä me Normaali pikkuaivojen näytteet olivat peräisin ei-pahanlaatuisten lapsi- ja aikuisen aivoissa. Kaikki medulloblastoma näytteet olivat peräisin lapsipotilailla. Tiedot potilaan näytteet on aiemmin kuvattu [38]. Lyhyesti kaikki näytteet olivat peräisin ei-metastaattinen (M0) kasvaimet klassisen medulloblastoma histologia.

MicroRNA eristäminen ja kvantitatiivinen PCR-analyysi

Small RNA: t eristettiin käyttäen Mirvana RNA eristyspakkausta (Ambion).

MicroRNA ilmentyminen mitattiin kvantitatiivisen PCR käyttäen ABI 7700 lämpö-cycler. MicroRNA alukkeet ja koettimet hankkia Applied Biosystems (Foster City, CA) ja jotka suoritettiin kohden valmistajan suositusten kanssa useita muutoksia, jotta voimme havaita alhainen runsautta MikroRNA. Sillä käänteistranskriptio (RT) reaktio 20 nanogrammaa kokonais-RNA: ta käytettiin. Sillä qPCR reaktion tuloksena cDNA laimennettiin 1:02. Kukin RT vaihe suoritettiin kahtena ja qPCR kolmena kappaleena kullekin RT reaktiota. U6b ja U66 pieniä RNA: ta käytettiin endogeenista valvontaa ja suhteellinen microRNA määrä lasketaan ΔΔCT menetelmällä.

ohimenevä transfektointi Daoy solujen miR-128a ja analyysi solujen leviämisen ja elinkelpoisuus

Solujen proliferaatio mitattiin MTT-määrityksellä, ja solujen elinkyky määritettiin trypaanisinivärin syrjäytymisen määrityksessä. Jotta määritys solujen lisääntymisen, medulloblastooman solut transfektoitiin kontrolli miR, miR-9 tai miR-128a oligonukleotidin 24-kuoppalevyillä käyttäen LT1 reagenssia (Mirus, Madison WI). 6, 000 solua /kuoppa siirrostetaan sitten kolmena kappaleena 96-kuoppaisille levyille 100 ui väliainetta. 2 päivän jälkeen, 100 ui Cell Titer vesipitoisessa (Promega, Madison, WI) lisättiin ja soluja inkuboitiin 1 tunnin ajan ja absorbanssi mitataan 490 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa kohti valmistajan suositusten mukaisesti. Suhteellinen solujen määrä laskettiin normalisoimalla absorbanssi käsittelemättömiin soluihin.

määritys solujen elinkelpoisuus, Daoy solut ympättiin 6-kuoppaiselle levylle ja 24 tuntia myöhemmin solut transfektoitiin kontrolli miR tai kahdella eri pitoisuuksilla (F).