Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Proteiini ja vasta-paneelit ovat nousseet lupaava teknologia tutkia proteiinin ilmentymisen ja proteiinin funktion suurikapasiteettisten tavalla. Nämä paneelit edustavat myös uuden mahdollisuuden profiloida proteiinin ekspressiotasot syöpäpotilailla näytteitä ja tunnistaa hyödyllinen biosignatures kliiniseen diagnoosiin, tautiluokituksen, ennustaminen, lääkekehityksen ja potilaiden hoitoa. Käytimme vasta-paneelit löytää paneeli proteiineja, jotka voivat toimia biomarkkereina erottamaan munasarjasyöpäpotilaalle ja normaalit kontrollit.

Menetelmät /Principal Havainnot

Käyttäen tapauskontrollitutkimuksessa suunnittelu 34 munasarjasyöpä potilasta ja 53 ikä-haun terveillä verrokeilla, me profiloitu ekspressiotasot 174 proteiineja käyttäen vasta array teknologiaa ja määritetään ca125 tasolla käyttäen ELISA. Ilmaisu tasot proteiinit analysoitiin 3 diskriminantti menetelmiä, kuten keinotekoinen neuroverkko, luokittelu puu ja split-pisteen pisteet analyysi. Paneeli 5 seerumin proteiinimarkkereita (MSP-alfa, TIMP-4, PDGF-R alfa, ja OPG ja CA125) tunnistettiin, jotka voivat käytännössä havaita munasarjasyöpää suurella spesifisyydellä (95%) ja korkea herkkyys (100%), AUC = 0,98, kun taas CA125 yksin oli AUC 0,87.

Johtopäätökset /merkitys

pilottitutkimus on osoittanut lupaavia sarja 5 seerumimarkkereiden munasarjasyöpään havaitsemiseen.

Citation: Jiang W, Huang R, Duan C, Fu L, Xi Y, Yang Y, et ai. (2013) Identification of Five Serum Protein tussit havaitseminen munasarjasyövän Vasta Arrays. PLoS ONE 8 (10): e76795. doi: 10,1371 /journal.pone.0076795

Toimittaja: Rakesh K. Srivastava, University of Kansas Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 28 elokuu 2013; Julkaistu: 08 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Jiang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ oli osittain tuettu RayBiotech biomarkkereiden Discovery Pilot Grant. Tekijät haluavat ilmaista kiitos tuesta johtava tutkija hankkeen Guangzhou taloudellisen kehityksen alueella (2009L-P180); Ohjelma sadan johtavien innovaattoreiden ja yrittäjät (LCY201111); Guangdongin innovatiivinen tutkimusryhmä ohjelma (201001s0104659419), ja tutkimus avustusta Guangzhou taloudellisen kehityksen alueella (2010Q-P450). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Weidong Jiang, Ruochun Huang ja Ruo-Pan Huang ovat työntekijöitä RayBiotech, Inc. , joka kehittää ja kaupallistaa proteiinijärjestelmäksi teknologioita ja tuotteita. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Munasarjasyöpä edustaa kolmanneksi yleisin syöpä ja se on yksi johtavista syistä syövän kuolinsyy naisilla Yhdysvalloissa ja Euroopassa [1-3]. Useimmat oireet munasarjasyöpä ovat epämääräisiä ja samanlaisia ​​kuin usein kokenut yleisempiä, ei-hengenvaarallisia terveyttä; nämä saattavat sisältää vatsan turvotus tai turvotus, lantion kipua tai epämukavuutta, alaselän kipu, ruokahaluttomuus tai tunnetta täynnä nopeasti, pysyviä ruoansulatushäiriöt, kaasu- tai pahoinvointia ja muutoksia suolen tai virtsarakon tottumuksia. Tämän seurauksena lähes 80% munasarjasyövän potilailla diagnosoidaan myöhemmissä vaiheissa. Valitettavasti 5 vuoden pysyvyys potilailla, joilla on kliinisesti kehittynyt munasarjasyöpä on vain 15%: sta 20%, silmiinpistävä vastakohta 5 vuoden pysyvyys yli 90% potilailla, joilla on vaiheen I tauti. Siksi on kiireellistä löytää ja kehittää biomarkkereita munasarjasyöpä seulonnan ja varhaisen havaitsemisen.

Tällä hetkellä CA-125 ja kuvantaminen ovat 2 yleisimpiä lähestymistapoja munasarjasyövän Syöpäseulontakokeille. Nämä 2 markkereita, joita käytetään joko yksinään tai yhdistelmänä, jotka eivät ole hyödyllisiä seulontaan tai diagnostisiin tarkoituksiin alhaisen spesifisyyden ja /tai herkkyys. Esimerkiksi seerumin CA-125 on osoitettu olevan herkkyyden 98%, mutta spesifisyys vain 50-60% alkuvaiheen tauti [4-6].

Useita tutkimuksia on raportoitu tunnistamaan seerumin munasarjasyöpään biomarkkereiden avulla multiplex-vasta array tekniikka [7-9]. Dr. Lokshin ryhmä tunnistetaan ryhmä 6 seerumin proteiinin markkereita, mukaan lukien interleukiini-6 (IL-6), interleukiini-8 (IL-8), epidermaalinen kasvutekijä (EGF), verisuonen endoteelin kasvutekijä (VEGF), monosyyttien kemoattraktantti proteiini -1 (MCP-1), ja CA-125, joka näkyy merkittävää eroa seerumin pitoisuuksien välillä munasarjasyöpä ja kontrolliryhmiin 84% herkkyys 95% tarkkuus [7]. Tohtori Gil Mor ryhmä tunnistettu paneeli 6 biomarkkereiden, CA-125, osteopontiinissa (OPN), insuliinin kaltainen kasvutekijä 2 (IGF-II), makrofagien migraatiota estävä tekijä (MIF), leptiini ja prolaktiini, joka osoitti herkkyys 95,3 % ja spesifisyys 99,4% havaitsemiseksi munasarjasyöpä [8]. Käyttäen ihmisen biotiini-pohjainen vasta-paneelit, me seulotaan seerumissa ilmaisun profiilit 507 proteiinien seeruminäytteistä 47 Munasarjasyöpäpotilaiden syöpiä, 33, joilla on hyvänlaatuinen munasarjojen massat ja 39 tervettä, samanikäisiin valvontaa ja tunnistettu merkittäviä eroja proteiiniekspressiossa normaalin tarkastukset ja munasarjasyöpäpotilaalle (

P

0,05). Luokittelemalla analyysi ja split-pisteen pisteet analyysin näistä 2 ryhmää, 6-markkeripaneelin proteiinien, joka koostui interleukiini-2-reseptorin alfa (IL2Rα), endoteliini, osteoprotegeriini (OPG), verisuonen endoteelin kasvutekijä D (VEGF-D ) ja beetaselluliinille (BTC), voidaan käyttää erottamaan munasarjasyöpä potilaat normaaleista kohteista [9]. Nämä tutkimukset viittaavat vahvasti siihen, että vasta-array tekniikka on osoittanut erittäin lupaavilta löytämiseen ja kehittämiseen seerumin munasarjasyöpä biomarkkereiden profiilit ja viittaavat vahvasti siihen, että seerumin sytokiini paneelit voivat olla käyttökelpoisia biomarkkereita varhaista havaitsemista munasarjojen syöpien.

Tässä tutkimuksessa, käytimme 174-merkki, sandwich-ELISA-pohjainen vasta-array paneelit seulomaan seeruminäytteistä 34 munasarjasyöpä potilasta ja 53 terveillä vapaaehtoisilla tunnistamiseksi seerumin proteiini markkeripaneelin havaitsemiseksi munasarjasyöpä.

tulokset

validointi 174-markkeri puolikvantitatiivinen sytokiini paneelit (kuviot 1, 2) B

paneeli A (vasen) osoittaa vahvaa määrityksen sisäinen korrelaatio (samasta näytteestä testattiin samalla lasilevyllä , testattiin samana päivänä); Paneeli B (keskellä) osoittaa vahvaa määritysten välinen korrelaatio (samasta näytteestä analysoitiin eri lasilevyille, testattiin eri päivinä); Paneeli C (oikealla) osoittaa huonoa korrelaatio syövän ja normaalin näytteet analysoitiin samalla lasilevyille testattu samana päivänä.

paneeli A (vasen) esitetään edustavat fluoresoiva signaali kuvia array G6; Paneeli B (keskimmäinen) esitetään edustavat fluoresoiva signaali kuvia array G7; Paneeli C (oikea) esitetään edustavat fluoresoiva signaali kuvia array G8.

Tässä tutkimuksessa käytimme vasta-array tekniikka määrittää ilmaisun profiilit 174 sytokiinien seerumi munasarjasyöpä potilaiden ja iän terveisiin normaalia valvontaa. Sytokiinit tässä tutkimuksessa olivat anti-inflammatoristen sytokiinien, proinflammatoristen sytokiinien, kasvutekijöiden, angiogeenisten tekijöiden tai kemotaktisia sytokiineja, muun muassa. Jotkut näistä sytokiinien kuulemma muutellaan munasarjasyöpä potilaiden omasta tutkimuksia ja kirjallisuutta, mutta meidän laaja näyttö 174 proteiinien myös monia muita markkereita osana ”puolueeton” lähestymistapaa, jossa käytetään korkea-pitoisuus, korkea suoritusteho sytokiini vasta-taulukot profiloida sytokiinien tasoja munasarjasyöpä potilaiden seerumista, jonka tavoitteena on tunnistaa mahdolliset diagnostisten biomarkkereita.

Ensinnäkin määritettiin edelleen toistettavuus määrityksen analyysissä ihmisen seerumin käyttäen sirontakuviona analyysi. Sisäinen dia toistettavuutta varten lasi-slide-pohjainen paneelit arvioitiin testaamalla jäljitellä alikvootteja saman näytteen kahdella aliryhmään tulostetaan samalle dia ja määritettiin samanaikaisesti. Välinen dia toistettavuus määritettiin käyttäen kahta erilaista dioja tulostetaan samalla paneelit testattiin käyttämällä kahtena alikvootteja saman näytteen kahtena eri päivänä. Pearsonin korrelaatiokertoimet sisäiseen slide välisen ja slide toistettavuus olivat 0,923 (

P

0,001) ja 0,899 (

P

0,001) ja viittasivat siihen, korkea toistettavuus määritystä. Sen sijaan, Pearsonin korrelaatiokerroin syövän vs. normaali näytteet olivat 0,226 (

P

0,005), mikä viittaa siihen, että syövän näytteet ja normaalit näytteet ovat kahden eri populaatioissa.

Seuraavaksi seerumia yhteensä 34 munasarjasyöpä potilasta ja 53 tervettä verrokkia määritettiin ekspressiotasot 174 sytokiinien, jonka tavoitteena on löytää uusia diagnostisia merkkiaineita munasarjasyöpä. Nämä seeruminäytteet pääosin saatu yhteistyökumppaneillemme ja olivat iän ja sukupuolen sovitettu (taulukko 1). Ihmisen Sytokiini Vasta Array käytettiin profiloida ilmaisua kaavoja 174 sytokiinien kaikkien 87 potilaan seeruminäytteistä. Signaali-intensiteetti on verrannollinen ekspressiotason yksittäisen proteiinin kussakin näytteessä. Array tiedot sen jälkeen normalisoidaan keskiarvon perusteella positiivisen ohjaussignaalin voimakkuuden kunkin matriisin. Mediaani signaali voimakkuudet jokaisesta paikalla korjattiin sitten paikallisen taustan. Luoda signaalin kynnyksen, signaalin voimakkuus cut-off-arvo määritettiin +/- 2 SD 10 puskuria tyhjä ohjaussignaalin intensiteettiä, jossa paneelit olivat inkuboidaan estopuskurilla sijaan potilaan seeruminäytteistä. Mikä tahansa arvo ylittää signaalin kynnyksen katsottiin todellisia signaaleja (eli positiivinen havaitseminen sytokiini). Arvot alempi kuin signaalin leikkaamista oli annetaan arvo 1. Jos mitatun signaalin voimakkuuden arvoja kaikista näytteistä tietyn sytokiinin olivat 1, nämä sytokiinit poistettiin luettelosta tarkempaa analysointia.

Munasarjasyöpä

Terve Ohjaus

kokonaismäärä

3453Mean Age61.751.2Median Age6656.2Age Range26-7928-79

Syöpä Characteristis

Histologia

seroosit Adenoocarcinoma29Mucous Adenocarcinoma4Germline tumor1

Stage

Stage I4Stage II3Stage III IV25NA2Table 1. Tutkimuskanta ominaisuudet.

CSV Lataa CSV

tunnistaminen seerumin proteiinimarkkereita keinotekoisella neuroverkon analyysi (kuva 3) B

3a. Keinotekoinen neuroverkko analyysi 174-markkeri-vasta array tuloksia verrataan munasarjasyöpiä ja terveillä verrokeilla. Näytteet edustavat sekä harjoitussarjassa ja ennustaminen asettaa on kuvattu kaaviossa.

3b. Top 8 markkereita kanssa suurin vaikutus keinotekoisen neuroverkon analyysi 174-markkeri-vasta taulukot munasarjojen syöpien ja terveillä verrokeilla esittelyyn.

jälkeen normalisointi ja suodatuksen, tiedot alistettiin sitten keinotekoinen hermostoputken verkko (ANN) analyysi. Signaalin voimakkuus tietoja yksittäisille potilaille jaettiin satunnaisesti harjoitussarjassa (N = 51) tai ennustaminen setti (N = 36). Vuonna ennustaminen löytö vaiheessa opetusjoukolla analysoitiin käyttäen jätettävää yhtä ristivalidointi lähestymistapaa. Tämän analyysin yhteensä 8 ennustavat tunnistettiin. Nämä 8 ennustajia käytettiin sitten ennustaa tautitilannetta ennustus asetettu. Oikea sopimus ennustaa taudin tilan käyttämällä 8-merkki paneeli kliininen diagnoosi koulutuksessa asettaa ja ennustaminen setti oli 82% ja 80% vastaavasti.

tunnistaminen 5-markkeripaneelin havaitsemiseksi munasarjasyöpä (kuviot 4 ja 5)

paneeli A (ylhäällä vasemmalla): Dot histogrammi tontilla 5-analyytin split-pisteen pisteet luokitus seerumeista terveistä ohjaus (N) ja munasarjasyöpä (CA). Luokiteltu oikein normaali seeruminäytteet tulisi olla pisteet 0-2, kun taas näytteet munasarjasyöpä potilaille pisteet 3-5; Paneeli B (ylhäällä oikealla): ROC käyrä 5-merkki paneeli split-pisteet analyysi munasarjasyövän vs. terveiden verrokkien. ROC on käyrä piirrettiin herkkyyden (tosi positiivinen) vastaan ​​1-spesifisyys (väärä positiivinen) arvot; Paneeli C (alhaalla oikealla): Taulukko käyttäen viiden markkerin split-pisteen pisteet luokitella munasarjasyöpä potilaille. Cut-off pisteet 3 käytettiin.

Seuraavaksi näistä 8 markkereita, päätimme 4, makrofagien stimuloiva proteiini alfa (MSP-alfa), kudoksen estäjä metalloproteinaasien-4 (TIMP-4 ), verihiutaleperäisen kasvutekijän reseptori alfaa (PDGF-R-alfa), ja osteoprotegeriini (OPG), ja hierarkkinen klusterianalyysi SPSS-ohjelmistolla. Käyttäen 4-markkeripaneeli yli 83% näytteistä tunnistettiin oikein (95% terveiden kontrollien ja 62% munasarjasyövistä).

Lopuksi kaikki 87 näytettä analysoitiin edellä tunnistetut 4 seerumimarkkereiden plus CA125 käyttämällä split-pisteellä analyysi. Käyttäen cutoff pisteet 3, 100% munasarjasyövän ja 95% terveillä verrokeilla näytteistä tunnistettiin oikein, jolloin koko oikea sopimus 96,6%.

Koska CA125 on yleisimmin käytetty merkkiaine munasarjasyöpä, vertasimme AUC välinen ca125 yksin että meidän 5-merkki paneeli, määritettynä ROC käyrät. CA125 yksin on AUC 0,87. Toisaalta on hiljattain tunnistettu 5-merkki paneeli on AUC 0,98. Siten Pilottitutkimuksemme on tunnistettu joukko lupaavia 5 seerumimarkkereiden varhaista havaitsemista munasarjasyöpä.

validointi 5-markkeripaneelin havaitsemiseksi munasarjasyövän kanssa ELISA-määritystä (kuva 6) B

tasot kaksi proteiinimarkkereita (MSP-alfa ja TIMP-4) tunnistaa näiden ilmentyy differentiaalisesti munasarjasyöpä näytteitä vasta-paneelit vahvistettiin ELISA. Vasta-array tiedot olivat täysin yhtäpitävä ELISA datan luokittelussa seerumeista munasarjasyöpä potilaiden ja terveiden verrokkien. Vasta-aine array tiedot näkyvät mediaani array signaalin intensiteettiä (FI), ja ELISA tiedot näytetään keskimääräisenä proteiinipitoisuus (ng /ml).

Vahvista multiplex havaitsemiseen array data, suoritimme yhden kohde-ELISA-määrityksissä mitata kvantitatiivisesti ilmentymisen näiden sytokiinien tasot erikseen ja näitä tuloksia verrattiin ryhmän tietoja. Suhteellinen ekspressiotasot proteiinien mitataan array ja ELISA olivat samanlaiset (katso kuvio 6). Kaikki 4 markkereita (MSP-alfa, TIMP-4, PDGF-R alfa, ja OPG) tunnistetaan ANN analyysi ja split-pisteen pisteet analyysi varmistettiin ELISA. Kuvio 6 esittää edustavia tietoja kaksi näistä merkeistä, MSP-α ja TIMP-4.

Keskustelu

CA125 on yksi tärkeimmistä biomarkkereita munasarjasyöpä. Sitä käytetään usein tehokkaasti valvontaan hoitovasteen ja havaita toistumisen munasarjasyöpä. Kuitenkin CA125 ei yksin käyttökelpoinen diagnostinen markkeri kliiniseen käyttöön Vähäisen spesifisyys; viittauksella sulku arvo on 35 IU /ml, CA125 osoitti rajoitettu spesifisyys 50-60% kanssa herkkyys 98% alkuvaiheen tauti [4-6]. Korkeus CA125 on havaittavissa noin 0,2-5,9%: terveen naisen ja 2,2-27,8% potilailla, joilla on hyvänlaatuinen munasarjojen sairaudet [10]. Korkeus CA125 havaittiin vain 50% vaiheen I munasarjasyöpä potilaiden ja nousi 90% tai yli vaiheessa III ja IV munasarjasyöpä potilaille [11].

monimutkaisuuden vuoksi ja heterogeenisyys munasarjasyöpä, on epätodennäköistä, että yksittäinen biomarkkereiden pystyy havaitsemaan kaikki alalajit ja vaiheissa tauti on korkea spesifisyys ja herkkyys. Etsimällä kirjallisuudesta ja muista lähteistä, Drs. Polanski ja Anderson on koota luettelo 1261 proteiinien uskotaan ekspressoitua eri ihmisen syövässä [12]. Niistä 260 ehdokas biomarkkerit pidetään ”korkean prioriteetin”, koska ne ovat sekaantuneet mahdollisina syövän markkereita useita julkaisuja kirjallisuudessa ja koska useimmat niistä on raportoitu olevan havaittavissa seerumista tai plasmasta. Olemme mukana monet näistä biomarkkereita meidän vasta-aineisiin perustuvia biomarkkereiden seulonta.

Sytokiinit ovat monipuolinen ryhmä käsittäviä proteiineja sytokiinien, kemokiinien, kasvutekijät, interferonit, adipokines ja lymfokiinien ja toistaa monia kriittisiä rooleja fysiologisten ja patologisten prosesseja. On myös hyvin tunnettua, että sytokiinien, kemokiinien, kasvutekijät, angiogeneesitekijät, proteaasit, apoptoottisten tekijöiden, reseptorien, adheesiomolekyylien ja adipokines tärkeä rooli syövän kehittymisessä, etenemisen ja etäpesäkkeiden. Kasvava näyttö viittaa siihen, että monimutkainen sytokiini verkko on mukana munasarjasyöpä. Useita autokriinisiä ja parakriinisiä sytokiinin silmukat on tunnistettu munasarjasyövän ja vaikuttaa biologian tämän kasvain. Havaitseminen ilmentymismalleja useiden sytokiinien voi tarjota uusia oivalluksia syöpäbiologian, tunnistaa uusia molekyylikohteista syövän hoitoon ja löytää uusia biomarkkereita diagnoosin ja ennusteen sairaus [13,14].

Tässä tutkimuksessa olemme osoitti tehokkuutta seulonta semikvantitatiivinen, sandwich-pohjainen vasta-aineen array havaitaan paneeli 174 markkereita seerumissa 34 munasarjasyöpä potilaiden ja 53 samanikäisiin terveisiin kontrolleihin tunnistaa paneelin 5 seerumin proteiinin markkereita, mukaan lukien CA125, että voidaan tehokkaasti havaita munasarjasyöpää suurella spesifisyydellä (95%) ja korkea herkkyys (100%) ja AUC 0,98. Nämä merkkiaineet validoitu ELISA-määrityksen.

Havaitsimme, että CA125 yksin on AUC 0,87, toisaalta on hiljattain tunnistettu 5-merkki paneeli on AUC 0,98, mikä osoittaa tehostumisen kun havaitseminen CA125 yhdistetään muihin 4 mahdollinen proteiinin biomarkkereita havaitsemista varten munasarjasyöpä (TIMP-4, OPG, PDGF-R alfa, ja MSP-alfa).

TIMP-4 kuuluu matriisimetalloproteinaasi (MMP) Yläheimo. MMP ovat keskeisiä tekijöitä extraceullular matriisiin (ECM) hajoaminen, mukaan lukien luovuttamista koskevat ECM-sitoutuneen sytokiinien ja kasvutekijöiden, joka johtaa angiogeneesi, solu invaasio ja lopulta monissa syövissä, etäpesäke. Nämä MMP niitä valvotaan ja säätelevät useat TIMP, joista useat näyttävät ratkaiseva rooli kasvainten synnyssä. Chegini Lab on raportoitu kohonnut ilmentyminen TIMP-4 munasarjasyövän kudoksissa IHC analyysin, joka osoittaa sen mahdollisen roolin kasvainten synnyssä munasarjasyövän [15].

OPG kuuluu TNF-superperheen ja voivat olla sidoksissa tumatekijä kappa-kevyen ketjun tehostaja aktivoitujen B-solujen (NFKB) ja tuumorinekroositekijä-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) signalointireittejä. OPG ensin tunnistetaan sen kyky säädellä homeostaasiin luun. Kuitenkin Piche Lab kertoi, että OPG voi toimia sellaisenaan eloonjäämistekijänä suojaamalla TRAIL aiheuttama apoptoosin munasarjasyöpäsoluja, mikä osoittaa sen mahdollisen roolin kehittymistä ja etenemistä munasarjasyövän [16].

PDGF-R alfa on reseptorin PDGF Yläheimo. Toimiminen angiogeenisten kasvutekijöiden, PDGF olla tärkeä rooli solujen kasvuun, kemotaksista, angiogeneesiä ja yhteydessä syövän, jälleenrakentaminen kasvain strooman mikroympäristöihin. Jakobsen Lab kertoi, että PDGF-R alfa osoittivat korkeampia ilmentymistä munasarjasyövän kudoksissa verrattuna viereisten normaaleissa kudoksissa [17]. On myös raportoitu, että PDGF-R alfa ilmentyy useammin vakavien karsinoomia kuin endometriod ja mucinous kasvaimissa [18], joka on sopusoinnussa havaintojen meidän tutkimus, jossa suurin osa kasvaimista testattu (29 34) olivat serous .

MSP on kasvutekijä mukana aktivoimaan makrofaagien stimuloivan reseptori-1 (MSTR1). Alfa-ketjun MSP (MSP-alfa) erittyy lohkaisemalla pro-MSP. On raportoitu osoittavat, että MSP-reitin tärkeä rooli tuumorimetastaasissa [19].

Yhteenvetona käyttäen 174-markkeri sytokiinin vasta-array tekniikka tunnistimme paneeli 5 seerumin proteiinimarkkereita joka voi havaita munasarjojen syöpä, jolla on suuri spesifisyys ja herkkyys, joka osoittaa sen lupaava sovellus henkilökohtaisen lääketieteen munasarjasyöpää havaitsemiseen. Lisäksi, kun otetaan huomioon, että suhteellisen pieni otoskoko (N 100) käytettiin tässä tutkimuksessa saavutettiin erittäin suuri herkkyys (100%) ja suhteellisen korkea spesifisyys (95%), tarjoamme toivoa, että validointi usean biomarkkereiden paneeli voi joskus olla hyödyllistä seulomiseksi tappava syöpä, joka harvoin saa diagnosoitu sen alkuvaiheessa.

proteiini ja vasta-paneelit ovat nousseet lupaava teknologia tutkia proteiinin ilmentymisen ja proteiinin funktion suurikapasiteettisten tavalla. Nämä proteiini ja vasta-paneelit esittää uuden mahdollisuuden profiloida proteiinin ekspressiotasot syöpäpotilailla näytteitä ja tunnistaa hyödyllinen biosignatures lääkekehityksen ja potilaiden hoitoa. Meidän 5-merkki paneeli voisi tehokkaasti erottaa munasarjasyöpiä peräisin terveiden verrokkien Nämä 5 yksittäisiä markkereita eivät ole ainutlaatuinen munasarjasyöpiä, mistä on osoituksena niiden ilmentymistä muissa syöpätyyppejä, kuten rintasyöpiä [18-22], keuhkosyövässä [23], peräsuolen syövät [24], eturauhasen syöpien [25,26], maksasolukarsinoomat [27], haiman syövät [28], jne. Siksi on erittäin tärkeää ja mielenkiintoista tutkia, onko tämä yhdistelmä 5-merkkiaineita voidaan havaita muita syöpätyyppejä yhtä hyvin. Kaksi tärkeimmistä osista biomarkkereiden löytö ohjelmassa ovat laadukkaita potilaiden näytteitä ja korkea-sisällön seulonta ja suurikapasiteettisia tekniikoita. Siksi yhdistelmä osoittautunut vasta-aineisiin perustuva tunnistus teknologiaa ja alustoja meiltä ja hyvin tunnettu pre-diagnostisia näytteitä PLCO National Cancer Institute (NCI) tarjoavat ainutlaatuisen tilaisuuden biomarkkereiden löytö ja validointi [29,30]. Tällaiset tutkimukset ole ainoastaan ​​vahvistaa erityisiä biomarkkereiden paneelin tunnistettu tässä tutkimuksessa; ne auttavat validoimaan vasta-joukoissa, kuten korkean throuput lähestymistapa tunnistaa syöpään biomarkkereita seulonta ja tunnistus.

Materiaalit ja menetelmät

Tämä protokolla on hyväksytty puntaa Institutional Review aluksella. IRB ID: 3303. Tarkastelussa hallitus on Sterling riippumaton palvelu, Inc sijaitsee 6300 Powers Ferry Road, Suite 600-351, Atlanta, GA 30339. kirjallinen suostumus saatiin kun näytteitä sekä potilaiden ja terveiden verrokkien.

Eettinen linjaus

Kirjallinen lupa saatiin, kun näytteitä sekä potilaiden ja terveiden verrokkien.

näytteiden kerääminen

seeruminäytteistä 34 potilasta diagnosoitu varhaisvaiheen (I ja II) tai myöhäisen vaiheen (III ja IV) munasarjojen syöpiä ja 53 ikä-haun terveillä verrokeilla mukana tutkimuksessa kerättiin sidoksissa sairaalassa, Sun Yat-sen University. Lyhyesti, noin 2 ml laskimoverta otettiin verta potilailla. Seerumi kerättiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes niitä tarvitaan. Tietoa munasarjasyöpä diagnosointiin, lavastus, histologia, laatu ja ikä oli käytettävissämme, mutta ainutlaatuinen potilas tunnisteet, kuten nimi, osoite, syntymäaika, ei toimitettu.

Vasta array tekniikka

Semikvantitatiivisilla sandwich-pohjainen vasta-paneelit (RayBio

® Human Sytokiini Array G-sarjan 2000) kehitettiin 3 eri paneelit (Human Sytokiini Arrays G6, G7 ja G8), joista kukin edustaa ainutlaatuisia 54 60-antigeeni-spesifisten vasta-aineiden havaitsemiseksi yhteensä 174 seerumimarkkereiden lasilevyllä matriisi. Pari vasta tarvitaan ilmaisemaan jokaisen analyytin. Lasiliuskat painettiin 4 tai 8 identtistä aliryhmään koostuvat paikoista kunkin antigeenispesifisen apture vasta-ainetta, joka array. Vastaava tunnistus vasta-aineet olivat biotiinileimattua ja yhdistää yhdeksi cocktail reagenssin myöhempää käyttöä varten. Painetut levyt sijoitettiin kammioon kokoonpanot mahdollistamiseksi inkubointia jokaisen aliryhmän eri näytteen. Blokkauksen jälkeen jokaisen aliryhmän salpauspuskurilla, sub-matriisia inkuboitiin seeruminäytteiden. Perusteellisen pesun jälkeen poistamaan ei-spesifinen sitoutuminen, cocktail biotinyloidun havaitsemisen vasta-aineita lisättiin taulukot. Perusteellisen pesemisen jälkeen array laseja inkuboitiin streptavidiini-konjugoitua fluori (HiLyte Fluor ™ 532, mistä AnaSpec, Fremont, CA). Fluoresoivia signaaleita visualisoitiin sitten käyttäen laser-pohjainen skanneri järjestelmä (GenePix 4200A, Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) käyttäen vihreä kanava. Voit lisätä tarkkuutta, kaksi rinnakkaista per vasta-nähtiin, ja keskiarvoja mediaani signaalin intensiteettiä sekä paikkoja (miinus paikallinen tausta vähennyslasku) käytettiin kaikissa laskelmissa. Näiden parannusten, voimme saada variaatiokerroin (CV) oli noin 10% käyttämällä lasilevyllä alustalla.

ELISA-analyysi

ELISA suoritettiin RayBio® ELISA käsikirja (RayBiotech Inc., Norcross, GA, USA). Lyhyesti, pre-päällystetty 96-kuoppaisia ​​ELISA-levyjä, joissa jää vasta-aineet ensin estetty salpauspuskurilla. Monista alikvootteja (100 mikrolitraa per kuoppa) laimennettua seerumia ja useita laimennoksia (eli pitoisuudet) standardia proteiinia ladattiin ELISA-levylle. Levyjä inkuboitiin sitten 2 tuntia huoneenlämmössä (RT). Sitoutumattomien materiaalien pestiin pois, ja biotinyloitua anti-sytokiini havaitsemisen vasta-ainetta lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyjä inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen 100 mikrolitraa streptavidiini-konjugoitua HRP-reagenssia lisättiin kuoppiin, ja levyä inkuboitiin 30 minuutin ajan RT: ssä. Perusteellisen pesemisen jälkeen värin kehittyminen suoritettiin inkuboimalla HRP-substraattia. Lisäämisen jälkeen keskitetyn ratkaisun, jonka optinen tiheys (OD) 450 nm: ssä määritettiin kullekin hyvin käyttäen mikrolevylukijaa, ja pitoisuudet näytteistä määritettiin vertaamalla standardin konsentraatiokäyrät.

Data-analyysi

muutetussa t-testiä käytettiin testaamaan merkityksen välillä proteiinin ekspressiotasot munasarjasyövän ja terve kontrollinäytteitä.

P

-arvot olivat alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.

määrittämiseksi signaalin kynnysarvon, signaalien taulukot mitattiin ilman näytteiden (käyttäen estopuskuria tyhjäksi) ja toistetaan 10 kertaa. Signaalit tuotetaan käyttämällä aihioita otettiin keskiarvo ja keskihajonta (SD) laskettiin. Signaalit arvojen keskiarvoa alhaisempi tyhjä signaali + 2 x SD pidettiin tausta.

Aineisto analysoitiin myös käyttämällä neuroverkon. Tämä tehokas työkalu mahdollistaa meille löytää yhteinen proteiinin ilmentymisen profiilit ennustaa syöpää. Ensimmäisessä vaiheessa tutkimuksessa, 80% näytteistä satunnaistettiin opetusjoukolla ja loput 20% näytteistä käytettiin koe asetettu. Etuna tässä lähestymistapa on menestys ennuste tulee tarkempi ajan mittaan, kun lisää tietoa on saatavilla.

Aineisto analysoitiin myös split-pisteellä analyysi. Jakopisteeseen jakaa otosavaruuden kahteen välein, toinen munasarjasyöpä ja toinen normaalia valvontaa. Paras split-pisteen pisteet kunkin merkin valittiin varmistaa minimoimista luokiteltu väärin näytteitä. Kunkin merkki, pisteet 0 on valittu otokseen, jos se putosi normaaliin säätelyyn välein, että merkki; pistemäärä 1 on valittu otokseen, jos se putosi munasarjasyöpä välein. Kaiken yksittäinen määrättiin pisteet summana näiden osoitettu pistemäärät

N

eri markkereita. Siksi erilaisia ​​tällaisten tilanne oli välillä 0

N

. Tietyn kynnyksen (

T

) valittiin optimaalisesti erillisiä munasarjasyöpään terveiltä hallintalaitteita, eli tietyn yksilön-pisteet

T

ennustetaan olevan normaali tila, kun taas yksittäinen -pisteet

T

oli diagnosoitu munasarjasyöpä.

edellä esitetyt tiedot, laskimme spesifisyys, herkkyys, positiivinen ennustearvo (PPV) ja negatiivinen ennustearvo (NPV) . ROC määritettiin myös.

Kiitokset

Kiitämme Brett Burkholder rakentavaan keskusteluun ja editointi tämän asiakirjan.