Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

XMRV (ksenotrooppiset hiiren leukemiaviruksen liittyvä virus) alun perin löydettiin yhdessä eturauhassyövän ja myöhemmin krooninen väsymysoireyhtymä (CFS). Sen yhteydessä CFS on nyt suurelta osin huonoon, ja nykyiset tulokset tukevat laboratorion alkuperän XMRV ilman toistettavissa todisteita infektion ihmiselle. Kuitenkin jotkut tulokset osoittavat läsnäolo XMRV eturauhassyövässä on vaikea kohdentaa näyte saastumista. Tässä olemme pyrkineet biologisia näytöstä, jotka saattavat vahvistaa läsnäoloa XMRV vuonna eturauhassyöpänäytteissä aiemmin on testannut positiivinen.

Menetelmät ja tulokset

Olemme testanneet tarttuvan XMRV ja neutraloivat vasta-aineet XMRV veressä plasmaa 29 potilaalla on eturauhassyöpä, ja tarttuvan XMRV eturauhasen eritteiden vielä viisi eturauhassyöpää aiheista. Yhdeksän näistä aiheista aiemmin positiivisen XMRV PCR tai viruksen määrityksessä. Emme havainneet XMRV tai niihin liittyvien retrovirusten otosta, ja neutraloiva toiminta plasmanäytteet olivat kaikki hyvin alhainen, seurauksena ristiriidassa XMRV infektio plasman luovuttajien.

Johtopäätökset

löydä mitään todisteita XMRV infektio tahansa ihmiselle testataan joko määritystä tarttuvan viruksen tai vasta-aineiden neutralointia. Tuloksemme ovat yhdenmukaisia ​​useimpien julkaistujen tutkimusten XMRV, joissa todetaan XMRV ei esiinny ihmisillä. Havaittu alhainen havaittavissa XMRV neutralointi ihmisen plasmaa on osoitus luontainen rajoitus XMRV replikaatiota liukoinen tekijät ihmisen veressä.

Citation: Mendoza R, Silverman RH, Klein EA, Miller AD (2012) Ei Biologiset todisteet XMRV in Blood tai eturauhasen nestettä eturauhassyöpään Potilaat. PLoS ONE 7 (5): e36073. doi: 10,1371 /journal.pone.0036073

Editor: Gilda Tachedjian, Burnet instituutti, Australia

vastaanotettu: 09 helmikuu 2012; Hyväksytty 25 maaliskuuta 2012 mennessä; Julkaistu: toukokuu 16, 2012

Copyright: © 2012 Mendoza et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: tukemana koulutus avustus T32 CA080416 National Cancer Institute (RM); by pilottihanke rahoitusta Core Center of Excellence in Hematology avustusta DK56465 ja rahoittamalla päässä Fred Hutchinson Cancer Research Center (ADM); ja jonka Charlotte Geyer Foundation, Maltz Family Foundation ja Abbott Laboratories (RHS ja EAK). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: EAK ja RHS ovat keksijät patentteja lisensoitu Abbott Laboratories, jotka liittyvät havaitsemismenetelmät of XMRV. Kuitenkin tulokset esitetään kertomuksessa todennäköisesti vähentää arvoa tällaisen tekniikan, näin lieventämään eturistiriitoja kysymyksiä. Tämä kiinnostus ei muuta tekijöiden sitoutumista kaikkiin PLoS ONE politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja. RM ja ADM ovat ilmoittaneet, etteivät ne ole kilpailevia intressejä.

Johdanto

retrovirus XMRV (ksenotrooppiset hiiren leukemiaviruksen liittyvä virus) alun perin löydettiin ihmisen eturauhassyöpänäytteissä [1] ja oli myöhemmin todettu veressä suuri osa potilaista diagnosoitu krooninen väsymysoireyhtymä (CFS) [2], huolen aihe, että XMRV oli uusi ihmisen taudinaiheuttaja. Kuitenkin, suurin osa sen jälkeen tehdyt tutkimukset eivät ole kyenneet havaitsemaan XMRV ihmisillä tai ilman eturauhassyövän [3], tai CFS [4]. Lisäksi XMRV isolaatteja alussa tutkimukset olivat lähes identtisiä virus on tuotettu yleisesti käytetty eturauhassyövän solulinjaa 22Rv1 [5] – [7]. Ehkä XMRV oli läsnä eturauhassyövän, josta 22Rv1 solut olivat peräisin, mutta puute XMRV sekvenssin monimuotoisuus on hämmentävä annettiin korkea mutaationopeus retrovirusten. Äskettäin XMRV läsnä 22Rv1 soluissa osoitettiin on syntynyt kulkiessa 22Rv1 eturauhassyövän soluissa ja niiden esi-nude-hiiriin, harvinainen rekombinaatiolla kahden hiiren endogeenisen retrovirukset, ja ei havaittu varhaisessa ksenografteissa ja eturauhasen tuumorin [8]. Odotettu harvinaisuus tämän tapahtuman ja puute järjestyksessä monimuotoisuuden ”ihmisen” XMRV isolaatit [7], [9] viittaavat siihen, että ihmisen näytteet saastunut 22Rv1 XMRV tai plasmidia klooneja XMRV.

Tällä hetkellä , rooli XMRV CFS suurelta osin vääräksi, ja alkuperäisen paperin löytyi tämä yhdistys on vedetty [10]. Erityisesti suuri välisessä tutkimuksessa havaittiin, että kaksi laboratorion osallistuvat ryhmät alkuperäisessä tutkimuksessa ei luotettavasti havaita XMRV potilaan näytteitä, ja että labs jotka voivat luotettavasti havaita XMRV ei havainnut XMRV potilailla, joilla on CFS tai normaalit kontrollit [11 ]. Kun kyseessä on yhdistyksen XMRV eturauhassyövän, on vielä epäselvää, onko joitakin alkuperäisen eturauhassyöpänäytteissä olisi voinut sisältyä potilaasta johdettujen XMRV tai muiden siihen liittyvien retrovirusten.

Tässä olemme analysoineet veriplasmaa ja ilmaisi eturauhasen eritteiden (EPS) eturauhassyöpään potilaista, joista osa on aiemmin positiivisen XMRV [1], [12] – [15], läsnäolo XMRV ja niihin liittyvät retrovirusten käyttämällä määritystä tarttuvan retroviruksia. Lisäksi testasimme veriplasma neutraloivia vasta-aineita XMRV, jotka voivat rajoittaa myös kyky havaita XMRV plasmassa, ja se osoittaa immuunivasteen XMRV plasman luovuttajalle. Emme löydä mitään todisteita XMRV tai liittyvien retrovirusten tai neutraloiva vasta-vastaan ​​XMRV missään potilaan näytteitä.

Tulokset

XMRV Detection Methods

havaitsemiseksi tarttuva XMRV ja niihin liittyvät retrovirusten potilaiden plasman ja EPS näytteitä, käytimme S

+ L

– ja merkki pelastus määrityksiä, joiden on osoitettu tehokkaasti havaita XMRV [5]. S

+ L

– määritys käytimme mittaa kykyä retrovirus tartuttaa ja aiheuttaa leviämistä Moloney hiiren sarkoomaviruksen läsnä PG-4 kissa soluissa [16], mikä johtaa tuotannon transformoitujen pesäkkeitä vuonna cell kerros. Markkeri pelastus määritys suoritettiin käyttäen

Mus dunnin

tail fibroblasteissa (dunnin solut) transdusoitu retrovirusvektorilla (LAPSN), joka tuottaa ihmisen istukan alkalista fosfataasia (AP). Dunnin /LAPSN solut altistettiin testinäytteet, siirrostettiin kuukauden jotta viruksen leviämistä, ja määritettiin tuotantoon LAPSN vektori on naiivi dunnin soluissa. Dunnin solut valittiin tässä määrityksessä, koska niiden herkkyys monenlaisia ​​hiiren leukemian viruksia [17], mukaan lukien XMRV, muut ksenotrooppinen retrovirusten, ja polytrooppinen retrovirukset tyyppiä aiemmin havaittu ihmisissä [1], [2], [18 ]. Havaitsemiseksi neutraloivien vasta-aineiden läsnä potilaan plasmanäytteistä, käytimme S

+ L

– määritys kvantitoimiseksi replikaatiokykyisten XMRV inkuboinnin jälkeen näytteet, verrattuna XMRV inkuboitiin viljelyväliaineessa kontrollina. Joissakin kokeissa, mittasimme kyky plasman neutraloida LAPSN vektori pakataan XMRV virionit (XMRV-pseudotyypin LAPSN vektori) korvikkeena suora mittaus XMRV neutralointi.

kinetiikan määrittämiseksi viruksen leviämisen ja herkkyyden pelastamiseen merkkigeenin, määritys suoritettiin altistamalla dunnin /LAPSN soluja 50, 25, 10, 5, 1, tai 0 kohdennus muodostavaa yksikköä (FFU) ja XMRV, määritettynä S

+ L

– määritys. Sitten solut määritettiin viikoittain LAPSN tuotannon kulkiessa solujen kuukaudessa. LAPSN tuotanto havaittiin yhden viikon kuluttua infektion 50 FFU of XMRV, 2 viikon infektion jälkeen 10 ja 5 FFU, ja 4 viikkoa 1 2 levyä tartunnan 1 FFU of XMRV. Nämä tulokset osoittavat, että markkeri pelastus määritys on suunnilleen yhtä herkkä kuin S

+ L

– määritys havaitsemiseen XMRV. Kuitenkin tämä markkeri pelastus määritys voi olla herkempi kuin S

+ L

– määritys joidenkin retrovirusten vuoksi tunnetun herkkyyden dunnin solujen monenlaisia ​​hiiren retrovirusten, kun taas vähemmän erilaisia ​​hiiren retroviruksia voi tartuttaa kissa soluja käytetään S

+ L

– määritys.

Ei Todisteet XMRV Infektio Eturauhassyöpä Potilaat

testattiin ensin onko veriplasmaa sarjasta kymmenen eturauhassyöpäpotilailla, joista kolme on aiemmin positiivisen XMRV RT-PCR: llä, sisälsivät replikoitumiskykyisen XMRV ja /tai neutraloivia vasta-aineita XMRV (taulukko 1). Emme havainneet XMRV tai liittyvät retrovirusten missään näytteessä S

+ L

– määritys. Havaitsemiseksi neutraloivat vasta-aineet, plasma näytteitä inkuboitiin 01:10 ja 1:100 laimennokset XMRV-pseudotyypin LAPSN vektori 30 minuuttia huoneenlämpötilassa, ja jäljellä LAPSN virus mitattiin AP

+ keskittyä määrityksessä. Vain yksi kymmenestä plasma näytteet osoittivat heikkoa neutraloivaa aktiivisuutta (neutraloivat tiitteri 10). Tämä neutraloivaa aktiivisuutta poistettiin inaktivoimalla lämmön plasman, joka inaktivoi komplementin, joka osoittaa, että ei vasta-aineita oli läsnä, joka voi suoraan estää virusinfektion.

Koska alhainen havaittavissa tasolle neutraloivien vasta-aineiden ensimmäiset 10 potilaan näytteitä, teimme lisää neutralointi joissa käytetään laimentamattomana plasmaa. Lisäksi, mittasimme neutralointi XMRV viruksen vastakohtana XMRV-pseudotyypin LAPSN vektori. Emme havainneet replikoitumiskykyisen XMRV tai liittyvät retrovirusten, S

+ L

– tai merkkiaine pelastus määrityksissä, plasmassa mistä tahansa 21 potilasta testattiin, joista neljä jotka aikaisemmin positiivisiksi XMRV PCR (katso Taulukko 2 potilaiden ja näytteen tiedot). Lisäksi löysimme juurikaan mitään XMRV neutraloiva aktiivisuus laimentamaton plasmanäytteiden, jopa ilman lämpökäsittelyä komplementin inaktivoimiseksi (Fig. 1). Näyte VP950 osoitti korkeimman neutraloivaa aktiivisuutta (75% neutralointi), mutta lämpöä inaktivaatio näytteestä ennen testausta, tai laimentamalla näyte 10-kertaisesti ennen testausta, poistettiin neutraloivaa aktiivisuutta (dataa ei ole esitetty), mikä osoittaa, että tämä toiminta on hyvin heikko ja todennäköisesti riippuu täydennys. Se, että tarttuva XMRV voi kestää seuraavan inkubaation laimentamattoman plasmanäytteet osoittaa, että tarttuva XMRV voisi säilyä veressä näiden eturauhassyöpäpotilaalla, ja olisivat havaittavissa meidän määrityksissä replikaatioon kykenevän viruksen. Ilmeinen humoraalisen immuunivasteen XMRV viittaa siihen, että nämä potilaat eivät tartunnan XMRV, vastaa meidän kyvyttömyys havaita viruksen esiintyminen näillä plasmanäytteistä.

Patient numerot on lueteltu alareunassa tähdillä ilmaisee jotka aiemmin positiivisen XMRV (katso keskustelu lisätietoja). XMRV tiitteri määritettiin inkuboinnin jälkeen pieni määrä XMRV kanssa laimentamatonta plasmaa, tai elatusaineella, kuten kontrollina, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tulokset esitetään suhde XMRV tiitterin inkubaation jälkeen plasmassa, että sen jälkeen, kun oli inkuboitu viljelyväliaineessa, ilmaistuna prosentteina. Huomaa, että jotkin arvot ylittävät 100%, mikä osoittaa, lisääminen XMRV infektion näiden plasmanäytteiden.

Seuraavaksi testasimme EPS nesteitä saatu leikattiin eturauhaset [13] läsnäolo XMRV. Testata mahdollisia vaikutuksia EPS XMRV tarttuvuuden, lisäsimme pieni määrä XMRV on laimentamaton normaalista eturauhasen tai elatusaineeseen kontrollina, ja mitataan tiitteri näiden seoksista käyttämällä S

+ L

– määritys. Monista näytettä kutakin, saatiin samanlaisia ​​tuloksia (XMRV tiitteri 5 x 10

6 FFU /ml), joka osoittaa, että XMRV voi selviytyä ja havaita EPS nestettä. Ei kuitenkaan replikaatiokompetentin virus havaittiin jonkin 5 EPS näytteiden eturauhassyöpäpotilaalla S

+ L

– tai pelastamiseen merkkigeenin määritykset (katso taulukko 2 näytteen tunnisteiden ja määrät testattu). Kolme näistä potilaista oli aiemmin testattu positiivisiksi XMRV virtsassa (taulukko 2) [15].

aktivointi

M. dunnin

endogeeninen retrovirus joissakin Marker Rescue Analyysit

kohtasivat joitakin vääriä positiivisia tuloksia markkeri pelastus määrityksessä. Muutamissa tapauksissa havaitsimme LAPSN tuotannon altistuksen jälkeen dunnin /LAPSN solujen plasmassa, mutta virus häiriöiden analyysi osoitti, että LAPSN transduktio oli täysin estetty dunnin soluissa, jotka ekspressoivat

M. dunnin

endogeeninen retrovirus (MDEV) [19], [20], mutta ei muuttunut dunnin soluissa, jotka ilmentävät XMRV (tuloksia ei ole esitetty). MDEV ja XMRV käyttävät eri reseptoreita solun merkintä, joka estyvät infektion sukulais retrovirus mutta ei vaikuta infektio vaihtoehtoisen virus [17]. Vahvistamaan, että positiiviset tulokset olivat todellakin keinotekoista, teimme merkki pelastus määritys käyttäen DU145 /LAPSN soluja, ja totesi, että kaikki on ilmeisen väärien positiivisten potilaiden näytteistä oli todellakin negatiivisia replikaatiokykyisistä XMRV (tuloksia ei ole esitetty). Aiemmin MDEV tuotanto

M. dunnin

solut havaittiin käsittelyn jälkeen soluja 5-jodi-2′-deoksiuridiini tai hydrokortisoni [19], ja vaikuttaa siltä, ​​että aineet potilaan näytteissä on samanlainen kyky aktivoida normaalisti hiljainen MDEV lokukseen dunnin soluissa .

keskustelu

Niistä 29 plasma ja 5 EPS näytteitä eturauhassyöpäpotilaalla testasimme yksikään ollut havaittavissa oleva määrä replikoitumiskykyisen XMRV tai liittyvät retrovirusten. Mukana oli kaksi plasmanäytteet (VP29 ja VP35) potilailta, joilla todettiin XMRV positiivisia viruksen havaitseminen DNA-siru (Virochip) analyysi alkuperäisessä tutkimuksessa [1], yksi plasma näyte (VP234) potilaalta, jotka testasivat XMRV positiivinen RT-PCR eturauhasen kudoksen RNA: [12], yksi plasmanäyte (VP693) potilaasta, jotka testattiin XMRV positiivinen RT-PCR: llä eristetyn RNA EPS [13], ja yksi plasmanäyte (VP432) potilaasta, joilla todettiin tarttuvan XMRV plasman [14]. Huomaa erityisesti, että eturauhasen syöpä kudosta potilaasta VP35 oli oletettu lähde ensimmäisen täyspitkän kloonin XMRV [1]. Myös meidän analyysi oli kolme EPS näytettä (VP830, VP844 ja VP881) ja yksi plasmanäyte (VP663) potilaista, jotka testattiin XMRV positiivinen RT-PCR RNA eristettiin virtsasta [15]. S

+ L

– ja dunnin solupohjaisten pelastamiseen merkkigeenin määrityksiä, että meidän käyttää virusten ovat molemmat pystyvät havaitsemaan ksenotrooppiset ja polytrooppinen retrovirukset [5], [17] tyypeistä aiemmin raportoitu eturauhassyövässä ja CFS potilailla [1], [2], [18], samoin kuin amfotrooppiset hiiren leukemia viruksia. Lisäksi, S

+ L

– määritys voidaan havaita RD114 feline retrovirus, kissan leukemiavirus tyypit A, B ja C, gibbonin leukemiavirus, ja

Mus Caroli

endogeeninen retrovirus (McERV) [16], [17], [21], joten määritykset käytimme olisi voinut havaita läsnäoloa laajan gamma retrovirusten.

Voit selvittää XMRV saattaa jatkua veressä ja havaita mahdolliset immuunivastetta vastaan ​​XMRV, me testattiin kyky veren plasman neutraloimiseksi XMRV tarttuvuuden. Olemme havainneet vain vähän neutralointi jopa tiukimmatkin kunnon inkuboimalla pieni määrä XMRV ohentamattomalla, ei-lämpöinaktivoitua plasma. Enintään 75% XMRV neutraloitiin inkubaation jälkeen plasmassa, mikä viittaa siihen, että XMRV irtoa vereen olisi tarpeeksi pitkä puoliintumisaika, jotta tunnistus. Itse asiassa 7 21 plasmanäytteistä määritettiin tällä tavalla osoitti ≤10% neutraloinnin (Fig. 1), mikä osoittaa, että ihmisen plasmassa on vähäinen luontainen neutraloivaa aktiivisuutta XMRV. Tämä tulos on yhdenmukainen aiemman tutkimuksen XMRV neutralointi seerumien CFS ja terveillä henkilöillä, jotka osoittivat, 0-80% XMRV neutralointi laimentamattomana ei-lämpöinaktivoitua seerumia, eikä XMRV neutralointi lämpöinaktivoitua seerumia [4], mutta on ristiriidassa useiden muiden tutkimusten että havaitaan suhteellisen suuri neutraloinnista XMRV ihmisen plasmaa tai seerumia, jopa niissä testataan negatiivisia XMRV muilla kriteereillä [22] – [24]. Esimerkiksi Groom et al. [22] löydetty esimerkkejä 50% neutralointi viruksen varustettujen XMRV Env proteiinien lämpöinaktivoitua seerumia 01:40 ja 1:80 laimennukset, ja useimmat näistä myönteisiä tuloksia olivat verrokeilla ilman eturauhassyöpä tai CFS. Kuitenkin useimmat positiivinen seerumi neutraloituu myös viruksia, joissa muita Env-proteiineja, mukaan lukien vesicular stomatitis virus, joka esittää neutraloiva aktiivisuus oli yleensä epäspesifinen. Zhou et al. [24] löydetty -30% neutralointi viruksen varustettujen XMRV Env jonka 1:80 laimennus lämpöinaktivoitua seerumia, jossa on kolme sera osoittaa -50% neutralointi. Kaikki muut määritykset suoritettiin osoitti, että kaikki nämä aiheet saastumaton mukaan XMRV.

Useat tekijät voivat selittää erot neutraloivat vasta-toimintaan: i) hepariini läsnä seerumista tai plasmasta valmistettu verestä kerättyjä heparinisoituihin putkiin voi epäspesifisesti estää virustitraus, ii) toistuva jäädytys ja sulatus näytteiden voivat komplementin inaktivoimiseksi mikä vähentää neutralointi, iii) erityiset viruskomponentteja viruksen neutraloimiseen tutkimuksiin voi vaikuttaa tuloksiin (esimerkiksi käyttö Gag proteiineja HIV tai muu hiiren retrovirusten yhdessä XMRV Env [22] – [24]), ja iv) solutekijöiden sisällytetty virioneihin tuotannon aikana käytetyn viruksen neutralointiin voi vaikuttaa tulokseen [25] – [27]. Tutkimuksessamme ja tutkimuksesta Knox et al. [4], aitoja XMRV tuotettu ihmisen eturauhassyövän solulinja 22Rv1 käytettiin neutralointiin määrityksissä, kun taas tutkimukset Groom et al. [22] ja Zhou et ai. [24] käytetään viruksia tehty Moloney Gag-pol-proteiinien ja XMRV Env, ja tuotettiin transfektoimalla ihmisen 293T-solut. Muita antigeenejä läsnä jälkimmäisessä virukset voisivat selittää joidenkin epäspesifisten neutralointi havaittu.

Yhteenvetona ei havaittu replikoitumiskykyisen XMRV plasmassa tai EPS nestettä eturauhassyöpäpotilaalla, eivätkä havaitsemme merkittäviä tasot neutraloivia vasta-aineita plasmasta. Nämä tulokset tukevat päätelmää muista tutkimuksista, jotka XMRV ei ole tullut ihmisiin.

Materiaalit ja menetelmät

ihmiseen kohdistuvan

Veren plasma ja ilmaisi eturauhasen nestettä (EPS) näytteet käytetty nykyisessä tutkimuksessa saatiin klo Cleveland Clinic hyväksynnän jälkeen Cleveland Clinic Foundation Institutional Review Board. Kaikki näytteet on saatu potilailla, joilla on eturauhasen syöpä, kun kirjallinen suostumus saatiin. Plasma näytteet valmistettiin kerätty veri standardin EDTA-putkiin, EPS nesteen saatiin hieronta leikattiin eturauhaset jälkeen prostatektomia, ja kaikki näytteet säilytettiin -70 ° C: ssa. Monet plasmanäytteet jäädytettiin ja sulatettiin kerran analysoitavaksi, kun taas toiset pakastettiin ja sulatettiin rajoitetun määrän kertoja (taulukko 2).

Cell Culture

M. dunnin

tail fibroblasteissa (dunnin solut) [28], 293 ihmisen alkion munuaissoluja [29], 22Rv1 eturauhasen karsinooma-solut (ATCC CRL-2505), HTX soluja (noin diploidi subklooni ihmisen HT-1080 fibrosarkoomasoluissa) [ ,,,0],5] ja DU145 syöpäsolujen [30] kasvatettiin Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa, jossa oli 4,5 g /l glukoosia ja 10% naudan sikiön seerumia (FBS). PG-4 kissan solujen [16] kasvatettiin McCoyn väliainetta, jossa 15% FBS. XMRV virusta käytettiin tässä tutkimuksessa kerättiin 22Rv1 solut saadaan suoraan ATCC.

S

+ L

– ja XMRV neutralointi Analyysit

PG-4-solut ympättiin 2,5 x 10

5 per 6 cm: n maljaa päivänä 1. päivänä 2, plasma ja EPS-näytteet sulatettiin ja osia kutakin näytettä (tai viljelyalusta kuin ei plasma kontrolli) inkuboitiin pienellä tilavuudella tarttuvan XMRV (talteen 22Rv1 solut) ja 15-30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa, kun taas muut osat plasman ja EPS näytteitä pidettiin jään päällä. Virus-piikki ja käsittelemättömän näytteet lisättiin PG-4-soluja, kun läsnä oli 4 ug /ml polybreeniä. Solut syötettiin päivänä 3, ja pesäkkeet laskettiin päivänä 4 tai 5. Joissakin kokeissa plasma lämpöinaktivoitiin 56 ° C: ssa 30 minuutin ajan ennen määritystä varten virusneutralisaatiokokeella.

Marker Rescue Assay

dunnin ja DU145-solut, jotka sisältävät LAPSN retrovirusvektorin (dunnin /LAPSN ja DU145 /LAPSN solut) tuotettiin altistamalla solut auttaja-free LAPSN vektori muodostetaan PA317 retrovirus pakkaus- soluihin, [31] ja valitsemalla solut G418 ja 1 viikko läsnäolon varmistamiseksi vektorin kaikkien solujen populaatioissa. Markkeri pelastus-määritys suoritettiin seuraavasti. Dunnin /LAPSN tai DU145 /LAPSN-soluja ympättiin 5 x 10

5 per 6 cm: n maljaa päivänä 1 ja altistettiin testinäytteiden (veriplasmassa tai EPS), kun läsnä oli 4 ug /ml polybreeniä päivänä 2 . sitten soluja siirrostettiin kuukauden suurella tiheydellä (helpottaa viruksen leviäminen) mukaan trypsiinikäsittely- ja kylvöä soluihin 1:10 laimennus aina soluista muuttui konfluentteja. LAPSN tuotanto mitattiin sitten syöttämällä konfluentteja soluja, korjuu väliaine seuraavana päivänä, poistamalla solut suodattamalla (0,2 pm huokoskoon pinta-aktiivisia selluloosa-asetaatti suodattimet) tai sentrifugoimalla (4000 x g 15 min), lisäämällä väliaineen näytteet 4 ug /ml Polybrene on dunnin tai 293-solut ympätään edellisenä päivänä klo 5 x 10

4 kuoppaa kohden 12-kuoppalevyillä, ja värjäämällä soluja AP kaksi päivää myöhemmin.

Virus häiriöt Pitoisuus

Toistetaan virus havaitaan markkeri pelastus määritys tehtiin häiriöitä analyysin avulla dunnin soluja kroonisesti infektoitu joko XMRV peräisin 22Rv1 soluista tai

M. dunnin

endogeeninen retrovirus (MDEV) alkaen dunnin soluista. Päivänä 1 tartunnan ja infektoitumattomiin dunnin solut ympättiin 12-kuoppaisilla levyillä 5 x 10

4 kuoppaa kohti. Päivänä 2, väliaine korvattiin 1 ml: lla elatusainetta, joka sisälsi 4 ug polybreeniä ja 0,1 ml väliainetta kerättiin pelastamiseen merkkigeenin määrityksessä soluja. Päivänä 4 solut värjättiin AP. MDEV-tartunnan dunnin solut ovat vastustuskykyisiä MDEV mutta salliva ja XMRV kun XMRV-tartunnan dunnin solut ovat vastustuskykyisiä XMRV mutta salliva ja MDEV.

Kiitokset

Kiitämme Christina Gaughan (Cleveland) asiantuntija teknistä tukea.