Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vaikka Wnt signalointia on osoitettu olevan tärkeä alkion morphogenesis ja syövän synnyssä useissa kudoksissa, sen rooli eturauhasen kehitys ja kasvaimen kehittymisen ei ole hyvin ymmärretty. Tässä osoitamme, että Wnt signalointia säännelty eturauhasen epiteelisolujen haarautuminen morphogenesis ja luminaalisen epiteelisolujen erilaistumisen kehittämisessä rotan eturauhasen elin kulttuureissa. Erityisesti Wnt signalointia säännelty leviämisen eturauhasen epiteelisolujen progenitorisolujen. Arviointi ilmentymisen tasoja Wnt-reitin transkription kohdegeenin, Axin2, osoitti, että Wnt-reitin aktivoitiin kehittää eturauhasen, mutta alas-säädellä aikuinen. Kastraatio johti ylösajon Axin2 taas androgeenien korvaaminen johti alas sääntelyn Axin2. Tällaiset dynaamiset muutokset Wnt aktiivisuuden vahvistettiin myös BAT-gal siirtogeenisen hiiren linja jossa β-galaktosidaasi toimittaja ilmentyy valvonnassa β-kateniinin /T-solu tekijä reagoiva elementtejä. Lisäksi arvioimme rooli Wnt signalointia eturauhasen kasvaimien syntyyn. Axin2 ekspressio havaittiin voimistunut useimmissa ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa tutkittiin. Lisäksi lisäämällä Wnt-reitin estäjä, Dickkopf 1 (DKK1), kasvatusalustaan ​​inhiboi merkittävästi eturauhasen syöpäsolujen kasvua ja siirtoa. Nämä havainnot viittaavat siihen, että Wnt signalointi säätelee eturauhasen epiteelisolujen ductal haarautuva morphogenesis vaikuttamalla solujen lisääntymistä, ja korostetaan rooli Wnt reitin aktivoitumista eturauhassyövän etenemistä.

Citation: Wang BE, Wang XD, Ernst JA, Polakis P, Gao WQ (2008) asetus epiteelin Haarautuvan morfogeneesi ja syöpäsolujen kasvua ja eturauhasen mukaan Wnt Signaling. PLoS ONE 3 (5): e2186. doi: 10,1371 /journal.pone.0002186

Editor: Hernan Lopez-Schier, Centre de Regulacio Genomica, Espanja

vastaanotettu: 17 tammikuu 2008; Hyväksytty 7 huhtikuuta 2008; Julkaistu: toukokuu 14, 2008

Copyright: © 2008 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Wnt-signalointireitin on ratkaiseva erilaisissa biologinen prosessi mukaan lukien hermo kuviointi, tasomainen napaisuus, kantasolu- huolto- ja solujen erilaistumiseen [1]. Tämä on osoitettu useissa järjestelmissä kautta geneettiset ja biokemialliset lähestymistavat. Wnt signalointi aloitetaan solunulkoisia proteiineja, ts Wnts, sitoutumalla niiden frizzled- perheen reseptoreihin. Sitten signaali transdusoitu p-kateniinin kautta signaalinvälitystapahtumien kaskadin molekyylien sytoplasmassa. β-kateniinin sitten siirtyy tumaan, muodostaa kompleksin TCF ja transaktivoi alavirran kohde geenejä, jotka säätelevät tai osallistumaan erilaisiin prosesseihin. Monimutkaisuus signalointi syntyy osittain lukuisia komponenttien tämän reitin mukaan lukien esimerkiksi 19 ihmisen Wnt-ligandien, 1 Wnt estävä tekijä (WIF), 5 erittyy frizzled liittyviä proteiineja (SFRP: t), jotka voidaan eristää Wnt-ligandien sitoutumisen niiden samankaltaisiin reseptoreihin , 2 low density lipoprotein-reseptorin kaltainen proteiineja (LRP5: stä /6) ja 4 Dickkopf (DKK) proteiineja, jotka moduloivat frizzled reseptorien [1], [2].

kanoninen Wnt-reitin, stabilointi ja translocalization ja β-kateniinin tumaan on kriittinen vaihe Wnt signaloinnin aktivointi. Puuttuessa Wnt ligandin sitoutumista, β-kateniinin on kohdistettu hajoamisen kautta vuorovaikutus adenomatoosi polyposis coli (APC) proteiinia ja Wnt-signalointi mahdollisimman vähän käytössä. Kun APC on mutatoitu, β-kateniinin kerääntyy tumaan ja Wnt-signalointi tapahtuu konstitutiivisesti aktiivinen [1]. Wnt signalointi alavirran ohjelma ymmärretään huonosti, ja erittäin hyödyllinen alavirtaan geenistä spesifinen tämä reitti on ak- siini 2, joka transkription ja kääntäminen, toimii negatiivista palautetta säätelijä Wnt siginaling koulutusjakson, auttamalla suoraan β-kateniinin hajoamiselle proteasomin [3], [4]. Vakauttaminen β-kateniinin proteiinia ja korkeus Axin2 transkriptin ovat viitteitä Wnt-reitin aktivointi [4].

säätelyhäiriön Wnt-signalointi liittyy myös syöpään patogeneesin eri kudoksissa [5], [6]. Geneettisten muutosten APC geenit aiheuttaa alttiutta paksusuolisyövän (Groden, Cell 1991), ja tuumorisuppressorigeenin funktio APC /onkogeenisiä vaikutusta Wnt reitin osoitetaan selvästi APCmin siirtogeenisiä hiiriä, jossa useat adenoomia muodostavat suolistossa [7]. Rooli Wnt reitin eturauhasen kasvainten synnyssä on viime aikoina kiinnitetty yhä enemmän huomiota, mutta ei ole vielä täysin ymmärretty. Viimeaikaiset tutkimukset raportoitu, että tietyt Wnt-ligandien, kuten Wnt1 ilmaistaan ​​eturauhassyövän solulinjoissa, ja näyttävät olevan koholla joissakin ihmisen eturauhassyövän kudosten [8]. Erityiset Wnt-reitin inhibiittorit kuten WIF1 ilmeisesti säädellä vähentävästi huomattava osa eturauhassyöpänäytteissä [9]. Prostataspesifisen poisto APC-geenin hiirissä johtaa muodostumiseen adenokarsinooma [10]. Lisäksi vuorovaikutus β-kateniinin ja androgeenireseptorin (AR) on osoitettu tehostavan AR-välitteisen transkription [11], joka on kriittinen rooli aikana eturauhassyövän etenemisen. Valaisemaan miten Wnt signalointi säätelee eturauhasen kehittämiseen ja kasvaimen kehittymisen helpottaisi kehittää uusia terapeuttisia aineita eturauhassyövän hoitoon.

Yrittäessään ymmärtää roolin Wnt signaloinnin eturauhasen epiteelisolujen kehitys, teimme elin viljelmät kehittää eturauhanen valmistettu varhain syntymänjälkeistä rottien määrittää vaikutukset modulaatio Wnt-signalointireitin on eturauhasen epiteelisolujen aluevaltaus monogeneesin. Huomasimme, että Wnt signalointia säännelty eturauhasen epiteelisolujen erilaistumisen vaikuttamalla leviämisen eturauhasen epiteelisolujen progenitorisolujen. Lisäksi TaqMan RT-PCR-analyysi paljasti, että useita yleisesti tutkittu eturauhassyövän solulinjoissa ja ksenografteissa esillä aktivointi Wnt-reitin. Lisäksi Dickkopf1 (DKK1), joka on Wnt estäjä [12] – [14], estivät merkittävästi eturauhasen syöpäsolujen kasvua ja muuttoliike. Nämä havainnot yhdessä viittaavat siihen, että aktivointi Wnt koulutusjakson on keskeinen rooli aikana eturauhasen kehittämiseen, ja regrowth ja että estämällä Wnt reitin voisi olla terapeuttista arvoa eturauhassyövän hoito etenemisen.

Tulokset

Wnt signalointi säätelee eturauhasen epiteelisolujen haarautuva morphogenesis

eturauhasen epiteelin haarautuva morfogeneesiä jyrsijän tapahtuu pääasiassa syntymän jälkeen laajeneminen ja edelleen haarautuvat epiteelin primodia [15], [16]. Tämä prosessi voidaan toisteta kätevä elinviljelyssä järjestelmä [17], [18]. Sen tutkimiseksi, Wnt signalointi on rooli eturauhasen epiteelisolujen aluevaltaus morphogenesis, käsittelimme elin viljelmistä synnytyksen jälkeinen päivä 2 (P2) rotan ventraalisessa eturauhanen kanssa Wnt ligandin, Wnt3a tai voimakas Wnt signalointia estäjä, DKK1 [12]. Kuten on esitetty kuviossa. 1, eturauhasen vertailuviljelmissä osoittivat laajaa aluevaltaus ei ainoastaan ​​ensimmäisen ja toisen kanavat, mutta myös kolmannen asteen, hieno oksat 7 päivän jälkeen viljelmässä (Fig. 1A). Kuitenkin kudoksen käsitellyissä viljelmissä Wnt3a pitoisuutena 50 nM näytetä pyöristettyjä, laajentuneen ductal vihjeitä (nuoli kuvassa. 1 B) ja pienempi määrä kolmannen asteen, hieno oksat. Eturauhanen käsitelty DKK1 400 nM, eturauhasissa ilmestyi pienempi ja oli vähemmän epiteelin oksat. Kuitenkin, toisin kuin Wnt3a käsitellyn prostates, DKK1 käsiteltiin prostates puuttui suurennettu ductal vihjeitä (Fig. 1 C). Kvantifiointi näiden viljelmien mittaamalla halkaisijat viljellään prostates ja duktaalinen vihjeitä ja laskemalla haaroituspisteissä näiden viljelmien osoitti tilastollisia eroja kontrolliviljelmien ja viljelmiä käsiteltiin Wnt3a kaikki 3 osa (Fig. 1 D-F). Nämä tulokset viittaavat siihen, että sekä aktivoinnin ja eston Wnt signaloinnin vaikuttaa haitallisesti eturauhasen epiteelisolujen haarautuminen morphogenesis, ja korostavat tarkasti säädelty Wnt signalointia asianmukaisen kehittämisen eturauhasen.

Koko mount ventral prostates valmistettiin P2 rotilla ja pidettiin 7 päivää seerumittomassa väliaineessa ilman (A) tai sen läsnä ollessa 50 nM Wnt3a (B) tai 400 nM DKK1 (C). Samanlaisia ​​kuvioita johdonmukaisesti esiintyi 3 toistetuista kokeista 5-6 eturauhasen elinten ryhmää kohti kussakin kokeessa. Huomaa, että lisäämällä joko Wnt3a tai DKK1 kulttuuriin johti muutokseen epiteelin aluevaltaus morfogeneesissä. Kvantifiointi viljelmiä mittaamalla halkaisija viljeltiin eturauhasten (D) ja tiehyen vihjeitä (E) käyttäen Axiovision ohjelmiston ja haaroituspisteissä (F) tehtiin analysoimalla 4 satunnaisesti valittua viljelmistä per ryhmä. Data ilmaistaan ​​keskiarvona + SEM (t-testi, kontrolliin verrattuna viljelmissä). Bar, 400 um.

Wnt signalointia vaikutteita solujen lisääntymistä ja erilaistumista kehittyvässä eturauhasen epiteelin

Eturauhasen epiteelin koostuu pääasiassa tyvi- ja onteloerityssolut yhdessä pienen populaation neuroendokriinisoluissa [19]. Tyvisolut nimenomainen p63 [20], sytokeratiini 14 (CK14) ja CK5 ja niiden uskotaan sisältävän progenitorisolupopulaatioon [21]. Luminaaliselle ilmentävät CK8 tai CK18, ja ovat yleensä postmitoottisia ja terminaalisesti erilaistuneita soluja. Jyrsijöillä, lähes kaikki epiteelisolut ovat progenitorisolujen ja lisääntyvät kunnes P5 kun jotkut progenitorisolujen tehdään päätelaitteen mitoosin ja erilaistuvat luminaalinen soluja, jotka ilmentävät vain CK8 tai CK18 [19]. Sen määrittämiseksi, modulaatio Wnt signaloinnin vaikuttaa erilaistuminen esiasteita osaksi onteloerityssolut teimme immunohistokemia osissa eturauhasen elimen kulttuureissa käyttäen tyvi- ja luminaaliselle solun markkereita, p63 ja CK8, vastaavasti. Kuten on esitetty kuviossa. 2, lisää p63-positiivisten solujen nähtiin tiehyen alueella Wnt3a-käsitellyissä viljelmissä (Fig. 2B) kuin kontrolliviljelmiin (Fig. 2A). Sitä vastoin vähemmän p63 positiivisia soluja läsnä DKK1-käsitellyissä viljelmissä (Fig. 2C). Solut, jotka leimattiin DAPI tumavärjäystä epiteelissä, mutta negatiivinen p63, ovat ne, eriytetty onteloerityssolut, joka vahvistettiin CK8 immunovärjäyksellä (tuloksia ei ole esitetty). Solumäärät satunnaisesti valituista viljelmistä 3 ryhmää paljasti, että prosenttiosuus tyvisolujen yli koko epiteelin solupopulaatio tietyn yksittäisen ductal yksikkö oli merkitsevästi suurempi Wnt3a-käsitellyissä viljelmissä verrattuna kontrolliviljelmiin (Fig. 2D). Toisin kuin Wnt3a toimintaa, suhteet tyvisolujen vs. yhteensä epiteelisolut olivat merkitsevästi vähemmän DKK1-käsitellyissä viljelmissä kuin kontrolliviljelmissä (Fig. 2C). Immunovärjäys käyttäen CK8 vasta-ainetta osoitti kuvion mukaan: Wnt3a vähensi määrän luminaalinen soluissa, kun taas DKK1 johtanut parannetun määrä onteloerityssolut (tuloksia ei ole esitetty). Muutos pohjapinta vs. yhteensä epiteelisolut eivät johdu solukuolemaa TUNEL merkintöjä havaittiin vain vähän, tausta signaaleja ei ole eroa kolmen ryhmissä viljelmiä (tietoja ei esitetty).

kudosleikkeet vastavärjättiin DAPI (sininen). Vaikka p63-positiivisia soluja (violetti) edustavat tyvisoluihin jossa esisolujen asuvat, siniset solut (nuolet), jotka ovat negatiivinen p63 epiteelin ovat eriytetty onteloerityssolut. (D) kvantifiointi p63-positiivisten solujen yli koko epiteelisolujen. Tiedot kerättiin satunnaisesti valittua 22-27 ductal yksiköitä osissa elimen kulttuurien ryhmää kohti ja ilmaistaan ​​keskiarvona + SEM (t-testi). Huomaa, että vaikka Wnt3a johti merkittävään lisääntymiseen tyvisolujen, DKK1 vähensi tyvisoluissa. Bar, 50 pm AC.

Koska Wnt3a ja DKK1 hoitoja johti parannettu ja määrän väheneminen p63-positiivisten solujen, vastaavasti, jotka koostuvat pääasiassa progenitorisolujen näin varhaisessa kehitysvaiheessa, haimme onko Wnt3a ja DKK1 vaikuttaisi leviämisen progenitorisolujen näissä eturauhasen elimessä viljelmiä käyttäen bromi-deoksiuridiinista (BrdU) ja Ki67 immunohistokemiallisesti. Kuten kuviossa 3 on esitetty, sen jälkeen kun 3- hoitopäivän, lisää lisääntyvien solujen havaittiin käsitellyissä viljelmissä Wnt3a (Fig. 3C, D), ja vähemmän lisääntyvien solujen käsitellyissä viljelmissä DKK1 (Fig. 3E, F), verrattuna kontrolliviljelmiin (Fig. 3A, B). Solumäärät suoritetaan satunnaisesti valitut kentät osoitti, että oli 1,63-kertainen määrä Ki67-positiivisten solujen Wnt3a-käsitellyn eturauhasen elimiä verrattuna kontrolliviljelmiin (Fig. 3G). Sen sijaan, oli merkittävä väheneminen ja Ki67-positiivisten solujen DKK1-käsitellyn eturauhasen elimet (Fig. 3G). Yhdenmukainen BrdU määritykset, meidän Ki67 immunohistokemia 7 päivän viljelmät osoittivat myös samanlainen soluproliferaatiota lisäävien ja estäviä vaikutuksia mukaan Wnt3a ja DKK1, vastaavasti (kuvio. 3H). Ymmärtää, miten solujen lisääntymistä säätelee Wnt signalointia eturauhasen kehittämiseen, tutkimme ekspressiokuviot useiden sykliini geenien erillisessä microarray tutkimuksen kehittämiseksi hiiren prostates. Huomasimme, että sykliini B2 ilme oli huomattavasti suurempi P4 kuin P19 ja 10 viikon ikäisiä hiiriä (noin 4- ja 8-kertaiseksi) ja että yhdistys sykliini B2 varhaisen kehityksen oli paljon voimakkaampaa kuin muiden Sykliinien (data ei esitetty). Vahvistamaan, onko koholla leviämisen perusteella Ki67 värjäystä, nähdään elinviljelyssä saattaa osittain välittyy sykliini B2, suoritimme TaqMan RT-PCR-analyysi näiden viljelmien. Kuten on esitetty kuviossa. 3I, ilmaisu sykliini B2 oli noin 118,8-kertainen ja 4,5-kertaa pienempi elimessä käsitellyissä viljelmissä Wnt3a ja DKK1, vastaavasti. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että Wnt signalointia säätelee terminaalin erilaistumista tyvi- solujen onteloerityssolut kontrolloimalla lisääntymistä ja /tai huolto epiteelisolujen progenitorisolujen.

(AF) Kuvassa ovat anti-BrdU-vasta (B, D, F) ja DAPI (A, C, E) kaksinkertainen merkitseminen P3 rotan ventraalisessa eturauhasessa elin viljelmiä pidettiin 3 päivänä puuttuessa (A, B) tai läsnä 50 nM Wnt3a (C, D) tai 400 nM of DKK1 (E, F). (G). Kvantifiointi BrdU-positiivisten solujen tietyllä visuaalisen alan 434 pm x 322 um. (H) kvantifiointi Ki67-positiivisten solujen P2 eturauhasen viljelmiä ylläpidettiin 7 päivää, joka oli normalisoitu kontrolliviljelmiin. Solulaskennat (G ja H) suoritettiin satunnaisesti valittujen näkökentät 5 elimen kulttuurien ryhmää kohti ja tiedot ilmaistiin keskiarvona + SEM (t-testi). Huomaa, että vaikka Wnt3a merkittävästi parannettu esisolujen lisääntymistä, DKK1 esti kantasolujen lisääntymistä. (I). Expression Tasonvaihtelut sykliini B2 P2 rotan eturauhasessa elin viljelmiä .. Tiedot kerättiin 4 elin viljelmiä säilytetään 2 päivää ryhmää kohti ja ilmaistaan ​​keskiarvona + SEM (t-testi). Huomaa, että ilmentyminen sykliini B2 voimistuvan wnt3a, mutta alas-säädellä DKK1. Bar, 100 pm AF.

Dynaaminen muutoksia Wnt signalointia aktivoinnin aikana eturauhasen kehittämiseen, kun kastraatio ja seuraavan androgeenien korvaaminen

Tuottaa edelleen tukevaa näyttöä roolin Wnt signaloinnin ylläpito eturauhasen epiteelin esiasteita, suoritimme kvantitatiivinen RT-PCR: llä käyttämällä Axin2 indikaattorina aktivointia varten Wnt signalointia eturauhasessa valmistettu eri ajankohtina kehitystä. Olemme havainneet, että Axin2 tasot olivat korkeimmat P2, mutta laski ajan myötä eturauhasen kypsynyt (Fig. 4A). Nämä tiedot viittaavat siihen, että Wnt signalointi on aktiivisempi alkuvaiheessa kehittää prostates, sopusoinnussa korkeampi progenitorisolupopulaatioon kuin täysin kehittynyt eturauhanen, jossa suurin osa epiteelisolujen ovat terminaalisesti erilaistuneita onteloerityssolut.

(A ) asteittainen downregulation Axin2 vastasyntyneestä adulthood.nbsp, (B) Axin2 oli voimistunut kastraation jälkeen, mutta palasi normaaliin alhainen jälkeen androgen korvaamisesta. Tiedot kerättiin 4-6 näytettä per ryhmä ja ilmaistaan ​​keskiarvona + SEM (t-testi, verrattuna normaalin aikuisen prostates). Lyhenne: N, normaali eturauhanen; C3, 3 vuorokauden kuluttua kastraation, C17; 17 päivää kastraation jälkeen; C14 + T. 14 päivää kastraation jälkeen + 3 päivä testosteronia hoidon.

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että osa tyvisoluosastoa yli koko epiteelisolujen eturauhasen epiteelin muutetaan kastraation jälkeen ja hormonikorvaushoito [22 ]. Kastrointi aiheuttama androgen peruuttamista tiedetään heikentävistä noin 90% epiteelin sisällön [23] ja tulokset rikastamiseen pohjapinta /progenitorisolupopulaatioon. Androgeenien korvaaminen puolestaan ​​johtaa lisääntymisen progenitorisolujen ja niiden erilaistumista onteloerityssolut, jolloin eturauhasen uudelleen kasvua takaisin normaaliin kokoonsa [24]. Suoritimme kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR verrata ekspressiotasoja Axin2 in eturauhasten kerätty normaalit hiiret, hiiret jälkeen 3 päivää ja 17 päivää kastraation jälkeen ja hiirillä jälkeen 3 päivää testosteronin korvaaminen kastraation jälkeen. Kuten on esitetty kuviossa. 4B, Axin2 tasot olivat 1,5 kertaa ja 1,7 kertaa suurempi prostates 3 ja 17 päivää kastraation, vastaavasti, mutta laski 3 päivän kuluttua testosteronikorvaushoitoa. Nämä tiedot sekä kehittää ja uusiutuvia prostates osoittavat, että Wnt signalointia korreloi positiivisesti tyvisolusyöpä numero ja korreloi käänteisesti erilaistuminen esiasteita osaksi luminal soluihin prostates.

seuraavaksi tutkinut BAT-gal siirtogeenisen hiiren linja jossa β-galaktosidaasi toimittaja on ilmaistu valvonnassa β-kateniinin /Tcell tekijä reagoivat elementit [25]. Tämä hiiri linja on osoitettu olevan

bona fide

in vivo indikaattorit Wnt /β-kateniinin signalointi, joka mahdollistaa visualisoinnin yleisen tilan Wnt aktivaation soluissa tietyssä kudoksessa. Tutkiminen kudosleikkeiden valmistettu prostates eri vaiheissa, myös P5 (kehittää prostates, Fig. 5A-C), aikuisten (kypsä prostates, Fig. 5D-F)), kastraation jälkeen (Kuva. 5G-I) ja seuraava androgeenien korvaaminen (Fig. 5J-L), osoitti, että määrä β-galaktosidaasi-positiivisia soluja oli paljon suurempi kehittää eturauhanen, kuin aikuisten eturauhanen (28,7 ± 6,9 /kanava, n = 10 vs. 1,92 ± 0,4 /kanava, n = 13 , Fig. 5M). Kastraatio johti kohonnut määrä β-galaktosidaasi-positiivisia soluja (5,2 ± 0,7 /kanava, n = 13), mutta androgeeni korvaaminen johti pienempi määrä, joka vastasi normaalitasolle aikuisten prostates (2,3 ± 0,5 /kanava, n = 15, Fig. 5M). Lisäksi me olemme havainneet, että Wnt-aktiivisuus yksinomaan nähty epiteelisoluissa, pääasiassa tyvisoluosastoa jossa esiastesoluista sijaitsee. Lisäksi, kahden merkinnästä kudosleikkeiden anti-p63-vasta-ainetta, joka on tyvisolusyöpä markkeri ja anti-β-galaktosidaasi-vasta-ainetta paljasti, että aikuisen, valtaosa β-galaktosidaasi-positiiviset solut co-leimattu anti- p63-vasta-ainetta (nuolet kuviossa. 5A-L ja N), vaikka synnytyksen jälkeinen prostates oli havaittavissa määrä β-galaktosidaasi-positiivisten solujen luminal solujen kerros, joka voi johtua mahdollisuus viivästynyt hajoaminen β-galaktosidaasin aktiivisuus in parantumattomasti mitoosi solut poistuivat solusyklin erilaistua onteloerityssolut. Siksi nämä havainnot eivät vain vahvistaa dynaamisia muutoksia Wnt toiminnan aikana eturauhasen kehittämistä ja uusiutumista saatu TaqMan RT-PCR-analyysi Axin2 ilmaisun, mutta myös tarjota lisätukea yhdistys Wnt signalointia eturauhasen tyvisoluihin jossa esisolut uskotaan yleisesti oleskella.

Double immunovärjäys eturauhassyövän kudosleikkeiden anti-β-galaktosidaasi (vihreä A, D, G, J) ja anti-p63 (punainen, B, E, H, K) vasta-aineita, jotka on valmistettu hiiristä P5 (AC), aikuisten (DF), 14 päivää kastraation jälkeen (GI) ja 14 päivää sen jälkeen androgeenien korvaaminen (JL). Leikkeitä counterstaining DAPI (sininen). Kun taas nuolet osoittavat solut, jotka ilmentävät p63 ja β-galaktosidaasi, arrowhead (Fig. 1A-C) esittää solua, joka on p-gal-positiivisia, mutta p63 negatiivinen kehittää eturauhasen. Huomaa, että β-galaktosidaasi-ilmentäviä soluja sijaitsevat yksinomaan epiteelin, ja pääasiallisesti sisällä tyvisoluosastoa aikuisten eturauhasen, vaikka huomattava määrä nähdään luminaalisessa solukerros kehittää eturauhasen. Bar, 50 pm. (M) kvantifiointi β-gal-positiivisten solujen kohti epiteelin duktaalinen yksikön, joka on määritetty kudosleikkeissä perustuu DAPI counterstaining ja läsnäolo epiteelin ontelon. (N) Solulaskennat of β-gal-positiivisten solujen yli yhteensä tyvisolujen (p63 positiiviset solut). Tiedot kerättiin 14-20 satunnaisesti valitun Duktaalinen yksiköiden kohdissa 4-5 prostates ryhmää kohti ja ilmaistaan ​​keskiarvona + SEM (t-testi, verrattuna normaalin aikuisen prostates).

esto Wnt-signalointi johtaa solujen proliferaatio ja migraatio eturauhassyöpäsolujen

Poikkeava Wnt signalointi on havaittu monissa kasvaimissa [5], [6]. Sen määrittämiseksi, ovatko Wnt signalointi on merkitystä eturauhasen kasvainten synnyssä ja syövän etenemiseen, arvioimme Wnt signalointia tila ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa ja 2 ihmisen eturauhasen tuumoriksenografteja mittaamalla ekspressiotasot Axin2. Kuten on esitetty kuviossa. 6, kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi paljasti, että Axin2 ilmaistiin korkeammalla tasolla PC3, DU145 ja LNCaP solulinjat ja ihmisen eturauhasen -tuumoriksenografti näytteitä (LuCaP35 ja LuCaP77) [26], kuin normaaleissa tai ei-tuumorigeeniset ihmisen eturauhasen epiteelisolut, kuten PrEC ja BPH1 soluihin [27]. Näin ollen, Wnt-signalointi yliaktiivista eturauhasen syöpäsolujen verrattuna normaalin eturauhasen epiteelisolujen.

TaqMan RT-PCR-analyysi Axin2 ekspression ihmisen eri eturauhasen epiteelisolujen ja syöpäsoluja. Data kerättiin tripletit ja ilmaistaan ​​keskiarvona + SEM (t-testi). Huomaa, että Axin2 ilmentyminen on paljon suurempi eturauhassyövän solulinjoissa (LNCaP, DU145, PC3) ja ihmisen eturauhassyövän ksenografteja (LuCaP35, LuCaP77) verrattuna ensisijaisen eturauhasen epiteelisolut (PrEC) tai ei-tumorigenenic kuolemattomiksi eturauhasen epiteelisolut (BPH1) .

seuraava arvioi Wnt3a tai DKK1 hoito vaikuttaisi kasvuun PC3-solujen. Mittaamalla solujen lisääntymistä käyttämällä

3H tymidiinin, huomasimme, että käsittely viljelmiä Wnt3a johti merkittävään kasvuun solujen lisääntymisen (Fig. 7A). Sen sijaan, DKK1 vähensi solujen lisääntymisen annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 7A). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös LNCaP-soluissa (tietoja ei esitetty).

Sen tutkimiseksi, onko Wnt signalointi vaikuttaa myös eturauhassyövän solumigraatio tai solun liikkuvuus, suoritimme solumigraatio kokeiluja PC3-soluja. Kuten on esitetty kuviossa. 7B, lisäys Wnt3a elatusaineeseen johti tehostettu määrä siirtynyt soluja, kun taas DKK1 inhiboi solujen vaeltaminen, kontrolliin verrattuna kulttuuriin. Sitä vastoin hoito BPH1 soluja, joissa ilmentyminen Axin2 oli alhainen tai ei ollut havaittavissa (kuvio. 6), jossa DKK1, ei estäviä vaikutuksia solujen vaeltaminen on nähtävissä (tietoja ei ole esitetty). Toisaalta, joko trypaanisinisellä värjäystä tai FACS lajittelu käyttämällä anneksiini 5 immunovärjäystä ei paljastanut parannettuja solukuolemaa DKK1-käsitellyissä viljelmissä (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset viittaavat siihen, että Wnt signaloinnin edistää lisääntynyt solun liikkuvuus, mikä puolestaan ​​voi edistää invasiivisuus ja /tai etäpesäkkeiden eturauhasen syöpäsoluja.

(A) Tritioitua tymidiinin PC3 kulttuureissa puuttuessa tai läsnä Wnt3a tai DKK1. Kun taas suuren pitoisuuden Wnt3a (10 nM) parannettu PC3-solujen lisääntymisen, DKK1 inhiboi PC3 proliferaatiota annoksesta riippuvaisella tavalla. (B) asetus PC3 solun muuttoliikkeen Wnt signalointia. Tiedot kerättiin 6-8 kulttuureista ryhmää kohti ja ilmaistaan ​​keskiarvona + SEM (t-testi). Huomaa, että Wnt3a lisännyt siirtynyt solujen, kun taas DKK1 esti solujen vaeltamiseen.

Keskustelu

rooli Wnt signalointia eturauhasen kehittämiseen

Tässä tutkimuksessa olemme tutkittiin miten Wnt-signalointireitin eturauhasen ensimmäisessä päässä kehitysbiologiaan näkökulma ja sitten jatkeena, joka liittyy läheisesti patogeeninen prosessi, eli kasvaimen kehittymisen.

ex vivo

synnytyksen jälkeinen eturauhasen kudosviljelmän kokeita paitsi mahdollistaa kätevän kohdistuvien vaikutusten seurantaa kasvutekijöiden tai estävät aineet varhaiseen eturauhasen kehittämiseen, mutta myös mahdollistaa suorittaa kokeet, vaikka tarjonta reagenssien on melko rajallinen. Tätä järjestelmää on käytetty aiemmin selvittämisessä rooli androgeenihormonien, kudosten komponentteja ja erilaisia ​​uusia reittejä eturauhasen aluevaltaus morfogeneesissä ja varhaisen kehityksen [17], [18], [28] – [30]

Olemme suoraan tutki roolia Wnt signalointia eturauhasen kehitystä käyttämällä sekä Wnt signalointia stimuloivat että estävät tekijät, Wnt3a ja DDK1, vastaavasti. Lisäksi Wnt ligandin, Wnt3a, johtaa solujen lisääntymisen tehostuneen ja vähentäminen luminaalisen epiteelin solujen erilaistumista, kun taas hoito Wnt estäjää, DKK1, parannettu solujen erilaistumista ja vähentää solujen lisääntymistä. Modulaatiota soluproliferaation Wnt signalointia voidaan katsoa osittain muuttuneen tasoja sykliini B2, koska sykliini molekyylit aiemmin raportoitu olevan rooli eturauhasen solujen lisääntymistä [31], [32]. Nämä tiedot yhdessä viittaavat siihen, että vaatimus Wnt signalointia eturauhasen haarautuva morfogeneesissä on tiukasti ja hienovaraisesti säännellään sekä lisätä ja vähentää Wnt toiminta voi vaikuttaa haitallisesti eturauhasen haarautuva morfogeneesiä ex vivo kulttuureissa. Lisäksi meidän analyysi lähetti-RNA tasojen Axin2 ja β-galaktosidaasin ilmentyminen BAT-gal siirtogeenisiä hiiriä indikaattoreina Wnt signalointia syntymän jälkeisessä prostates viittaavat myös siihen, että Wnt-reitti on enemmän kehittää aktiivisesti prostates kuin kypsä prostates.

Association of Wnt signalointia ja eturauhasen tyvisoluihin jossa esisolut uskotaan yleisesti oleskella

havainnot elin viljelmistä kehittää prostates ovat yhdenmukaisia ​​roolia Wnt signaloinnin ylläpito esisolujen muissa kudoksissa, kuten suoli [33], rintarauhasen [34] ja hematopoieettisen järjestelmän [35]. Lisäksi korrelaatio tyvisolujen jossa kantasolujen uskotaan yleisesti oleskella aktivoitumisen Wnt-reitin on myös havaittu eturauhasen uudelleen kasvua kastraation jälkeen ja hormonikorvaushoito. Epiteelin kantasolujen eturauhasen ovat riippumattomia androgeenireseptorin hengissä. Näin ollen, aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että kastraation jälkeen, eturauhasen epiteelisolujen progenitorisolupopulaatioon on parannettu tai rikastettu [30], [36], [37], koska apoptoosin androgeeniriippuvaisen, terminaalisesti erilaistuneita luminaalisen epiteelin solupopulaation. Käänteisesti, kun androgeeni korvataan eturauhasen laukaistaan ​​uudelleen kasvaa alkuperäiseen kokoonsa johtuu tehostetun leviämisen progenitorisolujen ja niiden myöhempää erilaistumista uusiin onteloerityssolut. Käyttäen Axin2 koska molekyyli indikaattori, huomasimme, että Wnt ylössäädellään kastraation jälkeen, mutta säätyy alas jälkeen androgeenien korvaaminen, joka vastaa hienosti sisällön esisolujen eturauhasen. Samanlaisia ​​dynaaminen malli Wnt oli vilkasta BAT-gal siirtogeenisiä hiiriä. Tukahduttaminen Wnt-signalointireitin jälkeen hormonikorvaushoito, kuten on esitetty säätely alaspäin Axin2 mRNA tai pienempi määrä β-galaktosidaasi-positiiviset solut voivat johtua vuorovaikutuksesta β-kateniinin ja AR-reitin. β-kateniinin on osoitettu voivat olla vuorovaikutuksessa AR ja toimii yhteistyössä aktivaattori AR [38]. On mahdollista, että ligandin sitoutumisen jälkeen, aktiivinen muoto AR, lisäksi sen normaalia toimintaa, kuten transkriptiotekijän eturauhasen kehittämiseen, sitoo myös ja sitoo ydin- β-kateniinin, mikä vähentää altaan β-kateniinin käytettävissä β-kateniinin-TCF trans-aktivoitumisen [38]. Tämän seurauksena vähentää Wnt signaloinnin, eturauhasen progenitorisoluja voitaisiin sitten indusoida erilaistumaan onteloerityssolut. Yhdessä nämä havainnot tarjoavat tukevaa näyttöä roolin Wnt signaloinnin esisolujen ylläpito eturauhasen epiteelissä.

Implications of Wnt signaloinnin eturauhasen syöpäsolujen kasvua

Lisääntyvä todistusaineisto viittaa siihen, että Wnt reitti voi myös edistää eturauhassyövän etenemiseen [39]. Useat Wnt ligandi kuten Wnt1 ja Wnt2 ovat säädellään ylöspäin ihmisen eturauhaskasvainnäytteissä [40], [41]. sFRP3 voi estää eturauhassyövän solujen kasvua ja invaasiota [42]. Dkk3 on äskettäin osoitettu olevan alassäädetty ihmisen eturauhaskasvainnäytteissä, ja DKK1 hoito voi estää eturauhasen kasvainsolujen kasvua [43]. Enemmän viime aikoina on raportoitu, että adenokarsinooman muodostetaan eturauhasspesifinen APC poisto hiirimallissa [10]. Tutkimuksemme osoittaa, että Axin2 on kohonnut useissa ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa ja ksenografti ihmisen eturauhasen kasvaimissa verrattuna normaaleihin ihmisen PrEC ja ei-tuumorigeeniset ihmisen immortalisoitu eturauhasen epiteelisolut, antaa lisätukea onkogeenisen rooli Wnt-reitin aktivaatio eturauhasen kasvainten synnyssä. Lisäksi meidän löytää että DKK1 hoito estää merkittävästi eturauhasen syöpäsolun kasvua ja muuttoliike vahvistaa tätä käsitystä. Johtuen luonnostaan ​​liittyviä vaikeuksia tuotantoon ja puhdistus suuren määrän DKK1 vaaditaan in vivo vierassiirrekokeissa, in vivo eturauhassyöpäksenograftista kokeilu ei ole tehty, mutta on perusteltua tulevaisuudessa vahvistaa estävät vaikutukset DKK1 eturauhasen kasvaimen kasvua ja etenemistä.

syövän kantasoluja malli on vastikään ehdotettu monia syöpätyyppejä. Kun kyseessä on eturauhasen syöpä, syövän kantasoluja ovat ne, joiden uskotaan olevan riippumaton androgeenin hengissä. Kun otetaan huomioon, Wnt signalointi on tärkeä solujen lisääntymisen ja erilaistumisen normaalin kehityksen ja liittyy tyvisoluista jossa esisolut uskotaan yleisesti oleskella aikana uudelleen kasvuun kastraation jälkeen ja androgeenien korvaaminen, olisi mielenkiintoista selvittää, onko Wnt-reitin liittyy myös eturauhassyövän kantasolujen joka voi olla ratkaiseva rooli androgen vastuksen ja myöhäisessä vaiheessa eturauhassyövän etenemistä.