Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kestävä kasvainsolu hävittämiseen kemoterapiaa kiistää kehittymistä monelle vastus (MDR) ja epäonnistuminen aiheuttaa immunogeenisen solukuoleman. Tavoitteena työssä on ollut tutkia MDR ja immunogeeninen solukuoleman yhteinen biokemiallinen reitti lopulta vastaanottavaisia ​​hoitointerventio. Huomasimme, että mevalonaatin signalointia, Ras ja RhoA proteiini isoprenylation, Ras- ja RhoA-loppupään signalointireitistä toimintaa, hypoksian indusoima tekijä-1-alfa aktivointi olivat merkitsevästi korkeammat MDR + verrattuna MDR- ihmisen syöpäsoluja, mikä lisää P-glykoproteiinin ilmentymisen, ja suojaa doksorubisiinin aiheuttaman sytotoksisuuden ja immunogeeninen solukuolemaa. Tsoledronihappo, joka on voimakas aminobisphosphonate kohdistettu mevalonaatin reitissä keskeytti Ras- ja RhoA riippuva alavirran signalointireittien, kumosi hypoksian indusoima tekijä-1-alfan perustuva P-glykoproteiinin ilmentymisen ja palauttaa doksorubisiini aiheuttama sytotoksisuuden ja immunogeeninen solukuoleman MDR + soluissa. Immunogeeninen solukuolemaa talteenotto dokumentoitiin kyky dendriittisolujen phagocytise MDR +: lla käsiteltyjen solujen tsoledronihappo plus doksorubisiini, ja rekrytoida kasvainten vastaisen sytotoksisen CD8 + T-lymfosyytit. Nämä tiedot viittaavat siihen, että MDR + solut on hyper-aktiivinen mevalonaatiksi reitti, joka on kohdennettavissa tsoledronihapolla antagonisoida niiden kyky kestää kemoterapian aiheuttama sytotoksisuuden ja paeta immunogeeninen solukuoleman.

Citation: Riganti C, Castella B, Kopecka J, Campia I, Coscia M, Pescarmona G, et ai. (2013) tsoledronihappo Palauttaa Doksorubisiini Kemosensitiivisyys ja immunogeeninen solukuoleman monilääkeresistenteistä ihmisen syöpäsoluja. PLoS ONE 8 (4): e60975. doi: 10,1371 /journal.pone.0060975

Editor: Derya Unutmaz, New York University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 tammikuu 2013; Hyväksytty: 01 maaliskuu 2013; Julkaistu: 12 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Riganti et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Italian Association for Cancer Research (AIRC, www.airc.it, MFAG 11475 ja Chiara Riganti, IG 13119 Massimo Massaia); Italian valtiovarainministeriön yliopisto ja Research (www.miur.it; PRIN 2010-2011 Massimo Massaia, FIRB 2012 Chiara Riganti); Fondazione Internazionale Ricerche Medicina Sperimentale (www.cerms.it, Amalia Bosia, Massimo Massaia); Piemonten aluetta (Ricerca Sanitaria Finalizzata 2009 Chiara Riganti, Amalia Bosia, Progetto Immonc Massimo Massaia). Joanna Kopecka on vastaanottaja ”Mario ja Valeria Rindi” apuraha italialaisilta Foundation for Cancer Research (FIRC). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

mevalonaatin (Mev) reitti on erittäin konservoitunut metabolinen cascade joka tuottaa sterolit, kuten kolesteroli, ja isoprenoideja, kuten farnesyylipyrofosfaatin (FPP) ja geranyyligeranyylipyrofosfaatti (GGPP). Viimeksi mainitut ovat välttämättömiä isoprenylation ja aktiivisuus pieniä G-proteiineja, kuten Ras ja Rho jotka kontrolloivat soluproliferaatiota, solun tukirangan remodeling ja angiogeneesin [1].

yli-ilmentyminen Mev reitin entsyymejä on korreloivat huono kliinistä tulosta useissa ihmisen syövissä [2], [3]. Solunsisäiset kolesterolia voi moduloida vastustuskyky erilaisia ​​syöpälääkkeiden, sisällä toimiva fenotyypin kutsutaan monelle vastus (MDR), joka voi olla konstitutiivinen tai indusoitu altistuksen jälkeen toistuvien kurssia ei-poistamisen kemoterapiaa [4]. Plasma limakalvojen MDR + kasvainsoluja erityisen runsaasti kolesterolia, joka helpottaa aktiivisuutta P-glykoproteiinin (Pgp) [5], kiinteä kalvo kuljettaja puristamista kemoterapiaa huumeiden, kuten antrasykliinit, taksaanit, Vinka-alkaloidit, epipodofyllotoksiinit, topotekaani, ja mitomysiini C [4]. Toinen tunnusmerkki MDR + kasvainsolujen on lisääntynyt isoprenylation ja aktiivisuuteen G-proteiineja, jotka ovat myös riippuvaisia ​​nopeus on Mev signalointia [6], [7].

Kertyvät näyttö osoittaa, että menestyksekäs ja kestävä kasvain solu poistaminen on riippuvainen kyvystä kemoterapiaa huumeita tappaa kasvainsoluja tavalla, joka on havaittavissa immuunijärjestelmää. Termi immunogeeninen solukuolemaa (ICD) on loi kuvaamaan kyky tiettyjen lääkkeiden, kuten doksorubisiinin (Dox), tappaa kasvainsoluja ja samanaikaisesti aiheuttaa tuumorin vastaisen laukaisemaa immuunivastetta kuolee kasvainsolujen [8]. Molecular tärkeimmistä tapahtumista Dox aiheuttama ICD ovat solunulkoinen vapauttamista korkean liikkuvuuden ryhmä 1 laatikko (HMGB1) proteiinia ja solun pinnan translokaatiota kalretikuliini (CRT) solulimakalvostosta, jossa se kykenee kalsium-anturi ja chaperoniproteiiniin toimintoja. Nämä tapahtumat laukaista kasvaimen solujen fagosytoosin dendriittisolujen (DC) ja myöhemmin DC-välitteisen palkkaamalla immuuni osapopulaatioiden kanssa antituumorivaikutus [9], [10]. Mielenkiintoista, MDR + solut ovat usein tulenkestäviä ICD [11] osoittaa, että kasvainsolut varaa useita strategioita selviytyä ja lisääntyä kemoterapiaa saaneilla isäntä.

Tsoledronihappo (ZA) on aminobisphosphonate käytetään laajasti klinikoilla estää luun resorptiota ja luusairauksien hoitoon on kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien rinta-, eturauhas-, keuhkosyöpä ja multippeli myelooma. ZA on spesifinen inhibiittori FPP-syntaasin että Mev reitin ja kohdistaa pleiotrooppisia vaikutuksia kasvainten ja ei-kasvainsoluissa, kuten osteoklastit, makrofagien, endoteelisolujen ja immuunijärjestelmän solujen [12], [13]. Nämä vaikutukset johtuvat solunsisäisen menetyksen isoprenylated proteiinien ja /tai kerääntymisen isopentenyylipyrofosfaatti, jota hyödynnetään aktivoida Vγ9Vδ2 T-soluja, on ainutlaatuinen osajoukko epätavanomaisten T-solujen sääntely- ja efektorifunktioita mikrobeja vastaan, korosti soluja ja tuumorisoluja [14 ] – [16].

Aiemmat tiedot ovat osoittaneet, että ZA parantaa antiproliferatiivista vaikutusta Dox huumeiden herkkien tuumorisoluissa [17], [18] ja kliinisiä tutkimuksia on käynnistetty rintasyövän potilaiden hyödyntämään tätä synergiaa [19]. On kuitenkin tällä hetkellä tiedetä, ZA on vaikutusta MDR ja /tai ICD kasvainsoluissa. Tavoitteena oli tutkia kaksijakoinen: 1) tutkia aktiivisuutta Mev reitin ja Ras /RhoA-myötävirtaan signaalireaktioteissä MDR- ja MDR + kasvainsoluja; 2) arvioida suhteen, jos sellainen on, välinen ZA-indusoidun Mev reitin inhibition, Dox-indusoidun sytotoksisuuden ja ICD alttius. Huomasimme, että hyper-aktiivinen Mev koulutusjakson vastaa sekä kemo- ja immuuni-vastus; kiitos inhibition Mev-reitin riippuvainen signaalien, ZA palauttaa Dox-indusoidun sytotoksisuuden ja ICD MDR + -soluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Chemicals

naudan sikiön seerumia (FBS ) ja viljelyväliaineessa olivat Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA). Muovivälineitä soluviljelmissä oli Falcon (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). ZA oli lahja Novartis (Basel, Sveitsi). Erityiset inhibiittorit farnesyylitransferaasin FTI-277, geranyyligeranyylitransferaasia GGTI-286 ja RhoA kinaasin Y27632 hankittiin Calbiochem (San Diego, CA). Elektroforeesi reagenssit saatiin Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). Valkuaispitoisuus yksisoluiset kerrokset ja lysaatit arvioitiin kanssa BCA pakki Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Ellei toisin mainita, kaikki muut reagenssit hankittiin Sigma Chemical Co.

Solulinjat

Ihmisen paksusuolen syövän HT29, keuhkosyöpä A549, ja rintasyöpä MCF7 ovat Dox-herkkä, MDR- kasvaimen solulinjat (ATCC, Rockville, MD). Dox kestävä vastineet (HT29-dx, A549-dx ja MCF7-dx) tuotettiin viljelemällä vanhempien solujen läsnäollessa kasvavia pitoisuuksia Dox jopa 20 kohtiin [11], [20], [21]. Toistaiseksi työ, HT29-dx-soluja kasvatettiin elatusaineessa, joka sisälsi 250 nmol /l Dox, A549-dx soluja alustassa, joka sisälsi 100 nmol /l Dox, MCF7-dx soluja alustassa, joka sisälsi 0,5 nmol /l, ja edusti malleja hankittujen MDR. Ihmisen hepatoma HepG2-solulinja (ATCC) ja HP06 ja HMM syöpäsoluja käytettiin prototyyppi malleja solujen konstitutiivisen MDR fenotyyppi ja aiemmin kuvattu ([7], [11], [21]; kaikissa näissä teokset HMM solut nimettiin MM98-soluja). Ensisijainen HP06 solut (lahja prof Anna Sapino, Department of Biomedical Sciences ja onkologian, University of Torino, Italia) olivat peräisin vatsakalvon etäpesäkkeiden naispuolinen potilas invasiivisen rintasyövän, kun taas ensisijainen HMM solut (pahanlaatuinen mesoteliooma biologis Bank, azienda Ospedaliera Nazionale, Alessandria, Italia) olivat peräisin pleuraalieffuusio potilaan histologisesti vahvistettu pahanlaatuinen mesoteliooma, kun kirjallinen suostumus potilailta. Käyttö HP06 solujen hyväksynyt bioetiikkaneuvoston ( ”Comitato of Bioetica d’Ateneo”) yliopiston Torino, Italia; käyttö HMM-solujen on hyväksynyt bioetiikkaneuvoston ( ”Comitato Etico Interaziendale”) ja ”Azienda Ospedaliera Nazionale SS. Antonio e Biagio e Cesare Arrigo ”Alessandria, Italia. Ensiöparit käytettiin kohtia 2-4. Kaikki viljelmät täydennetty 10% FBS, 1% penisilliini-streptomysiiniä ja 1% L-glutamiinia, ja pidettiin kosteutetussa ilmakehässä 37 ° C: ssa ja 5% CO

2.

Solunsisäinen Dox kertymistä

Solunsisäinen Dox sisällön detektoitiin Fluorimetristä perustuva määritys, kuten on raportoitu [20], ja joka ilmaistaan ​​nmol Dox /mg solun proteiinien mukaisen aiemmin valmistetun kalibrointikäyrän.

Reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio reaktio (RT-PCR) B

Kokonais-RNA uutettiin ja käänteistranskriptoidaan käyttäen QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Hilden, Saksa). RT-PCR suoritettiin IQ ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Sama cDNA valmistetta käytettiin kvantitointiin

MDR1

-geeni, joka koodaa ihmisen Pgp ja glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH), valittiin siivous geenin. Sekvenssit

MDR1

alukkeet olivat: 5′-TGCTGGAGCGGTTCTACG-3 ’, 5′-ATAGGCAATGTTCTCAGCAATG-3’. Sekvenssit GAPDH alukkeet olivat: 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 ’, 5′-CATGGTGGAATCATATTGGAA-3’. Suhteellinen kvantitointi Kunkin näytteen suoritetaan vertaamalla

MDR1

PCR-tuotteen kanssa, GAPDH PCR-tuotteen kanssa, Bio-Rad Software Gene Expression kvantitointi.

De novo

synteesi kolesterolin ja isoprenoidit

Soluja leimattiin 1 uCi /ml

3H-asetaatti (3600 mCi /mmol; Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) ja synteesi radioaktiivisesti kolesterolin, FPP ja GGPP mitattiin kuvatulla [22]. Tulokset ilmaistiin pmol /mg solun proteiinien, mukaan suhteellinen kalibrointikäyrien.

Ras ja RhoA isoprenylation ja toiminnan

havaitsemiseksi isoprenylated kalvoon liittyvä Ras tai RhoA proteiinit ja ei- isoprenylated sytosolin muotoja, solut hajotettiin MLB-puskuria (125 mmol /L Tris-HCI, 750 mmol /l NaCI: a, 1% v /v NP40, 10% v /v glyserolia, 50 mmol /L MgCl

2, 5 mmol /l EDTA: a, 25 mmol /L NaF, 1 mmol /L NAvó

4, 10 ug /ml leupeptiiniä, 10 ug /ml pepstatiinia, 10 ug /ml aprotiniinia, 1 mmol /l fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, pH 7,5) ja sentrifugoitiin 13 000 x g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantin alikvootti otettiin Western blot koko Ras ja RhoA, kun taas jäljelle jäävä osa sentrifugoitiin 100 000 x g 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa; sekä supernatantti (sytosolin otteita) ja pelletti (membraanifraktioiden) liuotettiin Laemli-puskuria (125 mmol /l Tris, 4% paino /tilavuus SDS: ää, 20% v /v glyserolia ja 1% w /v β-merkaptoetanoli) ja altistettiin Western blotting, käyttämällä anti-Ras (Millipore, Billerica, MA) ja anti-RhoA (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) vasta-aine. Arvioidaan Ras ja RhoA aktiivisuutta, GTP-sitoutunut osuus, otetaan indeksi aktiivisen G-proteiinit [23] mitattiin, käyttäen avattavasta määritys (kanssa Raf-1-GST-fuusioproteiinia, agaroosihelmet-konjugaatteja, Millipore) ja ELISA-määritystä (G-LISA ™ RhoA Activation Assay Biochem Kit, Cytoskeleton Inc, Denver, CO), vastaavasti, kuten aiemmin on kuvattu [22].

RhoA kinaasiaktiivisuutta

RhoA-kinaasiaktiivisuutta arvioitiin kanssa CycLex Rho-kinaasi-Assay Kit (CycLex Co, Nagano, Japani) valmistajan ohjeiden [22].

Western blot-analyysi

Solut hajotettiin MLB puskuria, sonikoitiin ja sentrifugoitiin 13 000 x g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. 10 ug solun lysaatit alistettiin Western blotting ja koetettiin seuraavilla vasta-aineilla: anti fosforia (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187) -ERK1 /2 (Millipore); anti-ERK 1/2 (Millipore); anti-hypoksian indusoima tekijä-1α (HIF-1α, BD Bioscience, San Jose, CA); anti-Pgp (Santa Cruz Biotechnology Inc.); anti-GAPDH (Santa Cruz Biotechnology Inc.), ja sen jälkeen toisen peroksidaasi-konjugoiduilla vasta-aineilla (Bio-Rad). Proteiinit havaittiin tehostetulla kemiluminesenssilla (PerkinElmer, Waltham, MA).

Sen arvioimiseksi, HIF-1α fosforylaation, kokosolulysaatissa immunosaostettiin polyklonaalisella anti-HIF-1α-vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology Inc.), tutkitaan sitten 1 h ja biotiinikonjugoitua anti-fosfoseriini-vasta-ainetta (Sigma Chemical Co.) ja sen jälkeen polymeerisen streptavidiini-piparjuuriperoksidaasi-konjugaatteja (Sigma Chemical Co.).

HIF-1α transkriptionaalisen aktiivisuuden

Nuclear proteiinit eristettiin käyttäen Nuclear Extract Kit (Active motiivi, Rixensart, Belgia). Aktiivisuus HIF-1 10 ug tumaekstrakteilla arvioitiin kanssa TransAm ™ HIF-1 transkriptiotekijä Assay Kit (Active motiivi). Jokaista koesarjaa, tyhjä (jossa kahdesti tislattua vettä), negatiivinen kontrolli (jossa mutatoitujen oligonukleotidi) ja kilpailun määritys (käyttäen 20 pmol villin tyypin oligonukleotidin kanssa tumaekstrakteilla HMM soluja kasvatettiin 3% O

2 24 h) olivat mukana. Vuonna hypoksinen olosuhteissa HIF-1-aktiivisuus oli 257,53 ± 3,77 mU /mg prot; kilpailuun määrityksessä, vastaava HIF-1-aktiivisuus väheni 33,14 ± 1,39 mU /mg prot (n = 5). Tiedot ilmaistiin mU absorbanssi /mg solun proteiineista.

Kromatiini Immunosaostaminen (chip) kokeissa mittaamaan sitoutumisen HIF-1α aiheesta ”Hypoksia vastaava elementti” on

MDR1

promoottori oli suoritettiin kuten on raportoitu muualla [24].

Sytotoksisuusmääritvs

(LDH) aktiivisuus mitattiin solunulkoiseen ja solulysaatissa, kuten on kuvattu [20]. Mitata solunulkoista vapautumista HMGB1, 20 ui soluja elatusaineessa keitettiin, SDS-PAGE: lla ja koetin, jossa on anti-HMGB1-vasta-ainetta (Sigma Chemical Co.). Blotit valmiiksi värjätty Red Ponceau tarkistaa yhtäläinen lastaus proteiineja. ATP: n vapautuminen mitattiin 100 ui soluviljelyväliaineesta ATP Bioluminescent Assay Kit (FL-AA, Sigma Aldrich), käyttämällä Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader (Bio-Tek, Winooski, VT). Tulokset ilmaistiin nmol ATP /ml, mukaan aiemmin asetetut titrauskäyrän.

analyysi solun pinnan CRT

Soluja inkuboitiin 45 min (4 ° C), jossa on anti- CRT-vasta-ainetta (Affinity Bioreagents, Rockford, IL), kuten on raportoitu [11], ja analysoitiin käyttäen FACS-Calibur-järjestelmä (BD Biosciences). Jokaista analyysia 100000 tapahtumaa kerättiin. Prosenttiosuus CRT-loisteputki elinkelpoisia soluja (propidiumjodidin-negatiivinen) laskettiin Cell Quest ohjelmisto (BD Biosciences). Vertailukokeet mukana inkuboimalla soluja ei-immuuni isotyyppiset vasta sen jälkeen sopivaa sekundaarista vasta-ainetta. Virtaussytometria tulokset vahvistettiin biotinylaatio määrityksillä [25], käyttämällä Cell Surface Protein eristyspakkausta Thermo Fisher Scientific Inc. (Rockford, IL). Merkintä biotiinia soluissa jätettiin tarkistamalla puuttuminen sytosolin proteiineja (GAPDH, aktiini) in biotinyloidun otteita (ei kuvassa).

dendritic cell (DC) tuottaminen ja

in vitro

fagosytoosin määritys

DC synnytettiin perifeerisen veren näytteissä saatu terveiltä luovuttajilta ystävällisesti paikallinen veripankin (Fondazione Strumia, Torino, Italia), kuten aikaisemmin on raportoitu [11]. Solut kerättiin päivänä 6 ja vahvistettu epäkypsiä DC morfologia ja immunofenotyypin.

MDR- HT29 ja MDR + HT29-dx ja HMM solut vihreä-värjätty PKH2-FITC (Sigma Chemical Co.), pestiin kahdesti ja niitä inkuboitiin suhteessa 1:01 18 tuntia 37 ° C: ssa. Co-viljelmät värjättiin sitten 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa APC-konjugoidun HLA-DR-vasta-aine (Miltenyi Biotec, Tetrow, Saksa) merkitä DC. Kaksivärinen virtaussytometrialla suoritettiin FACScan solulajittelijaa ja CellQuest-ohjelmaa (Becton Dickinson). Ainakin 10000 tapahtumia kertynyt nimenomaan backgating DC morfologia (alue 1: FSC vs. SSC). Kasvainsolujen fagosytoosin arvioitiin prosenttiosuuden kaksinkertaisen värjätty (FITC plus APC) soluja. Kasvainsolut eivät ilmennä huomattavia määriä HLA-DR, ja ne jäävät alue 1 niiden morfologiaa. Kussakin koesarjassa, joka on -fagosytoosikoe suoritettiin co-inkuboimalla DC ja kasvainsolujen 4 ° C: ssa, sen sijaan, että 37 ° C: ssa, ja prosenttiosuus double-värjättyjen solujen saatu inkuboinnin jälkeen 4 ° C: ssa vähennettiin arvoista havaittu 37 ° C: ssa. Fagosytoosin määrä on ilmaistu phagocytic indeksi, joka on laskettu aikaisemmin raportoitu [9].

fluoresenssimikroskopialla perustuvissa määrityksissä, PKH2-FITC vihreä-värjätty kasvainsoluja inkuboitiin 6 h tai 24 h 37 ° C 1 x 10

5 DC: iden 01:01 suhteessa. Co-viljelmiä Cytospin 1500 x g 5 minuutin ajan lasi- luistaa, kiinnitettiin 4% w /v paraformaldehydiä, pestiin ja värjättiin hiiren polyklonaalisen anti-MHCII-vasta-ainetta (Thermo Fisher Scientific Inc.). Pesun jälkeen näytteitä inkuboitiin Alexa fluor 350-conjuganted vuohen anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta (Invitrogen) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, pestiin, asennettu Gel Mount Aqueous Asennus ja tutkitaan fluoresenssimikroskoopilla, kuten edellä on kuvattu.

DC-välitteisen CD8 + T-solujen stimulaation

Kun kasvainsolu fagosytoosia, DC pestiin ja viljeltiin yhdessä autologisten T-solujen, jotka on eristetty CD14-solut immunomagneettisella lajittelu Pan T-Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec). DC ja T-soluja rinnakkaisviljeltiin viljeltiin 10 päivää, kun suhde on 01:05 täydellisessä alustassa, johon oli lisätty IL-2 (10 U /ml). Päivänä 10, CD107 ilme CD8 + T-solujen määritettiin virtaussytometrialla määrittää aktivaation kasvainspesifisten sytotoksisten T-solujen [26]. Ainakin 100000 tapahtumista lymfosyyttien portille hankittiin ja analysoitiin kahden värin virtaussytometria. Kasvain solukuolema CD8 + T-solujen kvantitoitiin myös CFSE-merkintöjä, mittaamalla prosentuaalinen HT29-dx solujen kaksinkertainen positiivisia CFSE ja propidiumjodidilla kuten aiemmin raportoitu [14], [15].

Statistical analyysi

Kaikki tiedot tekstissä ja luvut annetaan keskiarvoina ± SD. Tulokset analysoitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA), jossa

P

0,05 merkitys cut-off. R-kerroin laskettiin Fig.P ohjelmisto (Fig.P Software Inc., Hamilton, Kanada).

Tulokset

korrelaatio

MDR1

ilmaisun ja Mev signalointia

Solunsisäiset Dox säilyttäminen,

MDR1

mRNA-tasoja, ja kolesterolin synteesiä mitattiin merkkiaineina Pgp aktiivisuuden, Pgp ilme, ja Mev polku toimintaa HT29, A549, MCF7-solut (MDR- solujen) , HT29-dx, A549-dx, MCF7-dx-solut (hankittu MDR + solut), ja HepG2-soluissa, HP06, HMM soluja (konstitutiivinen MDR + solut), tässä järjestyksessä. Sekä hankittujen ja konstitutiivisen MDR + solut säilyvät merkittävästi vähemmän Dox (kuvio 1A) ja osoitti korkeampia

MDR1

mRNA-tasot (kuvio 1 B) kuin MDR- solujen. Kolesterolin synteesiä oli myös merkitsevästi suurempi MDR + kuin MDR- soluissa (kuvio 1 C). Erot hankittu ja perustava MDR + solut eivät olleet tilastollisesti merkitseviä, vaikka tämä oli taipumus säilyttää vähemmän Dox, ilmaista enemmän

MDR1

mRNA-tasoja, ja tuottaa enemmän kolesterolia kuin entinen. Erittäin merkittävä korrelaatiota ei havaittu nopeudella kolesterolin synteesiä ja

MDR1

mRNA (kuvio 1 D).

. Solunsisäinen doksorubisiini (Dox) pitoisuudet MDR- (HT29, A549 ja MCF7), vastaavassa hankittu MDR + vastineet (HT29-dx-solujen, A549-dx-solujen, MCF7-dx), ja konstitutiivinen MDR + soluja (HepG2, HP06, HMM ). Huomattavasti alhaisemmat pitoisuudet havaittiin solujen hankittu MDR

vs

MDR- (HT29-dx

vs

HT29: * p 0,002; A549-dx

vs

A549: * p 0,001; MCF7-dx

vs

MCF7: * p 0,001), ja soluissa stitutiivisella MDR

vs

MDR- solujen (keskiarvo solunsisäisten doksorubisiinin HepG2 /HP06 /HMM

vs

keskiarvo vuonna HT29 /A549 /MCF7: ° p 0,001). B.

MDR1

mRNA ilmaisun. Merkittävät korkeampi

MDR1

tasot havaittiin soluissa, joilla on hankittu MDR

vs

MDR- (HT29-dx

vs

HT29: * p 0,002; A549-dx

vs

A549: * p 0,002; MCF7-dx

vs

MCF7: * p 0,001), ja soluissa stitutiivisella MDR

vs

MDR- solujen (keskiarvo

MDR1

tasoilla HepG2 /HP06 /HMM

vs

keskiarvo vuonna HT29 /A549 /MCF7: ° p 0,001). C. Luokitus kolesterolin synteesiä. Merkittävät korkeampi aktiivisuus mitattiin solujen hankittu MDR

vs

MDR- (HT29-dx

vs

HT29: * p 0,002; A549-dx

vs

A549: * p 0,002; MCF7-dx

vs

MCF7: * p 0,002), ja soluissa stitutiivisella MDR

vs

MDR- solujen (keskiarvo kolesterolin synteesiä HepG2 /HP06 /HMM vs keskiarvo HepG2 /HP06 /HMM: ° p 0,001). D. Suora korrelaatio määrä kolesterolin synteesiä ja ekspressiotasot

MDR1

yksittäisissä solulinjoissa (r

2 = 0,95). Paneelien A, B, ja C edustavat keskimäärää ± SD 3 itsenäisen kokeen.

ZA estää Mev riippuvainen signalointireittien MDR + soluissa

ZA käytettiin tutkimaan vaikutus Mev reitin inhibition HT29, HT29-dx ja HMM soluja, jotka valittiin prototyyppi malleja MDR- hankki MDR + ja perustava MDR + kasvainsolujen vastaavasti.

ZA indusoi annoksesta (kuvio 2A, vasen paneeli ) ja ajasta riippuvia (kuvio 2A, oikea paneeli) vähennys kolesterolin synteesiä, joilla on merkittävä inhibitio 1 umol /L, joka oli selvempää MDR + HT29-dx ja HMM soluja kuin MDR- HT29 (kuvio 2A). Yksi umol /L on myös samanlainen seerumissa saavilla potilailla ZA kliinisesti hyväksyttyjä annoksia [27], [28] ja siksi tämä keskittyminen käytettiin koko tutkimuksen ajan.

MDR- HT29, ja MDR + HT29 -dx ja HMM soluja viljeltiin ilman (CTRL) tai tsoledronihapolla (ZA). Paneelit B-E, ZA (1 umol /l) käytettiin 48 tuntia, FTI-277 (10 umol /l, FTI), GGTI-286 (10 umol /l, GGTI), Y27632 (10 umol /l, Y276) 24 tuntia. A.

Vasen paneeli

: annoksesta riippuva esto kolesterolin synteesiä soluissa käsitelty 0,01-10 mikromol /l ZA 24 tuntia. Inhibitio oli tilastollisesti merkitsevä HT29 (* p 0,001), HT29-dx (° p 0,01) d HMM solut (

◊p 0,005)

vs

lähtötasolle (0).

Oikea paneeli

: aikariippuvainen eston kolesterolin synteesiä soluissa, joita käsiteltiin 1 umol /l ZA 24-72 tuntia. Inhibitio oli tilastollisesti merkitsevä HT29 (* p 0,001), HT29-dx (° p 0,0001) ja HMM-solut (

◊p 0,001)

vs

lähtötasolle (0). Sekä paneelit: HT29-dx /HMM

vs

HT29: * p 0,001. B. MDR + solujen syntetisoida suurempia määriä FPP (

vasen paneeli

) ja GGPP (

oikea paneeli

) kuin MDR- solujen (* p 0,005). ZA vähensi merkitsevästi FPP synteesi

vs

käsittelemätöntä (CTRL) (HT29: * p 0,001; HT29-dx: ° p 0,002; HMM:

◊p 0,001) ja GGPP synteesi

vs

käsittelemätön (CTRL) (HT29: * p 0,02, HT29-dx: ° p 0,001; HMM:

◊p 0,005). C. MDR + soluilla epätasapainoinen jakautuminen isoprenylated kalvoon sitoutunut (

M

) ja ei isoprenylated soluliman (

C

) Ras (

vasen paneeli

) ja RhoA (

oikea paneeli

) verrattuna MDR- solujen. ZA hoito korotti sytosolin Ras ja RhoA.

T

: määrä Ras ja RhoA in kokosolulysaateista. D. ZA vähentynyt Ras aktiivisuus, mitattuna Ras-GTP määrä, ja fosforia (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187) -ERK1 /2 määrä. GAPDH tiedot esitetään vahvistamaan vastaavaa proteiinia lastaus. E. MDR + soluja oli merkittävästi suurempia määriä RhoA-GTP (

avoimet pylväät

) ja RhoA kinaasi (

viivoitetut pylväät

) kuin MDR- solujen (* p 0,005); ZA laski sekä RhoA-GTP ja RhoA kinaasi

vs

käsittelemätöntä (CTRL) (HT29-dx: ° p 0,02; HMM:

◊p 0,02). Tulokset on esitetty paneelien C ja D edustavat 3 kokeissa. Paneeleissa A, B ja E tulokset edustavat keskiarvoa ± SD 3 kokeen.

mukaan hyper-aktiivinen Mev reitti, MDR + HT29-dx ja HMM-solut osoittivat korkeampia FPP (kuvio 2B , vasen paneeli) ja GGPP (kuvio 2B, oikea paneeli) synteesi kuin MDR- HT29. Sekä MDR- ja MDR + soluilla oli havaittavia määriä isoprenylated, membraaniin sitoutuneen Ras ja ei-isoprenylated, sytosolin Ras, vaikka edelliset oli pitkälti hallitseva MDR + -solujen seurauksena lisääntynyt FPP tarjonnan suosivat Ras isoprenylation (kuvio 2C, vasen paneeli ). Kalvoon sitoutuneen ja soluliman RhoA osoitti myös samanlainen kuvio MDR + HT29-dx ja HMM

vs

MDR- HT29 seurauksena lisääntyneestä GGPP tuotanto ja RhoA isoprenylation (kuvio 2C, oikea paneeli).

yli membraaniin sitoutuneen Ras ja RhoA tuloksena lisääntynyt aktiivisuus vastaavan loppupään signalointireittejä: solunsisäisiä tasoja GTP: hen sitoutuneen Ras (kuvio 2D), joka on markkeri Ras aktivaation, ja ERK1 /2-fosforylaation (kuvio 2D ), samoin kuin määrät GTP-sitoutuneen RhoA (kuvio 2E), ja aktiivisuus RhoA kinaasin (kuvio 2E) olivat korkeampia MDR + HT29-dx ja HMM soluja kuin MDR- HT29.

ZA hoidon kumottu erot MDR- ja MDR + soluja. Estämällä FPP ja GGPP synteesiä (kuvio 2B), ZA laski määrät membraaniin sitoutuneen Ras ja RhoA (kuvio 2C), solunsisäinen Ras-GTP ja RhoA-GTP sisältö, ja aktiivisuus niiden alavirran signalointireittien (kuvio 2D-E ). Nämä vaikutukset olivat selvempiä MDR + HT29-dx ja HMM soluja kuin MDR- HT29 niiden Mev signalointia.

ZA pienenee Pgp ilmentymistä vähentämällä HIF-1α aktivointi Ras /ERK1 /2- ja RhoA /Rho-kinaasi downregulation

HIF-1α, master säätelijä useiden geenien kuten

MDR1

[29], voi tulla konstitutiivisesti aktivoitua jopa normoxic olosuhteille Serin fosforylaatio RhoA kinaasin [30 ] ja MAP-kinaasien [31]. Fosforyloitua (pHIF-1α) ja ei-fosforyloitua HIF-1α olivat havaittavissa Western blot MDR- HT29, kun taas sekä pHIF-1α ja HIF-1α ilmaistiin MDR + HT29-dx ja HMM soluja (kuvio 3A). HIF-1α oli kopioinnin suhteen aktiivisia MDR + soluissa, mikä näkyy huomattavasti korkeammat ydinvoiman HIF-1 sidottu erityisten DNA kohdesekvenssiin (kuvio 3B). ZA ollut vaikutusta MDR- soluihin, kun se vähensi pHIF-1α ja alensi koko HIF-1α tasot ja aktiivisuuden MDR + soluissa (kuvio 3A-B).

. Detection of fosforyloitua (pHIF-1α) ja yhteensä HIF-1α in MDR- HT29, ja MDR + HT29-dx ja HMM soluja jälkeen 48 tunnin inkubaation ilman (CTRL) tai 1 umol /l ZA (ZA). B. HIF-1-aktiivisuus oli suurempi (* p 0,001) MDR + HT29-dx ja HMM soluja kuin HT29. Sen jälkeen ZA hoito (kuten raportoitu A), huomattavasti pienempään HIF-1 aktiivisuutta havaittiin HT29-dx (° p 0,001) ja HMM-solut (

◊p 0,001). C. Kromatiini immunosaostus HIF-1α on

MDR1

promoottorin MDR- ja MDR + soluja, käsitellään raportoitu.

pro MDR1

: PCR-tuotetta immunosaostettiin näytteistä.

Input

: PCR-tuotetta ei immunosaostettiin näytteistä (genomista DNA: ta).

ei Ab

: näytteitä inkuboitiin ilman anti-HIF-1α-vasta. ”-”: Tyhjä. D. Western blotting havaitseminen Pgp käsitellyissä soluissa, kuten on kuvattu AE Solunsisäinen doksorubisiini mitattiin spectrofluorimetrically: merkittävästi pienemmillä pitoisuuksilla havaittiin HT29-dx ja HMM

vs

HT29 (* p 0,002), merkittävästi suuremmat pitoisuudet ZA-käsitellyissä soluissa

vs

käsittelemätöntä (CTRL) vastineet (HT29-dx: ° p 0,02; HMM:

◊p 0,02). Tulokset on esitetty paneelien A, C ja D edustavat 3 kokeissa. Paneelien B ja E palkit edustavat keskiarvoa ± SD 3 itsenäisen kokeen.

HIF-1α oli olennaisesti sidottu hypoksiavaste elementti

MDR1

promoottori MDR + soluissa HT29-dx ja HMM-soluja, mutta ei MDR- HT29 (kuvio 3C). Tämä selittää, miksi ilmentymisen Pgp-proteiini oli havaittavissa vain MDR + -soluista (kuvio 3D) ja miksi nämä solut osoittivat merkitsevästi pienempi Dox retention kuin MDR- solujen (kuvio 3E).

ZA hoitoon tehokkaasti kumottu HIF-1α ta sitovaa että

MDR1

promoottori (kuvio 3C) ja Pgp lauseke (kuva 3D) ja lisäsi merkittävästi solunsisäisiä Dox tasoilla MDR + HT29-dx ja HMM soluja, jotka tulivat verrattavissa havaittiin MDR- HT29 ( Kuvio 3E). Solunsisäiset Dox kertyminen MDR + soluissa oli merkittävästi lisääntynyt, kun ZA annettiin ennen Dox, mutta kumpikaan

päinvastoin

, eikä silloin, kun kahta lääkettä käytettiin yhdessä (kuva S1).

lisänäyttöä että ZA aiheuttama Pgp alassäätöä in MDR + soluissa oli riippuvainen pHIF-1α tukahduttaminen kautta ERK1 /2 ja RhoA kinaasi esto, side-by-side kokeet suoritettiin spesifisten estäjien ERK1 /2 kinaasien (PD98059) , RhoA kinaasi (Y27632) ja HIF-1 (YC-1). MDR + HMM solujen nämä inhibiittorit osoitti samat vaikutukset ZA kannalta pHIF-1α tasot (kuvio 4A), HIF-1 transkriptionaalista aktiivisuutta (kuvio 4B), P-gp ilmentymistä (kuvio 4C), ja Dox säilyttäminen (kuvio 4D).

. Fosfo (Ser) -HIF-1α (pHIF-1α) ja yhteensä HIF-1α ilmentymisen HMM soluissa hoitamattomana (CTRL) tai käsiteltiin 24 tunnin ajan 10 mikromol /l kanssa ERK1 /2-inhibiittori PD98059 (PD), RhoA estäjä Y27632 (Y27), HIF, 1α estäjä YC-1 (YC), ja 1 umol /l ZA 48 tuntia. GAPDH tiedot esitetään vahvistamaan vastaavaa kaistaa kohti proteiinia lastaus. B. HIF-1 aktiivisuutta HMM soluissa hoitamattomana (CTRL) tai käsitelty raportoitu paneelissa A. Kaikki erot käsitellään

vs

käsittelemättömät solut ovat tilastollisesti merkitsevä (* p 0,01).