Krooninen sairaus

tiivistelmä

Neuropilins aluksi luonnehditaan hermosolujen reseptoreita, toimivat yhteistyössä reseptorit syöpään liittyvät kasvutekijöiden ja äskettäin mukana useissa signalointi johtavia reittejä tukirangan organisaatioon, angiogeneesiä ja syövän etenemistä. Sitten yritimme tutkia kykyä neuropiliini-2 ohjaamaan epiteelin-mesenkymaalitransitioon peräsuolen syövän soluissa. Käyttämällä erityisiä siRNA kohdistaa neuropi–2: n ilmentymisen, tai geeninsiirto, ensin todettava, että neuropi–2 ilmaisun hankkii HT29 ja Colo320 varten ksenograftin muodostumista. Lisäksi neuropi–2 siirrettävä fibroblastisella kaltainen muoto syöpäsoluja, mikä viittaa osallistuminen neuropi–2 in epiteelin-mesenkymaalitransitioon. Itse asiassa, kun läsnä on neuropiliini-2 peräsuolen sinoomasolulinjoja korreloi menetys epiteelin markkereita, kuten sytokeratiini-20 ja E-kadheriinin ja hankinta mesenkymaalisten molekyylien, kuten vimentiinista. Lisäksi osoitimme, pintaplasmoniresonanssilla kokeissa, että neuropiliini-2 on reseptori muuttaa-kasvutekijä-β1. Ekspression neuropiliini-2 koolonsyöpäsolulinjoissa todellakin osoitettu edistävän transformoiva-kasvutekijä-β1 signaloinnin, joka johtaa konstitutiivinen fosforylaatio Smad2 /3 monimutkainen. Hoito erityisiä TGFli-type1 reseptorin estäjät palauttaa E-kadheriinin tasoilla ja esti osittain neuropi–2 aiheuttama vimentiinista ilmaisua, mikä viittaa siihen, että neuropi–2 yhteistoiminnassa TGFli-type1 reseptori edistää epiteelin-mesenkymaalitransitioon peräsuolen syöpäsoluja. Tuloksemme viittaavat suoran roolin NRP2 epiteeli–mesenkymaalitransitioon ja korosta cross-talk välillä neuropi–2 ja TGF-β1 signalointi edistää syövän etenemiseen. Nämä tulokset viittaavat siihen, että neuropi–2 täyttää kaikki kriteerit terapeuttisena kohteena häiritä useita onkogeenisen toimintoja kiinteitä kasvaimia.

Citation: Grandclement C, Pallandre JR, Valmary Degano S, Viel E, BOUARD A, Balland J , et ai. (2011) Neuropiliini-2 Expression Edistää TGF-β1-välitteisen epiteelikasvaimet jotta mesenkymaalitransitioon kolorektaalisyövässä solut. PLoS ONE 6 (7): e20444. doi: 10,1371 /journal.pone.0020444

Editor: Hang Thi Thu Nguyen, Emory University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 marraskuu 2010; Hyväksytty: 03 toukokuu 2011; Julkaistu: 01 heinäkuu 2011

Copyright: © 2011 Grandclement et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Grant API -CHU 2008 yliopistollisen sairaalan Besançon; CG sai apurahan Ranskan ”agence nationale pour la Recherche tekniikkasuunnitelmaa”; JRP sai apurahan päässä maakuntaliiton Franche Comté; avustusta ”ligue contre le syöpä du Doubs” tukenut tätä työtä. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Neuropilins (uudistusohjelmien) ovat transmembraanisia ei-tyrosiinikinaasin glykoproteiineja alun perin kuvattu hermostoon. Neuropiliini (NRP) perheeseen kuuluu kaksi geeniä, neuropi–1 (NRP1) ja neuropi–2 (NRP2). Aikana hermoston kehitystä, NRP1 ja NRP2 olla ratkaiseva merkitys Axon takaisinveto ja ohjausta sitovat luokan III Semaforiinien [1]. Aluksi luonnehtia hermosolujen reseptoreita, KUO todettiin myös ilmaistava endoteelisoluissa ja myöhemmin osoitettiin olevan merkitystä kehitettäessä verisuoniston [2].

KUO näyttää lyhyen intrasytoplasmista häntää, joka ei sisältävät kinaasidomeeni. Alustavat tutkimukset neuropiliini riippuvaisten molekyyli polkuja ehdotti, että neuropilins voi suoraan välittää solunsisäisiä signaaleja. Tämä johti ehdotukseen, että hetero-dimerisaatio muiden reseptorien edellytetään välittävän neuropi–alavirran signalointia. Yksi näistä koreseptorin kuvatut kompleksit toistaiseksi sisältää verisuonten endoteelin kasvutekijän reseptorin (VEGFR) [3], [4], [5]. Lisäksi monistuminen VEGFR signalointi, KUO voisi vuorovaikutuksessa plexins välittävän luokkaan 3 semaforiini signaalin välittymistä Rho liittyvät G-proteiinit, muuttaakseen solun tukirangan organisaation [6].

Kuitenkin erittäin konservoitunut aminohapon sekvenssin edistää kansallisten uudistusohjelmien solunsisäinen hännän sitoutuminen PDZ verkkotunnuksen GAIP-C-pää vuorovaikutuksessa proteiini-1 (GIPC-1) on äskettäin raportoitu viittaa siihen mahdollisuuteen, että KUO voisi säädellä vaihtoehto biologisia toimintoja [7].

monikäyttöisyyden uudistusohjelmien oli korosti jokin tunnistamiseen NRP rooli kasvaimen synnyssä. Lisäksi läsnä uudistusohjelmien on kasvaimeen liittyvän alukset, uudistusohjelmien esittivät monenlaisia ​​kasvaimia, mikä viittaa mahdolliseen rooliin tämän glykoproteiinin syövän etenemisen. Todellakin, NRP2 ekspressio havaittiin osteosarkooman [8], melanooma [9], keuhkosyöpä [10], [11], aivokasvaimet [12], [13] paksusuolen syövistä [14], haiman syövät [15], [16 ], [17], rintasyöpiä [18], myelooinen leukemia [19], syljen rauhasmainen kystinen syöpä [20], infantiili hemangioomasta [21], munasarjan kasvaimet [22] ja virtsarakon syöpien [23]. Paksusuolen syöpä, NRP2 suoraan edistää syövän etenemisen solussa itsenäisesti (ks tarkastelu NRP2 ilmentymisen syöpäsolujen taulukossa S1). Ehdotettiin, että NRP2 onkogeeniset ominaisuudet luottaa lisääntynyt VEGFR1 fosforylaation ja aktivoitumisen VEGFR1 /PI3K /Akt signalointi. [14] Kuitenkin tarkka molekyyli reittejä ohjaavat NRP2 ja osallistuvat oncogenesis edelleen suureksi osaksi tuntemattomia.

epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon (EMT) on yksi tärkeimmistä molekyylitason mekanismeja aikana suoritettujen oncogenesis edistää syövän etenemiseen. EMT on ominaista jakautuminen soluliitos, menetys epiteelin ominaisuuksista ja solun polariteetti, edistää karsinooma etenemistä. Lisäksi voitto mesenkymaalisten markkereita, EMT itse antaa syöpäsolun Muuttoliikettä, invasiivisuus ja myöhemmin etäpesäkkeiden muodostumisen [24]. Huolimatta siitä useita tutkimuksia, jotka liittyvät roolia NRP2 syövän etenemiseen, ei merkittävää näyttöä perustanut osallistuminen tämän rakenteisen vuonna EMT.

Tässä käytimme koolonsyöpäsolulinjaa transfektoitu NRP2 siirtogeenin tai siRNA tutkia NRP2 osallistuminen EMT. Nämä kokeet esitti näyttöä siitä NRP2 endows koolonsyöpäsolulinjaa pesäkkeiden ja ksenograftin muodostumista. Lisäksi muuntaminen epiteeli- ja fibroblastien kaltainen muoto laukaisi NRP2 ilme sekä hankinnan vimentiinista ja EMT erityisiä transkriptiotekijät. Sitten tutkimme vaikutus NRP2 muuntamista kasvutekijä β1 (TGF-β1) signalointi, jonka uskotaan osaltaan myöhäisvaiheen karsinooma aiheuttamalla EMT. Olemme osoittaneet, että NRP2 edistää konstitutiivinen Smad2 /3: n fosforylaatiota koolonsyöpäsolulinjoissa. Lisäksi erityinen siRNA kohdistaminen NRP2 tai hoidon farmakologinen estäjiä TGFp-1 tyypin 1 reseptorin (TGFβRI) esti Smad2 /3 fosforylaation ja NRP2 välittämä EMT paksusuolisyövän soluja. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että NRP2 yhteistyössä TGFβRI edistämiseksi EMT peräsuolen syöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen solulinjat HT29, Colo320, SW620, MCF7 , Caki, A498, HEK293 hankittiin American Type Cell Culture Collection, ja niitä viljeltiin RPMI1640 tai DMEM (Lonza, Pariisi, Ranska), jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua endotoksiinivapaita vasikan sikiön seerumia (FCS), (Invitrogen, Cergy-Pontoise , Ranska). Bes-PAC01, Bes-PAC03, Bes-PAC04 ja Bes-PAC05 (Haiman adeno-karsinooma) solulinjat perin eristettiin ascitic nesteistä peräisin neljästä potilaasta, jolla haiman adenokarsinooman, meidän yliopistollisessa sairaalassa. R3III noomasolulinjasta toimittanut Nathalie Labarriere, Inserm (Nantes, Ranska). Jijoye ja Raji solulinjoissa (Human Burkittin lymfooma) toimitti Diaclone (Besançon, Ranska). Solulinjat tässä tutkimuksessa käytetyt olivat oikeaksi käyttäen DNA-profilointi (lyhyt tandemtoistoja analyysi) mukaisesti ATCC: n suositusten (katso taulukko 1). Lyhyt tandem-toisto (STR) analyysi on molekyylibiologian menetelmää suositellaan solu- linjan tunnistus. Solulinjat tässä tutkimuksessa käytetyt genotyypattiin ennen jäädyttämistä ja kahden kuukauden välein. STR-analyysi suoritettiin AmpFISTR Identifiler PCR Amplification Kit (Applied Biosystems). Korkeus erityisiä loci lukien peräkkäistoistot DNA syöpään solulinjoista analysoitiin. STR-analyysi mittaa tarkan lukumäärän toistuvia yksiköitä kunkin alleelin (D7S820 8,20 merkitsee sitä, että 8 ja 20 toistetaan tunnistetaan kunkin alleelin D7S820 lokus solulinjan Jijoye). Jos variantti näyttää sisältävän osittaisen toistaa, että osittainen toistoyksikön on nimeämän desimaalin seurasi useissa tukikohdat osittain toista.

pcDNA Ekspressioplasmidit

Vaikutus of NRP2 paksusuolen syövän solujen etenemisen arvioitiin siirtämällä NRP2 geeni HT29 solulinjassa. Olemme syntyy HT29

NRP2 solulinjoja käyttämällä kahta ilmaisua plasmideja, jotka koodaavat hNRP2 (pcDNA3.1-NRP2, ystävällisesti M. Klagsbrun) ja pCMV6-XL5-NRP2 (ostettu Origene (Rockville, MD, USA). Ohjaus HT29 luotiin käyttäen pcDNA3.1 tai pCMV6-XL5 vektoreita. 1,5 x 10

6 HT29-soluja siirrostettiin 60 mm

3: n pullo, 4 ml väliaineessa ja inkuboitiin 24 h. Tämän jälkeen solut transfektoitiin stabiilisti 1 ug pcDNA3.1-NRP2 tai pCMV6-XL5-NRP2 ekspressiovektoreihin tai kontrollivektoreihin käyttämällä Effectene kit (Qiagen, Courtaboeuf, Ranska) mukaan valmistajan ohjeiden. Solut transfektoitiin pcDNA3.1-vektorit on valittu 0,8 mg /ml genetisiiniä (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Ranska), 48 h transfektion jälkeen.

sirna

Käyttämällä Ambion siRNA web design työkalu, tunnistimme yksi potentiaalinen NRP2 kohdesekvenssi. erityiset NRP2 siRNA (sense 5′- AAA GGC TGG AAG TCA GCA CTA ATT T-3 ’ja anti-sense 5′-AAA AAT TAG TGC TGA CTT CCA GCT T-3′) ja ryntäily siRNA (sense 5’-AAAGGAGGGGCATGCCACGTTGG- 3 ’ja anti-sense 5′-AAAACCAACGTGGCATGCCCCTC-3’) sekvenssit hybridisoitiin ja kloonattiin Bbsl sivusto 3 ’LTR: pFIV-H1 /U6 mukaisen vektorin valmistajan ohjeiden (System Biosciences, Mountain View, CA). Sekvenssit varmistettiin NIH BLAST-analyysi ei ole olennaista homologiaa muiden selkärankaisten geenejä. Lentivirusvektorikonstruktit supernatantti tuotanto ja myöhemmin infektio soluja suoritettiin valmistajan ohjeiden (System Biosciences, Mountain View, CA). Colo320 transfektoitu stabiilisti valittiin 3 ug /ml puromysiiniä (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Ranska), 48 h transfektion jälkeen.

Virtaussytometria

Anti-NRP2, anti-NRP1, anti-pSmad2 /3, anti-TGFp 1, anti-TGFβR1 olivat Santa-Cruz Biotechnology (Heidelberg, Saksa). Anti-Smad2 /3 ja anti-TGFRII, olivat RD järjestelmä (Lille, Ranska). Alexafluor488-leimatut sekundääriset vasta-aineet hankittiin Fluoprobes (Interchim, Montluçon, Ranska). Kymmenen tuhatta solua kustakin näytteestä arvioitiin fluoresenssidetektoinnilla käyttämällä BD FACSCanto sytometrin. (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, Ranska) solunsisäistä värjäystä, solut kiinnitettiin 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa 2% paraformaldehydillä. Värjäys sitten toteutunut huoneen lämpötilassa 30 minuuttia puskurissa, joka sisälsi 0,4% saponiinia ja 5% FCS: ää. Pesupuskuri sisälsi 0,1% saponiinia, 5% FCS: ää. Virtaussytometriaa analyysin Suhteellinen fluoresenssi-intensiteetti (RFI) laskettiin.

proliferaatiomääritystä

Solun proliferaatiota in vitro analysoitiin tetratsoliumsuolaa 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2- yyli) -2,5 difenyylitetratsoliumbromidia (MTT). Lyhyesti, 4000 solua kuoppaa kohti ympättiin 96-kuoppaisille mikro- levyille, jotka sisälsivät 100 ui alustaa kaivoa kohti. Analyysiä varten 10 ui MTT: n substraattia (5-mg /ml kantaliuosta fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa) lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja levyjä anna vakio kudoksen inkubaattorissa olosuhteissa vielä 2 tuntia. Solut liuotettiin 200 ui: aan dimetyylisulfoksidia, ja kolorimetriset analyysit suoritettiin (aallonpituus 570 nm). Levyt analysoitiin 24 tunnin välein seuraavien 3 peräkkäisenä päivänä.

ELISA-määrityksessä

Soluja inkuboitiin RPMI tai DMEM-1% FCS: ssa 24 tuntia. Sitten solut laskettiin ja 10000 solua per kuoppa siirrostettiin 96-mikrolevyn 200 ui DMEM-0,1% FCS: ää 24 tunnin ajan. VEGF tuotantoa arvioitiin supernatanttien käyttäen ihmisen VEGF Elisa Kit (Strathmann Biotec, Hampuri, Saksa).

virtaussytometria analyysi DNA Content

Solut kerättiin trypsinisaatiolla, pestiin jääkylmällä PBS: llä , kiinnitettiin 70% etanolilla. Ennen DNA: n analyysiä varten solut värjättiin 50 ug /ml propidiumjodidia (Sigma-Aldrich, Lyon, Ranska) ja 2 ug /ml DNaasi-vapaata RNaasi (Sigma-Aldrich, Lyon, Ranska) 15 minuuttia 37 ° C: ssa pimeä. DNA-pitoisuus mitattiin käyttäen FACSCalibur-virtaussytometriä (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, Ranska) ja analysoitiin CellQuest-ohjelman.

vierassiirrekokeissa

Nude hiiret saatiin Janvier (Le Genest St Isle, Ranska), ja ylläpidetään eläinpalvelussa mukaan animal Experimental eettisen komitean suuntaviivat. 1 x 10

6 solua HT29

ctrl, HT29

NRP2, Colo320

si-RNA-NRP2 ja Colo320

siRNA-ctrl solulinjoja uudelleensuspendoitiin 100 ui PBS: ää istutettiin ihonalaisesti nude-hiirissä ja kasvaimen kasvua seurattiin joka toinen viikko kussakin ryhmässä. Kasvaimen tilavuus laskettiin kaavalla

V

= 1/2

×

b

2, jossa

on pisin kasvain akseli, ja

b

on lyhin kasvain akselilla. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet 1 cm halkaisijaltaan, hiiret tapettiin ja kasvaimet kiinnitettiin formaliinilla myöhempää immunohistokemiallista analyysiä.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

Effect of NRP2 ilmentymisen pesäkkeiden muodostumista in vitro arvioitiin pehmeä agar pesäkkeiden muodostumista määrityksessä. 5000 solua kuoppaa kohti ympättiin 500 ui 2%: isessa väliaineessa 24-kuoppalevylle. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO2 ja kuvat otettiin 10 päivän kuluttua viljelyn.

invaasiomääritys

Invasion arvioitiin käyttämällä 96W QCM invaasiomääritys (Millipore, USA). Lyhyesti, sama määrä (100000) valvonta- (HT29

ctrl) tai NRP2 ilmentäviä soluja (HT29

NRP2) uudelleensuspendoitiin seerumia pantiin alkuun osastoon standardin 8 uM pore Boyden kammioon. Lokeroon sisälsivät seerumittomassa väliaineessa tai väliaineessa 10% FCS. Sen jälkeen 16 tuntia invaasiota (37 ° C, 5% CO2), invasiivisia soluja inkuboitiin solujen irtoaminen puskurilla, hajotettiin ja merkitty CyQuant GR väriainetta. (QCM 96W Pitoisuus, Millipore, International). Fluoresenssi sitten arvioitiin fluoresenssilevylukijaa (Cell Lab Quanta, Beckman-Coulter) käyttäen 480-520 nm: n suodattimella set.

Cell Hoidot

TGF-β1 signalointi estyi käyttämällä SD- 208 tai SB-431542 (TGFRI estäjä) laimennettuna DMSO: ssa (Sigma-Aldrich, Lyon, Ranska). DMSO toimi kontrollina väliaine kaikissa kokeissa. Joissakin kokeissa Avastin (farmasian CHU Jean Minjoz, Besançon, Ranska) käytettiin estämään VEGF-A. TGF-β1 hankittiin RD System (Lille, Ranska).

Western Blot-analyysi

Lyhyesti, sen jälkeen, kun kaksi pesuvaihetta, solut kerättiin ja liuotettiin lyysipuskurissa containing1 mM EDTA, 1 mM NaF, 1 mM Vanadate ja yhden täydellisen Mini proteaasiestäjäseostabletit Tablet (Complete Mini EDTA Free, per 10 ml lyysipuskuria, Roche, Ranska). 30 ug kokosolulysaateista erotettiin natrium- duodecyl sulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvoja elektroforeesin. Jälkeen blotit blokattiin 1 tunnin ajan 5% maitoa ennen inkubointia spesifisten vasta seuraavasti: anti-NRP2 ja anti-twist1 (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Saksa), anti-Smad2 /3 (R läsnäolo tai puuttuminen subsellulaarinen spesifisten proteiinien (kuten β-aktiini tai histoni H1) osoituksena subsellulaarisen erottaminen.

Co-immunosaostusanalyysille

Solut hajotettiin PBS: ssä, joka sisälsi 200 mM Tris- HCl pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% v /v tritonX100, 1 mM DTT: tä, 15 mM EGTA, 1 mM NaF, 1 mM vanadaatti ja yksi täydellinen Mini proteaasi Inhibitor Cocktail Tablet (Complete Mini EDTA Free, per 10 ml lyysipuskuria Roche, Ranska). Kanin anti-TGFRI polyklonaalisia vasta-aineita (Santa-Cruz Biotechnology) ja kanin IgG polyklonaalisia vasta-aineita lisättiin lysaatit, jonka lopullisena laimennoksena 1/100, ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa. Proteiini-G magneettiset helmet (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Ranska) lisättiin seokseen ja inkuboitiin vielä kahden tunnin ajan 4 ° C: ssa. Sitten proteiinit eluoitiin magneettisella erotuksella ja denaturoitua. Western-blot suoritettiin sitten käyttäen anti-NRP2 vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Saksa).

histopatologinen analyysi ja immunohistokemiallinen värjäys kudosten

Tissue näytteitä, saatu -ksenografteja vahvistettu 4 % formaliinia ja parafiiniin upotettuja. Sitten lohkot leikattiin sarjoittain 4 um paksuus. HES (hematoksiliinilla siinilla Safran) värjäystä käytettiin arvioimaan morfologia. Standardi immunohistokemiallinen menetelmä suoritettiin käyttäen Ventana BenchMark XT (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, Arizona) immunostainer seuraavin ensisijainen vasta: anti E-kadheriinin (Zymed, San-Francisco, USA), anti-sytokeratiini-20 ( Zymed, San-Francisco, USA).

Pintaplasmoniresonanssianalyysi

suunnittelu ja valmistus kotitekoinen pelimerkkejä yhteensopiva SPR (pintaplasmoniresonanssi) on suoritettu kuten aiemmin julkaistu kanssa avustuksella MIMENTO teknologinen alusta, Besançon, Ranska [25]. NRP2 pelimerkit valmistettu tässä tutkimuksessa muodostuvat kovalenttiset varttaminen Fc-NRP2 yhteisöt kemiallisesti aktivoitu itse koottua yksikerroksista noudattamalla proteiinin siru rakennuksen hiljattain julkaistu [26]. Fc-NRP2 olivat RD System (Lille, Ranska). Tämä menettely johtaa kattavuus 7,4 +/- 0,1 femtomole /mm

2 NRP2. Injektiot BSA (Control -), VEGF (Control +) ja TGFp 1 suoritetaan 250 nM PBS-Tween 0,05%, pH 7,4. Biacore kokeet suoritettiin Biacore 2000-laitteessa 25 ° C: ssa virtausnopeudella käsittää 2 30 ul /min.

Real Time-kvantitatiivinen PCR (RT-qPCR) B

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen Kit RNeasy mini (Qiagen, Courtaboeuf, Ranska) ja käänteistranskriboitiin käyttämällä satunnaisia ​​heksameerejä ja Moloneyn käänteiskopioijaentsyymin (Life Technologies, Rockville, MD, USA). Monista näytteet altistettiin RT-qPCR. mRNA kvantitoitiin käyttämällä alukkeita luetellaan alla: NRP2 (Hs00187290_m1), Snail1 (Hs001955991_m1), TGF-β1 (Hs00171257_m1), Gli1 (Hs00171790_m1), Twist1 (Hs00361186_m1) (Applied Biosystems).

ABL-mRNA: ta kustakin näytteestä kvantitoitiin kuten endogeeninen kontrolli sisäisen RNA. Suhteellinen mRNA: n ekspressio laskettiin käyttämällä Delta-Delta-Ct menetelmä ja käsittelemättömiä soluja käytettiin kalibraattori.

Slide valmistelu ja konfokaalimikroskopialla

Solut levitettiin Labteck kammion dioja (Sigma-Aldrich, Lyon, Ranska) ja sen jälkeen käsitellään sopivalla reagenssien. Solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydi ja läpäiseviksi 0,1% Triton X100. Kun 20 minuuttia estää 20% naudan sikiön seerumia ja pesu, solut värjättiin sopivilla vasta-aineilla Pinot konfokaali kuvien kerättiin Olympus FV1000 laserkeilauksen -konfokaalimikroskoopilla. Solutumat vastavärjättiin DAPI (4 ’, 6-diamino-2-fenyyli). Fluoresenssitutkimukseen määrällisesti, suhde fluoresenssin voimakkuus laskettiin kunkin kunnossa. Suhde fluoresenssi-intensiteetti laskettiin jakamalla ydinvoiman fluoresenssin solulimaan-kalvon fluoresenssi. Fluoresenssin intensiteetti 50 solua on analysoitu kussakin kunnossa.

Smad reportterianalyysi

Olemme käyttäneet TGF-β reportterianalyysi alkaen SABiosciences (Qiagen, Courtaboeuf, Ranska) kvantifiointiin TGF -β-indusoidun Smad2 /3 signalointia. Kvantifiointi tulikärpäsen lusiferaasi toteutettiin käyttäen Dual-Luciferase Reporter määritystä (Promega Co., Madison, USA) valmistajan protokollan. Kaikki transfektiot suoritettiin kolminkertaisina käyttäen Lipofectamine kit. (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Ranska). 24 tunnin kuluttua transfektion väliaine vaihdettiin ja soluja käsiteltiin 50 ng /ml TGF-β1 vielä 24 tunnin ajan. Tulokset esitetään suhde

tulikärpäsen lusiferaasi

toimintaa ja

Renilla lusiferaasin

aktiivisuuden (Ren /Luc) kullekin olosuhteissa. Sitten arvot ilmoitettiin arvot negatiivisen kontrollin.

Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona plus tai miinus keskivirhettä keskiarvon (SEM). Ryhmä vertailut suoritettiin käyttäen Student

t

testiä. Eroja pidettiin merkittävinä osoitteessa

p

0,05.

Tulokset

NRP2 ilmentymistä ihmisen syövän solulinjoissa

Ensin pyrittiin tutkimaan ilmaus NRP2 glykoproteiinin eri syöpäsolulinjoissa. Immunofluoresenssilla analyysi vahvisti, että NRP2 on ilmaistu kalvon useiden ihmisen syöpäsolulinjojen (kuvio 1A). Ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC), jotka on eristetty normaalista ihmisen napalaskimon, käytettiin positiivisena kontrollina NRP2 ekspressiota. Havaitsimme NRP2 ilmentymistä kalvo 2 pois 3 koolonsyöpäsolulinjaa (SW620, Colo320 mutta ei HT29). NRP2 myös ilmaistu kaikissa munuais- syövän testatuissa solulinjoissa (HEK 293, Caki, R3III ja A498), kahdessa neljästä haimasyövän solulinjoissa (Bes-PAC03 ja Bes-PAC04 johdettu potilaan vesivatsanestesupernatan- meidän instituutti), vuonna NCIH441 keuhkosyövän solulinjassa ja 5637 virtsarakon syövän solulinja (kuvio 1A). MDAMB231 rintasyöpä-solulinja ilmaisi NRP2 taas mitään NRP2 värjäytymistä löytyi Burkittin lymfooman soluissa linjat (Raji, Jijoye) (kuvio 1A).

A

Virtaussytometrianalyysi of NRP2 ilmaisun ihmisen syöpäsolulinjoja.

B,

immunohistokemiallinen värjäys NRP2 ihmisen paksusuolen kudoksiin ja rintakudosten (ruskea). Formaliini-parafiiniin upotetut kudokset inkuboitiin yön yli huoneen lämpötilassa, jossa anti-ihmisen NRP2-vasta-ainetta. Edustavia micrographs otettiin alkuperäinen suurennos x1000; NRP2 ilmentyy kalvo ihmisen paksusuolen ja rintakarsinoomista vaikka sitä ei ole ilmaistu terveiden kudosten.

Immunohistokemiatutkimukset Sitten sitoutuneet onko NRP2 ilmentyy kalvo erilaisten parafiiniin-ihminen syöpä näyte. NRP2 ilmentyi 3 10 paksusuolen syöpä, 5 out of 15 Rintasyövän ja 4 ulos 12 haimakarsinooma-. Huomata, NRP2 ei havaittu eturauhasen syöpien (n = 10) ja B-solujen lymfooma (n = 10) (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi immunohistokemiallinen värjäys osoitti, että NRP2 on ilmaistu kalvo ihmisen paksusuolen syöpä ja rintasyöpä, kun sitä ei ole ilmaistu kuin pahanlaatuinen kudoksissa (kuvio 1 B). Tuloksemme ovat yhdenmukaisia ​​aiempien julkaistuista raporteista. Itse asiassa tuoreessa tutkimuksessa, Gray et ai havaittu, että NRP2 ei ollut havaittavissa pahanlaatuisissa paksusuolen limakalvolla, mutta oli ilmeistä 10 (83%) 12 vierekkäisten paksusuolen adenokarsinooma ja viidessä (71%) seitsemän maksametastaaseista IHC värjäystä. Lisäksi toisessa tutkimuksessa, NRP2 ekspressio havaittiin 5 out of 6 (83%) käytetään yleisesti haiman solulinjat [15] ja 7: ssä 11 (64%) kirurgisista näytteistä haiman adenokarsinooma IHC värjäystä [14]. Lopuksi, rintasyövän, Yasuoka ym raportoitu NRP2 ilmaisun 60 ulos 113 invasiivisen Rintasyövän (53,1%) [18]. Näistä eri tutkimusten perusteella näyttää siltä, ​​että NRP2 näyttää olevan erityinen useita kasvain kudosten, kun taas mitään ilmaus tästä glykoproteiinin yleisesti terveillä kudoksissa, joka vahvistaa, että NRP2 on houkutteleva kohde innovatiivinen anti-kasvain hoitoja (katso taulukko S1 tarkistettavaksi of NRP2 ilmaisun syövät).

tutkia tarkka rooli NRP2 syövän etenemiseen, päätimme tuottaa paksusuolensyöpä jotka ilmentävät tai eivät NRP2 käyttäen NRP2 geeninsiirto tai NRP2 erityisiä siRNA. Siksi NRP2 transfektoitiin HT29 ja erityinen siRNA käytettiin pudotus NRP2 ilmaisun Colo320. Virtaussytometria suoritettiin kokeita sen vahvistamiseksi modulaatioon NRP2 ilmentymisen HT29 ja Colo320 (kuvio 2A). Ei modulaatio NRP1 ilmentymistä havaittiin HT29 tai Colo320 transfektoiduissa soluissa. Caki-1 munuaissyövän-soluja käytettiin positiivisena kontrollina NRP1 värjäystä. NRP2 läsnäolo HT29

ctrl, HT29

NRP2, Colo320

siRNA-ctrl, Colo320

siRNA-NRP2 kontrolloitiin western blottauksella (kuvio 2B).

Transfektoidut solut analysoitiin for NRP1 ja NRP2 ilmaisun virtaussytometrialla analyysi (

) tai western-blottauksella (

B

). Virtaussytometriako- analyysi, suhteellinen fluoresenssin intensiteetti (RFI) laskettiin. Caki1 ja HUVEC-soluja käytettiin positiivisena kontrollina NRP1 ja NRP2 värjäys vastaavasti.

C,

leviämisen HT29 ja Colo320 soluja, mukaan NRP2 ilmentyminen arvioitiin käyttäen MTT määrityksiä. 4000-soluja päästää viljelmässä aikana 24, 48 tai 72 tuntia ennen analyysiä. NRP2 ilmentyminen liittyy parannettu proliferaatiota paksusuolen syöpäsoluissa. Tiedot edustavat keinot kolmen rinnakkaisen plus tai miinus keskivirhettä (SE) on edustava koe kolmesta suoritettu. (

**, P 0,01). D,

Samanlaisia ​​MTT kokeita toistettu läsnäollessa bevasitsumabia (0,25 ja 1 mg /ml, 72 h). HMEC-1 mikroverisuonten endoteelisoluja käytettiin positiivisena kontrollina bioaktiivisuutta bevasitsumabi. Todellakin, bevasitsumabi vähentää merkittävästi HMEC-1 leviämisen taas eivät pienene soluproliferaation havaitaan HT29

NRP2 ja Colo320 syöpäsoluja. Koe tehtiin 3 kertaa, ja joka kerta kolmena rinnakkaisena.

E,

virtaussytometrinen analyysi DNA-pitoisuus transfektoitujen paksusuolen syöpäsoluja. NRP2 ilmentyminen liittyy parannettu solujen määrä vaiheessa S. Data edustaa tulokset edustava koe 3 ilmaistu keskiarvona kahtena määritykset (*,

P 0,05; **, P 0,01, ** * P 0,001).

NRP2 edistää kasvainten lisääntymistä

käytti edellisen solulinjojen tutkia roolia NRP2 syövän proliferaatiota in vitro ja kasvaimen kasvua in vivo. Leviämisen seurattiin käyttäen MTT-määrityksissä. HT29

NRP2 solut osoittivat ylivoimaisen leviämisen nopeus 24, 48 ja 72 tuntia verrattuna HT29

ctrl (kuvio 2C). Käänteisesti NRP2 pudotus käyttämällä erityisiä siRNA, negatiivisesti moduloitu leviämisen Colo320 kasvaimen solulinja (kuvio 2C). Nämä kokeet osoittivat, että NRP2 ilmentymistä tehostaa koolonisyöpäsolulinja proliferaatiota in vitro (jäljempänä significativity kullakin ajanhetkellä näiden MTT määrityksissä on esitetty taulukossa S2). Vahvista vaikutuksen NRP2 soluproliferaatioon, olemme arvioitu kahdessa lisäkokeita kaksinkertaistaminen-ajat HT29

ctrl, HT29

NRP2, Colo320

siRNA-ctrl ja Colo320

siRNA-NRP2 syöpä solut. NRP2 ilmentävien solujen HT29

NRP2 ja Colo320

siRNA-ctrl oli kaksinkertaistaa aikaa 8 ja 11 tuntia vastaavasti, kun taas kaksinkertaistaa aikoina NRP2 puuttuu solujen HT29

ctrl ja Colo320

siRNA-NRP2 olivat 13 ja 14 tuntia. Koska KUO ovat VEGF koreseptorit, me seurataan VEGF-A tuotantoa HT29 ja Colo320 kulttuureissa Elisan testi. Nämä solut tuottivat alhaisia ​​VEGF-A. NRP2 ilme ei vaikuttanut VEGF tuotantoa (kuva S1). Lisäksi neutraloiva mAb bevasitsumabi, tiedetään estävän leviämisen mikrovaskulaaristen endoteelisolujen line HMEC-1 [27], on käytetty käsittelemään mahdollista roolia VEGFA in NRP2-välitteistä kasvainsolun kasvua. Nämä kokeet osoittivat, että VEGFA neutralointi eivät vaikuttaneet NRP2 välittämä HT29 tai Colo320 lisääntymistä. (Kuva 2D)

lisäksi NRP2 on toiminnallinen reseptori semaforiini 3F, joka on kuvattu estäjä angiogeneesi, kasvaimen etenemisen ja etäpesäkkeiden [28]. Western blotting kokeet osoittivat, että HT29

ctrl ja HT29

NRP2 ilmaista samantasoista semaforiini 3F, kun taas mitään semaforiini 3F löydettiin Colo320 soluissa, mikä viittaa siihen, että NRP2 välittämä kasvaimen leviämisen ei liity semaforiini 3F (kuva S2) . Sitten jakelun tuman DNA pitoisuus tutkittiin virtaussytometrialla vuonna HT29

ctrl, HT29

NRP2, Colo320

siRNA-ctrl ja Colo320

siRNA-NRP2 syöpäsoluja. NRP2 ilmentyminen liittyi parannettu solujen määrä vaiheessa S (kuvio 2E). Seerumideprivaatiolle viljelyväliaineessa indusoi kasvua subG1 osa vain NRP2 negatiivinen olosuhteissa (tuloksia ei ole esitetty). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että NRP2 ilmentymistä peräsuolen karsinooma edistää syöpäsolujen lisääntymistä ja selviytymistä.

NRP2 ablaatiota käyttäen siRNA estää ksenografti muodostumista

tarkka rooli NRP2 syövän etenemiseen oli ensimmäinen ominaista

in vivo

. Tutkia vaikutus NRP2 ilmaisun

in vivo

kasvaimen kasvua, me ympätty yhtä paljon (1,10

6 solua hiirtä kohti) HT29

NRP2 tai HT29

ctrl ihon alle nude-hiiriin. Kasvaimen esiintymistiheys ja volyymi arvioitiin joka toinen viikko. Kasvaimet esiintyi kaikissa hiirissä ympätty HT29

ctrl ja HT29

NRP2. NRP2 tehostaa merkittävästi kasvaimen kasvua in vivo (kuvio 3A). Näiden tulosten vahvistamiseksi, päätimme tutkia, NRP2 kohdistaminen käyttämällä erityisiä siRNA voisi estää kasvaimen muodostumista. Vaikka 1,10

6 Colo320

siRNA-ctrl solujen ihon alle nude-hiiriin aiheuttama kasvain siirteen kaikkien hiirten, NRP2 esto käyttämällä erityisiä siRNA esti Colo320 siirteen kaikilla eläimillä viittaa kriittinen rooli NRP2 alussa tapahtumiin osallistuvat kasvaimen muodostumiseen (kuvio 3B) kantavassa vaikutus NRP2 eston käyttämällä erityisiä siRNA on Colo320 tuumorigeenisyystesti vahvistettiin

in vitro

. Tätä tarkoitusta varten, Colo320-soluja käsiteltiin NRP2 siRNA tai ctrl siRNA ja viljeltiin pehmeässä agarissa määrityksen. NRP2 Knockdown in Colo320 vähentänyt pesäkkeiden havaittiin pehmeässä agarissa kokeissa (kuvio 3C). Koska HT29 eivät muodostaneet pesäkkeitä pehmeässä agarissa kulttuureissa, päätimme tutkia vaikutusta NRP2 HT29 hyökkäystä ja muuttoliike.