Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Solutonta DNA (cfDNA) kiertää koko verenkiertoon sekä terveillä ihmisillä ja potilailla, joilla on erilaisia ​​sairauksia ja suorittaa siihen soluihin. Vastauksena cfDNA riippuu pitoisuuksista ja tasot vahingon sisällä cfDNA. Hapetetaan ekstrasellulaarista DNA toimii stressin signaalin ja saa aikaan adaptiivisen vasteen.

Principal Ensimmäisen

Tässä osoitamme, että hapetettu ekstrasellulaarista DNA stimuloi selviytymisen MCF-7-syöpäsoluja. Tärkeää on, soluissa altistuvat hapetettu DNA, tukahduttaminen solukuolemaan liittyy lisääntyminen merkkiaineiden genomin epävakautta. Lyhytaikainen altistus hapettuneen DNA tuloksia yksin- tai kaksijuosteisen DNA taukoja. Pidemmät hoidot herättää korvaavia vastaus, joka johtaa lasku tasot kromatiinin sirpaloitumista poikki solupopulaatioiden. Altistuminen hapetetaan DNA johtaa lasku aktiivisuudessa Nrf2 ja lisätä aktiivisuutta NF-kB ja STAT3. Malli, joka kuvaa rooli hapettuneen DNA vapautettiin apoptoottisia soluja kasvaindiagnostiikassa ehdotetaan.

Johtopäätökset /merkitys

Survival solujen epävakaa genomin voi merkittävästi lisätä etenemistä pahanlaatuisuuteen. Lisätutkimukset vaikutuksista solunulkoisen DNA pahanlaatuiset ja normaalit solut ovat perusteltuja.

Citation: Kostyuk SV, Konkovaan MS, Ershova ES, Alekseeva AJ, Smirnova TD, Stukalov SV, et al. (2013) altistumisesta hapettuneen DNA lisätään sekä epävakaus Genome ja Survival syöpäsoluissa. PLoS ONE 8 (10): e77469. doi: 10,1371 /journal.pone.0077469

Editor: Roberto Amendola, ENEA, Italia

vastaanotettu: toukokuu 25, 2013; Hyväksytty: 03 syyskuu 2013; Julkaistu 17. lokakuuta 2013

Copyright: © 2013 Kostyuk et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat RFBR (12-04-32081; 12-04-32074), jonka sopimukset nro 14.512.11.0090 ja nro 8273 (alle puhelun nro 2012-1.1-12-000-2008-067) of opetus- ja tiedeministeri Venäjän ja JEFFRESS Foundation Grant No. J-1023. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Solutonta kiertävä DNA (cfDNA) fragmentteja voidaan kerätä plasmasta, seerumista tai muiden kehon nesteiden sekä terveiden ihmisten ja potilailla, joilla on erilaisia ​​sairauksia. Useimmiten vaikutukset cfDNA tutkitaan käyttämällä

in vitro

malleja solunulkoisen DNA (ecDNA), joka on eristetty solusta-free supernatanteista viljellyistä soluista [1], joko koskemattomia tai altistunut eri oksidatiivisen stressin.

Oksidatiivinen stressi tiedetään aiheuttavan solukuolemaa. Dying solut vapauttavat fragmentit hapettuneen DNA: n cfDNA allas. cfDNA kiertää koko kehon ja aiheuttaa toissijaisia, systeemisiä vaikutuksia kaukaisilla elimissä ja kudoksissa. cfDNA uutetaan verestä potilaiden plasmassa, joilla on korkea oksidatiivisen stressiä tiedetään vaikuttavan fysiologista aktiivisuutta koskemattomien solujen [1-6]. Vuonna mesenkymaaliset kantasolut (MSC: t), sekä ecDNA kerätään media primaarikasvaimen solujen viljelmissä ja cfDNA uutettiin plasmasta syöpäpotilaiden ovat vaikuttaneet ROS [5]. Fibroblasteissa, hapetetaan ecDNA herättää adaptiivisen vasteen, joka ilmentyy kasvu vastus käsiteltyjen solujen säteilytystä ja krooninen stressi aineet [7]. Itse asiassa, ecDNA fragmentit toimivat stressin signaalit sekä adaptiivisen vasteen ja sivullisten vaikutus, jotka kehittyvät vasteena pienen annoksen säteilytyksen monenlaisissa viljellyistä soluista [1,8-15].

Edellinen

in vitro

tutkimuksissa profiloitu eri vaikutuksia cfDNA /ecDNA viljellyissä primäärisiä soluja, mukaan lukien ihmisen endotheliocytes [2,3], mesenkymaaliset kantasolut (MSC: t) [5,6], lymfosyytit [8-10,12] ja fibroblastit [7] sekä rotan sydänlihassolujen [4] ja neuronien [16]. Ei kuitenkaan tutkimukset ovat tähän mennessä kuvattu vaikutukset ecDNA kasvainsoluihin huolimatta ilmeistä merkitystä tämän mallin hoito ihmisen maligniteettien, varsinkin siksi, että runsaasti julkaisi havainnot osoittavat kasvua cfDNA pitoisuudet verenkierrossa syöpäpotilaiden [17-25]. Syöpäsolut poikkeavat normaalista niitä sen kohonneeseen ROS; tasot hapetus kasvaimen DNA on myös suurempi kuin normaalissa kudoksessa. Itse asiassa sekä säteilytys ja kemoterapia johtaa hapettavaan syöttämällä suuri määrä kasvainsoluja, teoreettisesti, mikä massiivinen vapautumisen hapettuneen cfDNA.

Tässä tutkimuksessa kuvaamme vaikutuksia kasvaa ecDNA hapettumista ja ecDNA pitoisuudet eri ominaisuuksia estrogeenin (ER) ja progesteroni reseptorin (PR) rintasyöpä solujen MCF-7. Tässä osoitamme, että hapetettu ecDNA indusoi näissä soluissa oksidatiivisen stressin, että toisaalta, mukana on vika vakauden säilyttämiseksi genomin ja, toisaalta, johtaa kehitystä sopeutumisreaktio, joka edistää solujen eloonjäämistä .

Tulokset

pitoisuudet ecDNA media ehdollistettu ehjä MCF-7-soluja, keskimäärin 140 ± 20 ng /ml. Vaikutukset gDNA ja gDNA

OX arvioitiin jälkeen lisäämällä erilaisia ​​pitoisuuksia vastaavien DNA viljelyyn media. Ehjä gDNA uutettiin ensisijainen ihmisen alkion fibroblasteja (HEFs), kun taas gDNA

OX näytteet saatiin tuloksena hoidossa gDNA H

2O

2 kuten aiemmin on kuvattu [15]. Tasot 8- oxodG vuonna gDNA olivat

~ 0.1 8-oxodG kohden miljoona 2′- deoksinukleosidien, kun taas gDNA

OX nämä tasot olivat ~ 750 8-oxodG kohden miljoona 2′- deoksinukleosidien [5,7]. Sen varmistamiseksi, että gDNA vastaa gDNA

OX, jonka keskimääräinen pituus sen fragmenttien ja niiden kokojakauma (0,2-15 kb), gDNA käsiteltiin eri pitoisuuksilla DNAse I ja vastaavat gDNA näyte valittiin jälkeen elektroforeettisen arvioinnin agaroosigeeleillä. Vertaileva vaikutukset gDNA ja gDNA

OX hoitoja tutkittiin lopullinen pitoisuus alustassa 50 ng /ml tai 5 ng /ml, kun taas altistus vaihteli 30 minuutista 48 tuntiin.

1. Lokalisointi gDNA ja gDNA

OX MCF-7-solut

Saat solunsisäistä paikat gDNA ja gDNA

OX, useita DNA-koettimet syntetisoitiin ja differentiaalisesti leimattu. gDNA

punainen ja pBR322

vihreä koettimet leimattiin käyttäen nick-käännös SpectrumRed ja SpectrumGreen, vastaavasti. MCF-7-soluissa, gDNA

punainen ja pBR322

vihreä osoittavat samanlaisia ​​granuloidaan, kokkareista värjäyshahmojen kehän solulimassa, näkyvä noin 70% soluista (kuvio 1А). Tarkempi analyysi osoitti, että solunsisäinen jakelu leimatun DNA-fragmenttien on näyte erityinen (kuva 1В). Käsitellyissä soluissa sekä gDNA

punainen ja pBR322

vihreä, jotkut alueet solulimassa värjätään yksi, mutta ei muuta leimatun DNA. Alueet värjättiin enemmän sekvenssi-monipuolinen gDNA

punainen ovat läsnä suurempi määrä ja vievät suuremman solun tilavuuteen. Vuonna gDNA

punainen värjätään solut oli myös diffuusi värjäytyminen lähellä ydin- kirjekuori, joka oli nähtävissä suurennettuna (x 200). Meidän havainnot osoittavat, että ainakin jotkin eksogeenisen gDNA fragmentteja tuodaan soluun.

– gDNA

punainen, ytimet värjätään DAPI (x40); B – yhdistettiin värjäytymiskuvioissa gDNA

punainen ja pBR322

vihreä (x200); С – yhdistettiin värjäytymiskuvioissa gDNA

punainen-ox ja FITC-konjugoitua vasta 8-oxodG (x200); D – FACS-analyysi varhaisen endosomaalista merkki EEA1; jakelu solujen vaihtelevalla EEA1 sisältöä.

lopulliset pitoisuudet lisätään DNA media oli 50 ng /ml; soluja inkuboitiin DNA 30 min ennen kiinnittäminen 3% formaldehydiä. Tapauksessa värjäytymisen FITC-konjugoidulla vasta-8-oxodG, kiinnitettyjä soluja esikäsiteltiin 0,1% Triton Х100 läpäisevyyttä.

määrittää solunsisäisen sijainnit gDNA

OX, komposiitti koetin tuotettiin hitaasti renaturaatiossa nick-translation leimattu gDNA

punainen ja gDNA

OX (gDNA

punainen-OX). Samanlainen gDNA

punainen, tämä komposiitti leimattu koetin oli myös sijoitettu kehällä sytoplasmassa (kuvio 1С), kuitenkin, jos yhdistetyn koettimen gDNA

punainen-OX, huomattava osa leimatun fragmentit sisäpuolella sytoplasman lähellä tumassa. Sen vahvistamiseksi, että tämä hajanainen värjäytyminen vastasi hapetettu DNA, me värjätään solut FITC-konjugoidulla vasta 8-oxodG (kuvio 1 C). Tuloksemme osoittavat, että gDNA

OX tuodaan soluun olennaisesti suurempi aste kuin gDNA. Kirjoittamisen jälkeen solu, gDNA

OX etsii sytoplasmassa muodostaen pesäkkeitä tuman ympärillä.

Endocytosis on yksi yleisimmistä tavoista toimituksen eksogeenisia yhdisteiden soluun. Muodostuminen uusi endosomien mukana lisääntyminen ilmaus varhaisen endosomissa antigeeni 1 proteiinia (EEA1), joka tunnetaan varhaisena endosomaalista biomarkkereiden [26]. Käyttäen FACS, olemme osoittaneet, että altistuminen DNA

OX johtaa kasvua solujen osuus, jotka ilmentävät korkeita EEA1 (kuvio 1 D). Nämä havainnot ovat yhteistuumin visuaalisen kuvioita solunsisäisten värjäyksen gDNA

OX.

Tiedetään, että solunsisäiset anturit pystyvät sitoutumaan DNA-fragmenttien joko sisällä solulimassa (AIM2, RIG1, STING) [27 ] tai sisällä endosomeista (TLR9) [28]. Mielenkiintoista, 2 tunnin altistuksen gDNA

OX stimuloi ilmentymistä mRNA: iden, jotka koodaavat AIM2, TLR9 ja RIG1 (taulukko 1). Kaksi DNA-anturit, AIM2 ja TLR9, tutkittiin enemmän tiedot (kuva 2).

Symboli geeni

gDNA, 50 ng /ml

gDNA

OX, 50 ng /ml

2h

48h

2h

48h

Cell Cycle Checkpoint ja solukierron pysähtymisen:

CDKN2A (p16INK4) B 1,8 ± 0.53.3 ± 0,3 * 1,6 ± 0,1 * 2,5 ± 0,3 *

CDKN1A (p21CIP1 /WAF1) B 1,3 ± 0.32.9 ± 0,2 * 1,1 ± 0.22.2 ± 0,2 *

TP53

0,8 ± 0.41.6 ± 0,2 * 2,6 ± 0,3 x 2,1 ± 0,2 * antiapoptooppinen

BCL2

1,2 ± 0.22.5 ± 0,3 * 3,3 ± 0,3 x 3,2 ± 0,2 *

BCL2A1 (Bfl-1 /A1) B 1,3 ± 0.32.0 ± 0,3 * 5,0 ± 0,3 * 1,8 ± 0,3 *

BCL2L1 (BCL-X) B 1,0 ± 0.21.9 ± 0,3 * 1,2 ± 0.31.6 ± 0,3 *

BIRC3 (c-IAP1) B 0,7 ± 0,33. 5 ± 0,4 * 1,8 ± 0,2 * 2,6 ± 0,4 * Double langanvalvoja DNA korjaus

BRCA1

1,0 ± 0.11.0 ± 0.16.4 ± 0,6 * 2,1 ± 0,5 * Sytoplasmiset DNA-reseptoreita:

AIM2

1.2 ± 0.21.3 ± 0.12.2 ± 0,2 * 2,5 ± 0,4 *

RIG1

1,5 ± 0.21.3 ± 0.22.4 ± 0,2 * 1,4 ± 0,3

STING

1,3 ± 0,21. 4 ± 0.21.0 ± 0.21.3 ± 0,3

TLR9

1,6 ± 0,2 * 1,3 ± 0.23.0 ± 0,3 * 1,2 ± 0.2Nrf2-Keap1 Pathway:

Nrf2 (NFE2L2) B 1,4 ± 0,1 * 1,1 ± 0.12.3 ± 0,1 * 1,2 ± 0,2

KEAP1

0,9 ± 0.11.1 ± 0.13.6 ± 0,2 * 1,0 ± 0.1NFκB Pathway:

MAP4K4

1,1 ± 0.21.5 ± 0.22.0 ± 0,1 * 1,1 ± 0,3

Myd88

1,0 ± 0.22.0 ± 0,2 * 3,6 ± 0,2 * 1,4 ± 0,2

NFKB1

1,6 ± 0,2 * 0,9 ± 0.21.8 ± 0,2 * 1,5 ± 0,4

TIRAP

1,0 ± 0.22.2 ± 0,2 * 2,7 ± 0,3 * 1,3 ± 0.3STAT Perhe:

STST3

1,2 ± 0.21.8 ± 0,1 * 3,0 ± 0,3 x 1,0 ± 0.2

STAT6

1,2 ± 0.21.8 ± 0,3 * 1,6 ± 0,3 * 1,1 ± 0.3MAPK ja JNK /p38 Pathway:

FOS

1,3 ± 0.21.4 ± 0.31.4 ± 0.21.3 ± 0,3

kesäkuu

1,6 ± 0,3 x 1,6 ± 0,2 * 2,3 ± 0,3 x 1,9 ± 0,4 *

MAPK8 (JNK1) B 0,8 ​​± 0.21.8 ± 0,2 * 1,3 ± 0.21.3 ± 0,2 sytokiinit

IL10

0,8 ± 0.25.3 ± 0,5 * 1,8 ± 0,2 * 4,2 ± 0,4 *

IL6

0,8 ± 0.31.8 ± 0,2 * 2,6 ± 0,3 x 1,9 ± 0,2 *

IL8

1,7 ± 0,2 * 1,1 ± 0.23.2 ± 0,2 * 1,4 ± 0,4

TNFa

1,8 ± 0,2 * 2,2 ± 0,2 * 3,6 ± 0,2 * 2,3 ± 0,3 * Cell Adhesion ja Cell Migration Molekyylit:

ICAM1

0,9 ± 0.21.3 ± 0.22.6 ± 0,3 * 1,6 ± 0,4

PECAM1

1,3 ± 0.21.4 ± 0.21.7 ± 0,2 * 1,2 ± 0,2

SELE

1,0 ± 0.11.1 ± 0.22.1 ± 0,3 * 1,0 ± 0,2

SELP

3,7 ± 0,3 x 1,5 ± 0,2 * 1,3 ± 0.21.6 ± 0,3 *

VCAM1

1,5 ± 0.31.9 ± 0,2 * 3,2 ± 0,3 x 1,3 ± 0,2

RhoA

1,3 ± 0.21.2 ± 0.21.6 ± 0,2 * 1,1 ± 0.1Growth tekijät:

BMP2

1,6 ± 0,2 * 1,7 ± 0,2 * 3,0 ± 0,3 * 2,4 ± 0,2 *

BMP4

1,2 ± 0.21.9 ± 0,3 * 2,6 ± 0,4 * 1,4 ± 0,4

VEGFA

1,3 ± 0.21.8 ± 0,4 * 0,7 ± 0.31.4 ± 0.3Pluripotent kantasolujen liittyviä geenejä:

Nanog

1,2 ± 0.31.4 ± 0,1 * 1,2 ± 0.21.0 ± 0,2

Oct4

1,2 ± 0.21.5 ± 0,2 * 2,5 ± 0,2 * 1,7 ± 0,1 *

GATA-4

1,1 ± 0.21.5 ± 0,2 * 1,4 ± 0.31.3 ± 0.3Table 1. muutokset ekspressiotasot valitse mRNA: iden altistuksen jälkeen MCF-7-soluissa joko gDNA tai gDNA

OX.

suhteelliset ekspressiotasot ovat keskiarvoja kolmen biologisen rinnakkaisnäytteiden ja keskihajonta. (*) P 0.05 – vastaan ​​säätökennoja, epäparametrinen

U

-testi (Mann-Whitney U-testejä) CSV Lataa CSV

– solunsisäinen lokalisaatio AIM2 (FITC-konjugoituja vasta-aineita) ja leimattu koetin gDNA

red-ox (x40). B – suhde tasojen AIM1 [1] ja TLR9 [2] -, joka koodaa RNA: ita tasolle TBP-koodaus viittaamalla solujen mRNA altistetaan gDNA tai gDNA

OX 2 tuntia (har- maat pylväät) ja 48 tuntia ( mustat pylväät).

C ja D – Virtaussytometria havaitseminen AIM2 (C) ja TLR9 (D) ilmentyminen MCF-7. Solut värjättiin AIM2 (C) tai TLR9 (D) -vasta-ainetta (sekundaarinen PE-konjugoiduilla vasta-aineilla). Paneelit D [1] ja E [1] – säätökennoja tonttien: FL2 vs. SSC. R: aidatulla alueella. Paneelit C [2] ja D [2]: mediaani signaalin voimakkuuden FL2 (R) MCF-7-solut (keskiarvo kolmen erillisen kokeen). Paneelit C [3] ja D [3]: suhteelliset osuudet AIM2- tai TLR9-positiivisten solujen R portit [1]. Tausta-fluoresenssi kvantifioitiin käyttäen PE-konjugoituja sekundäärisiä vasta-aineita.

* p 0,05 vastaan ​​kontrolliryhmä soluja, ei-parametrinen U-testiä.

AIM2.

ei-konfluentteja MCF-7-soluissa, tasot

AIM2

mRNA: ta (kuvio 2B) [1] ja proteiinien ilmentyminen (kuvio 2C) ovat alhaiset. Kontrollisoluissa, proteiini tasot AIM2 korreloi konfluenttisuuden astetta. Ei-konfluentteja viljelmiä, AIM2 ilmentyy noin 25% soluista (kuvio 2C [1,3]). Konfluenteissa kulttuureissa, osuus solujen AIM2 lisää 2-kertaiseksi (kuvio 2C [1,3]). Nämä korotukset rinnastuvat suureneminen AIM2 proteiinipitoisuuden solua kohden (kuvio 2C [2]), kun taas tasot AIM2 iden translaation pysyvät suunnilleen samana (kuva 2B [1]). Nämä havainnot voidaan selittää vallitseva sääntelyn AIM2 toiminnan tasolla käännöksen tai sen vakauden sijaan tasolla transkription ja odottavat lisätutkimuksia.

Yhdistetty värjäystä kaavoja FITC-konjugoitu anti-AIM2 vasta-aineita ja leimattu koetin gDNA

punainen-ox on esitetty kuvassa 2A. Monet värjätään alueet todellakin päällekkäisyyttä, mikä saattaa viitata vuorovaikutusta gDNA

OX kanssa AIM2 antureita. Viljellyissä MCF-7-solut altistetaan hapetettu DNA: n tasot sekä AIM2 proteiinin ja sen mRNA: n ovat koholla (kuviot 2B [1] ja 2C). In AIM2-positiiviset solujen populaatio, altistuminen joko hapetetaan DNA: ta tai genomin DNA: ta 48 tuntia johtaa laskuun tasojen AIM2 proteiinia solua kohden (kuvio 2С [2]).

TLR9.

Ei-konfluentteja MCF-7-solut, tasot TLR9 ovat alhaiset, noin 20% värjättyjen solujen (kuvio 2B [2], D), kanssa aikaisemmat tutkimukset [28]. Konfluenteissa MCF-7 kulttuureissa ilmentävien solujen osuus TLR9 proteiinia nousee noin 40% (kuvio 2D) [3] sekä intensiteetit TLR9 värjäytymisen yksittäisten solujen (kuvio 2D [2]). Samoin tasot AIM2 encodings mRNA: iden tasot TLR9 encodings mRNA: iden säilyvät ennallaan (kuvio 2B [2]). 2 tunnin kuluttua altistuksen hapettuneen DNA tasot TLR9 koodaavan mRNA: n nousu, kun taas määrät TLR9 proteiinin yksittäisten solujen eivät muutu.

Pitkäaikainen MCF-7 hapetetaan DNA johtaa voimakkuuden lasku värjäyksen yksittäisten solujen anti-TLR9 vasta-aineita (kuvio 2D [2]). Aiemmin samantyyppinen vasteen gDNA ja gDNA

OX havaittiin viljellyissä ihmisen fibroblasteissa [7]. Kaikki yhdessä, meidän tiedot osoittavat, että pitkäaikainen altistuminen joko gDNA tai gDNA

OX johtaa lasku solun tasoja DNA anturien AIM2 ja TLR9 ja mahdollisesti osittaiseen siedätyshoito näiden solujen vaikutuksista solunulkoiseen DNA.

2. Altistuminen gDNA

OX indusoi lyhytaikaisen oksidatiivisen stressin

tutkia mahdollisia vaikutuksia gDNA ja gDNA

OX on solunsisäisiä tasoja reaktiivisia happiradikaaleja (ROS), ROS mitattiin dichlorodihydrofluorescindiacetate ( H2DCFH-DA) väriaine, joka nopeasti tunkeutuu solukalvon ja jää loukkuun sytosoliin sen deacetylated muodossa. Fluoresoimaton DCFH muuntaa loisteputki DCF erilaisilla ROS radikaaleja ja siten toimii herkkänä solunsisäisen markkeri oksidatiivisen stressin [29]. Kuvio 3A esittää tulokset ROS tasoilla analyysi elävissä soluissa. Käsittelemättömissä kontrollisoluissa, DCF väriaine diffuusisti yhdistää kanssa solun pinnalla, ja se voidaan poistaa kalvon PBS pesemällä. Yleisimmät ROS at solukalvon ovat entsyymejä NOX perhe [30]. Käsitellyissä soluissa gDNA (50 ng /ml), H2DCFH-DA tahra visualisoi sekä kalvon ja jonkin verran solunsisäisen rakeita. PBS pesu ei vaikuta sytoplasmista rae värjäystä. Patterns of DCF rakeita ja merkitty gDNA

punainen koetin tahrat noin päällekkäisyys (kuvio 3C), mahdollisesti osoittaa, että vuorovaikutus gDNA joidenkin soluaineksista stimuloi ROS biosynteesi paikassa yhteystiedot. Tämä havainto rinnastuu hyvin aiemmin todennut, hypoteesi, että ecDNA voi jotenkin suoraan stimuloida entsyymiaktiivisuus NOX proteiinien [5].

А – Mikroskopia perustuvaa arviota MCF-7-solut käsiteltiin peräkkäin DNA (50 ng /ml) ja H2DCFH-DA (ohjaus, gDNA, gDNA

ox [1]) ja inkuboitiin 30 minuutin ajan (x100). Vaihtoehtoisesti, MCF-7-soluja inkuboitiin DNA: ta (50 ng /ml) 1 tunnin ajan, minkä jälkeen lisättiin H2DCFH-DA, ja valokuvauksen 30 minuuttia myöhemmin (gDNA

ox [2]). B – MCF-7-solut altistettiin gDNA

ox (0,5 h, 50 ng /ml), käsiteltiin peräkkäin Mito-tracker TMRM (15 min) ja H2DCFH-DA (15 min) (x200). C – Co-havaitseminen leimatun koettimen gDNA

punainen (50 ng /ml) ja DCF 30 minuutin inkuboinnin. D – tulokset määrällisesti fluoresenssi käyttäen levynlukijaa [1]. Aika kinetiikka fluoresenssin lähtöjen soluissa, käsiteltiin peräkkäin H2DCFH-DA, ja kolme minuuttia myöhemmin, DNA-näyte lopullinen pitoisuus on 5 tai 50 ng /ml [2]. Sama soluja esikäsiteltiin DNA (lopullinen pitoisuus 5 ng /ml) yhden tunnin ajan, jonka jälkeen lisätään H2DCFH-DA. *) P 0,05 vastaan ​​kontrolliryhmä soluja, ei-parametrinen U-testiä.

soluja käsiteltiin gDNA

OX (50 ng /ml), solunsisäinen ROS tuottavat rakeita syntyy nopeasti, ja niiden määrä ovat oleellisesti suurempia kuin käsitellyissä soluissa gDNA (kuvio 3A, upotettavat gDNA

OX [1]). Nämä tapahtumat ovat mukana muutoksia morfologiassa MCF-7-solut, mukaan lukien lisääntyminen koko ytimet ja sytoplasman turvota. On tärkeää huomata, että havaittujen solujen reagointi on nopeaa ja lyhyen olo. Kuvattu muutoksia värjäyskuviot ja solujen morfologia nähdään vain siinä tapauksessa peräkkäisten lisäysten H2DCFH-DA ja gDNA

OX ja MCF-7 media. Kun soluja esikäsiteltiin gDNA

OX 1 tunti, sitten tutkittiin а H2DCFH-DA väriaine määrä ROS-syntetisointi rakeet nähdään soluissa oli pienempi ja niiden intensiteetti oli himmeämpi kuin Mikäli asiakas ei esikäsittely-protokollaa (Kuva 3А upotettavat gDNA

OX [2]). Vielä mielenkiintoisempaa, esikäsittelyssä protokollaa, jotkut solut pysähtyi ROS biosynteesi ollenkaan, ja tuli vielä himmeämpi sitten käsittelemättömien säätökennoja (tummempi solut, jotka ovat vähemmän loisteputki kuin tausta (kuva 3А upotettavat gDNA

OX (b )).

havaitut ilmiöt olivat itsenäisesti vahvistettiin tutkimuksessa DCF sukupolven kinetiikan käyttäen kvantifiointiin fluoresoivalla lukija (kuvio 3D). Kun MCF-7-soluja käsiteltiin DNA heti lisäämisen jälkeen H2DCFH-DA media, dramaattinen kasvu intensiteetti DCF fluoresenssi havaittiin. Nämä korotukset olivat korkeimmat korotuksen aikana ensimmäisen 20 minuutin lisäyksen jälkeen DNA medialle (kerrointa k1), sitten, ajan, nämä hinnat pudotus ( kerroin k2) (kuva 3D [1], taulukko upotus). k1 ja k2 kertoimet olivat riippuvaisia ​​tyyppi ja pitoisuus DNA hoito: gDNA

OX (5 ng /ml) gDNA (5 ng /ml) gDNA

OX (50 ng /ml) ≥ gDNA (50 ng /ml), ja gt; ohjaus. Näitä vaikutuksia ei havaittu, kun soluja esikäsiteltiin DNA: ssa 1 tunti, ennen kuin lisättiin H2DCFH-DA (kuvio 3D) [2].

Yhteenvetona tulokset näistä kokeista osoittavat, että hoito gDNA

OX aiheuttaa nopeasti ROS biosynteesiä MCF-7-soluissa. Samanaikaisesti, päinvastainen prosessi tukahduttaminen ROS: n syntyminen, tai ROS sammutusta, aloitetaan. Koska suuremmat määrät gDNA

OX lisättiin media, nopeampaa oli kehittää ROS sammuttamaan.

Suurin osa solunsisäistä ROS syntyy mitokondrioita. Lisääntyminen oksidatiivisen aineenvaihdunnan mitokondrioissa voivat johtaa diffuusion ROS solulimaan ja lisääntyminen myöhemmin perimitochondrial havaitsemiseen ROS DCF. Tämän hypoteesin testaamiseksi, me peräkkäin värjätään solut altistettiin 50 ng /ml gDNA

OX 30 minuutin Mito-tracker (TMRM punainen) ja DCF (kuvio 3B). Suurin osa Mito-tracker ja DCF-signaalin sijaitsivat lähellä toisiaan, joissa on osittain päällekkäinen (keltainen signaali, kuvio 3B). Vuonna koskemattomat solut, H2DCFH-DA ei tahraa mitokondrioita (kuva 3А, ohjaus). Havaintomme kohta, että solut altistetaan hapetettu DNA, suurin osa endogeenisen ROS syntyy mitokondrioissa.

3. Altistus togDNA

OX stimuloi tasojen nousu oksidatiivisen muutos solun omien DNA

On todennäköistä, että intensiivinen tuotanto ROS havaittu heti altistuksen jälkeen solujen gDNA

OX voi johtaa vaurioita solujen DNA. Visualisoida vaurioita, kiinteä MCF-7-solut värjättiin PE-leimatulla anti-8-oxodG vasta-aineita (kuvio 4). Verrattuna ei-käsiteltyjen kontrollisolujen, MCF-7, joita on käsitelty joko gDNA tai gDNA

OX, määrät värjätyt solut kasvoivat (kuvio 4A (x20). Suuremmilla suurennoksilla, kolme värjäyskuviot voi olla havaittu (kuvio 4B): (1) – tumavärjäystä; (2) – sytoplasminen värjäys, (3) – värjäys mikrotumia. ei-hoidettuun kontrolliryhmään populaatiot MCF-7-soluissa, PE-leimattua anti-8-oxodG vasta pääasiassa tahra mikrotumia. populaatioissa käsitelty gDNA

OX, lisääntyi määrien solujen tuman värjäytymisen (kuvio 4E). Kuten edellisessä kokeet osoittivat, että gDNA

punainen-OX sijaitsee sytoplasmassa ja ei tunkeutua ydin, havaittu värjäytyminen ytimien on kohdennettava vahinkoja solun omien DNA.

– Solut värjättiin PE-leimattua anti-8-oxodG vasta-aineita ja DAPI (x20). B – kolmenlaisia anti-8-oxodG tahra jakelu havaittiin soluissa, joita käsiteltiin gDNA

OX (x100). Cell inkuboitiin DNA-näytteitä 1 tunti, kiinnitettiin 3% formaldehydiä, läpitunkema 0,1% triton x100 ja värjättiin anti -8-oxodG (PE-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineet). C – rinnakkaispaikantumisen 8-oxodG kanssa mitokondrioissa. Soluja inkuboitiin gDNA

OX 0,5 tuntia, обработаны Mito-tracker (30 nM, 15 min), valokuvataan, sitten kiinnitettiin 3% formaldehydiä, läpitunkema 0,1% Triton X100, värjättiin anti-8-oxodG vasta-aineita (FITC-konjugoitua sekundaarista vasta-aineet) ja valokuvattiin uudelleen. D – 8-oxodG pitoisuus DNA altistetaan solut esikäsiteltiin NAC (FACS-analyysi). Soluja inkuboitiin NAC (0,15 mM) 30 minuuttia, sitten altistetaan gDNA

OX 1 tunnin ajan ja analysoitiin käyttäen anti-8-oxodG vasta-aineita (PE-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineet). Tausta-fluoresenssi kvantifioitiin käyttäen PE-konjugoituja sekundäärisiä vasta-aineita. E – suhteellinen osuus ytimiä värjättiin 8-oxodG ei-hoidettuun kontrolliryhmään, solut, altistetaan gDNA, solut altistetaan gDNA

OX (har- maat pylväät). Vaaleanharmaa sarakkeessa näkyvät solut esikäsiteltiin NAC ja altistuvat gDNA

OX. * P 0.05 vastaan ​​kontrolliryhmä soluja, epäparametrinen U-testiä.

lisäystä mitokondrioiden biosynteesin ROS vuonna gDNA

OX alttiina solujen osoitettiin edellä (kuvio 3В) voi johtaa kasvuun tason hapetus mitokondrion DNA, joka puolestaan ​​voi selittää havaittua sytoplasmista värjäytymistä gDNA

punainen-OX esitetty kuviossa 1C. Kuviossa 4C, voidaan nähdä, että noin 8-oxodG signaalit eivät sulautua gDNA

punainen-OX. Soluissa esikäsitelty antioksidantti N-asetyyli-kysteiini (NAC) (0,15 mmol) 30 minuuttia ennen altistusta gDNA

OX, tasot hapettumista solujen DNA oli huomattavasti pienempi kuin käsittelemättömien solujen NAC (kuvio 4D ja 4E).

4. Altistuminen gDNA

OX stimuloi kasvua katkeamisen solussa omien DNA

Yksi tunnettu ominaisuus DNA hapettumista on kertymistä yksi- ja kaksijuosteisen DNA katkoksia (SSBs ja DSB). Määrällisesti SSBs ja DSB MCF-7-solut altistettiin joko gDNA tai gDNA

OX, käytimme komeetta elektroforeesilla alkalisissa olosuhteissa (kuvio 5А). Kolmenlaista tumat lueteltu: ytimet ehjä DNA (kuvio 5А [1], tyyppi I); ytimet joilla on jonkinasteinen kromatiinin pirstoutuminen (tyypin II); ytimet huomattavia pirstoutuminen DNA (tyyppi III). Kun useimmissa tapauksissa ytimet käsittelemätöntä ohjaus luokitellaan joko tyypin I tai II, kun taas tyypin III ytimien nähdään pääasiassa soluissa käsitelty gDNA

OX. Riippuen siitä, kuinka kauan solut altistettiin gDNA

OX, osuudet tyypin III ydinten voivat vaihdella. Kuviossa 5A esitetään myös komeetan hännän hetkiä [2] ja% hännän DNA [3]. Kun 30 minuutin inkubointi MCF-7-solujen gDNA

OX, määrät DNA-katkosten tuntuvasti, kun taas vastaava kohtelu gDNA johtaa kohtalainen korkeus kromatiinin pirstoutumisen tasoilla. 2 tunnin inkuboinnin joko gDNA tai gDNA

OX, määrät DNA rikkoo väheneminen, ja niiden määrä laskee alle tuon löytyy kunkin gate-erityisiä väestön käsittelemättömien ohjaus soluissa.

А – comet alkalisissa olosuhteissa [1]. – Digitaalinen valokuvaus ydinten kanssa eriasteista DNA-vaurioiden [2,3]; – Kumulatiiviset histogrammit takaosan liike ja DNA: n prosenttiosuus sisällä hännät. Luotettavuus eroja kontrolliin saaduissa jakaumia analysoitiin avulla Kolmogorov-Smirnov tilastojen (taulukko osoittaa arvot D ja α).

B – dsDNA katkoksia altistuneiden solujen gDNA

OX (50 ng /ml, 1 tunti) .Cells prosessoitiin immunofluoresenssivärjäyksen anti γH2AX vasta-aineella (x40) [1] .- Kolme havaittu tyyppisiä ytimet numeroilla: 1- ydin useita dsDNA taukoja, 2- tuma kanssa muutama dsDNA taukoja, 3- tuma ehjillä DNA [2]. – Esimerkki mikronukleuskokeessa kanssa dsDNA taukoja.

С – FACS-analyysi γ-pesäkkeitä V: siellä Pääjakeet solujen kuten ilmeistä gating alueilla R1, R2, R3 [1], jakelu γH2AX fluoresenssi intensiteetit [2], suhteelliset osuudet solujen gating alueilla R1-R3 [3]. * P 0,05 vastaan ​​kontrolliryhmä soluja, ei-parametrinen U-testiä.

Huomautukset edellä kuvatut itsenäisesti vahvistettiin käyttämällä toista yleinen tekniikka visualisointiin DSB, joka on immunovärjäys vasta-aineilla histoni γH2AX, fosforyloitiin seriini -139. Tämä muoto H2AX tiedetään nopeasti kerääntyä DNA loci reunustavat DSB sivustolla [31]. MCF-7-solut värjättiin FITC-konjugoidulla vasta-Ser-139 fosforyloitiin histoni γН2АХ on esitetty kuviossa 5B [1]. Stained dioja myös kolme erilaista solupopulaatioiden γН2АХ positiivisia soluja. Tässä kokeessa solut luokiteltiin tyypin 1-soluissa, kun ne oli useita fosfo-γН2АХ pesäkkeitä. Useimmat γН2АХ positiiviset solut luokiteltiin tyypin 2 soluja (välillä 2 ja 10 erillistä γН2АХ pesäkkeitä solua kohti), ja tyypin 3 solujen mitään merkkejä polttopisteen fosforia γН2АХ värjäystä.

anti-γН2АХ värjäys yleisesti ottaen fluoresenssin voimakkuus solu on verrannollinen määrä γН2АХ pesäkkeitä solua kohti, ja näin ollen määrä on n DSB: ihin. Käyttäen FACS kolme porteilla alueilla, R1-R3, tutkittiin (kuvio 5C [1,2]). Soluja gate R1 on suurin FL1 (γH2AX); tämä tulkitaan useita DSB (tyyppi 1-soluja, kuvio 5B). Gate R2 sisältää soluja, joissa ei lukuisia γH2AX (tyyppi 2-solut). Gate R3 sisältää eniten solujen; useimmat näistä soluista ovat ehjät ilman DSB (Type 3 solut). MCF-7 kulttuureissa, altistuminen gDNA

OX (1h) johtaa 1,5-taittuu kasvaa solujen määrän portin R1, joka on samankaltaista kuin lasku solujen määrän R2. 24 tunnin kuluttua altistumisesta gDNA

OX, määrät solujen useita DSB pienentää tasolle alle että ei-hoidettuun kontrolliryhmään soluissa (kuvio 5C [3]). Hoito, jossa gDNA herättää samanlainen, mutta vähemmän selvä tyyppi soluvasteen, että sen suuruus ei ulotu merkitystä verrattuna ei-käsiteltyjen kontrollisolujen (p 0,05).

Nämä havainnot osoittavat, että MCF-7-solut, lyhytaikainen altistus gDNA

OX tulokset yksin- tai kaksijuosteisen DNA taukoja. Pidempiaikaisen hoidon (välillä 2 ja 24 tuntia) herättävät tietyntyyppinen korvaavia vasteen, joka johtaa lasku tasot kromatiinin sirpaloitumista poikki solupopulaatioiden.

pudotus osuus DSB sisältävien solujen lyhytaikaisella altistumisesta hapettuneen tai kontrolli-DNA voidaan selittää joko korjaukseen taukoja tai apoptoosin /irtoaminen vaurioituneiden solujen tai molempia. Arvioimaan näitä mahdollisuuksia, me lueteltu soluja, jotka pysyvät media irrottamisen jälkeen solusta kerroksesta, ja solut poistettiin kerros PBS pesun. Viljelmissä altistetaan hapetettu DNA: ssa 2 tuntia, osuus irrotettuja soluja jäi samanlainen kuin altistetuissa viljelmissä genomisen DNA: n ja ei-käsiteltyjen kontrolliviljelmiin (noin 2% kokonaismäärästä solujen annetaan kulttuuri). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kokeissa, joiden tavoitteena on suora arviointi apoptoosin (katso alla). Sen vuoksi on todennäköistä, että pienemmän osan solujen DSB havaittiin altistuksen jälkeen gDNA tai gDNA

OX on kasvun ansiosta DNA: n korjaukseen.

5. Altistuminen gDNA

OX johtaa kasvuun genomin epävakaus

Yksi- ja kaksijuosteisen DNA katkoksia tiedetään johtaa menetykseen kromosomi vakautta, joka on erityisen merkittävä aktiivisesti jakautuviin soluihin [32]. Perusteellinen tutkimus ytimet soluja inkuboitiin gDNA

OX paljasti voimakkaampaa kromosomi epävakaus (Kuva 6).

C.